Luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu tạo kháng nguyên tái tổ hợp của virus gây bệnh cúm A/H7N9 bằng phương pháp biểu hiện tạm thời trong cây thuốc lá (Nicotiana benthamiana) thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:153

Thêm vào BST

Báo xấu

53
lượt xem 8
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận án cung cấp cơ sở khoa học quan trọng trong việc thiết kế các cấu trúc vector chuyển gen mang gen HA mono_ELP, HA trimeric_ELP, HA trimeric và HA trimeric-IgMFc mã hóa cho các kháng nguyên HA tái tổ hợp; biểu hiện kháng nguyên tái tổ hợp trên cây thuốc lá bằng phƣơng pháp biểu hiện tạm thời; tách chiết, tinh sạch và đánh giá khả năng kích thích đáp ứng miễn dịch dịch thể của các kháng nguyên tái tổ hợp này trên động vật thí nghiệm. Kết quả đề tài luận án là bằng chứng khoa học về tiềm năng của việc sản xuất, phát triển vacxin tiểu đơn vị phòng virus cúm trong thực vật.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu tạo kháng nguyên tái tổ hợp của virus gây bệnh cúm A/H7N9 bằng phương pháp biểu hiện tạm thời trong cây thuốc lá (Nicotiana benthamiana) thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LÊ THỊ THỦY NGHIÊN CỨU TẠO KHÁNG NGUYÊN TÁI TỔ HỢP CỦA VIRUS GÂY BỆNH CÚM A/H7N9 BẰNG PHƯƠNG PHÁPBIỂU HIỆN TẠM THỜI TRONG CÂY THUỐC LÁ (Nicotiana benthamiana) THÔNG QUA VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens”. Chuyên ngành: Sinh lý học thực vật Mã số: 9 42 01 12 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội, 2019
i LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Phạm Bích Ngọc và PGS.TS. Chu Hoàng Hà đã hƣớng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện thuận lợi, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án. Trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án, tôi luôn nhận đƣợc sự giúp đỡ của tập thể cán bộ hƣớng dẫn, các thầy cô giáo, các nhà khoa học, các anh chị em đồng nghiệp và quý cơ quan, phòng ban. Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Lãnh đạo, Bộ phận đào tạo sau đại học, các phòng chức năng của Viện Công nghệ sinh học đã tạo điều kiện cho tôi học tập và hoàn thành luận án. Bên cạnh đó, tôi xin chân thành cảm ơn tập thể cán bộ nghiên cứu Phòng Công nghệ tế bào thực vật, phòng Công nghệ ADN ứng dụng Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam. Luận án đƣợc thực hiện tại, Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Phòng thử nghiệm sinh học, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam. Với sự hỗ trợ về tài chính và điều kiện làm việc trong khuôn khổ đề tài cấp Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam. Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, bạn bè và các đồng nghiệp đã luôn động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận án này. Tôi xin chân thành cảm ơn tất cả những sự giúp đỡ quý báu đó! Hà Nội, ngày tháng năm 2019 Nghiên cứu sinh Lê Thị Thủy Lê Thị Thủy
ii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Đây là công trình nghiên cứu của bản thân tôi các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã đƣợc công bố trên tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép của các đồng tác giả; phần còn lại chƣa ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tôi xin chịu trách nhiệm hoàn toàn về các số liệu, nội dung đã trình bày trong luận án. Hà Nội, ngày tháng năm 2019 Tác giả Lê Thị Thủy
iii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN...................................................................................... i LỜI CAM ĐOAN................................................................................ Ii MỤC LỤC........................................................................................... Iii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT..................................................... Vi DANH MỤC BẢNG........................................................................ Viii DANH MỤC HÌNH......................................................................... Xi MỞ ĐẦU............................................................................................... 1 1 Tính cấp thiết của đề tài ...................................................................... 1 2 Mục tiêu nghiên cứu............................................................................ 3 3 Nội dung nghiên cứu............................................................................ 3 4 Những đóng góp mới của luận án........................................................ 3 5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án.......................................... 4 Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU........................................................ 5 1.1 Đặc điểm cấu trúc của virus cúm A/ H7N9..................................... 5 1.1.1 Nguồn gốc virus cúm A/H7N9............................................................ 5 1.1.2 Đặc điểm cấu trúc virus cúm A/H7N9.................................................. 6 1.1.3 Đa hợp tạo nên phân type A/H7N9....................................................... 9 1.1.4 Đặc điểm kháng nguyên bề mặt của virus cúm A/H7N9...................... 10 1.1.5 Tình hình dịch cúm A/H7N9............................................................... 13 1.2 Vacxin phòng chống bệnh cúm A...................................................... 16 1.2.1 Một số loại vacxin phòng bệnh cúm A hiện nay................................... 16 1.2.2 Vacxin tái tổ hợp từ thực vật................................................................. 19 1.2.3 Vacxin phòng bệnh cúm gia cầm ở Việt Nam...................................... 20 1.2.4 Một số nghiên cứu về vắc xin cúm ở Việt Nam 21 1.3 Biểu hiện tạm thời protein tái tổ hợp ở thực vật thông qua Agrobacterium.................................................................................... 24 1.3.1 Hệ thống biểu hiện tạm thời protein tái tổ hợp ở thực vât..................... 24 1.3.2 Quá trình biểu hiện tạm thời thông qua Agrobacterium........................... 26
iv 1.3.3 Các chiến lƣợc tăng cƣờng biểu hiện protein tái tổ hơp ở thực vật……….. 28 1.3.4 Tinh sạch protein tái tổ hợp ở thực vật……………………………….. 34 1.4 Nano kim cƣơng (NDs) và những ứng dụng tiềm năng trong công nghệ sinh học................................................................................. 37 1.4.1 Giới thiệu chung về vật liệu nano kim cƣơng....................................... 37 1.4.2 Ứng dụng của Nanodiamons trong khoa học sự sống và công nghệ sinh học.................................................................................................. 37 Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU......................... 41 2.1 Vật liệu.................................................................................................. 41 2.1.1 Chủng vi khuẩn...................................................................................... 41 2.1.2 Các vector và vật liệu thực vật, động vật............................................... 41 2.1.3 Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu.................................................. 42 2.1.4 Hóa chất……………………………………………………………… 42 2.1.5 Thiết bị………………………………………………………………... 43 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu..................................................................... 43 2.2.1 Các phƣơng pháp thiết kế gen, thiết kế vector chuyển gen và tạo chủng A. tumefaciens cho biểu hiện tạm thời...................................... 43 2.2.2 Thiết kế cấu trúc vector mang gen HA phục vụ chuyển gen............. 45 2.2.3 Các phƣơng pháp trong biểu hiện tạm thời và đánh giá mức độ biểu hiện của protein tái tổ hợp trong lá thuốc lá........................................... 47 2.2.4 Tách chiết và tinh sạch protein tái tổ hợp ……………………………. 50 2.2.5 Phƣơng pháp đánh giá hoạt tính sinh học của protein kháng nguyên tinh sạch………………………………………………………………. 51 2.2.6 Phân tích thống kê kết quả thực nghiệm……………………………… 55 Chƣơng 3: KẾT QUẢ NHIÊN CỨU........................................................ 56 3.1 Tổng hợp nhân tạo và thiết kế vector hỗ trợ biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên HA……………………………………………………. 56 3.1.1 Tổng hợ nhân tạo gen mã hóa kháng nguyên HA…………………….. 56 3.1.2 Kết quả tạo vector chuyển gen mang gen mã hóa kháng nguyên HA mono_ELP.............................................................................................. 59 3.1.3 Kết quả tạo vector chuyển gen mang gen mã hóa kháng nguyên HA trimeric_ELP ......................................................................................... 62
v 3.1.4 Kết quả tạo vector chuyển gen mang gen mã hóa kháng nguyên HA trimeric................................................................................................................... 65 3.1.5 Tạo cấu trúc vector chuyển gen thực vật mang gen HA trimeric-IgMFc................ 68 3.2. Tối ƣu các điểu kiện biểu hiện và tinh sạch protein HA tái tổ hợp. 71 3.2.1 Tối ƣu các điểu kiện biểu hiện protein HA tái tổ hợp………………… 71 3.2.2 Kết quả biểu hiện và tinh sạch protein HA……………………………. 75 3.2.3 Kết quả đánh giá khả năng hình thành oligomer của protein HA trimeric bằng phản ứng liên kết ngang………………………………... 83 3.3 Kết quả tạo phức hệ, khả năng gây ngƣng kết hồng cầu của kháng nguyên HA và phức hệ HA trimeric:ND .............................. 84 3.3.1 Kết quả tạo phức hệ kháng nguyên HA trimeric:ND............................. 84 3.3.2 Đánh giá khả năng ngƣng kết hồng cầu của protein tinh sạch HA trimeric-IgMFc................................................................................ 88 3.3.3 Đánh giá khả năng ngƣng kết hồng cầu của protein tinh sạch HA mono_ELP và HA trimeric_ELP……………………………………... 89 3.4 Đánh giá khả năng kích thích đáp ứng miễn dịch của kháng nguyên HA và phức hệ HA trimeric:ND trên động vật………….... 91 3.4.1 Kết quả thí nghiệm gây đáp ứng miễn dịch trên chuột……………....... 91 3.4.2 Khả năng kích thích tạo kháng thể IgG đặc hiệu với HA…………... 92 Chƣơng 4: BÀN LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU...................................... 95 4.1 Tổng hợp nhân tạo và thiết kế vector hỗ trợ biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên HA……………………………………………………. 95 4.1.1 Lựa chọn gen trong thiết kế vector biểu hiện........................ 95 4.1.2. Cấu trúc vector biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên HA .................... 96 4.2 Biểu hiện tạm thời gen mã hóa kháng nguyên HA thông qua vi khuẩn Agrobacterium………………………………………………... 101 4.2.1 Mức độ biểu hiện tạm thời các kháng nguyên tái tổ hợp....................... 101 4.2.2 Khả năng hình thành oligomer............................................................ 103 4.3 Khả năng tạo phức hệ và gây ngƣng kết hồng cầu của kháng nguyên HA ....................................................................................... 104
vi 4.3.1 Khả năng tạo phức hệ kháng nguyên HA trimeric:ND........................ 104 4.3.2 Khả năng gây ngƣng kết hồng cầu của kháng nguyên HA và phức hệ kháng nguyên HA trimeric:ND(1:12)............................................... 105 4.4 Khả năng kích thích sản sinh kháng thể IgG đặc hiệu trên chuột... 105 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ................................................................ 108 NHỮNG CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN....... 110 TÓM TẮT LUẬN ÁN BẰNG TIẾNG ANH............................................. 111 TÀI LIỆU THAM KHẢO....................................................................... 115 PHỤ LỤC
vii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT 2b CMV Cucumber mosaic virus , (Protein 2b của virus khảm dƣa chuột) 35S Ter 35S Terminator (Trình tự kết thúc phiên mã) Aa Amino acid (axit amin) Bp Base pair (Cặp base) BSA Bovine serum albumin CaMV Cauliflower mosaic virus (Virus khảm súp lơ) Cs Cộng sự DNA Deoxyribonucleic acid ELISA Enzyme linked immunosorbent assay ELP Elastin-like polypeptide ER Endoplasmic reticulum (Lƣới nội chất) Fc Fragment crystallizable HA Hemagglutinin HAU Hemagglutination unit HC-Pro Helper component protease (Protein hỗ trợ) HRP Horseradish peroxidase IgG Immunoglobulin G Immobilized Metal Affinity Chromatoraphy (sắc khí ái lực) IMAC Kb Kilobase KDa Kilodalton LB Luria-Bertani (Môi trƣờng nuôi vi khuẩn) mITC Membrane-based ITC (phƣơng pháp tinh sạch qua màng) NA Neuraminidase OD Optical density (Mật độ quang) PAGE Polyacrylamide gel electrophoresis PBS Phosphate-buffered saline PCR Polymerase Chain Reaction
viii PCS Polycloning site ARN Ribonucleic acid RNase Ribonuclease SAP Shrimp alkaline phosphatase ScFv Single chain variable fragment SDS Sodium dodecyl sulfate SDS-PAGE Sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis TAE Tris Acetate EDTA TaqDNA Thermus aquaticus DNA polymerase polymerase TSP Total soluble protein (Protein tổng hợp) v/p vòng/phút VLP Virus-like particle WHO World Health Oganization WT Wild type (Cây không chuyển gen)
viii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Một số thay đổi axit amin liên quan đến khả năng lây nhiễm, gây bệnh và tính nhạy cảm với thuốc kháng virus của virus cúm gia cầm A(H7N9) phân lập từ đợt dịch thứ năm………………... 14 Bảng 1.2 Danh sách một số giống gốc vắc xin cúm A/H7N9 chuyển giao cho cơ sở có nhu cầu sản xuất…………………………………. 20 Bảng 1.3 Sự so sánh các đặc trƣng kỹ thuật giữa CVD diamons, Titanium và thép không gỉ............................................................................ 38 Bảng 2.1 Trình tự mồi sử dụng trong nghiên cứu gen HA mono_ELP, HA trimeric_ELP, HA trimeric và HA trimeric-IgMFc............... 42 Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR............................................................ 44 Bảng 2.3 Thành phần phản ứng nối ghép gen.............................................. 44 Bảng 2.4 Thiết kế thí nghiệm dãy trực giao L9 (34)……………………….. 49 Bảng 3.1 Nồng độ protein HA trong mẫu lá biểu hiện tạm thời protein HA khi không sử dụng vector hỗ trợ và có sử dụng vector hỗ trợ HcPro PRSV/2b CMV………………………………………….. 72 Bảng 3.2 Kết quả phân tích phƣơng sai của các công thức thí nghiệm trong thí nghiệm trực giao………………………………………. 75 Bảng 3.3 Mức độ biểu hiện và khả năng gây ngƣng kết hồng cầu của protein HA....................................................................................................... 90
ix DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Hình ảnh cấu trúc virus cúm A...................................................... 8 Hình 1.2 Nguồn ngôc các phân đoạn gen của chủng virus H7N9 tái tổ hợp.. 9 Hình 1.3 Mô hình cấu trúc Hemagglutinin..................................................... 12 Hình 1.4 Sơ đồ mô tả bằng phƣơng pháp biểu hiện tạm thời thông qua Agrobacterium…………………………………………………………... 27 Hình 1.5 Quy trình tinh sạch protein bằng phƣơng pháp mITC……………. 36 Hình.1.6 Cấu trúc tinh thể của Nanodiamons………………………………. 37 Hình.1.7 Hình ảnh minh họa cho ứng dụng ND trong dẫn thuốc…………... 40 Hình 2.1 Chuyển gen vào lá cây thuốc lá bằng phƣơng pháp biểu hiện tạm thời nhờ A. tumefaciens................................................................ 48 Hình 2.2 Cơ chế gây phản ứng ngƣng kết hồng cầu....................................... 52 Hình 2.3. Sơ đồ thí nghiệm gây miễn dịch trên chuột bạch BALB/C............. 54 Hình 3.1 Kết quả điện di sản phẩm PCR nhân gen HA............................... 59 Hình 3.2 Kết quả điện di sản phẩm xử lý vector pRTRA_HA mono_ELP.... 60 Hình 3.3 Kết quả thiết kế vector pCB301_35S_ HA mono_ELP.................. 61 Hình 3.4 Kết quả thiết kế vector pCB301_35S_ HA mono_ELP.................. 62 Hình 3.5 Kết quả điện di sản phẩm xử lý vector tách dòng bằng enzyme giới hạn BamHI/PspOMI................................................................. 63 Hình 3.6 Kết quả phân tích kiểm tra vector chuyển gen pCB301_35S_ HA trimeric_ELP................................................................................ 64 Hình 3.7 Kết quả kiểm tra vector pCB301_35S_ HA trimeric_ELP bằng enzyme cắt giới hạn....................................................................... 65 Hình 3.8 Kết quả điện di sản phẩm xử lý vector tách dòng bằng enzyme giới hạn BamHI/PspOMI................................................................. 66 Hình 3.9 Kết quả phân tích kiểm tra vector chuyển gen pCB301_35S_ HA trimeric............................................................................................ 67
x Hình3.10 Kết quả kiểm tra vector pCB301_35S_ HA trimeric..................... 68 Hình 3.11 Kết quả thiết kế vector pRTRA_35S_SP_His_ HA trimeric- IgMFc................................................................................... 69 Hình 3. 12 Kết quả thiết kế vector pCB301_35S_SP_His_ HA trimeric_IgMFc............................................................................. 70 Hình 3. 13 Kết quả đánh giá biểu hiện kháng nguyên HA.............................. 72 Hình 3.14 Kết quả biểu hiện protein HA tại các điều kiện thí nghiệm khác nhau……………………………………………………………….. 74 Hình 3.15 Kết quả tối ƣu nồng độ PEG cho protein HA trimeric _ ELP……………………………………………………………… 77 Hình 3.16 Kết quả biểu hiện, tinh sạch và đánh giá hoạt tính sinh học protein HA trimeric……………................................................. 78 Hình 3.17 Kết quả Western blot đánh giá sự biểu hiện của kháng nguyên HA................................................................................................ 79 Hình 3.18 Kết quả tinh sạch HA trimeric-IgMFc bằng sắc ký ái lực............ 80 Hình.3.19 Đánh giá kết quả tinh sạch protein HA mono_ELP bằng SDS- PAGE và lai miễn dịch................................................................ 81 Hình.3.20 Đánh giá kết quả tinh sạch protein HA trimeric_ELP bằng SDS- PAGE và lai miễn dịch …………………………………………. 82 Hình.3.21 Kết quả kiểm tra khả năng hình thành oligomer của protein HA trimeric…….................................................................................. 84 Hình 3.22 Kết quả tổng hợp và đặc điểm hạt NDs......................................... 85 Hình 3.23 Kết quả tổng hợp và tính chất vật lý của HA trimeric- ND...................................................................................... 85 Hình 3.24 Kết quả sàng lọc tỷ lệ trộn HA trimeric và hạt ND đƣợc đánh giá bằng lai miễn dịch với kháng thể kháng cmyc........................ 87 Hình 3.25 Kết quả phản ứng gây ngƣng kết hồng HA trimeric- IgFMc…………………………………………………………… 88
xi Hình 3.26 Kết quả ngƣng kết hồng cầu Hemagglutinin HA.......................... 89 Hình 3.27 Sơ đồ gây đáp ứng miễn dịch trên chuột………………………... 91 Hình 3.28 Kết quả thì nghiệm gây đáp ứng miễn dịch trên chuột………….. 92 Hình 3.29 Đáp ứng kháng thể ở chuột đƣợc xác định bằng ELISA………... 93 .
1 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Virus cúm A/H7N9 là chủng virus cúm gia cầm đƣợc phát hiện tại Trung Quốc từ năm 2013. Cúm A/H7N9 gây ra là bệnh truyền nhiễm cấp tính có tốc độ lây lan nhanh với tỷ lệ gây chết cao trong đàn gia cầm bị bệnh (Gao và cs., 2013). Virus cúm A/H7N9 là một phân type trong nhóm virus cúm A thuộc họ Orthomyxoviridae. Trên bề mặt capsid của hạt virus có protein Hemagglutinin (HA) và Neuraminidase (NA) mang tính kháng nguyên tham gia quá trình đáp ứng miễn dịch. Kháng nguyên HA có 18 type (ký hiệu từ H1 đến H18) và kháng nguyên NA có 11 type (ký hiệu từ N1 đến N11). Kháng nguyên HA đƣợc mã hóa bởi phân đoạn 4 của hệ gen virus cúm A, có đặc tính kết hợp với thụ thể đặc hiệu trên bề mặt màng của tế bào nhiễm và phân đoạn 6 mã hóa cho neuraminidase (NA) là những protein nằm trên bề mặt có tính kháng nguyên và gây bệnh. HA có khả năng đột biến trong gen tạo nên sự khác biệt làm thay đổi tính kháng nguyên, đặc biệt là điểm cắt của enzym protease ở vị trí có sự glycosyl hóa đã đƣợc xác định bao gồm Asn30, Asn46, Asn249 trên tiểu phần HA1 và Asn421, Asn493 trên tiểu phần HA2. Cả 5 vị trí này đều có tính bảo thủ cao trên kháng nguyên H7 của các chủng virus H7N9 gây bệnh trên ngƣời và gia cầm, Gen HA gồm 2 đoạn là HA1 và HA2 nối với nhau bằng chuỗi oligopeptide, mã hóa cho gồm một dãy các amino acid là arginine và lysine (-RRRKK-), tạo nên điểm cắt của protease. Đây là vùng quyết định độc lực của virus hay tính gây bệnh của virus cúm. Phần HA1 và HA2 bộc lộ ra ngoài màng và có khả năng làm ngƣng kết hồng cầu và chịu trách nhiệm cho việc gắn kết virus vào thụ thể trên bề mặt tế bào chủ trong giai đoạn đầu tiên của quá trình xâm nhiễm (Svedda và cs., 1981). Trong đợt dịch cúm đầu tiên từ ngày 31/03/2013 có ba trƣờng hợp nhiễm virus cúm gia cầm A/H7N9 trên ngƣời đƣợc phát hiện và công bố tại Thƣợng Hải và An Huy, Trung Quốc. Chỉ trong một thời gian ngắn, tính đến ngày 09/06/2013 loại virus nguy hiểm này đã lây lan ra 11 tỉnh thành của Trung Quốc, gây ra 131 trƣờng hợp nhiễm bệnh, đa phần bị suy hô hấp nặng, trong đó 39 ngƣời đã tử vong (WHO, 2013).
2 Trong đợt dịch cúm A/H7N9 thứ 5 trên ngƣời tại Trung Quốc diễn ra từ 19/1/2017 đến 14/2/2017 đã khiến 36 ngƣời chết trên tổng số 304 ngƣời mắc bệnh (WHO, 2017). Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) nhận định đây là một tỷ lệ cao bất thƣờng cho một sự lây nhiễm mới và xác định H7N9 là chủng virus rất nguy hiểm đối với con ngƣời. Các nghiên cứu về hệ gen, xác định các vùng biến đổi của virus cúm A/H7N9 đã cho thấy virus A/H7N9 tỏ ra thích ứng nhanh hơn và có độc lực cao hơn với tế bào của loài có vú (ngƣời, heo...) so với các chủng virus cúm gia cầm khác. Cho đến nay chƣa có bằng chứng nào về việc virus cúm A/H7N9 lây truyền từ ngƣời sang ngƣời - yếu tố cơ bản để A/H7N9 có thể biến chuyển thành một đại dịch cúm. Tuy nhiên, vì sự lan truyền giữa ngƣời và ngƣời đã từng xảy ra với virus H7 (dịch H7N7 ở Hà Lan năm 2003) nên cần phải cảnh giác về khả năng lây truyền ngƣời- ngƣời của virus H7N9 hiện nay. Ở Việt Nam chƣa ghi nhận trƣờng hợp cúm A/H7N9 trên ngƣời cũng nhƣ trên gia cầm; tuy nhiên, nguy cơ xâm nhập, lan truyền và gây bùng phát dịch rất cao do Việt Nam có đƣờng biên giới trải dài với Trung Quốc. Vấn đề cấp bách hiện nay, ngoài việc ngăn chặn lây lan và triển khai các biện pháp phòng bệnh thì việc nghiên cứu chủ động sản xuất vacxin phòng bệnh hết sức quan trọng. Trong những năm gần đây một hƣớng mới đã đƣợc ứng dụng để phát triển các loại vacxin cúm khác nhau, trong đó có hƣớng nghiên cứu tạo vacxin thực vật. Hệ thống biểu hiện ở thực vật rất hữu dụng vì vacxin đƣợc tạo ra hứa hẹn sẽ có giá thành thấp hơn từ 10-20 lần so với phƣơng pháp truyền thống. Tuy nhiên, protein tái tổ hợp đƣợc tích luỹ trong cây trồng chuyển gen lại không cao và thiếu một phƣơng thức tinh sạch protein tái tổ hợp hiệu quả. Để khắc phục nhƣợc điểm này, hiện nay hệ thống biểu hiện tạm thời là phƣơng pháp hữu ích để sản xuất kháng nguyên tái tổ hợp ở thực vật. Phƣơng pháp này có ƣu điểm nhanh, hàm lƣợng protein tái tổ hợp cao, không bị ảnh hƣởng bởi vị trí gắn gen đích trong tế bào thực vật và có thể tiến hành biểu hiện trong các mô đã biệt hóa hoàn toàn nhƣ lá. Nhận thấy việc nghiên cứu biểu hiện các kháng nguyên của virus cúm A/H7N9 trong tế bào thực vật là rất cần thiết. Hơn nữa mô hình sản xuất kháng
3 nguyên tái tổ hợp bằng phƣơng pháp biểu hiện tạm thời ở thực vật có thể sản xuất vacxin với số lƣợng lớn và nhanh chóng (1-2 tháng) đáp ứng kịp thời khi dịch bệnh xảy ra. Việc kết hợp kháng nguyên tái tổ hợp với vật liệu nano nhằm sản xuất vacxin dạng nhƣ virus like particle để làm tăng hoạt tính kháng nguyên. Với cơ sở khoa học và ứng dụng nhƣ trên, chúng tôi đã lựa chọn đề tài “Nghiên cứu tạo kháng nguyên tái tổ hợp của virus gây bệnh cúm A/H7N9 bằng phƣơng pháp biểu hiện tạm thời trong cây thuốc lá (Nicotiana benthamiana) thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens”. 2. Mục tiêu nghiên cứu - Biểu hiện và xác định đƣợc đặc điểm cấu trúc của kháng nguyên HA và phức hệ kháng nguyên HA trimeric:ND (Nanodiamon) - Đánh giá đƣợc hoạt tính sinh học, khả năng kích thích đáp ứng miễn dịch trên động vật thí nghiệm của kháng nguyên tái tổ hợp HA trimeric và phức hệ HA trimeric:ND 3. Nội dung nghiên cứu Nội dung 1: Thu thập thông tin, tổng hợp gen mã hóa kháng nguyên và thiết kế vector biểu hiện mang gen mã hóa kháng nguyên HA. Nội dung 2: Nghiên cứu biểu hiện và tinh sạch kháng nguyên HA của virus H7N9 ở lá thuốc lá. Nội dung 3: Nghiên cứu tạo phức hệ và khả năng gây ngƣng kết hồng cầu của kháng nguyên HA và HA trimeric:ND (1:12). Nội dung 4: Nghiên cứu khả năng kích thích đáp ứng miễn dịch của kháng nguyên HA và phức hệ kháng nguyên HA trimeric:ND trên động vật thí nghiệm. 4. Những đóng góp mới của luận án - Đã thiết kế thành công 4 cấu trúc vector biểu hiện pCB301/HA mono_ELP pCB301/HA trimeric_ELP, pCB301/HA trimeric và pCB301/HA trimeric-IgMFc mang gen HA đƣợc tổng hợp nhân tạo từ gen HA của chủng virus cúm H7N9 và tạo chủng Agrobacterium mang vector tƣơng ứng. - Biểu hiện và tinh sạch thành công protein HA tái tổ hợp pCB301/HA mono_ELP, pCB301/HA trimeric_ELP, pCB301/HA trimeric và pCB301/HA trimeric-IgMFc trong cây thuốc lá bằng phƣơng pháp mITC và IMAC.
4 - Đã xác định đƣợc cấu trúc trimeric của kháng nguyên HA và khả năng gây ngƣng kết hồng cầu của protein HA với hiệu giá ngƣng kết của HA trimeric_ELP và HA trimeric bằng 2 HAU, HA trimeric:ND (1:12) bằng 1024 HAU với lƣợng 5 µg tại giếng đầu tiên. - Các kháng nguyên HA dạng HA trimeric và HAtrimeric:ND (1:12) đều gây đáp ứng miễn dịch ở chuột trong đó HA trimeric:ND (1:12) kích thích đáp ứng miễn dịch mạnh hơn HA trimeric. 5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án 5.1. Ý nghĩa khoa học Luận án cung cấp cơ sở khoa học quan trọng trong việc thiết kế các cấu trúc vector chuyển gen mang gen HA mono_ELP, HA trimeric_ELP, HA trimeric và HA trimeric-IgMFc mã hóa cho các kháng nguyên HA tái tổ hợp; biểu hiện kháng nguyên tái tổ hợp trên cây thuốc lá bằng phƣơng pháp biểu hiện tạm thời; tách chiết, tinh sạch và đánh giá khả năng kích thích đáp ứng miễn dịch dịch thể của các kháng nguyên tái tổ hợp này trên động vật thí nghiệm. Kết quả đề tài luận án là bằng chứng khoa học về tiềm năng của việc sản xuất, phát triển vacxin tiểu đơn vị phòng virus cúm trong thực vật. 5.2. Ý nghĩa thực tiễn Các cấu trúc vector chuyển gen thực vật mang gen HA mã hóa các kháng nguyên tái tổ hợp HA mono_ELP, HA trimeric_ELP, HA trimeric và HA trimeric- IgMFc của chủng virus cúm đang lƣu hành tại Trung Quốc và các chủng A. tumefaciens mang các vector này có thể đƣợc sử dụng để nghiên cứu biểu hiện, sản xuất và phát triển vacxin tiểu đơn vị phòng virus cúm. Quy trình biểu hiện gen HA trên lá cây thuốc lá bằng phƣơng pháp biểu hiện tạm thời với các điều kiện tối ƣu của đề tài luận án có thể ứng dụng để sản xuất các kháng nguyên tái tổ hợp HA mono_ELP, HA trimeric_ELP, HA trimeric và HA trimeric-IgMFc hoặc các protein tái tổ hợp khác. Kháng nguyên tái tổ hợp HA trimeric : ND đƣợc tạo ra trong đề tài luận án là ứng viên tiềm năng cho sản xuất vacxin tiểu đơn vị phòng bệnh cúm gia cầm ở Việt Nam.
5 Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Đặc điểm cấu trúc của virus cúm A/ H7N9 1.1.1. Nguồn gốc virus cúm A/H7N9 Sự thích ứng trên vật chủ ở động vật có vú của virus cúm A/HAxNAy chính là sự chuyển đổi thụ thể sialic acid thích ứng từ loài chim sang thích ứng gần hơn đối với ngƣời (Paulson và cs., 2013). Trong hai năm (2012 - 2013), một số chủng tái tổ hợp phân type HAxNAy đã đƣợc hình thành tạo nên các phân type gây nhiễm và gây bệnh trên ngƣời, đáng quan tâm nhất là H7N9 gây chết ngƣời phát hiện năm 2013 (Liu và cs., 2013; Yang và cs., 2013; Cui và cs., 2014) và H10N8 công bố cuối năm 2013 (To và cs., 2013; 2014; Chen và cs., 2014). Virus cúm A (H7N9) là một phân nhóm nhỏ của một nhóm lớn các virus cúm A mang gen kháng nguyên HA (H7), lƣu hành giữa các loài chim. Đã có nhiễm một số phân nhóm khác của virus cúm A mang gen H7 trên ngƣời, bao gồm các phân type H7N2, H7N3, H7N7 và đã đƣợc thông báo tại Australia, Canada, Italy, Mexico, Hà Lan, Vƣơng quốc Anh và Hoa Kỳ, tuy nhiên, mức độ biểu hiện và tầm quan trọng của sự truyền lây rất giới hạn. (http://www.who.int/influenza/human_animal_interface/latest_update_h7n9/en/i ndex.htm). Virus cúm A/H7N9 là chủng virus cúm gia cầm mới đƣợc phát hiện tại Trung Quốc. Ngay sau khi dịch cúm xảy ra, các nghiên cứu về virus cúm A/H7N9 đã đƣợc tiến hành nhằm thu thập dữ liệu, giải mã hệ gen, xác định các vùng biến đổi, từ đó tìm ra phƣơng thức để phòng và chống dịch bệnh. Mẫu virus cúm A/ H7N9 đƣợc lấy từ ba bệnh nhân nhiễm bệnh đầu tiên (kí hiệu A/Shanghai/1/2013, A /Shanghai/2/2013, và A/Anhui/1/2013) đã đƣợc giải mã và trình tự các vùng mã hóa của 8 phân đoạn gen virus đã đƣợc đăng trên cơ sở trình tự dữ liệu của tổ chức Sáng kiến toàn cầu về chia sẻ dữ liệu cúm (GISAID).
6 Trƣớc đây, hầu hết các ca nhiễm H7N7 ở ngƣời xảy ra do tiếp xúc chăn nuôi gia cầm bị dịch bệnh, biểu hiện triệu chứng đơn giản, chủ yếu là viêm kết mạc và viêm nhẹ đƣờng hô hấp trên, ngoại trừ một ca tử vong, đã xảy ra ở Hà Lan (Koopmans và cs., 2004). Dịch cúm A (H7N9) bắt đầu đƣợc ghi nhận tại Trung Quốc từ 3/2013 đến tháng 2/2018 có tới 5 đợt dịch, trong đó đợt dịch thứ 5 diễn ra từ tháng 10/2016 tới tháng 10/2017 là đợt dịch lớn nhất từ trƣớc tới nay cả về quy mô, số lƣợng ca mắc bệnh và tốc độ lây lan tạo thành đợt dịch thứ 5 với 541 trƣờng hợp mắc so với 135 ca nhiễm đƣợc báo cáo trong đợt dịch đầu tiên, 320 ca nhiễm đƣợc báo cáo trong vụ dịch thứ hai, 226 ca nhiễm ở vụ dịch thứ ba và 119 ca nhiễm ở vụ dịch thứ tƣ. Dịch đạt đỉnh cao vào tháng 2/2017 với khoảng 50-60 trƣờng hợp mắc mới/tuần, sau đó từ tháng 3 đến nay có xu hƣớng giảm dần với khoảng 18-34 trƣờng hợp mắc mới/tuần. Từ 3/2017 đến nay đã ghi nhận thêm 3 địa phƣơng thuộc khu vực Cam Túc, Tây Tạng và Thiểm Tây có trƣờng hợp bệnh mới. Nhƣ vậy trong đợt dịch thứ 5 đã ghi nhận các trƣờng hợp mắc cúm A/H7N9 tại 17 tỉnh tại Trung Quốc. Theo Tổ chức Y tế Thế giới, từ tháng 2/2013 đến tháng 1/2018, có tổng cộng 1.624 trƣờng hợp xác định mắc cúm H7N9 ở ngƣời trong đó có ít nhất 621 trƣờng hợp tử vong tại Trung Quốc. Hầu hết các trƣờng hợp nhiễm là do trực tiếp tiếp xúc với động vật hoặc với môi trƣờng nhiễm, đặc biệt là chợ động vật sống (Yu và cs., 2013). Tuy nhiên xu hƣớng thích ứng của virus cúm A/H7N9 trên tế bào niêm mạc phổi và thụ thể tiếp đón hemagglutinin H7 ngày càng cao, đây là mối lo sinh học của việc lan truyền giữa ngƣời và ngƣời (Knepper và cs., 2013; Dortmans và cs., 2013). 1.1.2. Đặc điểm cấu trúc virus cúm A/H7N9 Phân tích thành phần hoá học các hạt virus cúm A có chứa khoảng 0,8 - 1,1% RNA, 70-75% là protein, 20 - 24% lipid và 5 - 8% là carbohydrate (Murphy và Websters 1996). Dƣới kính hiển vi điện tử, hầu hết các hạt của virus (virion) có dạng hình cầu đƣờng kính từ 50 -100 nm. Một số ít có dạng hình sợi đƣờng kính 20 nm và dài từ 200-300nm. Hạt virus có cấu tạo đơn giản gồm vỏ (capsid), vỏ
7 bọc ngoài (envelope) và lõi chứa ARN. Vỏ virus với bản chất là protein có nguồn gốc từ màng tế bào nhiễm đã đƣợc đặc hiệu hóa để gắn protein màng của virus vào, bao gồm một số protein đƣợc glycosyl hoá (glycoprotein) và một số protein dạng trần không đƣợc glycosyl hoá (non-glycosylated protein). Protein bề mặt có cấu trúc từ glycoprotein, bao gồm protein gây ngƣng kết hồng cầu HA, protein enzym cắt thụ thể NA và protein đệm M (matrix). Lipid tập trung ở màng virus, chủ yếu là lipid có gốc photpho, số còn lại là cholesterol, glucolipid và một ít carbohydrate gồm các loại đƣờng galactose, mannose, ribose, fructose, glucosamin. Bên trong virus có cấu trúc phức tạp gồm protein capsid và các sợi ARN nối với nhau thành các nucleocapsid có cấu trúc đối xứng xoắn. Vỏ của virus đƣợc cấu tạo bởi 2 lớp lipid, trên bề mặt có khoảng 500 “gai mấu” nhô ra và phân bố dày đặc, mỗi gai mấu có độ dài khoảng từ 10 -14 nm có đƣờng kính 4-6 nm, đó là những kháng nguyên bề mặt của virus. bản chất cấu tạo là glycoprotein gồm : HA, NA, MA( matrix) và các dấu ấn khác của virus ( Bender và cs., 1999; Zhou và cs., 2007). Có sự phân bố không đồng đều giữa các phân tử HA và NA (tỉ lệ khoảng 4HA/1NA), đây là hai loại kháng nguyên có vai trò quan trọng trong quá trình xâm nhiễm của virus ở tế bào cảm nhiễm (Murphy và Webster, 1996; Wagner và cs., 2002). Hệ gen virus cúm A là ARN sợi đơn âm, gồm 8 phân đoạn gen riêng biệt (Hình 1.1A), mã hoá cho 11 protein khác nhau của virus, các phân đoạn đƣợc sắp xếp theo trật tự: PB2, PB1 (PB1 và PB1-F2), PA, HA, NP, NA, M (M1 và M2), NS (NS1 và NS2) (Murphy và Webster, 1996; Rabadan và cs., 2006). Mỗi phân đoạn ARN của virus cúm A có cấu trúc xoắn bậc 2 α đối xứng dài 50 -100 nm, đƣờng kính 9 -10 nm, đƣợc bao bọc bởi nucleoprotein (NP) với bản chất là lipoprotein, tạo thành cấu trúc ribonucleoprotein (RNP) (Hình 1.1B).