Luận văn : BƯỚC ĐẦU XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG CÁC SẢN PHẨM BIẾN ĐỔI GEN BẰNG PHƯƠNG PHÁP REAL-TIME PCR part 3

Chia sẻ: Pkjd Opiuj | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:13

Thêm vào BST

Báo xấu

232
lượt xem 52
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Tác động có hại Môi trƣờng Sự chuyển gen từ các thực vật biến đổi gen cho các loài thực vật tự nhiên khác gây ra các biến đổi di truyền bất thường trên các loài thực vật này [34]. Tác động xấu đến các loài không mục tiêu: các loài thực vật chuyển gen kháng sâu hại có thể tác động xấu đến các loài sinh vật và côn trùng có lợi khác [34]. Gia tăng việc sử dụng thuốc hóa học trong nông nghiệp: Trái với mong đợi, báo cáo năm 1999 tại Mỹ cho thấy, nông dân...

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn : BƯỚC ĐẦU XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG CÁC SẢN PHẨM BIẾN ĐỔI GEN BẰNG PHƯƠNG PHÁP REAL-TIME PCR part 3

Tác động có hại Môi trƣờng Sự chuyển gen từ các thực vật biến đổi gen cho các loài thực vật tự nhiên khác gây ra các biến đổi di truyền bất thường trên các loài thực vật này [34]. Tác động xấu đến các loài không mục tiêu: các loài thực vật chuyển gen kháng sâu hại có thể tác động xấu đến các loài sinh vật và côn trùng có lợi khác [34]. Gia tăng việc sử dụng thuốc hóa học trong nông nghiệp: Trái với mong đợi, báo cáo năm 1999 tại Mỹ cho thấy, nông dân trồng đậu nành biến đổi gen Roundup Ready gia tăng sử dụng thuốc hóa học từ 2 đến 5 lần so với nông dân trồng đậu nành thông thường. Trong năm 2001-2002, lượng thuốc hóa học sử dụng đã tăng 70 tỷ pound tại Mỹ. Điều này gây ra lo ngại về dư lượng thuốc hóa học trong các sản phẩm nông nghiệp [12]. Sự hình thành “siêu cỏ dại”: các nghiên cứu cho thấy, các gen kháng thuốc diệt cỏ có thể phóng thích khỏi cây trồng biến đổi gen và chuyển vào các loại cây trồng, cỏ dại khác tạo nên một loại “siêu cỏ dại” có khả năng kháng một hay nhiều loại thuốc diệt cỏ. Điều này sẽ gây ra rất nhiều khó khăn trong việc phòng trừ cỏ dại trong thời gian tới [34]. Sự hình thành “siêu côn trùng” kháng lại các tác nhân biến đổi gen gây độc được tạo ra (Bt). Điều này có thể gây ra rất nhiều khó khăn trong việc phòng trừ sâu hại [23][34]. Sức khoẻ ngƣời tiêu dùng Các tác nhân dị ứng mới: Công nghệ gen cho phép biểu hiện các gen chuyển nạp bắt nguồn từ nhiều loại sinh vật khác loài: virus,vi khuẩn. Các loại protein mới này có thể gây ra các triệu chứng dị ứng trên con người. Dư lượng thuốc bảo vệ thực vật: Việc tạo ra cây trồng kháng thuốc trừ cỏ cho phép sử dụng thuốc trừ cỏ trên cây đang trong giai đoạn phát triển. Điều này vốn bị cấm trước đây do người tiêu dùng có thể bị ảnh hưởng bởi d ư lượng thuốc trừ cỏ trong thực phẩm họ sử dụng. Điều không thể phủ nhận là tỷ lệ hồi chuyển từ dạng thuốc trừ cỏ bị phân hủy về dạng độc nguyên thủy đã lên đến 10% trong hệ tiêu hóa. 13
Các gen kháng kháng sinh làm marker trong thực phẩm biến đổi gen có thể chuyển nạp vào vi khuẩn đường ruột gây ra những vấn đề nghiêm trọng với các tác nhân gây bệnh kháng kháng sinh. Tạo ra các loại chất độc mới do các tương tác không kiểm soát được giữa các sản phẩm biến đổi gen và các phần tử khác [24][34]. Các nghiên cứu và dẫn chứng cụ thể Cà chua Flavr Savr: Gây ra những thương tổn cho chuột (7 trong số 40 con - chuột thí nghiệm đã chết sau 15 ngày). Chúng đã bị cấm bán trên thị trường. Khoai tây biến đổi gen: thí nghiệm của Dr Arpad Pusztai (Viện nghiên cứu - Rowett) cho thấy thương tổn trong hệ tiêu hóa chuột khi ăn khoai tây biến đổi gen chứa gen sản xuất lectin. Các con chuột này không bị ảnh hưởng khi chỉ ăn khoai tây không biến đổi gen hay ăn lectin. Bắp biến đổi gen (Chardon LL): Trong nghiên cứu của công ty, số gà chết - khi ăn bắp này gấp đôi số gà chết khi ăn thức ăn không biến đổi gen (10 con so với 5 con). Nghiên cứu của Đại học Newcastle về chuyển nạp gen: Kết quả cho thấy khi - ăn thực phẩm chứa đậu nành biến đổi gen có hiện tượng gen chuyển nạp thoát ra và chuyển nạp vào vi khuẩn đường ruột. L-tryptophan: Thực phẩm biến đổi gen bổ sung chất này đã gây ra 37 trường - hợp tử vong và ít nhất 1500 trường hợp tàn tật tại Mỹ do một chất độc không xác định được. Công ty sản xuất đã bồi thường 2 tỷ USD cho trên 2000 nạn nhân [34]. Dƣ luận xã hội đối với cây trồng biến đổi gen Bên cạnh những ý kiến tranh cãi hết sức gay gắt của các nhà khoa học, dư luận xã hội về vấn đề cây trồng biến đổi gen cũng hết sức phức tạp do lương thực, thực phẩm là một vấn đề có tác động to lớn đối với đời sống con người. Có nhiều ý kiến ủng hộ nhưng cũng không thiếu những ý kiến phản đối hết sức gay gắt. 14
Hình 2.8: Biểu tình phản đối GMO tại châu Âu [27] Hiện nay, các Tổ chức bảo vệ môi trường (Greenpeace, Friends of the Earth…) và người dân tại nhiều quốc gia trên thế giới đã phản đối hết sức gay gắt cây trồng biến đổi gen và các công ty nông nghiệp. Sự phản đối này bắt nguồn từ các nguyên nhân sau: Các tác động xấu tiềm năng do thực vật biến đổi gen gây ra cho môi trường - và sức khoẻ con người. Các công ty thiếu trách nhiệm trong việc nghiên cứu những ảnh hưởng của - chúng lên con người. Cây trồng biến đổi gen sẽ gây ra tình trạng lệ thuộc vào hạt giống và thuốc - hóa học của các công ty nông nghiệp [27]. Tại châu Âu, những phản đối này đã dẫn đến việc thành lập những khu vực „Không GMO„ (GMO free zone) tại nhiều quốc gia châu Âu (22 khu vực vào năm 2003) và các công ty thực phẩm tại châu Âu đã tuyên bố không sử dụng sản phẩm biến đổi gen làm nguyên liệu thực phẩm. Thái độ của người dân châu Âu cũng được thể hiện rõ qua cuộc thăm dò dư luận do Eurobarometer thực hiện vào tháng 12 năm 2001: 94,6 % muốn có quyền lựa chọn sản phẩm truyền thống hay sản phẩm biến - đổi gen. 85,9 % muốn được thông tin nhiều hơn trước khi sử dụng GMO. - 70,9 % không muốn sử dụng thực phẩm biến đổi gen. - Trước đó, một nghiên cứu vào năm 1996 cũng cho thấy: 74% công dân châu Âu ủng hộ việc dán nhãn thực phẩm biến đổi gen. - 15
53% tin rằng các biện pháp quản lý không đủ để bảo vệ người tiêu dùng - khỏi các rủi ro do thực phẩm biến đổi gen mang lại. Các kết quả trên cho thấy người dân tại châu Âu và nhiều quốc gia trên t hế giới đòi hỏi chính phủ phải có các biện pháp quản lý thích hợp các sản phẩm biến đổi gen vì lợi ích của cộng đồng [27][28]. 6. Vấn đề quản lý sản phẩm biến đổi gen trên thế giới Hiện nay, việc quản lý các sinh vật biến đổi gen trên toàn cầu được qui định bằng Nghị định thư An toàn sinh học Cartagena (Liên Hiệp Quốc ban hành và có hiệu lực từ ngày 11/9/2003). Đây là văn bản đầu tiên trên thế giới xác định các sinh vật biến đổi gen là khác biệt so với các sinh vật thông thường khác, vì vậy cần có các biện ph áp quản lý riêng biệt. Một trong những điểm chính của Nghị định là việc quản lý sự lưu hành của sinh vật biến đổi gen trên thế giới, qua đó kiểm soát việc phóng thích vào môi trường và thương mại hóa các sinh vật đặc biệt này. Dù còn nhiều hạn chế, đây là một tiến bộ của thế giới trong việc đạt sự đồng thuận về vấn đề sinh vật biến đổi gen [26]. Bên cạnh Nghị định thư, các nước còn ban hành các văn bản quản lý vấn đề sinh vật biến đổi gen. Hiện nay, qui định của các quốc gia trên thế giới rất đa dạng và khác biệt tùy theo tình hình thực tế tại mỗi nước. Hầu hết các nước đều ban hành những quy định cụ thể nhằm quản lý việc xuất nhập khẩu và thương mại hóa các sản phẩm biến đổi gen. Một điểm chính trong các quy định là yêu cầu dán nhãn các sản phẩm biến đổi gen được thương mại hóa. Bên cạnh việc quản lý, quy định này còn giúp người tiêu dùng phân biệt được sản phẩm biến đổi gen với các sản phẩm truyền thống không biến đổi gen khác, qua đó cho phép họ lựa chọn việc sử dụng sản phẩm nào là thích hợp nhất. Trong việc dán nhãn, điều quan trọng nhất là việc xác định mức ngưỡng. Mức ngưỡng này biểu thị sự hiện diện của thành phần biến đổi gen (do ngẫu nhiên hay không thể loại bỏ được) trong một loại thực phẩm hay thức ăn được thương mại hóa. Nếu thành phần biến đổi gen này vượt quá mức ngưỡng cho phép, sản phẩm đó phải được dán nhãn. Tuy nhiên, mức ngưỡng quy định và yêu cầu dán nhãn rất khác biệt ở các nước. Ta có thể điểm qua một số quốc gia sau đây: 16
Bảng 2.2: Quy định một số quốc gia trên thế giới về cây trồng biến đổi gen [10] Mức ngƣỡng cho sự hiện diện Qui định về Quốc gia dán nhãn vật liệu chuyển gen trong thực phẩm (%) Bắt buộc Châu Âu 0,9 Úc & New Bắt buộc 1 Zealand Bắt buộc Nhật Bản 5 Bắt buộc Hàn Quốc 3 Không bắt buộc Không có Mỹ Không bắt buộc 5 Canada Không bắt buộc Không có Argentina Nhìn vào bảng thống kê trên ta thấy, ngoại trừ 3 quốc gia Mỹ, Canada và Argentina là không bắt buộc dán nhãn sản phẩm biến đổi gen cũng như không quy định mức ngưỡng cụ thể, hầu hết các quốc gia trên thế giới đều có quy định cụ thể về mức ngưỡng và việc dán nhãn bắt buộc (còn có Brazil, Trung Quốc, Ấn Độ, Nga, Phillipines, Ả rập Saudi, Đài Loan, Thái Lan…). Trong đó, khắt khe nhất là châu Âu [10]. Quy định tại châu Âu [33]: Châu Âu là nơi đã ban hành những quy định sớm nhất và chặt chẽ nhất về vấn đề sinh vật biến đổi gen (từ năm 1990) nhằm bảo vệ người tiêu dùng và môi trường. Hiện nay, các văn bản quy định hiện hành bao gồm: Chỉ thị 2001/18/EC (Directive 2001/18/EC) - Chỉ thị 98/81/EC (Council Directive 98/81/EC) - Quy định 258/97 (EC) (Regulation (EC) No 258/97) - Quy định 1829/2003 (EC) (Regulation (EC) 1829/2003) - Quy định 1830/2003 (EC) (Regulation (EC) 1830/2003) - 17
Các văn bản này quản lý và quy định việc thử nghiệm và cấp phép thương mại các sinh vật biến đổi gen rất chặt chẽ, đặc biệt những mức ngưỡng mới, nhỏ hơn cho việc dán nhãn đã được qui định trong thời gian gần đây. Mức ngưỡng 1% cũ cho tỷ lệ gen chuyển nạp của những sản phẩm GMO đã được cấp phép đã giảm xuống ở mức 0,9%. Thêm vào đó, đối với những sản phẩm biến đổi gen chuẩn bị được cấp phép, tỷ lệ gen chuyển nạp được qui định là 0,5%. Cộng đồng châu Âu xác định người tiêu dùng có quyền được thông tin và việc dán nhãn như là một công cụ để có sự lựa chọn chính xác. Từ năm 1997, việc dán nhãn để thông báo sự hiện diện của GMO hay thực phẩm biến đổi gen là bắt buộc. Vì những lý do đó, châu Âu xác định sự cần thiết phải phát triển các phương pháp phân tích. Chúng không chỉ phát hiện sự hiện diện có thể xảy ra của GMO trong thực phẩm mà còn giúp xác định một sản phẩm biến đổi gen đặc biệt và định lượng hàm lượng của GMO trong những thành phần thực phẩm và thức ăn khác nhau. Nguyên tắc định lƣợng dựa trên DNA Theo quy định châu Âu, những sản phẩm được phát hiện có thành phần biến đổi gen sẽ phải trải qua bước định lượng để xác định tỷ lệ phần trăm thành phần biến đổi gen hiện diện trong đó. Tỷ lệ phần trăm được tính bằng cách chia số lượng trình tự đặc trưng của GMO cho số lượng một gen đặc trưng của loài thực vật đó (ví dụ: gen lectin ở đậu nành; gen invertase, zein ở bắp). Công thức này có thể biểu diễn như sau: GMO(%)= (số lượng trình tự GMO/số lượng gen đối chiếu) x 100 Việc dán nhãn không bắt buộc đối với những sản phẩm có chứa nguyên liệu từ GMO chiếm tỷ lệ không hơn 0,9% thành phần nguyên liệu đó. Tất cả các thành phần (bột, dầu, bơ…) bắt nguồn từ một loài (ví dụ: bắp, đậu nành…) được gộp lại và xem là một thành phần đơn [42]. Ví dụ, hình 2.9 không yêu cầu phải dán nhãn do tỷ lệ bắp chuyển gen chỉ chiếm 0,6% trên tổng thành phần bắp, tương tự như đậu nành. Tuy nhiên, trong hình 2.10 ta thấy tổng tỷ lệ phần trăm 2 loại bắp chuyển gen là Bt11 và Bt 176 là 0,6%+0,6% =1,2% lớn hơn mức ngưỡng 0,9%. Vì vậy loại thực phẩm này bắt buộc phải dán nhãn. 18
Hình 2.9: Không yêu cầu dán nhãn [42] Hình 2.10: Bắt buộc phải dán nhãn [42] Quy trình xét nghiệm sản phẩm biến đổi gen tại châu Âu Quá trình sàng lọc sản phẩm biến đổi gen Mục tiêu của quá trình này là phát hiện định tính sản phẩm biến đổi gen trong các loại nông sản, thực phẩm khác nhau. Các sản phẩm được phát hiện dương tính sẽ trải qua quá trình định lượng, các sản phẩm âm tính sẽ bị loại bỏ. Quá trình này dựa trên độ nhạy của phản ứng PCR để phát hiện tất cả các thành phần biến đổi gen trong mẫu thí nghiệm. Trong số này, promoter 35S và terminator nos là hai đối tượng được kiểm tra nhiều nhất do chúng hiện diện phần lớn trong các sản phẩm biến đổi gen [31][32][37]. Quá trình định lƣợng sản phẩm biến đổi gen Quá trình định lượng nhằm xác định chính xác tỷ lệ phần trăm chuyển gen của một mẫu sản phẩm, đây là cơ sở cho việc áp dụng các quy định dán nhãn cho mẫu sản phẩm. Các đối tượng được định lượng có thể là p35S, tnos hay chính xác gen chuyển 19
nạp. Việc định lượng p35S và tnos trong các mẫu sản phẩm hỗn hợp nhiều thành phần có thể không chính xác do chúng hiện diện trong rất nhiều sản phẩm biến đổi gen khác nhau, do đó kết quả định lượng chỉ là kết quả tổng. Vì vậy, việc định lượng thường được tiến hành trên những đối tượng riêng biệt cho mẫu sản phẩm đó, như: gen chuyển nạp, trình tự nối giữa promoter và gen chuyển nạp. Tại châu Âu, gen chuyển nạp đã đăng ký và chưa đăng ký được áp dụng 2 mức ngưỡng khác nhau (0,9 % và 0,5%) [37][42]. Hình 2.11: Quy trình kiểm soát GMO tại châu Âu [13] Như vậy, nhìn trên Hình 2.11 ta thấy quy trình quản lý và kiểm tra này được thực hiện khá hoàn chỉnh và chặt chẽ từ khâu đầu đến khâu cuối, áp dụng cho tất cả các loại thực phẩm và thức ăn được sản xuất và xuất nhập khẩu tại châu Âu (ở đây chỉ là ví dụ ở bắp và đậu nành, hai loại nông sản chuyển gen chính). Điều này cũng đặt ra những thách thức và rào cản đối với nông sản của các nước khi muốn tham gia vào thị 20
trường rộng lớn này. Đồng thời, xu hướng quản lý chặt chẽ các sản phẩm biến đổi gen ngày càng được chú trọng trên thế giới. Đây là một vấn đề mà các q uốc gia xuất khẩu nông sản chính, trong đó có Việt Nam cần phải quan tâm. 7. Tình hình Việt Nam Nghiên cứu và phát triển sinh vật biến đổi gen Là một phần quan trọng trong chiến lược phát triển công nghệ sinh học của nước ta, chính phủ đã đầu tư khá lớn (1,5-2 triệu USD hàng năm) cho việc nghiên cứu phát triển các giống cây trồng biến đổi gen. Các cơ quan tham gia nghiên cứu và phát triển có thể kể đến là: Viện Công nghệ sinh học, Viện Di truyền nông nghiệp, Viện lúa đồng bằng sông Cửu Long. Các giống cây trồng đã được quan tâm nghiên cứu có thể kể đến như: gạo, bắp, đu đủ, bông vải, hoa và một số cây lấy gỗ khác. Với sự đầu tư lớn và tập trung nghiên cứu, nước ta đã đạt được một số thành quả nhất định trong chuyển gen: gạo, bắp mang gen Bt, đu đủ kháng virus. Mặc dù các thành tựu còn khá khiêm tốn, nhưng hứa hẹn khả năng ứng dụng to lớn trong tương lai [38]. Vấn đề thƣơng mại hóa và kiểm soát sinh vật biến đổi gen Tại nước ta chính thức thì chưa có một loại cây trồng biến đổi gen nào được thương mại hóa. Tuy nhiên, các giống nông sản được trồng hiện nay như: bắp, đậu nành, bông vải, đa phần là các giống nước ngoài. Hầu hết chúng đều có năng suất cao, chất lượng tốt nhưng chúng cũng mang một số tính trạng nghi ngờ là chuyển gen như: kháng thuốc diệt cỏ, hạt giống không sử dụng được cho vụ sau. Vấn đề là do chưa có một văn bản pháp luật kiểm soát chính thức nên vấn đề quản lý gặp rất nhiều khó khăn. Mặc khác, do không có sự thông tin đầy đủ dẫn đến hiện tượng người nông dân trồng tràn lan các giống nông sản gây ra tình trạng lẫn lộn giữa các giống chuyển gen và không chuyển gen. Đây là vấn đề nghiêm trọng, có thể gây ra các tác hại không lường được đối với môi trường và sức khỏe người tiêu dùng khi ta sử dụng các giống này. Đồng thời, việc thiếu một văn bản pháp lý hoàn chỉnh cũng gây ra không ít khó khăn khi ta muốn xuất khẩu nông sản sang các nước khác, đặc biệt là thị trường châu Âu, vốn đòi hỏi rất khắt khe về vấn đề này. 21
Nhận thức được điều đó, nước ta đã tích cực hợp tác với quốc tế trong vấn đề an toàn sinh học và xây dựng bộ luật riêng ở Việt Nam. Vào tháng 2/2002, nước ta là một trong 10 nước tham gia vào dự án: “Xây dựng năng lực an toàn sinh học cho các giống cây trồng biến đổi di truyền (GM) tại châu Á” do chính phủ Nhật Bản tài trợ chính thông qua tổ chức Lương Nông Liên Hiệp Quốc (FAO). Đồng thời, vào năm 2003, nước ta cũng đã chính thức tham gia vào Nghị định thư An toàn sinh học Cartagena. Từ năm 1999, nước ta cũng đã bắt đầu xây dựng quy chế nhằm kiểm soát, quản lý cây trồng biến đổi gen. Tuy nhiên, đến năm 2004, quy chế này vẫn chưa hoàn thành. Bên cạnh đó, nhằm phục vụ cho nhu cầu kiểm tra các sản phẩm biến đổi gen sản xuất và xuất khẩu, một số trung tâm nghiên cứu cũng đã trang bị các loại máy móc hiện đại (Real-time PCR) phục vụ cho việc định lượng GMO, như: Trung tâm kỹ thuật tiêu chuẩn đo lường chất lượng 3 (Quatest3), Trung tâm dịch vụ phân tích thí nghiệm (số 2, Nguyễn Văn Thủ), ĐH Khoa Học Tự Nhiên Tp Hồ Chí Minh, ĐH Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh. Điều này cho thấy nhu cầu phát hiện và định lượng GMO đã xuất hiện ở nước ta xuất phát từ yêu cầu khắt khe của các đối tác nước ngoài trong việc nhập khẩu nông sản Việt Nam sản xuất. Tình hình đó đòi hỏi việc tập trung nghiên cứu và phát triển các phương pháp xét nghiệm theo tiêu chuẩn quốc tế. Vì vậy, Khóa luận tốt nghiệp này xuất phát từ yêu cầu đó [2][5][6]. 8. Các phƣơng pháp định lƣợng sản phẩm chuyển gen Việc xác định mức ngưỡng cho các sản phẩm biến đổi gen đặt ra yêu cầu xây dựng các phương pháp định lượng thật chính xác làm cơ sở cho việc dán nhãn các sản phẩm này. Hiện nay, các phương pháp này được chia thành 2 nhóm sau: Nhóm 1: Phương pháp dựa trên việc khuếch đại nucleotide (PCR-based method) - Quantitative competitive PCR (QC-PCR) - Real-time PCR Nhóm 2: Phương pháp dựa trên protein (Protein-based method) Kĩ thuật ELISA - 22
Phƣơng pháp ELISA Kỹ thuật này sử dụng một kháng thể để phát hiện các protein mục tiêu. Protein được liên kết chặt chẽ với một tấm plastic. Kháng nguyên liên kết với kháng thể và tạo thành một phức hợp ổn định, có thể được hình dung là liên kết với một kháng thể thứ hai với một enzyme. Thuận lợi của phương pháp này là có khả năng phân tích dựa vào đường chuẩn [24]. Quantitative competitive PCR (QC-PCR) [42] Đây là kỹ thuật căn bản dựa trên sự đồng khuếch đại gen mục tiêu và một mẫu thứ hai – tác nhân cạnh tranh. Sản phẩm khuếch đại sẽ có cường độ phát quang tương ứng với số lượng DNA được khuếch đại và chúng sẽ xuất hiện hai dãy khác nhau trên gel agarose với cường độ khác nhau. Vì thế, các dãy thu được có thể xác định được s ố lượng ban đầu của DNA mục tiêu. Phương pháp này có khả năng phát hiện một cách đơn giản và bán định lượng được sản phẩm biến đổi gen trong thực phẩm [42]. Hình 2.12 : QC-PCR Tuy vậy, hai phương pháp này đều có ưu khuyết điểm riêng. Kỹ thuật ELISA có thể cho phép định lượng sự hiện diện sản phẩm biến đổi gen với tỷ lệ từ 0,3% đến 5%, tuy nhiên khuyết điểm lớn nhất của nó là kĩ thuật này chỉ áp dụng được cho các mẫu sản phẩm thô, chưa chế biến do protein có thể bị biến tính ở nhiệt độ cao. Nghiên cứu cho thấy kĩ thuật này chỉ có hiệu quả khi mẫu sản phẩm chế biến ở nhiệt độ nhỏ hơn 65oC trong thời gian dưới 60 phút, đây là giới hạn giữ cho protein không bị biến tính. Tuy nhiên, đối tượng chính của việc định lượng lại là các sản phẩm thực phẩm và thức ăn đã chế biến. Hầu hết chúng đều trải qua quá trình chế biến với nhiệt độ cao trong thời gian khá dài (đặc biệt là các sản phẩm tinh luyện) nhằm diệt khuẩn và giữ chất lượng sản phẩm. Chính điều này đã hạn chế khá lớn phạm vi áp dụng của kĩ thuật ELISA. Đồng thời, các nghiên cứu cho thấy DNA có độ bền vững cao, có thể tồn tại 23
qua quá trình chế biến khắc nghiệt, giúp cho việc định lượng chúng. Trong các kĩ thuật định lượng bằng PCR, kĩ thuật QC-PCR xuất hiện từ sớm, tuy nhiên chúng mang nhiều khuyết điểm như độ chính xác không cao, khó khăn trong thiết kế. Trong khi đó, kĩ thuật Real-time PCR với các ưu điểm là độ chính xác cao, có thể xác định sự hiện diện GMO trong thực phẩm ở tỷ lệ thấp, đồng thời kĩ thuật này được tiến hành khá đơn giản, trong thời gian ngắn. Những ưu điểm này giúp Real-time PCR ngày càng được ứng dụng rộng rãi trên thế giới [42]. Nguyên tắc kĩ thuật Real-time PCR Real-Time PCR được xem là một trong những kỹ thuật cho phép định lượng chính xác nhất số lượng trình tự DNA trong một mẫu thí nghiệm. Khác với việc định lượng khi quá trình khuếch đại đã hoàn tất, kỹ thuật này cho phép kiểm soát và định lượng số lượng DNA ngay khi phản ứng đang xảy ra (đây là ý nghĩa của từ ”Real - Time”). Trong kỹ thuật này, ở mỗi chu kỳ, lượng DNA được khuếch đại sẽ phát ra một lượng tín hiệu huỳnh quang nhất định. Nói cách khác, lượng tín hiệu huỳnh quang sẽ tăng tỷ lệ thuận với mỗi chu kỳ khuếch đại thành công của phản ứng Real -Time PCR. Như vậy, bằng cách ghi nhận lượng tín hiệu huỳnh quang phát ra sau mỗi c hu kỳ, ta có thể kiểm soát phản ứng PCR ngay trong giai đoạn khuếch đại tuyến tính của chúng. Và sự gia tăng đầu tiên của tín hiệu huỳnh quang sẽ tương ứng với lượng DNA ban đầu của mẫu. Hiệu quả của kỹ thuật Real-Time PCR dựa trên cả hóa chất dùng để định lượng và kiểm soát phản ứng khuếch đại và công cụ để phát hiện các tín hiệu huỳnh quang [42]. Hóa chất định lƣợng Có nhiều loại hóa chất được sử dụng trong phản ứng Real-Time PCR cho việc định lượng DNA. Chúng có thể chia thành 2 loại chính: Thuốc nhuộm xen giữa DNA: ethidium bromide, SYBR Green I. - Mẫu dò lai: Taqman, Fluorescence Resonance Energy Transfer, Molecular - Beacons, Scorpions và Taqman Minor Groove Binder. 24
SYBR Green I Hình 2.13: Thuốc nhuộm SYBR Green I [43][45] Thuốc nhuộm SYBR Green I gắn với DNA mạch đôi, mà không gắn với DNA mạch đơn. Kết quả là tín hiệu huỳnh quang (bước sóng kích thích khoảng 488 nm và 254 nm; bước sóng phát quang 560 nm) được gia tăng rất nhiều (khoảng 800 đến 1000 lần). Khi phản ứng PCR bắt đầu, sự gia tăng số lượng trình tự DNA mới được tổng hợp sẽ làm tăng lượng tín hiệu huỳnh quang phát ra. Một điểm hạn chế của việc định lượng bằng SYBR Green I là hóa chất này liên kết không đặc hiệu với DNA mạch đôi. Vì vậy, mọi trình tự DNA mạch đôi trong phản ứng đều được địn h lượng, cho dù đó là sản phẩm PCR không đặc hiệu hay primer-dimer. Để giải quyết vấn đề này, việc phân tích một đường cong nhiệt độ nóng chảy cần được thực hiện. Khi chu kỳ cuối kết thúc, sản phẩm khuếch đại được nung biến tính thành mạch đơn từ từ và tín hiệu huỳnh quang được thu nhận. Do mỗi chuỗi DNA mạch đôi đều có một nhiệt độ nóng chảy khác nhau, ta có thể xác định các thành phần có nhiệt độ nóng chảy khác nhau trong phản ứng và do đó, có thể loại bỏ các kết quả không đặc hiệu khi định lượng [42]. Mẫu dò phân hủy (Taqman probe) Vấn đề về sự đặc hiệu của phản ứng định lượng đã được giải quyết bằng cách sử dụng các mẫu dò có trình tự đặc hiệu gắn với chất phát quang được thiết kế bên trong cặp mồi của phản ứng PCR. Quá trình liên kết và phân hủy của các mẫu dò này 25