ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
----------
Lê Thùy Ngân
ĐÁNH GIÁ HÀM LƯỢNG CROCIN VÀ MỘT SỐ CHỈ TIÊU
AN TOÀN THỰC PHẨM CỦA DỊCH CHIẾT TỪ
HẠT DÀNH DÀNH (GARDENIA JASMINOIDES J. ELLIS)
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
Hà Nội – 2018
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
----------
Lê Thùy Ngân
ĐÁNH GIÁ HÀM LƯỢNG CROCIN VÀ MỘT SỐ CHỈ TIÊU
AN TOÀN THỰC PHẨM CỦA DỊCH CHIẾT TỪ
HẠT DÀNH DÀNH (Gardennia jasminoides J. Ellis)
Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60 42 30
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. Phạm Thị Lương Hằng
PGS.TS. Nguyễn Lai Thành
Hà Nội – 2018
LỜI CẢM ƠN
Để có thể hoàn thành đề tài luận văn thạc sĩ một cách hoàn chỉnh, bên cạnh
sự nỗ lực cố gắng của bản thân còn có sự hướng dẫn nhiệt tình của quý thầy cô,
cũng như sự động viên ủng hộ của gia đình và bạn bè trong suốt thời gian học tập
nghiên cứu và thực hiện luận văn thạc sĩ.
Tôi xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn đến TS. Phạm Thị Lương Hằng, PGS.
TS. Nguyễn Lai Thành người đã hết lòng giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho
tôi hoàn thành luận văn này. Bên cạnh đó, tôi xin gửi lời cảm ơn đến ThS. Bùi Thị
Vân Khánh và bạn Kiều Trung Kiên đã nhiệt tình hỗ trợ tôi trong quá trình thực
hiện các thí nghiệm của đề tài luận văn. Tôi xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn đến
toàn thể quý thầy cô trong khoa Sinh học và khoa sau đại học trường Đại học Khoa
học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã tận tình truyền đạt những kiến thức quý
báu cũng như tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong suốt quá trình học tập
nghiên cứu và cho đến khi thực hiện đề tài luận văn.
Tôi cũng xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn đến các cán bộ, học viên, sinh
viên của Phòng Thí nghiệm trọng điểm công nghệ Enzym và protein, những người
đã giúp đỡ tôi rất nhiều để thực hiện luận văn này.
Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn đến gia đình, các anh chị và bạn bè đã
hỗ trợ cho tôi rất nhiều trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và thực hiện đề tài
luận văn thạc sĩ một cách hoàn chỉnh.
Hà Nội, ngày 2 tháng 11 năm 2018
Học viên
Lê Thùy Ngân
BẢNG CHỮ VIẾT TẮT
Kí hiệu Tên Tiếng Anh Tên Tiếng Việt
DPPH 1,1- diphenyl-1-picrylhydrazyl 1,1- diphenyl-1-picrylhydrazyl
High-performance liquid HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao chromatography
The half maximal inhibitory Nồng độ ức chế 50% đối tượng thử IC50 concentration nghiệm
Liquid chromatography-mass LC-MS Sắc ký lỏng kết hợp khối phổ spectrometry
Nồng độ gây chết 50% đối tượng Lethal concentration 50% LC50 thử nghiệm
Liều gây chết 50% đối tượng thử Lethal dose 50% LD50 nghiệm
Organization for Economic Co- Tổ chức Hợp tác và Phát triển Kinh OECD operation and Developme tế
Tia cực tím UV Ultraviolet
Methanol MeOH Methanol
Ethanol EtOH Ethanol
DANH MỤC HÌNH VẼ
Hình 1: Hoa và quả của cây dành dành (Gardenia jasminoides J.Ellis) ..................... 2
Hình 2: Công thức cấu tạo của Tartrazine (E102) .................................................... 11
Hình 3: Công thức cấu tạo của Sunset Yellow FCF (E110) ..................................... 11
Hình 4: Một số nguồn nguyên liệu tự nhiên làm phẩm màu thực phẩm ................... 12
Hình 5: Quả dành dành làm nguyên liệu tách chiết .................................................. 17
Hình 6: Hiệu suất của quá trình chiết hạt dành dành ................................................ 24
Hình 7: Sắc ký đồ HPLC của dịch chiết dành dành ở các bước sóng 212 nm, 254 nm
và 440 nm .................................................................................................................. 25
Hình 8: Phổ hấp thụ của dịch chiết dành dành ở bước sóng từ 200-800 nm ............ 26
Hình 9: Sắc ký đồ mẫu chuẩn crocin ở các bước sóng 212 nm, 254 nm và 440 nm 26
Hình 10: Sắc kí đồ LC-MS của mẫu crocin tham chiếu (A) và dịch chiết (B) tại
bước sóng 440 nm ..................................................................................................... 28
Hình 11: Phổ UV của crocin trong mẫu tham chiếu và mẫu thử nghiệm ................. 28
Hình 12: Phổ khối ESI ở trạng thái ion âm của đỉnh chính (P1) trong dịch chiết .... 30
Hình 13: Phổ khối ESI ở trạng thái ion âm của đỉnh P3 trong dịch chiết ................. 30
Hình 14: Sắc ký đồ HPLC của mẫu chuẩn crocin ở hàm lượng 5µg ........................ 31
Hình 15: Sắc ký đồ HPLC của dịch chiết dành dành ở hàm lượng 20µg ................. 32
Hình 16: Đường chuẩn của mẫu chuẩn crocin .......................................................... 33
Hình 17: Hoạt tính chống oxi hóa của dịch chiết dành dành so với axit ascorbic .... 36
Hình 18: Biểu đồ thể hiện tỷ lệ phôi chết khi phơi nhiễm với dịch chiết dành dành 37
Hình 19: Hình ảnh dị dạng của phôi cá ngựa vằn ở thời điểm 72h khi phơi nhiễm
với dịch chiết dành dành nồng độ trên 1g/L ............................................................. 39
Hình 20: Độ hòa tan của bột chế phẩm màu dành dành trong nước ......................... 40
Hình 21: Ảnh hưởng của độ pH đến độ bền màu của dịch chiết dành dành ............. 41
Hình 22: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền màu của dịch chiết dành dành ......... 41
Hình 23: Ảnh hưởng của thời gian bảo quản đến độ bền màu của bột dành dành ... 42
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1: Crocin và các dẫn xuất thu được từ cây dành dành G. jasminoides .............. 4
Bảng 2: Một số hợp chất iridoid và iridoid glycoside từ cây dành dành G.
jasminoides ................................................................................................................. 5
Bảng 3: Chất phụ gia tạo màu tổng hợp được phép sử dụng cho thực phẩm (Cục
Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ - FDA) ................................................ 11
Bảng 4: Một số loại phẩm màu tự nhiên thông dụng ................................................ 13
Bảng 5: Số khối của các hợp chất tương ứng với các đỉnh P1-P4 ............................ 29
Bảng 6: Diện tích của các đỉnh P1-P4 trên sắc ký đồ HPLC của mẫu chuẩn tại bước
sóng 440 nm .............................................................................................................. 32
Bảng 7: Diện tích các đỉnh trong sắc ký đồ của dịch chiết (bước sóng 440 nm) và
hàm lượng crocin trong mẫu dịch chiết .................................................................... 34
Bảng 8: Kết quả đánh giá các chỉ tiêu vi sinh vật của dịch chiết dành dành ............ 43
Bảng 9: Kết quả đánh giá các chỉ tiêu kim loại nặng của dịch chiết dành dành ....... 43
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ..................................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN ....................................................................................... 2
1.1. Đặc điểm sinh học của cây dành dành Gardenia jasminoides J.Ellis .................. 2
1.1.1. Đặc điểm hình thái ........................................................................................... 2
1.1.2. Phân bố địa lý ................................................................................................... 2
1.1.3. Phân loại học .................................................................................................... 3
1.2. Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của hạt dành dành ............................. 3
1.2.1. Thành phần hóa học ......................................................................................... 3
1.2.2. Một số hoạt tính sinh học của các hợp chất từ hạt dành dành G. jasminoides 6
1.3. Nghiên cứu ứng dụng dịch chiết từ hạt dành dành làm phẩm màu thực phẩm.... 8
1.4. Một số phẩm màu thực phẩm đang được sử dụng hiện nay ................................ 9
1.4.1. Tầm quan trọng và sự sử dụng phẩm màu thực phẩm trong đời sống ............. 9
1.4.2. Phân loại phẩm màu thực phẩm ..................................................................... 10
1.4.3. Những ưu điểm của phẩm màu tự nhiên ........................................................ 14
1.5. Tiêu chí an toàn của các chất được sử dụng làm phẩm màu thực phẩm ............ 15
CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ............................................. 17
2.1. Nguyên liệu ...................................................................................................... 17
2.1.1. Dịch chiết hạt dành dành ................................................................................. 17
2.1.2. Động vật thử nghiệm ....................................................................................... 17
2.2. Hóa chất và thiết bị ........................................................................................... 18
2.3. Phương pháp nghiên cứu .................................................................................. 18
2.3.1. Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ................................................................. 18
2.3.2. Sắc kí lỏng kết hợp khối phổ (LC-MS) ........................................................... 19
2.3.3. Khảo sát tác dụng chống oxi hoá của dịch chiết dành dành ........................... 20
2.3.4. Khảo sát tính an toàn của chế phẩm màu ........................................................ 21
2.3.5. Khảo sát một số tính chất vật lý của chế phẩm ............................................... 22
2.3.6. Xử lý số liệu .................................................................................................... 22
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................ 24
3.1. Phân tích hàm lượng crocin trong dịch chiết từ quả dành dành ......................... 24
3.1.1. Chuẩn bị dịch chiết .......................................................................................... 24
3.1.2. Phân tích thành phần hoá học của dịch chiết bằng HPLC .............................. 24
3.1.3. Xác định thành phần crocin bằng LC-MS ...................................................... 27
3.1.4. Xác định hàm lượng crocin trong dịch chiết dành dành ................................. 31
3.2. Khảo sát tác dụng chống oxi hoá của dịch chiết dành dành .............................. 35
3.3. Khảo sát tính an toàn của chế phẩm màu ........................................................... 36
3.3.1. Đánh giá độc tính của dịch chiết dành dành trên chuột .................................. 36
3.3.2. Đánh giá ảnh hưởng lên phát triển của phôi cá ngựa vằn ............................... 37
3.4. Khảo sát một số tính chất vật lý của chế phẩm màu vàng ................................. 39
3.4.1. Độ hòa tan ....................................................................................................... 39
3.4.2. Khả năng chịu pH ............................................................................................ 40
3.4.3. Khả năng chịu nhiệt ........................................................................................ 41
3.4.4. Độ bền màu trong thời gian bảo quản ............................................................. 42
3.5. Đánh giá một số chỉ tiêu an toàn thực phẩm của chế phẩm ............................... 42
3.5.1. Đánh giá các chỉ tiêu về vi sinh vật ................................................................ 42
3.5.2. Đánh giá các chỉ tiêu về hàm lượng kim loại nặng ......................................... 43
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ................................................................................... 45
Lê Thùy Ngân – K24 Sinh học thực nghiệm 2018
MỞ ĐẦU
Dành dành (Gardenia jasminoides J. Ellis) là loài thực vật có nhiều ứng dụng
trong đời sống. Quả dành dành được sử dụng như một loại thảo dược trong y học cổ
truyền để điều trị các chứng viêm, vàng da, nhức đầu, phù nề, sốt, rối loạn chức
năng gan và tăng huyết áp [33]. Bên cạnh đó, dịch chiết từ hạt dành dành thường có
màu vàng hoặc đỏ cam và đã được sử dụng làm phẩm màu thực phẩm trong các
nước Đông Á trong các sản phẩm như mì và bánh kẹo [38].
Phẩm màu thực phẩm có tác dụng tạo màu sắc đẹp cho đồ ăn, đồ uống, tăng
giá trị cảm quan, làm tăng cảm giác ngon miệng. Việc thay thế các phẩm màu tổng
hợp bằng các phẩm màu tự nhiên không những tạo màu sắc hấp dẫn mà còn đem lại
lợi ích cho sức khỏe người tiêu dùng. Các loại phẩm màu tự nhiên, ngoài giá trị về
màu sắc, bản thân chúng còn là các thành phần có hoạt tính sinh học rất tốt cho cơ
thể như vitamin, axit hữu cơ, glycozit, protein. Ví dụ như phẩm màu từ dịch chiết
hạt dành dành (Gardenia jasminoides J. Ellis) có chứa crocin và crocetin, có tác
chống oxy hóa, hạ huyết áp, giảm xơ vữa động mạch, kháng viêm, tác dụng bảo vệ
thần kinh, tác động tích cực đến giấc ngủ, giảm căng thẳng mệt mỏi về thể chất và
ngăn ngừa thoái hóa võng mạc [9].
Ở Việt Nam, rất nhiều loài cây như lá cẩm, dành dành, đậu biếc ... được sử
dụng để nhuộm màu cho các món ăn truyền thống. Tuy nhiên, các chất màu tự
nhiên từ những cây này thường được dùng trong đời sống hàng ngày theo kinh
nghiệm dân gian mà chưa được đánh giá một cách toàn diện về thành phần và mức
độ an toàn đối với con người. Xuất phát từ những thực trạng trên, chúng tôi tiến
hành đề tài nghiên cứu “Đánh giá hàm lượng crocin và một số chỉ tiêu an toàn
thực phẩm của dịch chiết từ hạt dành dành (Gardenia jasminoides J. Ellis)”. Mục
tiêu của đề tài là nhằm tạo được bột phẩm màu vàng có hàm lượng crocin xác định
và đảm bảo được các chỉ tiêu về an toàn thực phẩm.
1
Lê Thùy Ngân – K24 Sinh học thực nghiệm 2018
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Đặc điểm sinh học của cây dành dành Gardenia jasminoides J.Ellis
1.1.1. Đặc điểm hình thái
Dành dành (Gardenia jasminoides J.Ellis) là dạng cây bụi, cao từ 1-2 m.
Thân cây có tiết diện tròn, thân non có màu xanh, thân già có màu nâu đen và có
những nốt sần. Lá đơn, mọc đối hay mọc vòng 3. Phiến lá hình bầu dục, dài 5-12
cm, rộng 1,5-4 cm, bìa phiến nguyên, màu xanh lục đậm ở mặt trên, nhạt ở mặt
dưới. Gân lá hình lông chim, nổi rõ ở mặt dưới, gân giữa màu trắng. Cuống lá rất
ngắn, mặt trên phẳng, mặt dưới lồi, màu xanh. Hoa to, mọc riêng lẻ ở ngọn cành
hay chỗ phân nhánh của thân. Hoa đều, lưỡng tính, mẫu 6, có mùi thơm. Cuống hoa
nhẵn, ngắn có 6 cạnh lồi, màu xanh. Quả mọng, hình thoi, màu vàng cam, có 6 sóng
dọc màu vàng xanh. Đỉnh quả có 6 lá đài tồn tại. Hạt dẹt, nhiều, màu nâu đỏ, kích
thước 3 x 2 mm.
Hình 1: Hoa và quả của cây dành dành (Gardenia jasminoides J.Ellis) [32]
1.1.2. Phân bố địa lý
Cây dành dành có nguồn gốc ở châu Á và thường được tìm thấy ở Việt Nam,
Đông Nam Á, Đài Loan, Nhật Bản và Myanmar. Chúng thường phân bố rộng rãi ở
các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới châu Phi và châu Á. Ở Việt Nam cây Dành dành
mọc khắp các tỉnh đồng bằng và trung du. Cây dành dành thường ra hoa từ tháng 5
đến tháng 7 và ra quả trong khoảng thời gian từ tháng 7 đến tháng 10.
2
Lê Thùy Ngân – K24 Sinh học thực nghiệm 2018
1.1.3. Phân loại học
Cây dành dành (Gardenia jasminoides J.Ellis) hay còn gọi là chi tử, thuộc
giới Thực vật (Plantae), bộ long đởm (Gentianales), họ Thiến thảo (Rubiaceae), chi
Dành dành (Gardenia) và loài Gardenia jasminoides J. Ellis.
1.2. Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của hạt dành dành
Hạt dành dành (Gardenia jasminoides J.Ellis) có chứa các thành phần như
iridoids, iridoid glucosides, triterpenoids, axit hữu cơ, và các hợp chất dễ bay hơi.
Trong đó, các hợp chất geniposide, genipin, gardenoside, crocin và iridiod là các
thành phần chính có hoạt tính sinh học được tìm thấy trong loài cây này [36].
1.2.1. Thành phần hóa học
1.2.1.1. Crocin và các dẫn xuất của chúng trong hạt dành dành G. jasminoides
Crocin và các dẫn xuất của chúng được chiết xuất từ G. jasminoides đã được
xác định là có độc tính thấp, khả năng gây dị ứng thấp, và thân thiện với môi trường
[14]. Crocin và crocetin ban đầu được tìm thấy trong nhị hoa nghệ tây Crocus
sativus L. Nhị hoa nghệ tây có rất nhiều công dụng đặc biệt là đối với ngành công
nghiệp thuốc nhuộm và dược phẩm. Nó cũng có tác dụng dược lý trong một số điều
kiện như giúp giảm cân, chữa rối loạn sinh lý và hội chứng tiền mãn kinh [12].
Các dẫn xuất crocin và crocetin là thành phần chính tạo nên màu cam hoặc
đỏ của hạt dành dành và đồng thời cũng là hai thành phần đem lại hoạt tính sinh học
cho loại thảo dược này.
Crocin I hay còn được gọi là alpha-crocin (β, β ’digentiobiosyl 8,
8’diapocarotene 8, 8’oate hoặc crocetin digentiobioside) có công thức hóa học là
C44H64O24 với khối lượng phân tử là 976,2 Dalton [28]. Crocin thuộc nhóm
cartotenoid tự nhiên và là hợp chất diester được hình thành từ gốc gentacobiose
disaccharide và crocetin axit dicarboxylic.
Hiện nay, crocin đang được rất nhiều nhà khoa học nghiên cứu do chúng có
nhiều hoạt tính sinh học đáng chú ý. Trong vài nghiên cứu trên người và động vật,
người ta thấy rằng crocin và crocetin có tác dụng chống oxy hóa, hạ huyết áp, giảm
xơ vữa động mạch, kháng viêm, tác dụng bảo vệ thần kinh, tác động tích cực đến
3
Lê Thùy Ngân – K24 Sinh học thực nghiệm 2018
giấc ngủ, giảm căng thẳng mệt mỏi về thể chất và ngăn ngừa thoái hóa võng mạc
[9].
Bảng 1: Crocin và các dẫn xuất thu được từ cây dành dành G. jasminoides [36]
Tên hợp Công thức cấu tạo chất
Crocin
cis-
Crocin 1
Gardecin
1.2.1.2. Iridoid và iridoid glycoside
Iridoid và iridoid glycoside là thành phần rất giàu trong G. jasminoides. Các
iridoid và iridiod glycoside này bao gồm genipin, geniposide, và gardenoside.
Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng, geniposide là một trong những hợp chất đem lại
rất nhiều lợi ích đối với sức khỏe con người như khả năng kháng viêm, chống trầm
cảm [8], các hiệu quả trong điều trị đái tháo đường [35], chống tạo huyết khối [30].
4
Lê Thùy Ngân – K24 Sinh học thực nghiệm 2018
Hàm lượng của iridoid glycoside có thể thay đổi đối với những cây dành dành G.
jasminoides được trồng ở những vùng khác nhau.
Bảng 2: Một số hợp chất iridoid và iridoid glycoside từ cây dành dành G.
jasminoides [36]
STT Tên hợp chất Công thức cấu tạo
1 Geniposide
2 Gardenoside
6-O-Methylscandoside methyl 3 ester
4 Shanzhiside
5 Gardoside
6 Genipin
7 Ixoroside
5
Lê Thùy Ngân – K24 Sinh học thực nghiệm 2018
8 Bartsioside
1.2.1.3. Axit hữu cơ
Dịch chiết từ hạt dành dành G. jasminoides chứa thành phần axit hữu cơ,
chẳng hạn như axit ursolic đã cho thấy khả năng trung hòa axit, hoạt tính chống oxy
hóa, và tác dụng ức chế sự tăng trưởng của Helicobacter pylori (H. pylori). Ngoài
ra, axit ursolic còn có hoạt tính gây độc tế bào kháng lại các tế bào ung thư dạ dày
AGS và SUN638 [19].
1.2.1.4. Các hợp chất dễ bay hơi
Các hợp chất dễ bay hơi chính trong tinh dầu của G. jasminoides là các axit
béo, ketone, aldehyde, este, rượu và các dẫn xuất thơm [10, 31]. He và cộng sự đã
báo cáo rằng trong dầu được chiết xuất từ quả dành dành G. jasminoides có chứa 16
loại chất chính. Axit béo trong của dầu từ quả dành dành chứa thành phần chính là
axit linoleic (khoảng 44%), tiếp theo là axit palmitic (khoảng 26,4%) và axit oleic
(khoảng 24,6%) [13].
1.2.2. Một số hoạt tính sinh học của các hợp chất từ hạt dành dành G.
jasminoides
1.2.2.1. Hoạt tính chống oxy hóa
Dịch chiết trong nước và ethanol từ quả dành dành G. jasminoides đã được
phát hiện là đều có khả năng chống oxy hóa. Dịch chiết nước từ hạt dành dành G.
jasminoides có hoạt tính quyét gốc tự do đối với DPPH (1,1-diphenyl-2-
picrylhydrazyl), ABTS [axit 2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic),
hydroxyl và superoxide với các giá trị IC50 lần lượt là 0,14 mg/mL, 0,21 mg/mL,
1,08 mg/mL, và 1,43 mg/mL; trong khi đó dịch chiết từ etanol có các giá trị IC50 lần
lượt là 0,36 mg/mL, 0,39 mg/mL, 1,56 mg/mL, và 1,99 mg/mL. Do đó, dịch chiết
nước có hoạt tính chống oxy hóa cao hơn so với dịch chiết ethanol. Ở nồng độ 20
6
Lê Thùy Ngân – K24 Sinh học thực nghiệm 2018
ppm, hoạt tính chống oxy hóa của crocin tinh khiết có thể so sánh được với chất
chống oxy hóa BHA (hydroxyanisole butylated) [17].
1.2.2.2. Hoạt tính kháng viêm
Dịch chiết nước của hạt dành dành thể hiện các đặc tính chống viêm thông
qua việc giảm đáng kể sự phosphoryl hóa JNK2/1 (c-Jun N-terminal protein kinase)
và p38 MAPK (mitogen-acivated protein kinase), và giảm sự biểu hiện của COX-2
(cyclooxygenase-2) trong các tế bào BV-2 gây ra do LPS. Dịch chiết nước của G.
jasminoides được sử dụng trên gan của chuột bị tổn thương do LPS gây ra, bệnh lý
gan đã đáng kể giảm [20].
Geniposide được chứng minh là làm giảm viêm bằng cách ức chế MeCP2
(methyl cytosine binding protein-2) trong chuột bị tổn thương gan cấp tính do CCl4
gây ra và các tế bào THP-1 được xử lý với LPS [21]. Geniposide có thể là một
thuốc chống viêm tiềm năng để điều trị tổn thương gan cấp tính, tổn thương phổi
cấp tính và viêm vú [27].
Crocin có thể ức chế cyclooxygenase-1 và các hoạt tính của cyclooxygenase-
2, quá trình sản sinh prostaglandin E2, ức chế phù nề tai do xylen gây ra và phù nề
chi do carrageenan gây ra ở chuột [37].
1.2.2.3. Hỗ trợ điều trị trầm cảm
Tinh dầu và geniposide chiết xuất từ G. jasminoides được chứng minh là có
hoạt tính chống trầm cảm [31]. Genipin đóng vai trò như tác nhân chống trầm cảm
thông qua việc điều chỉnh quá trình đường phân (glycolysis), sinh tổng hợp đường
(gluconeogenesis) và chuyển hóa lipit của gan [4].
1.2.2.4. Hỗ trợ điều trị tiểu đường
Dịch chiết nước từ hạt G. jasminoides cải thiện độ nhạy với insulin trong
chuột kháng insulin gây ra do steroid (steroid-induced insulin-resistant) với liều tối
ưu là 200 mg/kg [6]. Geniposide làm giảm bớt sự dung nạp glucose bất thường và
chứng tăng insulin máu, đây là những dấu hiệu nhận biết ở bệnh nhân tiểu đường
typ 2 do di truyền [18]. Geniposide (200 mg/kg và 400 mg/kg) được chứng minh là
7
Lê Thùy Ngân – K24 Sinh học thực nghiệm 2018
tác nhân hạ đường huyết hiệu quả trong chuột tiểu đường, nó làm giảm đáng kể
lượng đường, insulin và nồng độ triglyceride trong máu ở chuột tiểu đường [35].
1.2.2.5. Tác động đến hệ tuần hoàn máu
Dịch chiết từ nước nóng của hạt G. jasminoides mặc dù không kích thích
tăng sinh tế bào cơ trơn mạch máu trong quá trình nuôi cấy, nhưng lại kích thích có
chọn lọc tăng sinh tế bào nội mô, dó đó có thể ngăn ngừa xơ cứng động mạch và
huyết khối [16]. Dịch chiết etanol 70% của hạt G. jasminoides cho thấy hoạt tính
chống tạo quá trình tạo mạch máu hiệu quả thông qua sàng lọc CAM (chick
chorioallantoic membrane) [24].
1.3. Nghiên cứu ứng dụng dịch chiết từ hạt dành dành làm phẩm màu thực
phẩm
Sắc tố vàng thu được từ hạt dành dành G. jasminoides có độ hòa tan tốt trong
nước và chứa thành phần chính là crocin. Trước khi có các nghiên cứu chuyên sâu
về hoạt tính sinh học của dành dành, chúng đã được sử dụng rộng rãi như một loại
thảo dược, đồ uống và đặc biệt là được sử dụng làm phẩm màu ở châu Á.
Màu vàng tự nhiên từ hạt dành dành đang dần thay thế các loại phẩm màu
tổng hợp cũng như phẩm màu vàng từ hoa nghệ tây do có giá thành rẻ hơn nhưng
vẫn đem lại hiệu quả tương tự về mặt cảm quan cũng như hương vị cho thực phẩm.
Crocin là một trong những chất tạo màu tự nhiên từ hạt dành dành được sử dụng
rộng rãi để tạo màu cho các thực phẩm như các loại mứt, các loại thạch rau câu, các
loại đồ uống không chứa cồn [22]. Bên cạnh đó, các nhà nghiên cứu Trung Quốc đã
xác định được trong một số sản phẩm nước giải khát, bánh ngọt và mỳ ăn liền được
bán tại siêu thị ở Bắc Kinh có chứa chất màu crocin với hàm lượng từ 0,84-4,20
mg/g. Tuy nhiên, cũng theo các tiêu chuẩn của Trung Quốc, hàm lượng lớn nhất của
crocin được phép trong thực phẩm là 1,50mg/g. Do đó, việc sử dụng crocin để làm
phẩm màu thực phẩm cũng cần được kiểm soát nghiêm ngặt [34]. Ở Việt Nam,
phẩm màu từ dành dành thường được sử dụng để làm bánh, đồ xôi, thạch rau câu,
bánh ngọt. Tuy nhiên, việc sử dụng phẩm màu này mới chỉ là những công thức
truyền miệng mà chưa được đánh giá cũng như kiểm soát của Bộ Y tế.
8
Lê Thùy Ngân – K24 Sinh học thực nghiệm 2018
Hiện nay tại Việt Nam đã có một vài nghiên cứu khả năng ứng dụng dịch
chiết từ hạt dành dành làm phẩm màu thực phẩm. Trong đó có nhóm tác giả Nguyễn
Thị Thanh Thủy và Nguyễn Thị Hiển đã tiến hành khảo sát phương pháp chiết tách
crocin từ quả dành dành và độ bền của chất màu ở các điều kiện khác nhau. Hàm
lượng crocin được xác định bằng phương pháp đo quang phổ hấp thụ phân tử ở
bước sóng 440 nm. Kết quả cho thấy quả dành dành là một loại nguyên liệu tiềm
năng cung cấp lượng lớn crocin với hàm lượng lên tới 16,04 mg/g với nguyên liệu
tươi và 14,63 mg/g với nguyên liệu khô [1]. Tuy nhiên, nghiên cứu này mới chỉ xác
định được hàm lượng tương đối của crocin thông qua xác định hàm lượng
carotenoid trong dịch chiết nhưng chưa xác định được hàm lượng và thành phần cụ
thể của các loại crocin trong dịch chiết. Cũng trong nghiên cứu này, hiệu suất chiết
crocin đạt cao nhất với hệ dung môi ethanol: nước (40: 60, 50: 50, v/v). Mặc dù
vậy, để định hướng ứng dụng tạo sản phẩm phẩm màu an toàn cho người sử dụng,
dung môi nước được ưu tiên sử dụng hơn nhằm đảm bảo tiêu chí không có dung
môi hữu cơ tồn dư trong chế phẩm. Crocin bền với nhiệt độ dưới 100ºC trong thời
gian 140 phút. Bên cạnh đó, crocin còn khá bền trong điều kiện axit yếu, trung tính
và kiềm. Tác giả Đào Thị Vui và cộng sự (2001) đã tiến hành nghiên cứu thăm dò
độc tính cấp của dịch chiết dành dành, kết quả cũng cho thấy rằng ở liều 6-12g có
thể dùng để chữa bệnh an toàn [2]. Những nghiên cứu nêu trên gần như mới chỉ
dừng lại ở bước nghiên cứu các tính chất và mức độ an toàn của dịch chiết dành
dành mà chưa đánh giá một cách tổng thể bao gồm cả các tiêu chí về an toàn thực
phẩm nhằm ứng dụng trong sản xuất tạo phẩm màu.
1.4. Một số phẩm màu thực phẩm đang được sử dụng hiện nay
1.4.1. Tầm quan trọng và sự sử dụng phẩm màu thực phẩm trong đời sống
Màu sắc là một chỉ tiêu cảm quan quan trọng đối với các sản phẩm thực
phẩm. Phẩm màu thực phẩm mặc dù không có giá trị về mặt dinh dưỡng nhưng
đóng vai trò quan trọng đối với quá trình chế biến thực phẩm vì chúng có những
chức năng sau đây:
+ Tăng cường màu sắc tự nhiên vốn có của thực phẩm để thu hút người tiêu
dùng.
9
Lê Thùy Ngân – K24 Sinh học thực nghiệm 2018
+ Khôi phục lại màu sắc ban đầu của thực phẩm do phẩm màu có thể đã bị
biến đổi trong quá trình chế biến, bảo quản, gia nhiệt v.v..
+ Khiến một số thực phẩm không màu hoặc màu nhạt trở nên có màu sắc bắt
mắt làm tăng giá trị cảm quan của sản phẩm, hấp dẫn các đối tượng người tiêu dùng
đặc biệt là các sản phẩm dành cho đối tượng trẻ em như thạch rau câu, nước giải
khát.
1.4.2. Phân loại phẩm màu thực phẩm
Dựa vào nguồn gốc, phẩm màu thực phẩm được chia làm 3 loại: phẩm màu
tổng hợp (hay còn gọi là phẩm màu nhân tạo), phẩm màu vô cơ và phẩm màu tự
nhiên. Phẩm màu tổng hợp là các phẩm màu được tạo ra bằng các phản ứng hóa học
và không có trong tự nhiên. Các phẩm màu tổng hợp thường có độ bền cao, màu sắc
bắt mắt, giá thành rẻ nên rất được ưa chuộng. Phẩm màu vô cơ là các muối vô cơ có
màu sắc, chẳng hạn như đồng (II) sulphat, sắt (III) oxit... Các phẩm màu này thường
độc hại nên khi sử dụng cần phải rất thận trọng. Phẩm màu tự nhiên là các các chất
được tách chiết hoặc chế biến từ các nguyên liệu hữu cơ có sẵn trong tự nhiên (thực
vật, động vật hoặc các vi sinh vật). Phẩm màu tự nhiên thường có độ an toàn cao
đối với sức khỏe con người, nhưng giá thành cao do hiệu suất tách chiết và thu hồi
từ nguyên liệu thấp. Trong số ba loại phẩm màu nói trên, hai nhóm phẩm màu được
sử dụng nhiều nhất trong chế biến thực phẩm là phẩm màu có nguồn gốc tổng hợp
và phẩm màu có nguồn gốc tự nhiên.
1.4.2.1. Phẩm màu tổng hợp
Phẩm màu tổng hợp được sử dụng phổ biến trong ngành chế biến thực phẩm.
Tuy nhiên, không phải phẩm màu tổng hợp nào cũng an toàn đối với sức khỏe
người tiêu dùng. Do vậy, trong quá trình sử dụng phẩm màu tổng hợp cần tuân thủ
theo quy định và chỉ dẫn của Bộ Y tế.
Trong các phẩm màu tổng hợp nói trên, Tartrazine (E102) và Sunset Yellow
FCF (E110) là hai màu thực phẩm được sử dụng rộng rãi nhất và được tiêu thụ
nhiều nhất trên thế giới. Tuy nhiên, Tartrazine (E102) bị cấm ở Na Uy và Úc vì nó
chứa các hợp chất gây ung thư benzidine và 4-aminobiphenyl.
10
Lê Thùy Ngân – K24 Sinh học thực nghiệm 2018
Hình 2: Công thức cấu tạo của Tartrazine (E102) Hình 3: Công thức cấu tạo của Sunset Yellow FCF (E110)
Bảng 3: Chất phụ gia tạo màu tổng hợp được phép sử dụng cho thực phẩm (Cục
Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ - FDA)
STT Tên thông thường Danh pháp Mã EEC Đặc điểm, màu
sắc
1 Brilliant Blue FCF FD&C Blue No. 1 E133 Màu xanh lam
sáng
2 Indigo carmine FD&C Blue No. 2 E132 Màu chàm
3 Fast Green FCF FD&C Green No. 3 E143 Màu xanh lá cây
4 - Orange B Màu cam nhạt -
5 - Citrus Red No. 2 Màu cam -
6 Erytrosin FD&C Red No. 3 E127 Màu cam đỏ
7 Allura Red AC FD&C Red No. 40 E129 Màu đỏ
8 Tartrazine FD&C Yellow No. E102 Màu vàng chanh
5
9 Sunset Yellow FCF FD&C Yellow No. E110 Màu vàng cam
*Mã EEC (EEC-numbers hay E-numbers) là ký hiệu cho các chất được phép sử dụng làm
phụ gia thực phẩm để sử dụng trong Liên minh Châu Âu và Hiệp hội Mậu dịch tự do châu Âu
(EFTA).
6
11
Lê Thùy Ngân – K24 Sinh học thực nghiệm 2018
1.4.2.2. Phẩm màu tự nhiên
Phẩm màu tự nhiên thường là các hợp chất hữu cơ có nguồn gốc từ thiên
nhiên. Chúng có thể thu được từ lá, quả hay rễ của thực vật, các loại động vật như
côn trùng hay các loài vi sinh vật v.v.. Vì có nguồn gốc từ tự nhiên, nên các phẩm
màu này có mức độ độc hại thấp, thường an toàn đối với môi trường và quan trọng
nhất là đối với người tiêu dùng. Tuy nhiên, cũng phải thừa nhận rằng, các chất tạo
màu có nguồn gốc thiên nhiên như vậy thường không bền màu, dễ bị ảnh hưởng bởi
các điều kiện nhiệt độ, pH hay ion kim loại. Phẩm màu tự nhiên được phép sử dụng
trên toàn thế giới, tuy vậy việc cho phép sử dụng ở từng quốc gia cũng có sự khác
nhau.
Bên cạnh đó, ngoài vai trò là chất tạo màu cho các sản phẩm thực phẩm, các
chất này cũng là các nhân tố có lợi cho sức khỏe chẳng hạn như β-carotene là tiền
chất của vitamin A rất cần thiết cho phát triển thị giác, đồng thời có khả năng chống
oxi hóa, bảo vệ cơ thể chống lại một số bệnh ung thư, bệnh tim mạch; màu vàng
curcumin từ củ nghệ có khả năng kháng khuẩn, kháng tế bào ung thư; màu xanh lá
cây chlorophyll từ lá cây có khả năng khả năng kích thích hệ miễn dịch, chống
viêm, ngăn ngừa ung thư, giải độc gan v.v.. Một số loại phẩm màu tự nhiên phổ
biến được liệt kê trong bảng dưới đây.
a. b.
c. d.
Hình 4: Một số nguồn nguyên liệu tự nhiên làm phẩm màu thực phẩm
a. Lá rau chân vịt (spinach); b. Cà rốt; c. Củ nghệ; d. Bắp cải tím
12
Lê Thùy Ngân – K24 Sinh học thực nghiệm 2018
Bảng 4: Một số loại phẩm màu tự nhiên thông dụng
STT Tên thông Mã Màu sắc Đặc điểm
thường EEC*
1 Curcumin E100 Cucurmin có nguồn gốc từ củ nghệ. Màu
vàng Curcumin có khả năng chống oxy hóa
nghệ [7], hoạt tính kháng khuẩn, kháng ung
thư, phòng ngừa và điều trị một số bệnh
như Alzheimer, viêm khớp, ung thư.
2 Anthocyanin E163 Màu sắc Thường có nhiều trong các loại thực vật
phụ thuộc có màu sắc đỏ, tím như nho, dâu, đậu
vào độ đen, bắp cải tím... Anthocyanin có khả
pH (màu năng cải thiện thị lực, chống béo phì,
đỏ, xanh kháng khuẩn, chống oxy hóa, kháng ung
lá cây và thư, làm bền vững thành mạch, bảo vệ hệ
thần kinh... [17]. tím)
3 Riboflavin E101 Riboflavin thường có trong dịch chiết Màu
vàng cam men, gan, thận, cám lúa mì, trứng, thịt,
sữa và pho mát.
Riboflavin còn được biết đến là vitamin
B2, đóng vai trò rất quan trọng trong quá
trình chuyển hóa chất béo, carbohydrate,
protein. Ngoài ra, chúng còn rất cần thiết
cho quá trình hình thành tế bào hồng cầu
và sản xuất kháng thể.
4 Chlorophyll E140 Màu Chlorophyll là một hợp chất tự nhiên có
xanh lá trong thực vật và tảo. Chlorophyll có khả
cây năng kích thích hệ miễn dịch, chống
viêm, giảm tình trạng thiếu máu, ngăn
ngừa ung thư, làm sạch hệ tiêu hóa, giúp
trẻ hóa và bồi bổ cơ thể, giải độc gan,
13
Lê Thùy Ngân – K24 Sinh học thực nghiệm 2018
bình thường hóa huyết áp...[15]
5 Caramen E150a Màu nâu Caramen là chất tạo màu dạng lỏng, đậm
đậm đặc, vị đắng thu được từ phản ứng
(màu caramen hóa đường. Caramen có khả
caramen) năng chống oxi hóa [26]
6 Carotene E160a Màu Carotene thường có mặt trong nhiều loài
vàng cam thực vật như cà chua, cà rốt. Carotene có
đậm các loại đồng phân là α-carotene, β-
carotene, γ-carotene. Carotene là tiền
chất của vitamin A, đóng vai trò thiết yếu
trong quá trình phát triển của cơ thể và
ảnh hưởng đến chức năng thị giác. Ngoài
ra, carotene còn có khả năng chống oxi
hóa, bảo vệ cơ thể chống lại một số bệnh
*Mã EEC (EEC-numbers hay E-numbers) là ký hiệu cho các chất được phép sử dụng làm
phụ gia thực phẩm để sử dụng trong Liên minh Châu Âu và Hiệp hội Mậu dịch tự do châu Âu
(EFTA)
ung thư, bệnh tim mạch [29].
1.4.3. Những ưu điểm của phẩm màu tự nhiên
Phẩm màu thực phẩm có rất nhiều ưu điểm nhưng có 3 lý do chính để người
tiêu dùng chuyển sang sử dụng phẩm màu tự nhiên đó là:
Màu sắc đa dạng
Nguồn nguyên liệu để sản xuất phẩm màu tự nhiên vô cùng phong phú, do
đó các loại phẩm màu thu được từ chúng cũng có màu sắc rất đa dạng chẳng hạn
như màu đỏ cam đậm thu được từ hạt điều màu, màu vàng từ củ nghệ, màu đỏ từ
bắp cải tím, màu xanh từ rau cải và màu caramen. Nguồn nguyên liệu này luôn có
sẵn trong tự nhiên và có thể tái tạo được, do vậy các phẩm màu tự nhiên thu được từ
đó cũng trở nên phổ biến và dễ sản xuất.
Sự tiện dụng
Hiện nay, phẩm màu tự nhiên luôn luôn sẵn sàng để cung cấp cho người tiêu
dùng. Chúng thường được thu nhận và tinh chế để tạo ra sản phẩm tinh khiết, sau đó 14
Lê Thùy Ngân – K24 Sinh học thực nghiệm 2018
được đóng gói để người tiêu dùng ở có thể dễ dàng sử dụng ở nhà. Ngoài ra, người
tiêu dùng cũng dễ dàng chuẩn bị phẩm màu thực phẩm tự nhiên ngay tại chính gia
đình của mình, chẳng hạn như màu vàng có thể được chuẩn bị dễ dàng bằng cách
đun sôi nhụy hoa nghệ tây trong nước khoảng mười phút, hoặc màu đỏ có thể thu
được dễ dàng từ củ cải đỏ hoặc bắp cải tím.
Lợi ích đối với sức khỏe
Một trong những ưu điểm khác của phẩm màu tự nhiên là chúng có nguy cơ
thấp trong việc gây ra các bệnh về ung thư hoặc tim mạch. Mặc dù chúng cũng có
thể là vấn đề đối với một số người bị dị ứng hoặc không dung nạp được phẩm màu
thực phẩm, nhưng nhìn chung sự dị ứng như vậy thường là những vấn đề cá nhân và
thường không phải là phổ biến. Ngoài ra, các loại phẩm màu tự nhiên cũng cung
cấp chất dinh dưỡng, chất chống oxy hóa và còn có các tác dụng dược lý khác.
1.5. Tiêu chí an toàn của các chất được sử dụng làm phẩm màu thực phẩm
Các chất được sử dụng làm phẩm màu thực phẩm muốn đưa ra thị trường
thương mại hóa đều cầu phải đáp ứng các tiêu chuẩn và quy chuẩn kỹ thuật của Việt
Nam. Quy chuẩn kỹ thuật (QCVN) là quy định về mức giới hạn của đặc tính kỹ
thuật và yêu cầu quản lý mà sản phẩm, hàng hoá, dịch vụ, quá trình, môi trường và
các đối tượng khác trong hoạt động kinh tế - xã hội phải tuân thủ để bảo đảm an
toàn, vệ sinh, sức khoẻ con người; bảo vệ động vật, thực vật, môi trường; bảo vệ lợi
ích và an ninh quốc gia, quyền lợi của người tiêu dùng và các yêu cầu thiết yếu
khác. QCVN 4-10:2010/BYT đã quy định rất cụ thể về phụ gia thực phẩm – phẩm
màu. Trong quy định ngoài các quy chuẩn kỹ thuật liên quan đến định tính của chất
cò nêu rõ các quy chuẩn kỹ thuật nhằm đảm bảo độ an toàn cho người sử dụng.
Chẳng hạn như đối với chất curcumin, là một hợp chất màu vàng có nguồn gốc tự
nhiên thì mức độ tồn dư dung môi axeton không được quá 30,0 mg/kg, hexan không
được quá 25,0mg/kg và methanol, ethanol, isopropanol, ethyl acetat không được
quá 50,0 mg/kg. Hoặc đối với hợp chất tartrazine, chất màu vàng tổng hợp đang
được sử dụng rộng rãi hiện nay thì yêu cầu kỹ thuật đối với các chất hữu cơ ngoài
chất màu chứa trong phẩm màu không được quá 0,5% (tổng các axit
tetrahydroxysuccinic; axit 4-hydrazinbenzensulfonic; axit 4-Aminobenzensulfonic;
15
Lê Thùy Ngân – K24 Sinh học thực nghiệm 2018
axit 5-Oxo-1-(4-sulfophenyl)- 2-pyrazolin-3-carboxylic; axit 4,4'-Diazoaminodi
(axit benzensulfonic)). Ngoài ra, một chỉ tiêu rất quan trong đối với tất cả các phẩm
màu là hàm lượng chì không được quá 2,0 mg/kg. Bên cạnh những chỉ tiêu này, một
số các chỉ tiêu liên quan vi sinh vật cũng là một tiêu chí đánh giá mức độ an toàn
của chế phẩm đối với người tiêu dùng.
16
Lê Thùy Ngân – K24 Sinh học thực nghiệm 2018
CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1. Nguyên liệu
2.1.1. Dịch chiết hạt dành dành
Quả dành dành tươi được thu hái ở Bắc Ninh vào tháng 10 năm 2016, những
quả chín có vỏ chuyển sang màu vàng được bóc vỏ để thu hạt và sấy khô. Sau đó,
dịch chiết dành dành được chuẩn bị bằng cách đun sôi hạt trong nước cất ở 100ºC
với thời gian từ 3-5 phút. Dịch màu vàng được lọc, sấy khô thành bột và bảo quản ở
nhiệt độ 4 ºC.
Hình 5: Quả dành dành làm nguyên liệu tách chiết
2.1.2. Động vật thử nghiệm
Chuột nhắt trắng
Chuột nhắt trắng Swiss, 4-6 tuần tuổi, với trọng lượng trung bình 20-22g
được cung cấp bởi Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương được sử dụng để nghiên cứu
độc tính cấp của dịch chiết dành dành.
Phôi cá ngựa vằn
Cá ngựa vằn được nuôi tại phòng thí nghiệm thuộc Bộ môn Sinh học Tế bào,
Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội ở điều kiện nhiệt độ
27 ± 1°C, chu kỳ sáng 14/10 (14 giờ sáng, 10 giờ tối) trong nước đã lọc qua màng
lọc nano (Geyser). Cá được cho ăn 2 lần mỗi ngày bằng thức ăn khô (ZM300) hoặc
thức ăn tươi (lòng đỏ trứng, artemia) vào sáng và chiều.
17
Lê Thùy Ngân – K24 Sinh học thực nghiệm 2018
Phôi thí nghiệm được thu từ cá bố mẹ vào đầu chu kỳ sáng ở giai đoạn từ 4 -
64 tế bào, được rửa sạch chất bẩn bám trên vỏ và loại bỏ những phôi chết hoặc phát
triển bất thường.
2.2. Hóa chất và thiết bị
Hóa chất
Nước cất
Nước cất loại ion
Ethanol (Trung Quốc, Merck)
Methanol (Trung Quốc, Merck)
NaOH (Trung Quốc)
HCl (Trung Quốc)
Axit ascorbic (Merck)
1,1- diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) (Merck)
Methanol HPLC (J.T. Baker 9093- Avantor Performance Materials, USA)
Thiết bị
Bình định mức 1000 ml, 100ml, 50ml, 25ml, 10ml.
Pipet: 1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml, pipet thủy tinh, pipet pasteur
Bình tam giác 250ml, cốc thủy tinh 100 ml, 250 ml.
Ống nhỏ giọt, ống nghiệm thủy tinh, ống eppendorf, ống falcon
Bình tia, phễu lọc, cối sứ, chày sứ, giấy lọc thường.
Đèn UV, đĩa 24 giếng, tủ lạnh, máy ly tâm, cân, kính hiể n vi
Hệ thống HPLC (Shimadzu)
Hệ thống LC-MS (Agilent)
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography-
HPLC) là một trong những kỹ thuật sắc ký sử dụng để phân tách một hỗn hợp chất
với mục đích xác định, định lượng và phân lập từng thành phân riêng lẻ của hợp
18
Lê Thùy Ngân – K24 Sinh học thực nghiệm 2018
chất. Để xác định hàm lượng crocin trong dịch chiết dành dành, mẫu chuẩn và mẫu
thử nghiệm (dịch chiết) được phân tích HPLC trong điều kiện giống nhau.
Chuẩn bị mẫu
Mẫu chuẩn crocin (Sigma) được chuẩn bị ở nồng độ 0,5 mg/mL.
Dịch chiết dành dành được chuẩn bị ở nồng độ 2,0 mg/mL.
Điều kiện chạy HPLC
Loại thiết bị: Shimazu
Loại cột Cột: Atlantis C18, 5 µm, hãng Water
Chiều dài cột 4,6 x 250 mm.
Thời gian phân tích : 45 phút
Tốc độ dòng: 0,8 ml/phút
Bước sóng phân tích: 440 nm
Thể tích mẫu bơm:
+ Mẫu chuẩn: 10 μl, 15 μl, 20 μl, 25 μl, 30 μl.
+ Dịch chiết: 10 μl.
Pha động sử dụng hệ hai dung môi: H2O (kênh A) – MeOH (kênh B)
Thời gian (phút) Dung môi (MeOH:nước)
20:80 0,20
20:80 2,00
25:75 5,00
40:60 10,00
60:40 20,00
100:0 24,00
100:0 35,00
20:80 45,00
2.3.2. Sắc kí lỏng kết hợp khối phổ (LC-MS)
Sắc ký lỏng kết hợp khối phổ (LC-MS) là một kỹ thuật phân tích hiệu quả
dựa trên khả năng phân tách các thành phần của hợp chất bằng sắc ký lỏng kết hợp 19
Lê Thùy Ngân – K24 Sinh học thực nghiệm 2018
với độ đặc hiệu phát hiện của khối phổ. Sắc ký lỏng (LC) tách các thành phần mẫu
và sau đó đưa chúng vào máy đo khối phổ (MS). Dữ liệu LC-MS có thể được sử
dụng để cung cấp thông tin về khối lượng phân tử, cấu trúc, đặc điểm và hàm lượng
của các thành phần mẫu cụ thể.
Chuẩn bị mẫu
Mẫu chuẩn crocin (Sigma) được chuẩn bị ở nồng độ 0,5mg/mL.
Dịch chiết dành dành được chuẩn bị ở nồng độ 2mg/mL.
Điều kiện chạy LC-MS
Máy LC-MS: Agilent
Cột sắc ký: Cột VertiSep GES C18 (150 x 4.6 mm, 5μm) và cột bảo vệ GES C18
của hãng Vertical.
Màng lọc 0,45 µm cho kim bơm mẫu dùng để lọc mẫu trước khi bơm vào hệ
thống LC-MS.
Pha động sử dụng hệ hai dung môi: H2O (kênh A) – MeOH (kênh B) biến đổi
gradient từ tỉ lệ A:B từ 60:40 đến 0:100
Lượng mẫu bơm: 5 µl.
Tốc độ dòng: 0,5 ml/phút.
Thời gian phân tích: 25 phút
Bước sóng phân tích: 440nm.
Hệ thống LC-MS được kết nối với phần mềm Agilent OpenLAB Control Panel.
Khí nitơ được bơm với tốc độ dòng 5,0 L/phút, áp suất đầu phun đạt 40 psi, nhiệt độ
làm khô đạt 250ºC.
Phương pháp này được thực hiện tại Trung tâm tiên tiến về hóa sinh hữu cơ thuộc
Viện Hóa sinh biển – Viện Hàn lâm Khoa học Việt Nam
2.3.3. Khảo sát tác dụng chống oxi hoá của dịch chiết dành dành
Về nguyên tắc, các chất chống oxi hóa sẽ trung hòa gốc DPPH bằng cách
cho hydro, làm giảm độ hấp thu tại bước sóng cực đại và màu của dung dịch phản
ứng nhạt dần, chuyển từ màu tím sang màu vàng nhạt. Phương pháp nghiên cứu này
được thực hiện dựa trên mô tả của W.Brand-Williams và cộng sự [3] bằng cách
20
Lê Thùy Ngân – K24 Sinh học thực nghiệm 2018
chuẩn bị dung dịch DPPH 0,2M trong ethanol (Merck) sau đó bổ sung 1,0 mL dung
dịch này vào 1,0 mL dịch chiết dành dành trong nước cất ở nồng độ 0,005-1 g/L.
Hỗn hợp được giữ trong bóng tối ở nhiệt độ phòng trong 30 phút trước khi đo độ
hấp thụ ở bước sóng 517 nm. Sự giảm độ hấp thụ của hỗn hợp phản ứng cho thấy
hoạt tính chống oxy hóa của mẫu. Các phép đo được thực hiện ba lần. Axit ascorbic
được sử dụng làm chất chuẩn. Tỷ lệ ức chế (phần trăm) được tính theo phương trình
sau:
Ức chế (%) = [1- (Ai - Aj) / A0] × 100
Trong đó, A0 là độ hấp thụ của mẫu trắng (DPPH), Ai là độ hấp thụ của mẫu
có chứa DPPH và có nồng độ màu khác nhau. Aj là độ hấp thụ của mẫu đối chứng
(dịch chiết). Giá trị IC50 được tính toán bằng đồ thị.
2.3.4. Khảo sát tính an toàn của chế phẩm màu
2.3.4.1. Đánh giá độc tính trên chuột
18 con chuột nhắt trắng Swiss được chia làm 3 lô, 6 con/lô, trong đó có 1 lô
đối chứng và 2 lô thử nghiệm. Các con chuột được bỏ đói 16 giờ trước khi cho uống
1 liều duy nhất dịch chiết dành dành. Mức liều của dịch chiết dành dành được sử
dụng cho chuột là 2,062 mg/kg, 4,125 mg/kg, 8,250 mg/kg, 16,500 mg/kg và
33,000 mg/kg trọng lượng cơ thể (dịch chiết dành dành được pha trong nước cất vô
trùng).
Sau khi cho chuột uống dịch chiết dành dành từ 1 đến 2 giờ, cho chuột ăn
uống như bình thường và tiếp tục theo dõi trong 72 giờ để xác định số chuột chết
trong mỗi lô thử nghiệm, từ đó tính toán giá trị LD50.
2.3.4.2. Đánh giá ảnh hưởng lên phát triển của phôi cá ngựa vằn
Dịch chiết của dành dành được pha với nước từ bột màu dành dành theo dải
nồng độ: 0,1 g/L, 0,5g/L, 1g/L, 2g/L, 4g/L, 8g/L, 12 g/L để thử nghiệm độc tính với
phôi cá ngựa vằn.
Quy trình thử độc trên phôi cá ngựa vằn dựa theo hướng dẫn của OECD về
thử độc trên đối tượng phôi cá (OECD 236). Phôi cá ngựa vằn sau khi chọn lọc sẽ
được chuyển vào đĩa 24 giếng có chứa hóa chất với mật độ 1 phôi/giếng. Mỗi giếng 21
Lê Thùy Ngân – K24 Sinh học thực nghiệm 2018
thử nghiệm sẽ được thay mới hóa chất, quan sát, ghi lại tỷ lệ sống chết và các hình
thái phôi phát triển bất thường sau mỗi 24 giờ cho tới thời điểm 72 giờ. Thử nghiệm
được lặp lại ít nhất 3 lần.
2.3.5. Khảo sát một số tính chất vật lý của chế phẩm
2.3.5.1. Độ hòa tan
Bột dành dành khô được hòa tan với nước ở các nồng độ 0,1 g/L, 0,4 g/L và
0,8 g/L để tạo thành dung dịch đồng nhất. Quan sát mức độ đồng nhất của dung
dịch trong điều kiện ánh sáng thường.
2.3.5.2. Khả năng chịu pH
Chuẩn bị dịch chiết dành dành trong nước với nồng độ 0,4 g/L. NaOH 0,5N
và HCl 0,5N được sử dụng để thay đổi pH của dung dịch mẫu từ 1,0 đến 12,0. Sau
đó, sự thay đổi màu sắc được quan sát và độ hấp thụ của tất cả các mẫu được ghi lại
bằng máy quang phổ UV-Vis ở bước sóng 440nm.
2.3.5.3. Khả năng chịu nhiệt
Độ bền nhiệt của màu vàng được xác định ở các nhiệt độ khác nhau từ 40-
100°C. Ở mỗi nhiệt độ, mẫu được giữ trong nồi cách thủy trong 5 phút. Sự thay đổi
màu sắc được quan sát và độ hấp thụ của tất cả các mẫu được ghi lại bằng máy đo
quang phổ UV-Vis ở bước sóng 440 nm.
2.3.5.4. Độ bền màu trong thời gian bảo quản
Bột màu dành dành được bảo quản ở 4°C trong 12 tháng và độ hấp thụ được
xác định tại tháng 0; 6 và 12 bằng máy đo quang phổ UV-Vis ở bước sóng 440 nm.
2.3.6. Xử lý số liệu
Phần mềm Graphpad Prism 6.0 được dùng để phân tích hồi quy và xây dựng
biểu đồ đường cong đáp ứng liều trong thử nghiệm độc tính trên phôi cá ngựa vằn.
Phần mềm Excel 2010 được sử dụng để xác định đường tuyến tính và xử lý
các số liệu, tính toán các giá trị IC50, LD50.
Mối liên hệ giữa thể tích mẫu và hàm lượng được tính toán dựa trên công
thức sau đây:
22
Lê Thùy Ngân – K24 Sinh học thực nghiệm 2018
𝐶 = 𝑚 𝑉
Trong đó, C là nồng độ của mẫu (μg/ul), m là hàm lượng chất tan trong mẫu
tính (μg) và V là thể tích của mẫu (μl).
23
Lê Thùy Ngân – K24 Sinh học thực nghiệm 2018
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Phân tích hàm lượng crocin trong dịch chiết từ quả dành dành
3.1.1. Chuẩn bị dịch chiết
Hạt dành dành khô được chiết với nước theo các tỉ lệ từ 1:2,5 đến 1:20 (trọng
lượng: thể tích) ở 100ºC trong 5 phút. Sau đó, dịch chiết được lọc qua lưới (kích
thước mắt 20 - 40 µm) để loại bỏ cặn và sấy khô để thu được dạng bột màu vàng.
Khối lượng bột màu dành dành được ghi lại và so sánh với khối lượng hạt dành
30.00
24.74
23.17
22.79
22.56
25.00
16.92
20.00
15.00
dành nguyên liệu. Kết quả được thể hiện ở hình 6 dưới đây.
t ấ u s u ệ i
10.00
h %
5.00
0.00
1:2,5
1:5
1:15
1:20
1:10 Tỉ lệ nguyên liệu - dung môi (w/v)
Hình 6: Hiệu suất của quá trình chiết hạt dành dành
Kết quả cho thấy, tỉ lệ nguyên liệu - dung môi là 1:10 là tỉ lệ tối ưu nhất, khi
đó 30,0g hạt dành dành khô sau quá trình tách chiết thu được 7,42g bột khô, tương
đương với hiệu suất thu hồi là 24,74%.
3.1.2. Phân tích thành phần hoá học của dịch chiết bằng HPLC
Bột màu vàng từ dịch chiết hạt dành dành được hoà tan trong mung môi
methanol 80% và phân tích thành phần bằng hệ thống HPLC. Các điều kiện khác
nhau của HPLC bao gồm: loại cột sắc ký chạy HPLC (C18 của hãng Phenomenex
hoặc C18 của hãng Water), dung môi chạy (acetonitril hoặc methanol trong nước),
thời gian phân tích mẫu từ 18 - 45 phút đã được thử nghiệm nhằm tìm ra điều kiện
chạy HPLC tối ưu. Kết quả cho thấy, sự phân tách các đỉnh trên sắc ký đồ HPLC tốt
nhất khi sử dụng cột phân tích HPLC C18 của hãng Water, pha động là gradient của
24
Lê Thùy Ngân – K24 Sinh học thực nghiệm 2018
methanol trong nước với thời gian phân tích là 45 phút (hình 7), các hợp chất trong
mẫu được phát hiện ở 3 bước sóng 212 nm, 254 nm và 440 nm.
Kết quả phân tích dịch chiết từ hạt dành dành cho thấy, ở bước sóng 440 nm
có 5 đỉnh xuất hiện với các thời gian lưu là 26,2; 26,7; 28,2; 28,9 và 30,2 phút. Các
đỉnh này hấp thụ mạnh ở bước sóng 440 nm hơn là hấp thụ các bước sóng ngắn 212
nm và 254 nm. Phổ hấp thụ UV-Vis của 5 đỉnh này khi quét ở dải bước sóng 200 -
800 nm cũng xác định các hợp chất tương ứng với 5 đỉnh này có cực đại hấp thụ
xấp xỉ 440 nm (hình 8). Phổ UV-Vis của 5 hợp chất trùng với phổ hấp thụ của các
hợp chất crocin vì vậy chúng tôi nhận định ban đầu là có sự xuất nhiện của nhiều
chất crocin trong dịch chiết từ hạt dành dành.
(cột C18, gradient dung môi là 20% -100% methanol trong nước, thời gian phân
tích 45 phút)
Hình 7: Sắc ký đồ HPLC của dịch chiết dành dành ở các bước sóng 212 nm, 254 nm và 440 nm
25
Lê Thùy Ngân – K24 Sinh học thực nghiệm 2018
Hình 8: Phổ hấp thụ của dịch chiết dành dành ở bước sóng từ 200-800 nm
Bên cạnh dịch chiết từ quả dành dành mẫu crocin chuẩn được cung cấp bởi
hãng Sigma cũng được phân tích ở cùng điều kiện HPLC để làm mẫu tham chiếu.
Kết quả cho thấy, ở cùng bước sóng hấp thụ 440 nm, sắc ký đồ của chất chuẩn
crocin cũng xuất hiện 5 đỉnh ở các phút thứ 26,2; 26,7; 28,2; 28,9 và 30,2 phút.
Trong số 5 đỉnh xuất hiện thì đỉnh lớn nhất xuất hiện ở phút thứ 26,2 tương tự như ở
mẫu dịch chiết. Như vậy, có thể thấy rằng trong dịch chiết có chứa các thành phần
crocin tương tự như trong mẫu crocin chuẩn. Tuy nhiên, để xác định chính xác loại
crocin trong cả mẫu chất chuẩn và mẫu dịch chiết cần phải tiến hành các nghiên cứu
khác chẳng hạn như LC-MS nhằm xác định khối lượng phân tử của hợp chất.
Hình 9: Sắc ký đồ của mẫu chuẩn crocin ở các bước sóng 212 nm, 254 nm và 440 nm
26
Lê Thùy Ngân – K24 Sinh học thực nghiệm 2018
Bên cạnh việc quan sát ở bước sóng 440 nm, các thành phần hợp chất khác
ngoài crocin được phát hiện ở bước sóng thấp hơn là 212 nm và 254 nm. Kết quả
thể hiện trên sắc ký đồ hình 7 và 9 cũng cho thấy mẫu chuẩn chỉ chứa các hợp chất
crocin trong khi mẫu dịch chiết còn có lẫn nhiều chất khác, trong đó có các hợp chất
hấp thụ bước sóng 254 nm với thời gian lưu là 15,5; 17,6 và 24,2 phút; hợp chất hấp
thụ bước sóng 212 nm ở thời gian lưu là 2,6 phút. Điều này cũng hoàn toàn phù hợp
về độ tinh sạch của crocin trong mẫu dịch chiết, vì đây là dịch chiết thô chưa được
tinh sạch qua cột. Tuy nhiên kết quả phân tích bằng HPLC trên cũng khẳng định
bằng cách sử dụng nước làm dung môi tách chiết chúng tôi đã thu được nhiều loại
crocin tương tự như chất chuẩn thương mại.
3.1.3. Xác định thành phần crocin bằng LC-MS
Thành phần crocin trong mẫu chuẩn (mẫu tham chiếu) và trong dịch chiết
dành dành (mẫu thử nghiệm) được xác định bằng phương pháp đo phổ khối lượng
(LC-MS) ở chu kỳ 25 phút. Kết quả được minh hoạ ở hình 10 cho thấy: thành phần
crocin trong mẫu thí nghiệm hoàn toàn giống mẫu tham chiếu với 5 đỉnh ở các thời
gian lưu thời gian lưu 12,2; 12,7; 13,3; 16,2 và 17,1 phút. Phổ hấp thụ UV – Vis cho
thấy các chất xuất hiện ở 5 thời gian lưu này hoàn toàn giống nhau ở cả mẫu thí
nghiệm và mẫu tham chiếu (hình 11), đây cũng là phổ hấp phụ UV-Vis đặc trưng
của các chất thuộc nhóm crocin đã được công bố bởi Hadizadeh và cộng sự [11].
Tuy nhiên, tương quan về độ lớn của các đỉnh có sự khác nhau ở mẫu tham chiếu và
mẫu thí nghiệm chứng tỏ tỷ lệ về hàm lượng của mỗi loại crocin trong hai mẫu này
khác nhau.
27
Lê Thùy Ngân – K24 Sinh học thực nghiệm 2018
Hình 10: Sắc kí đồ LC-MS của mẫu crocin tham chiếu (A) và dịch chiết (B) tại bước sóng 440 nm
Hình 11: Phổ UV của crocin trong mẫu tham chiếu và mẫu thử nghiệm Phổ khối của các chất tương ứng với 5 đỉnh trên sắc ký đồ trích xuất từ phần
mềm của hệ thống LC-MS. Kết quả cho thấy 4 trong 5 đỉnh trên xuất hiện số khối,
riêng đỉnh P5 không xuất hiện số khối ở cả hai mẫu. Kết quả số khối của các chất
được trình bày ở bảng 5 và được minh hoạ trong hình 12 và hình 13.
28
Lê Thùy Ngân – K24 Sinh học thực nghiệm 2018
Bảng 5: Số khối của các hợp chất tương ứng với các đỉnh P1-P4
Số khối ở trạng thái Số khối ở trạng thái Khối lượng
Đỉnh ion dương [M+Na]+ ion âm [M+Cl]- phân tử
(m/z) (m/z) (Dalton)
P1 999 1011 [M+Cl]- 976
P2 999 1011 [M+Cl]- 976
P3 837 849 [M+Cl]- 814
P4 999 1011 [M+Cl]- 976
Dựa vào phổ khối ESI ở bảng 5 cho thấy ở cả hai mẫu dịch chiết và mẫu
tham chiếu đều chứa 3 chất tương ứng với các đỉnh P1, P2 và P4 đều có khối lượng
phân tử 976 Dalton. Chứng tỏ, cả 3 chất này đều là crocin-1 hay còn gọi là α-crocin
như đã được khẳng định trong công bố của Srivastava và cộng sự [28]. Sở dĩ hợp
chất crocin-1 có xuất hiện nhiều đỉnh trên sắc ký đồ là do hợp chất này tồn tại ở các
dạng đồng phân khác nhau, mỗi loại đồng phân lại có độ phân cực khác nhau. Do
vậy, trong quá trình phân tách qua cột sắc ký các đồng phân này xuất hiện ở các thời
gian lưu khác nhau. Chất tương ứng với đỉnh P3 có trọng lượng phân tử 814 Dalton,
chứng tỏ đây là hợp chất crocin-2. Loại crocin này cũng đã được công bố bởi tác giả
Srivastava và cộng sự [28] với trọng lượng phân tử là 814 Dalton.
29
Lê Thùy Ngân – K24 Sinh học thực nghiệm 2018
[M + Cl]-
Hình 12: Phổ khối ESI ở trạng thái ion âm của đỉnh chính (P1) trong dịch chiết
Hình 13 : Phổ khối ESI ở trạng thái ion âm của đỉnh P3 trong dịch chiết
30
Lê Thùy Ngân – K24 Sinh học thực nghiệm 2018
Như vậy, trong mẫu dịch chiết và mẫu crocin tham chiếu đều có chứa 2
thành phần crocin là crocin-1 và crocin-2. Hàm lượng của hai loại crocin này trong
dịch chiết và trong mẫu chuẩn được xác định bởi tương quan diện tích của các đỉnh
tương ứng nhờ phương pháp HPLC phân tích trong thí nghiệm tiếp theo.
3.1.4. Xác định hàm lượng crocin trong dịch chiết dành dành
Mẫu chất chuẩn crocin được hòa tan trong methanol 80% ở nồng độ
0,5mg/mL và được phân tích ở 5 nồng độ khác nhau (các hình PL1-PL5 trong phụ
lục) nhằm xây dựng đường tuyến tính giữa hàm lượng crocin và diện tích của các
đỉnh tương ứng. Sau đó, dịch chiết dành dành ở nồng độ 2,0 mg/mL được phân tích
ở cùng một điều kiện HPLC để hồi quy hàm lượng crocin tổng số (crocin-1 và
crocin-2) dựa vào diện tích các đỉnh P1-P4.
Hình 14: Sắc ký đồ HPLC của mẫu chuẩn crocin ở hàm lượng 5µg
31
Lê Thùy Ngân – K24 Sinh học thực nghiệm 2018
Hình 15: Sắc ký đồ HPLC của dịch chiết dành dành ở hàm lượng 20 µg Bảng 6: Diện tích của các đỉnh P1-P4 trên sắc ký đồ HPLC của mẫu chuẩn tại bước
sóng 440 nm
Hàm Thể lượng mẫu tích Tổng diện chuẩn Diện tích Diện tích Diện tích Diện tích bơm tích của tương ứng P1 P2 P3 P4 mẫu các đỉnh với thể (crocin-1) (crocin-1) (crocin-2) (crocin-1) chuẩn crocin tích bơm (µl) mẫu (µg)
10 5,0 3140246 282438 440670 839200 4702554
15 7,5 3999925 391980 570000 1106134 6068038
20 10,0 5330577 594978 792526 1544730 8262811
25 12,5 6960347 757630 1117593 1874052 10709622
30 15,0 8440921 883590 1278491 2459022 13062024
32
Lê Thùy Ngân – K24 Sinh học thực nghiệm 2018
Diện tích của các đỉnh P1 – P4 trên sắc ký đồ HPLC (minh hoạ trên hình 14)
và hàm lượng mẫu crocin chuẩn qua mỗi chu kỳ phân tích được trình bày trong
bảng 6. Số liệu trên cho thấy mối tương quan thuận giữa hàm lượng mẫu và diện
tích của các đỉnh của crocin chuẩn. Từ đó phương trình hồi quy tuyến tính được xây
dựng là y = 854421x + 16800 với x là hàm lượng crocin tổng số trong mẫu chuẩn, y
là tổng diện tích các đỉnh crocin và được trình bày trong hình 16. Hệ số tương quan
R2 = 0,99 cho khoảng hàm lượng 5-15 μg cho thấy tỉ lệ diện tích đỉnh sắc ký của
crocin và hàm lượng của chất chuẩn phụ thuộc tuyến tính một cách chặt chẽ với. Do
đó, đường chuẩn này được sử dụng để xác định hàm lượng crocin tổng số trong dịch
chiết dành dành ở khoảng tuyến tính đã khảo sát này.
14000000.0
n
12000000.0
y = 854421x + 16800 R² = 0,99
i c o r c h n
10000000.0
ỉ
8000000.0
6000000.0
đ c á c h c í t n ệ i
4000000.0
2000000.0
d g n ổ T
0.0
0.0 10.0 15.0 5.0
20.0 Hàm lượng crocin tổng số trong mẫu chuẩn (μg)
Hình 16: Đường chuẩn của mẫu chuẩn crocin
Để phân tích hàm lượng crocin trong dịch chiết dành dành, 20μg bột dịch
chiết được hoà tan trong 80% methanol và bơm vào hệ thống HPLC với các điều
kiện phân tích tương tự như phân tích mẫu crocin chuẩn. Kết quả về diện tích các
đỉnh sắc ký và hàm lượng crocin trong mẫu dịch chiết được trình ở bảng 7 dưới đây.
33
Lê Thùy Ngân – K24 Sinh học thực nghiệm 2018
Bảng 7: Diện tích các đỉnh trong sắc ký đồ của dịch chiết (bước sóng 440 nm) và
hàm lượng crocin trong mẫu dịch chiết
Đỉnh sắc ký Diện tích Tổng diện tích đỉnh sắc ký
Diện tích đỉnh sắc ký của mỗi loại crocin Tỷ lệ crocin trong dịch chiết (%) Tỉ lệ tương đối giữa các thành phần crocin (%) Hàm lượng crocin (µg) tính theo đường chuẩn
5305859
77508 6219934 85,64
7262539 8,48 42,4
836567
1042603 1042603 14,36 P1 (crocin-1) P2 (crocin-1) P4 (crocin-1) P3 (crocin-2)
Từ số liệu ở bảng 7, có thể thấy rằng tổng diện tích đỉnh sắc ký của crocin là
7262539. Dựa trên phương trình trình hồi quy tuyến tính đã xây dựng là y =
854421x + 16800 với x là hàm lượng crocin trong mẫu chuẩn, y là tổng diện tích
các đỉnh crocin thì hàm lượng tương đối của crocin trong dịch chiết được xác định
là 8,48 μg, chiếm 42,4% khối lượng của bột dịch chiết. Trong nghiên cứu của các
tác giả Jiang Zhiguo và cộng sự năm 2010, bằng phương pháp sắc ký ngược dòng
cô quay chậm (slow rotary countercurrent chromatography- SRCCC) với hệ dung
môi là methyl tert-butyl ether, n-butanol, acetonitrile và nước (2:2.5:1:5, tính theo tỉ
lệ thể tích) thu được 2,47 g crocin từ 5g dịch chiết thô, tương đương với 49,4%
[39]. Hàm lượng crocin tổng số thu được theo nghiên cứu của chúng tôi thấp hơn
không đáng kể so với nghiên cứu của Jiang Zhihou, đồng thời phương pháp chiết sử
dụng dung môi nước đảm bảo tính an toàn cao trong định hướng ứng dụng dịch
chiết để làm phẩm màu thực phẩm.
Ngoài ra, tỉ lệ giữa diện tích các đỉnh sắc ký của crocin-1 (đỉnh P1, P2 và P4)
và crocin-2 (đỉnh P3) cho thấy crocin-1 chiếm tỉ lệ 85,6% (tương đương với hàm
34
Lê Thùy Ngân – K24 Sinh học thực nghiệm 2018
lượng 7,26 μg) và crocin-2 chiếm tỉ lệ 14,36% (tương đương với hàm lượng 1,22
μg) trong tổng số crocin. Như vậy, so với khối lượng toàn bộ dịch chiết thì crocin-1
chiếm 36,3% và crocin-2 chiếm 6,1%. Theo nghiên cứu của Shao-cheng Chen và
cộng sự năm 2017, trong dịch chiết methanol 70% từ quả dành dành chứa genipin,
gentiobioside, gardenoside, crocin-1 và crocin-2 với hàm lượng lần lượt là 1,03%,
5,90%, 1,26% và 0,17% [5]. Như vậy, có thể thấy rằng, dung môi nước cho thấy
khả năng tách chiết được crocin-1 và crocin-2 với hàm lượng cao hơn so với dung
môi methanol.
3.2. Khảo sát tác dụng chống oxi hoá của dịch chiết dành dành
Để khảo sát tác dụng chống oxi hóa của dịch chiết dành dành, khả năng
chống oxi hóa của dịch chiết dành dành được xác định bằng khả năng khử gốc tự do
DDPH (1,1-diphenyl-1- picrylhydrazyl) và được so sánh, đánh giá với axit ascorbic,
một hợp chất chống oxi hóa đã biết, kết quả được thể hiện ở hình 17.
Kết quả minh hoạ ở hình 17 cho thấy rằng hoạt tính khử gốc tự do DDPH
của dịch chiết dành dành phụ thuộc vào nồng độ, cụ thể hơn khi nồng độ càng cao
thì hoạt tính của dịch chiết càng lớn. Mức độ ức chế lớn nhất là 91% ở nồng độ dịch
chiết dành dành là 1,0 g/L. Giá trị IC50 của dịch chiết dành dành là 0,33 g/L trong
khi giá trị này của axit ascorbic (một hợp chất chống oxi hóa đã biết) là 0,02 g/L.
Như vậy, dịch chiết dành dành có thể hiện khả năng chống oxi hóa, mặc dù hoạt
tính chống oxi hóa của nó yếu hơn axit ascorbic. Điều này cho thấy, dịch chiết từ
dành dành rất tốt để ứng dụng làm màu thực phẩm thay thế màu thực phẩm tổng
hợp bởi vì chúng không những tạo nên màu sắc đẹp cho thực phẩm mà còn mang lại
lợi ích cho sức khỏe của con người.
35
100.
75.
50.
Lê Thùy Ngân – K24 Sinh học thực nghiệm 2018
Dịch chiết dành dành
ế h c c Ứ %
Axit ascorbic
25.
0.
0.005
0.01
0.05
0.1
0.2
0.4
0.8
1
Nồng độ (g/L)
Hình 17: Hoạt tính chống oxi hóa của dịch chiết dành dành so với axit ascorbic
3.3. Khảo sát tính an toàn của chế phẩm màu
Sắc tố vàng được chiết xuất từ hạt dành dành từ lâu đã được sử dụng như
một loại phẩm màu trong ngành công nghiệp chế biến thực phẩm. Tuy nhiên, hiện
nay vẫn chưa có nhiều kết quả thử nghiệm về độ an toàn của dịch chiết dành dành,
do vậy việc kiểm tra và đánh giá độc tính của dành dành là điều thực sự cần thiết để
cho người tiêu dùng biết được mức độ an toàn của sản phẩm bột màu từ dành dành.
3.3.1. Đánh giá độc tính của dịch chiết dành dành trên chuột
Chuột nhắt trắng Swiss được cho uống dịch chiết dành dành ở các mức liều
là 2062 mg/kg, 4125 mg/kg, 8250 mg/kg, 16500 mg/kg và 33000 mg/kg trọng
lượng cơ thể (dịch chiết dành dành được pha trong nước). Sau 72 giờ nghiên cứu,
tất cả các con chuột đều sống sót và khỏe mạnh. Kể cả ở liều sử dụng cao lên đến
33,0 g/kg trọng lượng cơ thể thì các con chuột vẫn không có bất kỳ biểu hiện bất
thường nào, đó đó cũng chưa thể xác định được giá trị LD50 của dịch chiết dành
dành. Ở một số nghiên cứu trước đó của Sato và cộng sự năm 2007 về độc tính của
dịch chiết dành dành trên chuột cho thấy rằng chuột 13 tuần tuổi sau 3 tháng sử
dụng bột dịch chiết dành dành chứa 2,783% geniposide (hàm lượng tương đương
với 60 mg/kg/ngày) vẫn hoàn toàn khỏe mạnh [25]. Như vậy, kết quả nghiên cứu
của chúng tôi cùng hoàn toàn phù hợp về mức độ an toàn của dịch chiết dành dành
trên đối tượng nghiên cứu chuột nhắt trắng.
36
Lê Thùy Ngân – K24 Sinh học thực nghiệm 2018
3.3.2. Đánh giá ảnh hưởng lên phát triển của phôi cá ngựa vằn
Số lượng phôi chết ở các thời điểm 24h, 48h và 72h sau khi phơi nhiễm với
các nồng độ dịch chiết được thống kê và biểu diễn dưới dạng đường cong đáp ứng
liều (Hình 18).
Hình 18 : Biểu đồ thể hiện tỷ lệ phôi chết khi phơi nhiễm với dịch chiết dành dành Nhìn chung, ảnh hưởng độc tính của dịch chiết dành dành lên phôi cá tăng
dần theo thời gian và nồng độ. Sau 24 giờ phơi nhiễm, dịch chiết gần như không
gây ảnh hưởng đến sức sống của phôi cá, không xuất hiện phôi chết ở cả 7 nồng độ
thí nghiệm. Tại thời điểm 48 giờ, bắt đầu quan sát được những ảnh hưởng độc tính
của dịch chiết ở các nồng độ cao 4, 8, 12 g/L, tỷ lệ phôi chết tăng dần theo nồng độ:
0% ở nồng độ thấp hơn 4 g/L, xấp xỉ 5% ở nồng độ 4 g/L và 55% ở nồng độ 12 g/L.
Tại thời điểm kết thúc thử nghiệm (72 giờ), tỷ lệ tử vong tiếp tục tăng đều ở tất cả
các nồng độ, ở nồng độ 12 g/L đạt tới 100%, nồng độ 8 g/L đạt 80% và nồng độ 2
g/L đã tăng tới 10%, ấu thể phơi nhiễm với nồng độ 0,1, 0,5 và 1 g/L không bị ảnh
hưởng đáng kể lên sức sống. Bằng phần mềm Graphpad Prism, chúng tôi tính toán
được LC50 tại thời điểm 72h của dịch chiết dành dành là 4,9 g/L. Hiện nay, đã có
một số nghiên cứu in vivo và in vitro về độc tính của dịch chiết dành dành [4, 36],
trong đó liều dùng trong các thử nghiệm dược tính của dịch chiết thường dao động
từ 50 mg/kg – 200 mg/kg/ngày thấp hơn so với nồng độ không quan sát thấy ảnh
hưởng trên phôi cá ngựa vằn (0,5 g/L) và thấp hơn rất nhiều liều bắt đầu gây chết
37
Lê Thùy Ngân – K24 Sinh học thực nghiệm 2018
(2,0 g/L). Như vậy, có khoảng cách về liều mang hiệu quả dược tính và liều gây độc
cấp tính, cho thấy dịch chiết tương đối an toàn. Tuy nhiên, vẫn cần thêm những
nghiên cứu đánh giá về ảnh hưởng của dịch chiết khi sử dụng liên tục kéo dài ở liều
cao, trong một nghiên cứu của Yutaka và cộng sự thực hiện khảo sát trên 52 bệnh
nhân cùng sử dụng các sản phẩm chứa dịch chiết từ quả dành dành với liều lượng
dao động từ 1-3 g trong thời gian dài (trung bình 11 năm), 10 người trong số đó
mang chứng xơ cứng tĩnh mạch mạc treo tràng trên. Kết quả cho thấy nhóm mang
bệnh sử dụng nhiều sản phẩm từ dịch chiết dành dành hơn hẳn so với nhóm không
mắc bệnh, với lượng dịch chiết tích lũy ở nhóm mang bệnh 6539,0 g so với 997,5 g
ở nhóm so sánh. Nhóm nghiên cứu đã đưa ra khuyến cáo rằng việc sử dụng liên tục
dịch chiết dành dành ở liều cao trong thời gian dài có khả năng gây xơ cứng tĩnh
mạch mạc treo tràng trên [23].
Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng phôi cá ngựa vằn là đối tượng rất
mẫn cảm với các độc tố từ môi trường sống. Những dấu hiệu bất thường về hình
thái được quan sát sau mỗi 24 giờ cho tới thời điểm 72 giờ và được minh hoạ như ở
hình 19 dưới đây. Sau khi phơi nhiễm với dịch chiết dành dành, trong 48 giờ đầu
không quan sát được những thay đổi đáng kể về hình thái phôi cá ngựa vằn. Đến
thời điểm 72 giờ, một số ấu thể cá ngựa vằn xuất hiện những bất thường về hình
thái bên ngoài như: noãn hoàng đen, mất sắc tố, noãn hoàng chia cắt bất thường và
tụ máu ở màng noãn hoàng. Những dị dạng này có phân bố theo nồng độ khác nhau:
hiện tượng noãn hoàng chia cắt bất thường chỉ quan sát được ở các nồng độ khá
thấp như 1-2 g/L trong khi đó ảnh hưởng lên sắc tố của cá lại chỉ quan sát thấy ở các
nồng độ cao hơn như 4-12 g/L. Tụ máu và noãn hoàng đen là 2 dị dạng ít phổ biến
hơn và không phụ thuộc nồng độ, có thể giả thiết rằng chúng là biểu hiện ảnh hưởng
của hóa chất lên những cá thể nhạy cảm hơn trong quần thể. Như vậy, có thể thấy
rằng sau thời gian 72 giờ khảo sát thử nghiệm, các nồng độ 0,1; 0,5 và 1 g/L là nồng
độ an toàn đối với phôi cá ngựa vằn.
38
Lê Thùy Ngân – K24 Sinh học thực nghiệm 2018
Hình 19: Hình ảnh dị dạng của phôi cá ngựa vằn ở thời điểm 72h khi phơi nhiễm với dịch chiết dành dành nồng độ trên 1g/L A.Đối chứng; B,C: Noãn hoàng đen; D,E: Mất sắc tố; F: noãn hoàng phân cắt bất
thường; G: Tụ máu; Mũi tên màu đen chỉ ra các điểm bất thường.
3.4. Khảo sát một số tính chất vật lý của chế phẩm màu vàng
3.4.1. Độ hòa tan
Độ hòa tan của bột màu là một tiêu chí quan trọng để đánh giá khả năng ứng
dụng làm màu thực phẩm. Ngoài ra, độ hòa tan cũng ảnh hưởng đến khả năng thực
hiện các thí nghiệm tiếp theo nhằm đánh giá các tính chất hóa học và sinh học của
bột dành dành.
39
Lê Thùy Ngân – K24 Sinh học thực nghiệm 2018
0,1 g/L 0,4 g/L 0,8 g/L
Hình 20: Độ hòa tan của bột chế phẩm màu dành dành trong nước
Dựa vào kết quả ở hình trên, có thể thấy rằng bột dành dành có thể tan hoàn
toàn tốt trong nước để tạo thành dạng dung dịch đồng nhất ở cả 3 nồng độ khác
nhau là 0,1 g/L, 0,4 g/L và 0,8 g/L. Khả năng tan tốt trong nước của bột màu dành
dành được đánh giá là tương đương với phẩm màu tổng hợp Tartrazine đang được
lưu thông trên thị trường hiện nay.
3.4.2. Khả năng chịu pH
Bên cạnh độ hòa tan thì độ bền màu đối với pH cũng là yếu tố quan trọng để
đánh giá khả năng ứng dụng làm phẩm màu của bột dành dành. Trong quá trình chế
biến thực phẩm không thể tránh khỏi việc phối trộn nhiều nguyên liệu khác nhau,
do đó có thể ảnh hưởng độ pH của thực phẩm. Do đó, bột dành dành nếu có độ ổn
định cao trong các điều kiện pH khác nhau thì sẽ là một ưu điểm lớn trong việc ứng
dụng nó để làm phẩm màu thực phẩm.
Ảnh hưởng của pH đối với độ bền màu của sắc tố vàng trong dịch chiết dành
dành được thể hiện trong Hình 21. Dịch chiết dành dành thu được ngay sau quá
trình tách chiết có độ pH bằng 5,6 và có độ bền màu là 100%. Dịch chiết dành dành
sau đó được xử lý bằng dung dịch NaOH và dung dịch HCl nhằm điều chỉnh độ pH
của dịch chiết từ 1,0 đến 12,0. Kết quả minh họa ở hình 21 cho thấy rằng sắc tố
vàng có độ ổn định cao trong các điều kiện pH từ 1,0 đến 12,0 với độ bền màu trên
90%. Cụ thể hơn, sắc tố vàng trong dịch chiết dành dành có độ bền màu cao nhất ở
dải pH từ 9,0 đến 12,0.
40
138
106.5
100.0
98.3
97.0
110
94.0
Lê Thùy Ngân – K24 Sinh học thực nghiệm 2018
)
92.0
91.5
%
(
83
55
u à m n ề b ộ Đ
28
00
2
3
4
7
10
12
5.6 pH
Hình 21: Ảnh hưởng của độ pH đến độ bền màu của dịch chiết dành dành
3.4.3. Khả năng chịu nhiệt
Độ bền màu của dịch chiết dành dành được khảo sát ở dải nhiệt độ từ 40 đến
100ºC, kết quả về khả năng chịu nhiệt của dịch chiết dành dành như được thể hiện ở
Hình 22.
Kết quả cho thấy độ bền màu của sắc tố vàng bị giảm nhẹ tương ứng với sự
tăng lên của nhiệt độ. Độ bền màu của sắc tố vàng bị giảm nhiều nhất ở nhiệt độ
100ºC với mức giảm 11,5% so với ở nhiệt độ 40ºC độ bền màu chỉ giảm 1,7%. Tuy
nhiên, sự giảm độ bền màu như vậy là không đáng kể. Do đó, có thể kết luận rằng
sắc tố vàng trong dịch chiết dành dành tương đối bền ở nhiệt độ cao. Tính chất này
cũng cho thấy dịch chiết dành dành rất có tiềm năng trong việc ứng dụng để làm
phẩm màu thực phẩm vì chúng sẽ ít bị biến đổi bởi nhiệt độ trong suốt quá trình chế
105
98.3
96.7
96.6
biến thực phẩm, nhất là quá trình chế biến ở nhiệt độ cao.
)
94.9
98
%
(
90.5
90.3
88.5
90
u à m n ề b ộ Đ
83
75 Nhiệt độ
40˚C
50˚C
60˚C
70˚C
80˚C
90˚C 100˚C
Hình 22: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền màu của dịch chiết dành dành
41
Lê Thùy Ngân – K24 Sinh học thực nghiệm 2018
3.4.4. Độ bền màu trong thời gian bảo quản
Bột dành dành được bảo quản trong thời gian 12 tháng ở nhiệt độ 4ºC, kết
100%
98%
96%
quả khảo sát về độ bền màu được thể hiện ở Hình 23.
)
%
(
u à m n ề b ộ Đ
100% 95% 90% 85% 80% 75% 70% 65% 60% 55% 50%
0
12
6 Thời gian bảo quản (tháng)
Hình 23: Ảnh hưởng của thời gian bảo quản đến độ bền màu của bột dành dành
Độ bền màu của bột dành dành sau thời gian bảo quản 0, 6 và 12 tháng có sự
chênh lệch rất nhỏ. Sau 1 năm bảo quản trong điều kiện 4ºC, độ bền màu của bột
dành dành vẫn giữ được ở mức 96%, chỉ giảm so với ban đầu 4%. Điều này cho
thấy, có thể bảo quản bột dành dành ở điều kiện 4ºC trong thời gian dài mà không
làm ảnh hưởng quá nhiều đến chất lượng màu sắc của chúng.
3.5. Đánh giá một số chỉ tiêu an toàn thực phẩm của chế phẩm
Để đánh giá khả năng đưa ra thị trường dưới dạng phẩm màu thực phẩm của
dịch chiết dành dành với thành phần chính là crocin, mẫu bột màu crocin được gửi
đến cơ quan được Bộ Y tế chỉ định có thẩm quyền xác định các chỉ tiêu an toàn thực
phẩm. Bất kỳ sản phẩm thực phẩm trước khi đưa ra lưu thông trên thị trường phải
được công bố phù hợp quy định an toàn thực phẩm. Vì vậy việc đáp ứng một số tiêu
chuẩn cơ bản theo quy định của pháp luật đối với thực phẩm là một trong những
điều kiện tiên quyết.
3.5.1. Đánh giá các chỉ tiêu về vi sinh vật
Như đã đề cập ở phía trên, giới hạn ô nhiễm vi sinh vật trong thực phẩm là
mức giới hạn tối đa vi sinh vật được phép có trong thực phẩm, đây là một trong
những tiêu chí nhằm đánh giá mức độ an toàn sinh học của một sản phẩm thực
phẩm trước khi đưa ra thị trường. Các phương pháp thử nhằm xác định giới hạn ô
42
Lê Thùy Ngân – K24 Sinh học thực nghiệm 2018
nhiễm vi sinh vật được đề cập đến trong các tài liệu TCVN 8881:2011, TCVN
7924-2:2008, TCVN 7924-2:2008... Kết quả đánh giá về các chỉ tiêu vi sinh vật
được thể hiện ở bảng 8 dưới đây.
Bảng 8: Kết quả đánh giá các chỉ tiêu vi sinh vật của dịch chiết dành dành
STT Tên chỉ tiêu Phương pháp thử Kết quả thử nghiệm Kết luận
Pseudomon Dưới 1,0x101 1 TCVN 8881:2011 Đạt as CFU/g
TCVN 7924- Dưới 1,0x101 2 E.coli Đạt 2:2008 CFU/g
TCVN 7924- Dưới 1,0x101 3 Coliforms Đạt 2:2008 CFU/g
Các thử nghiệm được thực hiện bởi Phòng Thí nghiệm Hóa sinh, Trung tâm
chứng nhận phù hợp (QUACERT), Tổng cục tiêu chuẩn đo lường chất lượng. Tham
chiếu các quy chuẩn kỹ thuật quốc gia đối với ô nhiễm vi sinh vật trong thực phẩm
nêu trong QCVN 8-3: 2012/BYT, cả 3 kết quả về chỉ tiêu vi sinh vật đều dưới giá
trị giới hạn dưới của giới hạn cho phép 1,0x101 CFU/g. Các kết quả này cho thấy
sản phẩm phẩm màu được tạo ra đảm bảo tính an toàn.
3.5.2. Đánh giá các chỉ tiêu về hàm lượng kim loại nặng
Tương tự như giới hạn về ô nhiễm vi sinh vật thì giới hạn ô nhiễm đối với
kim loại nặng cũng là một trong những tiêu chí để đánh giá mức độ an toàn của sản
phẩm thực phẩm. Một số chỉ tiêu đối với kim loại chì, cadimi và asen được xác định
và kết quả thử nghiệm của dịch chiết dành dành được thể hiện như bảng 9 dưới đây.
Bảng 9: Kết quả đánh giá các chỉ tiêu kim loại nặng của dịch chiết dành dành
Phương pháp STT Tên chỉ tiêu Kết quả thử nghiệm Kết luận thử
TCVN Không phát hiện 1 Chì Đạt 7602:2007 (LOD 0,02 mg/kg)
AOAC Không phát hiện 2 Cadimi Đạt 999.11.2012 (LOD 0,02 mg/kg)
43
Lê Thùy Ngân – K24 Sinh học thực nghiệm 2018
AOAC Không phát hiện 3 Asen Đạt 986.15.2012 (LOD 0,5 mg/kg)
Các thử nghiệm được thực hiện bởi Phòng Thí nghiệm Hóa sinh, Trung tâm
chứng nhận phù hợp (QUACERT), Tổng cục tiêu chuẩn đo lường chất lượng, các
kết quả được tham chiếu với QCVN 8-2:2011/BYT là quy chuẩn kỹ thuật quốc gia
đối với giới hạn ô nhiễm kim loại nặng trong thực phẩm. Giới hạn ô nhiễm kim loại
nặng là mức tối đa hàm lượng kim loại nặng đó được phép có trong thực phẩm, cụ
thể hơn giới hạn của asen là 0,5mg/kg, chì 0,02mg/kg, cadimi là 0,02mg/kg. Kết
quả cho thấy trong sản phẩm đều không phát hiện được chì, asen hay cadimi.
Với các kết quả trên, có thể tin tưởng rằng, dịch chiết dành dành hoàn toàn
có thể đạt các điều kiện tiêu chuẩn để đưa vào sản xuất đại trà và đưa ra thị trường
dưới dạng phẩm màu thực phẩm.
44
Lê Thùy Ngân – K24 Sinh học thực nghiệm 2018
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Kết luận
1. Crocin là thành phần tạo màu chính trong dịch chiết dành dành chiếm 42,4% so
với khối lượng của bột dịch chiết, bao gồm crocin-1 với khối lượng phân tử 976
Dalton và crocin-2 với khối lượng phân tử 814 Dalton.
2. Dịch chiết dành dành có hoạt tính chống oxi hóa với giá trị IC50 là 0,33 g/L.
3. Dịch chiết dành dành không gây độc tính trên chuột ở mức liều cao 33,0g/kg,
nhưng lại có ảnh hưởng tăng dần lên phôi cá theo thời gian và nồng độ. Giá trị
LC50 tại thời điểm 72h của dịch chiết dành dành là 4,9 g/L; nồng độ không gây
dị dạng lên phôi cá ngựa vằn là 0,1-1g/L.
4. Chế phẩm bột màu vàng từ hạt dành dành có độ hòa tan tốt trong nước, chịu được
khoảng pH rộng từ 1-12, bền với nhiệt độ cao lên đến 100ºC và có khả năng giữ
màu 96% sau thời gian bảo quản 12 tháng ở 4ºC.
5. Chế phẩm bột màu vàng từ hạt dành dành đảm bảo một số chỉ tiêu về vệ sinh an
toàn thực phẩm như chỉ tiêu vi sinh vật (Pseudomonas, E.coli, Coliforms) dưới
giá trị giới hạn dưới cho phép (1,0x101 CFU/g) và không phát hiện được kim loại
nặng (chì, cadimi, asen) trong chế phẩm.
Kiến nghị
Tiếp tục đánh giá một số chỉ tiêu an toàn thực phẩm khác của bột màu vàng từ
dịch chiết hạt dành dành nhằm đưa chế phẩm ra thị trường.
45
Lê Thùy Ngân – K24 Sinh học thực nghiệm 2018
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt
1. Nguyễn Thị Thanh Thủy, Nguyễn Thị Hiển (2016), "Chiết tách và khảo sát độ
bền của chất màu crocin từ quả dành dành", Tạp chí Khoa học Nông nghiệp Việt
Nam, 14(12), tr. 1978-1985.
2. Đào Thị Vui, Giang Thị Sơn, Mai Hải Yến (2001), "Nghiên cứu thành phần hoá
học và thăm dò độc tính cấp của quả dành dành (Gardenia jasminoides)", Tạp chí
Dược học, 9, tr. 12-14.
Tiếng Anh
3. Brand-Williams W., Cuvelier M.-E., and Berset C., (1995), "Use of a free radical
method to evaluate antioxidant activity", LWT - Food Science and Technology,
28(1), pp. 25-30.
4. Chen J., Shi B., Xiang H., Hou W., Qin X., Tian J., and Du G., (2015), "1H
NMR-based metabolic profiling of liver in chronic unpredictable mild stress rats
with genipin treatment", Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 115,
pp. 150-158.
5. Chen S., Zhao X., Yi R., Qian J., Shi Y., and Wang R., (2017), "Anticancer
effects of Gardenia jasminoides in HepG2 human hepatoma cells", Biomedical
Research, 28(2), pp. 716-726.
6. Chen Y., Cheng Y., Tzeng C., Lee Y., Chang Y., Lee S., Tsai C., Chen J., Tzen
J.T.C., and Chang S.L., (2014), "Peroxisome proliferator-activated receptor
activating hypoglycemic effect of Gardenia jasminoides Ellis aqueous extract and
improvement of insulin sensitivity in steroid induced insulin resistant rats", BMC
Complementary and Alternative Medicine, 14, pp. 30.
7. FAO, (2004), "CURCUMIN", Chemical and Technical Assessment 61st JECFA.
8. Fu Y., Liu B., Liu J., Liu Z., Dejie, Liang, Li F., Li D., Cao Y., Zhang X., Zhang
N., and Yang Z., (2012), "Geniposide, from Gardenia jasminoides Ellis, inhibits the
inflammatory response in the primary mouse macrophages and mouse models",
International Immunopharmacology, 14(4), pp. 792-798.
46
Lê Thùy Ngân – K24 Sinh học thực nghiệm 2018
9. Gao L. and Zhu B.-Y., (2013), "The Accumulation of Crocin and Geniposide
and Transcripts of Phytoene Synthase during Maturation of Gardenia jasminoides
Fruit", Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine, pp. 686351.
10. H L., L Y., J C., X G., Y M., Y C., P L., and C Z., (2015), "Analysis of volatile
ingredients in Gardeniae Fructus and its processed products by GC-MS", J Tradit
Chin Med, 40(9), pp. 1732-1737.
11. Hadizadeh F., Mohajeri S.A., and Seifi M., (2010), "Extraction and Purification
of Crocin from Saffron Stigmas Employing a Simple and Efficient Crystallization
Method", Pakistan Journal of Biological Sciences, 13, pp. 691-698.
12. Hausenblas H.A., Heekin K., Mutchie H.L., and Anton S., (2015), "A
systematic review of randomized controlled trials examining the effectiveness of
saffron (Crocus sativus L.) on psychological and behavioral outcomes", J Integr
Med, 13, pp. 231-240.
13. He W., Gao Y., Yuan F., Bao Y., Liu F., and Dong J., (2010), "Optimization of
Supercritical Carbon Dioxide Extraction of Gardenia Fruit Oil and the Analysis of
Functional Components", Journal of the American Oil Chemists' Society, 87(9), pp.
1071-1079.
14. Hong I.K., Jeon H., and Lee S.B., (2015), "Extraction of natural dye from
Gardenia and chromaticity analysis according to chi parameter", Journal of
Industrial and Engineering Chemistry, 24, pp. 326-332.
15. İnanç A.L., (2011), "Chlorophyll: Structural Properties, Health Benefits and Its
Occurrence in Virgin Olive Oils ", Academic Food Journal 9(2), pp. 26-32.
16. Kaji T., Hayashi T., Nsimba M., Kaga K., Ejiri N., and Sakuragawa N., (1991),
"Gardenia Fruit Extract Does Not Stimulate the Proliferation of Cultured Vascular
Smooth Muscle Cells, A10", Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 39(5), pp.
1312-1314.
17. Khoo H.E., Azlan A., Tang S.T., and Lim S.M., (2017), "Anthocyanidins and
anthocyanins: colored pigments as food, pharmaceutical ingredients, and the
potential health benefits", Food Nutr Res, 61(1), pp. 1361779.
18. Kojima K., Shimada T., Nagareda Y., Watanabe M., Ishizaki J., Sai Y.,
Miyamoto K.-i., and Aburada M., (2011), "Preventive Effect of Geniposide on
47
Lê Thùy Ngân – K24 Sinh học thực nghiệm 2018
Metabolic Disease Status in Spontaneously Obese Type 2 Diabetic Mice and Free
Fatty Acid-Treated HepG2 Cells", Biological and Pharmaceutical Bulletin, 34(10),
pp. 1613-1618.
19. Lee J.H., Lee D.U., and Jeong C.S., (2009), "Gardenia jasminoides Ellis
ethanol extract and its constituents reduce the risks of gastritis and reverse gastric
lesions in rats", Food and Chemical Toxicology, 47(6), pp. 1127-1131.
20. Lin W.H., Kuo H.H., Ho L.H., Tseng M.L., Siao A.C., Hung C.T., Jeng K.C.,
and Hou C.W., (2015), "Gardenia jasminoides extracts and gallic acid inhibit
lipopolysaccharide-induced inflammation by suppression of JNK2/1 signaling
pathways in BV-2 cells", Iranian J Basic Med Sci, 18, pp. 555-562.
21. Ma T., Li X., Li W., Yang Y., Huang C., Meng X., Zhang L., and Li J., (2015),
"Geniposide alleviates inflammation by suppressing MeCP2 in mice with carbon
tetrachloride-induced acute liver injury and LPS-treated THP-1 cells", International
Immunopharmacology, 29(2), pp. 739-747.
22. Martins N., Roriz C.L., Morales P., Barros L., and Ferreira I.C.F.R., (2016),
"Food colorants: Challenges, opportunities and current desires of agroindustries to
ensure consumer expectations and regulatory practices", Trends in Food Science &
Technology, 52, pp. 1-15.
23. Nagata Y., Watanabe T., Nagasaka K., Yamada M., Murai M., Takeuchi S.,
Murase M., Yazaki T., Murase T., Komatsu K., Kaizuka M., Sano M., Asano K.,
Ando C., and Taniuchi N., (2016), "Total dosage of gardenia fruit used by patients
with mesenteric phlebosclerosis", BMC Complementary and Alternative Medicine,
16(1), pp. 207.
24. Park E.H., Joo M.H., Kim S.H., and Lim C.J., (2003), "Antiangiogenic activity
of Gardenia jasminoides fruit", Phytotherapy Research, 17(8), pp. 961-962.
25. Sato S., Kitamura H., Chino M., Takei Y., Hiruma M., and Nomura M., (2007),
"A 13-week oral dose subchronic toxicity study of gardenia yellow containing
geniposide in rats.", Food and Chemical Toxicology, 45(8), pp. 1537-1544.
26. Sengar G. and Sharma H.K., (2014), "Food caramels: a review", J Food Sci
Technol, 51(9), pp. 1686–1696.
48
Lê Thùy Ngân – K24 Sinh học thực nghiệm 2018
27. Song X., Zhang W., Wang T., Jiang H., Zhang Z., Fu Y., Yang Z., Cao Y., and
Zhang N., (2014), "Geniposide Plays an Anti-inflammatory Role via Regulating
TLR4 and Downstream Signaling Pathways in Lipopolysaccharide-Induced Mastitis
in Mice", Inflammation, 37(5), pp. 1588-1598.
28. Srivastava R., Ahmed H., Dixit R.K., Dharamveer, and Saraf S.A., (2010),
"Crocus sativus L.: A comprehensive review", Pharmacognosy Reviews, 4, pp.
200-208.
29. Stahl W. and Sies H., (2005), "Bioactivity and protective effects of natural
carotenoids", Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Basis of Disease,
1740(2), pp. 101-107.
30. Suzuki Y., Kondo K., Ikeda Y., and Umemura K., (2001), "Antithrombotic
Effect of Geniposide and Genipin in the Mouse Thrombosis Model", Planta Med,
67, pp. 807-810.
31. Tao W., Zhang H., Xue W., Ren L., Xia B., Zhou X., Wu H., Duan J., and Chen
G., (2014), "Optimization of Supercritical Fluid Extraction of Oil from the Fruit of
Gardenia jasminoides and Its Antidepressant Activity", Molecules, 19, pp. 19350-
19360.
32. Thantsin K., (2011), "Natural Colorant from Gardenia jasminoides Ellis (Cape
jasmine) ", Universities Research Journal, 4(1), pp. 65-74.
33. Tseng T.H., Chu C.Y., Huang J.M., Shiow S.J., and Wang C.J., (1995),
"Crocetin protects against oxidative damage in rat primary hepatocytes", Cancer
Letters, 97(1), pp. 61-67.
34. Wei-E Z., Yuan Z., Yang L., Yun L., Hong-Na L., Shao-Hui L., Shou-Jun J.,
Zhi-Qin R., Zhi-Qiang H., and Feng Z., (2016), "Determination of gardenia yellow
colorants in soft drink, pastry, instant noodles with ultrasound-assisted extraction by
high performance liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass
spectrum", Journal of Chromatography A, 1446, pp. 59-69.
35. Wu S., Wang G., Liu Z., Rao J., Lü L., Xu W., Wu S., and Zhang J., (2009),
"Effect of geniposide, a hypoglycemic glucoside, on hepatic regulating enzymes in
diabetic mice induced by a high-fat diet and streptozotocin", Acta Pharmacologica
Sinica, 30(2), pp. 202-208.
49
Lê Thùy Ngân – K24 Sinh học thực nghiệm 2018
36. Xiao W., Li S., Wang S., and Ho C.-T., (2017), "Chemistry and bioactivity of
Gardenia jasminoides", Journal of Food and Drug Analysis, 25(1), pp. 43-61.
37. Xu G.L., Li G., Ma H.P., Zhong H., Liu F., and Ao G.Z., (2009), "Preventive
Effect of Crocin in Inflamed Animals and in LPS-Challenged RAW 264.7 Cells", J.
Agric. Food Chem, 57(18), pp. 8325-8330.
38. Yamada S., Oshima H., Saito I., and Hayakawa J., (1996), "Adoption of
Crocetin as an Indicator Compound for Detection of Gardenia Yellow in Food
Products", Analysis of Natural Coloring Matters in Food. V, 37, pp. 372-377.
39. Zhiguo J., Wenxue C., Sixin L., and Qizhen D., (2011), "Preparation of crocin
from gardenia yellow pigment by slow rotary countercurrent chromatography",
Chinese Journal of Chromatography, 29(033), pp. 277-180.
50
Lê Thùy Ngân – K24 Sinh học thực nghiệm 2018
PHỤ LỤC
Hình PL1: Sắc ký đồ HPLC của mẫu chuẩn crocin ở hàm lượng 5µg
1
Lê Thùy Ngân – K24 Sinh học thực nghiệm 2018
Hình PL2: Sắc ký đồ HPLC của mẫu chuẩn crocin ở hàm lượng 10µg
2
Lê Thùy Ngân – K24 Sinh học thực nghiệm 2018
Hình PL3: Sắc ký đồ HPLC của mẫu chuẩn crocin ở hàm lượng 15µg
3
Lê Thùy Ngân – K24 Sinh học thực nghiệm 2018
Hình PL4: Sắc ký đồ HPLC của mẫu chuẩn crocin ở hàm lượng 20µg
4
Lê Thùy Ngân – K24 Sinh học thực nghiệm 2018
Hình PL5: Sắc ký đồ HPLC của mẫu chuẩn crocin ở hàm lượng 25µg
5
