ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN -------------------------------- NGUYỄN QUỐC TUẤN XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƢỢNG FLAVONOID TRONG NỤ VÀ LÁ VỐI LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC Hà Nội – 2012

1

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN -------------------------------- NGUYỄN QUỐC TUẤN XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƢỢNG FLAVONOID TRONG NỤ VÀ LÁ VỐI

Chuyên ngành: Hóa phân tích Mã số: 60 44 29

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC CÁN BỘ HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. PHƢƠNG THIỆN THƢƠNG Hà Nội – 2012

2

Mục lục

Trang

MỞ ĐẦU………………………….……….……………...…………………….…1

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN…………..…………….……………………….…..3

1.1 Tổng quan cây vối………………………….….……………………………..3

1.1.1 Tên gọi ……………………………..……………………………………3

1.1.2 Đặc điểm thực vật………………………………………………..………3

1.1.3 Phân bố, sinh thái………………………………………………….……..3

1.1.4 Thu hái và chế biến…………………………………………...………….4

1.1.5 Thành phần hóa học……………………………………………..……….5

1.1.6 Flavonoid trong cây vối………………………………………………….7

1.1.7 Tác dụng sinh học………………………………...…………………….13

1.1.8 Ứng dụng…………………………………………...…………………..16

1.2 Các phƣơng pháp định tính, định lƣợng flavonoid ……………………...…17

1.2.1 Phƣơng pháp định tính………………………………………….………17

1.2.2 Phƣơng pháp định lƣợng……………………………….……………….20

CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN

CỨU………………………………………………………………………………26

2.1 Đối tƣợng nghiên cứu……………………………………...……………….26

2.2 Nội dung nghiên cứu …………………………………………..…………..27

2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu……………………………………..…………….27

2.3.1 Chiết xuất, phân lập flavonoid chính………….………………………..27

2.3.2 Xác định cấu trúc chất phân lập………………………………….……..28

2.4 Xây dựng phƣơng pháp định tính trong nụ và lá vối…………………...…..28

3

2.4.1 Định tính bằng phƣơng pháp hóa học…………………….…………….28

2.4.2 Định tính bằng phƣơng pháp sắc ký………………………..…………..28

2.5 Xây dựng phƣơng pháp định lƣợng flavonoid trong nụ và lá vối…….…….30

2.5.1 Định lƣợng flavonoid toàn phần bằng phƣơng pháp trắc quang…….…30

2.5.2 Định lƣợng flavonoid chính bằng phƣơng pháp HPLC……….…..........30

2.6 Một số đặc trƣng thống kê để xử lý và đánh giá kết quả……...……………31

2.7 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất, dung môi……………………………………32

2.7.1 Thiết bị, dụng cụ………………………………………………………..32

2.7.2 Hóa chất, dung môi……………………………………………………..32

CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN…………………………………...33

3.1 Chiết xuất và phân lập một flavonoid chính từ nụ cây vối………………....33

3.1.1 Chiết xuất dƣợc liệu và phân đoạn…..………………………………….33

3.1.2 Phân lập flavonoid chính trong cao phân đoạn ethyl acetat…………….34

3.1.3 Xác định cấu trúc chất phân lập………………...………………………37

3.2 Xây dựng phƣơng pháp định tính flavonoid trong lá và nụ vối……...……..41

3.2.1 Định tính bằng phản ứng hóa học………………………...…………….41

3.2.2 Định tính bằng TLC………………………………………...…………..42

3.2.3 Định tính bằng HPLC……………………………………………..……46

3.3 Xây dựng phƣơng pháp định lƣợng flavonoid trong lá và nụ vối…………..48

3.3.1 Xây dựng bằng phƣơng pháp trắc quang………………...……………..48

3.3.2 Xây dựng phƣơng pháp định lƣợng CO-1 bằng HPLC………...………61

KẾT LUẬN……………………………….…………………………………...…74

TÀI LIỆU THAM KHẢO……………………………………………………....76

4

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC BẢNG

6

8

19

26

35

40

46

49

50

51

52

53

53

54

Bảng 1.1. Các thành phần chính trong tinh dầu vối ………………………... Bảng 1.2. Thành phần flavonoid trong nụ vối………………………………. Bảng 1.3. Một số hệ dung môi khai triển để phân tích flavonoid bằng TLC.. Bảng 2.1. Bảng chi tiết mẫu nụ và lá vối……………………………………. Bảng 3.1. Kết quả định tính sơ bộ flavonoid ở cao H và cao E…………….. Bảng 3.2. Số liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất CO-1………… Bảng 3.3. Kết quả SKLM cao phân đoạn ETOAC…………………………. Bảng 3.4. Kết quả độ lặp lại của phƣơng pháp trắc quang………………….. Bảng 3.5. Kết quả xây dựng đƣờng chuẩn theo chất đối chiếu CO-1………. Bảng 3.6. Kết quả xây dựng đƣờng chuẩn theo chất Catechin……………… Bảng 3.7. Kết quả xác định độ lệch chuẩn của mẫu trắng……………........... Bảng 3.8. Kết quả xác định nồng độ giới hạn LOL của chất chuẩn CO-1….. Bảng 3.9. Kết quả xác định nồng độ giới hạn LOL của chất Catechin……... Bảng 3.10. Kết quả xác định độ đúng của phƣơng pháp………………….....

55

Bảng 3.11A. Kết quả đánh giá độ ổn định của phƣơng pháp theo cách 1…..

56

5

Bảng 3.11B. Kết quả đánh giá độ ổn định của phƣơng pháp theoc cách 2.....

58

62

63

64

65

65

66

66

67

69

69

71

72

6

Bảng 3.12. Kết quả xác định flavonoid toàn…………………………….….. Bảng 3.13. Kết quả khảo sát pha động ……………………………………... Bảng 3.14. Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống………………...… Bảng 3.15. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính…………………………….. Bảng 3.16. Giá trị hệ số bi ……………………………………………...…… Bảng 3.17. Các đại lƣợng thống kê……………………………………….… Bảng 3.18A. Kết quả khảo sát độ lặp lại của phƣơng pháp bằng mẫu CO-1.. Bảng 3.18B. Kết quả khảo sát độ lặp lại của phƣơng pháp bằng mẫu thực… Bảng 3.19. Kết quả khảo sát độ đứng của phƣơng pháp……………………. Bảng 3.20. Kết quả xác định nồng độ giới hạn LOD……………………….. Bảng 3.21. Kết quả xác định nồng độ giới hạn LOL………………………... Bảng 3.22. Kết quả đánh giá sai số của phƣơng pháp………………………. Bảng 3.23. Kết quả định lƣợng hoạt chất trong một số mẫu nụ và lá vối…...

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ SƠ ĐỒ

Hình 1.1. Hình ảnh cây vối………………………..…………………………..4

Hình 1.2. Sắc ký đồ hai chất và các thông số đặc trƣng…………….……….23

Hình 3.1. Hình ảnh SKLM và chất CO-1 phân lập từ nụ vối………………..37

Hình 3.2. Sắc ký đồ HPLC chất CO-1…………………………………...…..37

Hình 3.3. Phổ tử ngoại UV chất CO-1……………………………………….38

Hình 3.4. Công thức cấu tạo chất CO-1………………………………….…..41

Hình 3.5A. Sắc ký đồ định tính flavonoid trong nụ và lá vối…………….….44

Hình 3.5B. Sắc ký đồ định tính flavonoid trong cao ETOAC……………….45

Hình 3.6. Sắc ký đồ của mẫu đối chiếu CO-1 và nụ, lá vối………………….48

Hình 3.7. Đƣờng chuẩn xác định flavonoid toàn phần theo CO-1………..…50

Hình 3.8. Đƣờng chuẩn xác định flavonoid toàn phần theo Catechin……….51

Hình 3.9. Đồ thị xác định nồng độ giới hạn LOL của CO-1……………...…53

Hình 3.10. Đồ thị xác định nồng độ giới hạn LOL của Catechin…………....54

Hình 3.11. Đƣờng chuẩn xác định hàm lƣợng CO-1 trong nụ và lá vối……..64

Hình 3.12. Chiều cao tín hiệu phát hiện LOD…………………………….....69

Hình 3.13. Đồ thị xác định nồng độ giới hạn LOL………………………….70

Sơ đồ 3.1: Sơ đồ chiết xuất và phân đoạn cao nụ vối………………………..34

7

Sơ đồ 3.2: Quy trình định lƣợng flavonoid toàn phần ……………………….57

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

CTPT : Công thức phân tử

EtOAC : Ethyl acetat

EtOH : Ethanol

KLPT : Khối lƣợng phân tử

MeOH : Methanol

SKLM : Sắc ký lớp mỏng

Rf : Hệ số lƣu UV : Ultra violet

IR : Infrared Spectroscopy

MS : Mass Spectroscopy

NMR : Cộng hƣởng từ hạt nhân

(Nuclear Magnetic Resonance)

TLC : Sắc lớp mỏng

(Thin Layer Chromatography)

HPLC : Sắc kí lỏng hiệu năng cao

(High Performance Liquid Chromatography)

SD : Độ lệch chuẩn

(Standard deviation)

RSD : Độ lệch chuẩn tƣơng đối

(Relative standard devition)

LOD : Giới hạn phát hiện

(Limit of Detection)

LOQ : Giới hạn định lƣợng

(Limit of Quantitation)

LOL : Giới hạn tuyến tính

8

(Limit of Linearity)

MỞ ĐẦU Cây Vối, một loại cây quen thuộc của làng quê các tỉnh Đồng Bằng bắc

bộ, có tên khoa học là Cleistocalyx operculatus (Roxb.) Merr. et Perry thuộc họ

Sim (Myrtaceae). Từ lâu nhân dân ta đã biết dùng lá và nụ vối với cách chế biến

đơn giản tạo thành loại trà nấu hay hãm lấy nƣớc uống hàng ngày vừa có tác

dụng thanh nhiệt vừa có tác dụng kiện tỳ, tiêu thực.

Đến nay đã có nhiều nghiên cứu về cây Vối. Thành phần hóa học chính

của lá và nụ Vối gồm tinh dầu, triterpenoid và flavonoid. Theo Trung học dƣợc

từ hải I (1993), tinh dầu lá vối có 27 thành phần. Vỏ cây chứa một chất triterpen

nhóm ursan đã đƣợc nhận dạng là acid ursolic. Nụ vối có nhiều thành phần hóa

học đã đƣợc phân lập và xác định cấu trúc hóa học, chủ yếu là các flavonoid.

Thành phần hóa học chính trong nụ vối là flavonoid, với khoảng hơn 20

flavonoid khác nhau. Flavonoid là một nhóm hợp chất lớn có cấu trúc hóa học

C6-C3-C6, thƣờng gặp nhiều trong thực vật. Đến nay, số lƣợng flavonoid từ thực

vật đã đƣợc tìm thấy lên tới trên 8150 flavonoid khác nhau. Các flavonoid có

nhiều tác dụng sinh học quý nhƣ chống ung thƣ, chống dị ứng, chống co giật,

giảm đau, nghẽn mạch, nghẽn phế quản, lợi mật, diệt nấm... Do đó, chúng đƣợc

dùng nhiều trong các ngành công nghiệp dƣợc phẩm, thực phẩm, và mỹ phẩm,

phục vụ lợi ích của con ngƣời.

Các flavonoid của lá và nụ vối cũng đã đƣợc chứng minh có nhiều tác

dụng sinh học quan trọng nhƣ chống oxy hóa, chống ung thƣ, ức chế một số

enzym (xanthin oxydase, α-glucosidase, maltase, acetylcholinesterase và

butyrylcholinesterase). Đặc biệt, một số chất một hợp chất có tác dụng đối với

ung thƣ nhƣ 2',4'-dihydroxy-6'-methoxy-3',5'-dimethylchalcone, 3,5',3'-

9

trihydroxy-6,7,4'-trimethoxy flavon; 3,3'-dihydroxy-5,6,7,4'-tetramethoxy

flavon. Do đƣợc sử dụng nhiều để làm trà uống và làm thuốc trong y học dân

gian nên cần thiết phải có tiêu chuẩn cho nguyên liệu lá và nụ vối. Trong dự

thảo Dƣợc Điển Việt Nam V (dự kiến xuất bản năm 2013-2014) đã có chuyên

luận về lá và nụ vối. Tuy nhiên, trong các chuyên luận này chƣa có tiêu chí về

định tính và định lƣợng flavonoid trong nụ vối, trong khi flavonoid là thành

phần chính và có nhiều tác dụng quan sinh học trọng.

Với thực trạng trên, chúng tôi đề xuất thực hiện đề tài “Xây dựng

phƣơng pháp định tính, định lƣợng flavonoid trong nụ và lá vối”. Kết quả

của đề tài sẽ là cơ sở cho việc xây dựng tiêu chuẩn và kiểm tra chất lƣợng dƣợc

liệu nụ và lá vối phục vụ việc quản lý chất lƣợng dƣợc liệu trên thị trƣờng.

Các mục tiêu của đề tài gồm có:

• Phân lập đƣợc một flavonoid chính trong nụ vối dùng làm chất đối

chiếu trong việc định tính, định lƣợng flavonoid.

• Xây dựng đƣợc quy trình định tính và định lƣợng flavonoid trong dƣợc

10

liệu nụ và lá vối.

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về cây vối

1.1.1 Tên gọi

- Tên tiếng Việt: Cây vối, vối nhà

- Tên Latin: Cleistocalyx operculatus (Roxb.) Merr. et Perry

- Tên đồng nghĩa: Eugenia operculata Roxb.

- Họ Sim (Myrtaceae).

1.1.2 Đặc điểm thực vật

Cây vối là loại cây gỗ nhỡ, cao 5-10 m, có khi hơn, vỏ thân nứt nẻ, màu

nâu đen. Cành nhánh có nhiều vảy, cành non tròn hay hơi hình 4 cạnh, nhẵn [3,

4, 10, 22, 42].

Lá đơn mọc đối, có cuống dài 1-1,5 cm, dai, cứng, phiến lá hình trái xoan

hay hình trứng, dài 8-20 cm, rộng 5-8 cm giảm nhọn ở gốc, có mũi ngắn. Hai

mặt lá có hai màu khác nhau, có nhiều tuyến mờ nâu, lá già mặt dƣới của lá có

chấm nâu, gân phụ khoảng 10 cặp cách mép là 3-5 mm [3, 4, 10, 22, 42].

Hoa nhỏ màu trắng lục nhạt, gần nhƣ không cuống, hợp thành cụm hoa

dạng chùy rộng, mọc ở kẽ những lá đã rụng. Nụ hoa dài, lá bắc dễ rụng. Đài

dính vào bầu. Hoa đều lƣỡng tính 4 cánh hình tròn hay hình bầu dục, nhiều

tuyến mờ dính lại ở đỉnh thành mũ hình chóp. Nhị nhiều xếp thành 7-9 dãy có

hình bầu dục nằm sâu trong ống đài, bị nhị che kín [3, 4, 10, 22, 42].

Quả hình cầu hay hơi hình trứng, đƣờng kính 7-12 mm, xù xì, khi chín có

màu tím, thể chất nạc, vị ngọt [3, 4, 10, 22, 42].

Mùa hoa quả: Tháng 4 – 6

11

1.1.3 Phân bố, sinh thái

Chi Cleistocalyx Blume gồm một số loài phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt

đới Đông Nam Á. Việt Nam có 3 loài Vối là cây đặc hữu của vùng Việt Nam và

Nam Trung Quốc. Ở Việt Nam, vối mọc tự nhiên dọc theo suối hay bờ ao hồ ở

vùng núi thấp và trung du, thuộc các tỉnh Cao Bằng (Hà Quảng, Thông Nông,

Thạch An…); Lạng Sơn (Đồng Mỏ, Hữu Lũng); Bắc Giang (Sơn Động, Lục

Nam, Yên Thế...); Vĩnh Phúc (Lập Thạch, Tam Dƣơng); Phú Thọ, Tuyên

Quang, Hà Tây, Hòa Bình….Cây vối còn đƣợc trồng rải rác trong nhân dân các

tỉnh đồng bằng và trung du Bắc Bộ.

Vối thuộc loại cây gỗ ƣa sáng, ƣa ẩm, sinh trƣởng và phát triển nhanh;

trong vòng 3 năm đầu, chiều cao thân có thể đến 5 m. Cây phân cành nhiều chồi

và lá non ra nhiều trong mùa xuân, hè. Những cây mọc ở chỗ đƣợc chiếu sáng

b) Nụ vối tƣơi

đầy đủ ra hoa quả rất nhiều, tái sinh tự nhiên từ hạt.

b) Nụ vối khô

a) Cây vối ơ

Hình 1.1: Hình ảnh Cây và Nụ vối

1.1.4 Thu hái và chế biến

Hái lá tƣơi, phơi khô, nhƣng có ngƣời đem ủ rồi mới phơi khô, cách làm

12

nhƣ sau: thái nhỏ, rửa sạch, cho vào thùng hay thúng ủ cho đến khi đen đều thì

lấy ra rửa sạch, phơi khô. Lá vối ủ uống thơm ngon hơn. Để làm thuốc thƣờng

dùng lá tƣơi phơi khô [4,10].

Nụ vối đƣợc thu hái, phơi khô dùng để pha nƣớc và làm thuốc [4, 10].

1.1.5 Thành phần hóa học

Lá Vối chứa rất ít tanin, vết alcaloid (nhóm indolic) và tinh dầu, tinh dầu

lá gồm nhiều thành phần trong đó thành phần chính là (Z)-β-ocimen, myrcen,

(E)-β-ocimen [3, 4, 17]. Trong lá vối có chứa flavonoid, coumarin, tanin, acid

hữu cơ, đƣờng tự do và sterol.

Vỏ cây chứa triterpen nhóm ursan là acid usolic [3].

Nụ vối chứa nhiều flavonoid khác nhau, với nhiều thành phần đã xác định

cấu trúc hóa học đƣợc trình bày ở Bảng 1.2.

- Tinh dầu: Từ mẫu nụ vối Việt Nam, với phƣơng pháp sắc kí khí khối

phổ GC/MS, Nguyễn Thị Dung và cộng sự đã xác định đƣợc 55 thành phần

khác nhau có trong tinh dầu nụ vối (Bảng 1.1), gồm các monoterpen,

13

serquiterpen và hydrocarbon serquiterpen [5].

Bảng 1.1. Các thành phần chính trong tinh dầu nụ vối

STT Thành phần chính Tỷ lệ (%)

1 3,45 α-pinen

2 3,07

3 β-pinen β-myrcen 2,40

4 Camphen 4,12

5 γ-terpinen 5,76

6 Cis-linalool oxide 5,21

7 Terpinen-4-ol 2,58

8 Trans-carveol 3,93

9 2,3-dehydro-1,4-cineol 3,01

10 γ-amorphen 2,12

11 Cyclobazzanen 3,12

12 α-cadinen 1,47

13 Globulol 5,61

14 β-himachalol 3,84

15 Acorenol 5,12

16 1-hexanol 2,59

17 2-heptanen 2,03

18 Presilphiperfol-1-en 2,48

19 α-terpinen 1,19

20 Cis-verbenol 1,85

21 Methyl jasmonate 1,92

14

22 1,8-oxidocadin-4-en 1,84

- Thành phần khác: ethyl galat, acid galic, acid ursolic, β-sitosterol và

acid cinamic [3, 4, 17, 21, 33].

1.1.6 Flavonoid trong cây Vối

Flavonoid là một nhóm hợp chất tự nhiên lớn thƣờng gặp trong thực vật.

Về cấu trúc hóa học flavonoid có khung cơ bản theo kiểu C6-C3-C6 (có 2 vòng

benzen A và B nối với nhau qua một mạch 3 carbon) và đƣợc chia làm nhiều

nhóm khác nhau [16].

Đã có nhiều nhà khoa học trong và ngoài nƣớc nghiên cứu về thành phần

hóa học của cây vối đều chỉ ra rằng flavonoid trong lá và nụ vối có thể ở dạng

tự do hoặc dạng glycosid. Chủ yếu là nhóm chalcone, flavanol, flavone và

flavanonol. Các flavonoid thƣờng dễ kết tinh và thƣờng có màu. Flavone có

màu vàng nhạt hoặc màu da cam; flavonol màu vàng nhạt đến màu vàng;

Chalcone màu vàng đến cam-đỏ; flavanonol kết tinh không màu. Các flavonoid

đƣợc trình bày ở bảng 1.2.

15

.

Bảng 1.2: Thành phần flavonoid trong nụ vối

TT

Tên chất

Công thức cấu tạo

Tài liệu

[18],

2',4'-dihydroxy-6'- 1 [22],

methoxy-3',5'- [33]

dimethylchalcone

2 5,7-dihydroxy-6,8- [22]

3

7-hydroxy-5-methoxy-6,8-

[22]

dimethylflavone

dimethylflavanon

3'-formyl-4',6',4- 4 [27]

trihydroxy-2'-methoxy-5'-

methylchalcone

3'-formyl-6',4-dihydroxy-

2’-methoxy-5'- [27] 5 methylchalcone 4'-O-β-D-

16

glucopyranosid

6 (2S)-8-formyl-6- [33]

methylnaringenin

(2S)-8-formyl-6- 7 [27] methylnaringenin 7-O-β-

D-glucopyranosid

8 (2S)-8-formyl-5-hydroxy- [31],

7-methoxy-6- [33]

methylflavanon

9 7-hydroxy-5-methoxy-6,8- [33]

dimethylisoflavone

10 (2S,3S)-2,3-trans-5,7 [33] dihydroxy-6,8

17

dimethyldihydroflavonol

11 (2S)-2,7-dihydroxy-5-

[33] methoxy-6,8-

dimethylflavanol

12 (E)-4,2',4'-trihydroxy-6'-

methoxy-3',5'- [33]

dimethylchalcone

7-hydroxy-5-methoxy-6,8- 13 [33] dimethylflavone

(2S)-5-hydroxy-7- 14 [33] methoxy-6,8-

dimethylflavanol

2',4'-dihydroxy-3'-methyl- 15 [33] 6'-methoxychalcone

16 (2S)-6-formyl-8-methyl-7-

18

O-methylpinocembrin [33]

(2S)-7-hydroxy-5- 17

methoxy-8- [18]

methylflavanon

18 (2S)-8-methylpinocembrin

[18]

2,2',4'-trihydroxy-6'-

19 methoxy-3',5'- [18]

dimethylchalcone

20 Quercetin [28]

19

21 Kaempferol [28]

22 Tamarixetin [28]

23 Myricetin-3'-methylether [28]

24 Myricetin-3'-methyether- [28]

3-O-β-D-

galactopyranoside

25 5,7,8,4'-Tetrahydroxy- [28]

3',5'-dimethoxyflavone-3-

O-β-D-galactopyranoside

26 Gossypetin-8,3'- [28]

dimethyether-3-O-β-D-

20

galactoside

1.1.7 Tác dụng sinh học

a) Tác dụng của lá và nụ vối.

Năm 1968, Nguyễn Đức Minh thuộc phòng đông y thực nghiệm Viện

nghiên cứu Đông y [10], nghiên cứu thăm dò tính kháng khuẩn của lá và nụ vối

với một số vi khuẩn Gram (+) và Gram (-) đã đi tới kết luận sau:

- Ở tất cả các giai đoạn phát triển lá và nụ vối đều có tác dụng kháng khuẩn.

Mùa đông kháng sinh tập chung nhiều nhất ở lá.

- Chất kháng khuẩn tan trong nƣớc, các dung môi hữu cơ nhƣ ether, CCl4, ehtyl

acetat, chloroform, aceton, toluen, dầu hỏa. - Chất kháng khuẩn bền vững với nhiệt độ 1000C/30 phút, bền vững ở môi

trƣờng có PH > 7, tác dụng mạnh nhất đối với Streptococcus (hemolytic và

staman), sau đó đến vi khuẩn bạch cầu và Staphylococcus và Pneumococcus.

- Chất kháng khuẩn có thể kết tinh trong hỗn hợp dung môi methanol: nƣớc,

cho tinh thể hình kim không màu.

- Liều độc cao LD50 = 7830 mg/kg (thử trên chuột nhắt trắng bằng đƣờng uống)

* Chất chiết từ nụ vối bằng chloroform tách khỏi dung dịch đệm PH > 7 có màu

vàng, vị đắng, dạng muối natri tan nhiều trong nƣớc có tác dụng đặc biệt với

đơn bào Entamoeba histolytica, E. moshkovskii ở độ pha loãng 1/1200.

* Chất kháng khuẩn làm tăng khả năng thực bào trên chuột lang, tăng cƣờng co

bóp tim cô lập, tăng huyết áp nhẹ trên thỏ [3, 10].

Đào Thị Thanh Hiền đã thử tác dụng kháng khuẩn của tinh dầu lá vối ủ,

tinh dầu lá vối không ủ, cao khô lá vối ủ, cao khô lá vối không ủ đối với: Vi

khuẩn Gram (-): E. coli, P. aeruginosa, vi khuẩn Gr (+): Bacteroides subtillis,

S. aureus, nấm mốc: Asp. niger, Furanium oxysporum, nấm men: Candida

21

albicans. Kết quả cho thấy đối với E. coli thì mẫu thử của cao khô lá vối ủ có

tác dụng tốt nhất (nồng độ ức chế tối thiểu nhỏ nhất). Đối với tụ cầu vàng (S.

aureus) cao khô lá vối cho tác dụng tốt hơn tinh dầu lá vối. Đối với Bacteroides

subtillis cả 4 mẫu thử đều cho tác dụng tốt (MIC = 50 μg/ml) còn đối với nấm

mốc thì cả 4 mẫu đều không có tác dụng. Đối với nấm men thì chỉ có cao khô lá

vối cho tác dụng [7].

Tinh dầu lá vối có tác dụng ức chế sự phát triển của tế bào ung thƣ gan,

ung thƣ màng tử cung và ung thƣ màng tim….[7].

Dịch chiết lá vối ủ với 2 liều 10 g/kg và 20 g/kg thể trọng của chuột đều

có tác dụng lợi mật rõ rệt. Liều 20 g/kg thể trọng chuột thì chế phẩm có tác

dụng lợi mật lớn hơn 1,5 lần so với liều 10 g/kg thể trọng chuột [7].

Theo Trƣơng Thị Tuyết Mai và các cộng sự đã thử nghiệm thành công

khả năng chống oxy hóa của nụ vối trong ống nghiệm và trên chuột tiểu đƣờng.

[14]. Với kết quả của nghiên cho thấy bột chiết tách từ nụ vối có khả năng triệt

tiêu gốc tự do là rất mạnh với giá trị IC50 nhỏ nhất là 22,9 mg/ml. Và có hiệu

quả chống oxy hóa, ức chế peroxy hóa lipid trên chuột đái tháo đƣờng [14].

Byung Sun Min cùng với các cộng sự đã tách đƣợc 7 flavonoid (trình bày

trong bảng 1.2) trong nụ vối đƣợc thu hái ở Việt Nam và chứng minh chỉ ra

rằng các flavonoid đều có tác dụng chống ung thƣ [28].

b) Tác dụng của các flavonoid trong lá và nụ vối

Trƣớc hết, các chất flavonoid là những chất oxy hóa chậm hay ngăn chặn

quá trình oxy hóa do các gốc tự do, có thể là nguyên nhân làm cho tế bào hoạt

động khác thƣờng. Các gốc tự do sinh ra trong quá trình trao đổi chất thƣờng là -•, (là các yếu tố gây biến dị, hủy hoại tế các gốc tự do nhƣ OH•, ROO•, R•, O2

bào, ung thƣ, tăng nhanh sự lão hóa,…). Thí nghiệm cho thấy khả năng dập tắt

22

của một số flavonoid theo thứ tự: myricetin > quercetin > rhammetin > morin >

diosmetin > naringenin > apigenin > catechin> 5,7 dihydroxy-3',4',5' trimethoxy

flavon > robinin > kaempferol > flavon [9].

Các flavonoid còn có khả tạo phức với các ion kim loại nên có tác dụng

nhƣ những chất xúc tác ngăn cản các phản ứng oxy hóa. Do đó, các chất

flavonoid có tác dụng bảo vệ cơ thể, ngăn ngừa xơ vữa động mạch, tai biến

mạch, lão hóa, thoái hóa gan, tổn thƣơng do bức xạ [17].

Thành phần của màng tế bào có các chất lipid dễ bị peroxyd hóa, tạo ra

những sản phẩm làm rối loạn sự trao đổi chất cũng dẫn đến sự hủy hoại tế bào.

Đƣa các chất chống oxi hóa nhƣ flavonoid vào cơ thể để bảo vệ tế bào thì có thể

ngăn ngừa các nguy cơ nhƣ xơ vữa động mạch, tai biến mạch, lão hóa, tổn

thƣơng do bức xạ, thoái hóa gan.

Flavonoid còn có tác dụng bảo vệ hệ tim mạch, giảm nguy cơ tử vong do

các bệnh lý tim mạch nhƣ thiếu máu cơ tim, đau thắt ngực, nhồi máu cơ tim, xơ

vữa động mạch,…nhờ khả năng chống oxy hóa không hoàn toàn cholesterol.

Flavonoid cùng với acid ursolic tham gia trong quá trình hoạt động của

enzym oxy hóa-khử. Flavonoid còn ức chế tác động của hyaluronidazơ. Enzym

này làm tăng tính thẩm của mao mạch. Khi enzym này thừa thì gây hiện tƣợng

xuất huyết dƣới da mà y học gọi là bệnh thiếu vitamin P (Pavitaminose).

Flavonoid đƣợc dùng trong các trƣờng hợp rối loạn chức năng tĩnh mạch,

tĩnh mạch suy yếu, giãn tĩnh mạch, trĩ, chảy máu do đặt vòng trong phụ khoa,

các bệnh trong nhãn khoa nhƣ sung huyết kết mạc, rối loạn tuần hoàn võng

mạc. Các dẫn chất anthocyanozid có tác dụng tái tạo tế bào võng mạc và đã

đƣợc chứng minh có tác dụng tăng thị lực vào ban đêm.

Tác dụng chống độc của flavonoid thể hiện làm giảm thƣơng tổn gan,

23

bảo vệ đƣợc chức năng gan khi một số chất độc đƣợc đƣa vào cơ thể súc vật thí

nghiệm (CCl4, benzen, etanol, CHCl3, quinin, novasenol…). Dƣới tác dụng của

flavonoid, ngƣỡng ascorbic đƣợc ổn định đồng thời lƣợng glycogen trong gan

tăng. Sự tích lũy glycogen có ý nghĩa quan trọng trong việc nâng cao chức năng

giải độc gan.

Flavonoid thể hiện tác dụng chống co thắt những tổ chức cơ nhẵn (túi

mật, ống dẫn mật, phế quản và một số tổ chức khác).

Tác dụng chống viêm của nhiều flavonoid thuộc các nhóm flavone,

flavanon, dihydroflavonol, anthocyanin, flavan-3-ol, chalcone, isoflavone,

biflavone, 4-arylcoumarin, 4-arylchroman đều đƣợc chứng minh bằng thực

nghiệm do các chất flavonoid này ức chế con đƣờng sinh tổng hợp prostagladin.

Trên hệ tim mạch, nhiều flavonoid thuộc nhóm flavonol, flavan-3-ol,

anthocyanin nhƣ quercetin, rutin, myricetin, pelargonin, hỗn hợp catechin của

trà có tác dụng làm tăng biên độ co bóp và tăng thể tích phút của tim, thí

nghiệm làm hồi phục tim khi bị ngộ độc bởi CHCl3, quinin, methanol, bình

thƣờng lại sự rối loạn nhịp.

- Tác dụng ức chế sự phát triển của TB ung thư: 2',4'-dihydroxy-6'-methoxy-

3',5'-dimethylchalcone phân lập từ nụ vối có tác dụng ức chế sự phát triển của

TB ung thƣ với các dòng TB ung thƣ khác nhau [29, 30, 35, 36].

- Tác dụng làm giảm đường huyết: tác dụng ức chế maltase đƣờng ruột làm

giảm đƣờng huyết trên chuột gây bệnh tiểu đƣờng [45].

- Tác dụng chống oxy hóa: ức chế các enzym α-glucosidase [27].

- Tác dụng chống Alzheimer: các flavonoid nhƣ quercetin, kaempferol,

tamarixetin đƣợc phân lập từ nụ vối có tác dụng chống Alzheimer thông qua ức

chế acetylcholinesterase và butyrylcholinesterase [43].

24

1.1.8 Ứng dụng

Lá và nụ vối từ lâu đƣợc nhân dân ta nấu nƣớc uống thay trà, vừa thơm

vừa có tác dụng tiêu cơm. Lá vối tƣơi hay khô sắc đặc có tính chất kháng sinh

sát trùng để rửa mụn nhọt, lở loét, ghẻ [4, 10].

Lá, vỏ thân, hoa chữa đầy bụng, khó tiêu, ỉa chảy, mụn nhọt, viêm đại

tràng mạn, lị trực trùng [3, 4].

Ở Ấn Độ, rễ sắc đặc dạng siro dùng đắp vào khớp sƣng đỏ, quả ăn trị

phong thấp [4].

Ở Trung Quốc, các bộ phận của cây dùng trị cảm mạo, đau đầu phát sốt, lỵ

trực khuẩn, viêm gan, mẩn ngứa, viêm tuyến sữa, ngứa ngáy ngoài da, nấm ở

chân, vết thƣơng [3, 4].

1.2 Các phƣơng pháp định tính, định lƣợng flavonoid

1.2.1 Phƣơng pháp định tính

a) Phương pháp ống nghiệm

Phản ứng với hơi amoniac

Nhiều flavonoid thay đổi màu khi gặp hơi NH3. Có thể quan sát sự biến

đổi màu này bằng mắt thƣờng hoặc dƣới ánh sáng tử ngoại [6].

Phản ứng với kiềm loãng.

Cho dịch chiết flavonoid vào dung dịch kiềm nếu xuất hiện:

+ Nếu vàng: Nhóm flavone, flavonon

+ Màu đỏ: Nhóm isoflavanon

+ Màu tím: Nhóm chalcone

+ Màu xanh: antoxyanin

Phản ứng cyanidin (phản ứng Shinoda).

Phản ứng do sự có mặt nhân γ-penzopyron trong đa số flavonoid. Thuốc

25

thử là HCl đặc và bột Magie kim loại [6].

Phản ứng bằng thuốc thử Sibata và dung dịch H2SO4 đậm đặc

Cho dịch chiết vào ống nghiệm, thêm vài mililit H2SO4 đậm đặc, sau đó

cho thêm 0,1 gam Mg, tiếp theo thêm từ từ rƣợu isoamylic theo thành ống

nghiệm. Đun nóng, có màu hồng từ từ xuất hiện rồi chuyển sang đỏ cam hoặc

đỏ tím [6].

Phản ứng với dung dịch sắt (III) clorid 5%.

Cho dịch chiết vào ống nghiệm, thêm vài giọt dung dịch sắt (III) clorid

5%, lắc sẽ xuất hiện màu xanh đen.

Hoàng Thị Lý đã định tính flavonoid bằng phản ứng hóa học và chỉ ra

rằng flavonoid là nhóm chất chính trong nụ vối [13].

b) phương pháp sắc ký lớp mỏng (SKLM)

SKLM là một kỹ thuật tách các chất đƣợc tiến hành khi cho pha động di

chuyển qua pha tĩnh, trên đó ta đặt hỗn hợp các chất cần tách [23].

Pha tĩnh là chất hấp phụ đƣợc lựa chọn phù hợp theo từng yêu cầu phân

tích, đƣợc trải thành lớp mỏng đồng nhất và đƣợc cố định trên các phiến kính,

phiến kim loại hoặc phiếm nhựa.

Pha động là hệ dung môi đơn hoặc đa thành phần đƣợc trộn với nhau

theo tỷ lệ thích hợp cho các yêu cầu phân tích.

Trong quá trình di chuyển qua lớp hấp phụ, các thành phần trong hỗn hợp

mẫu di chuyển trên lớp mỏng theo hƣớng pha động, với những tốc độ khác

nhau tùy theo đặc điểm của chúng. Kết quả ta thu đƣợc một sắc ký đồ trên lớp

mỏng.

Đại lƣợng đặc trƣng cho mức độ di chuyển của các chất phân tách là hệ

số di chuyển Rf đƣợc tính bằng tỷ lệ giữa khoảng cách di chuyển của chất thử

26

và khoảng cách di chuyển của dung môi. Rf = a : b

Trong đó: a là khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm của vết mẫu thử, cm.

b: là khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi đo trên cùng

đƣờng đi của vết, cm.

Rf có giá trị từ 0 đến 1. Vì vậy khi định tính các chất ta thƣờng nên triển khai

song song với chất chuẩn hoặc chất đối chiếu để định tính các chất thông qua

Rf.

Trần Quang Vinh định tính flavonoid trong cây chùm ngây bằng hệ dung

môi khai triển n-butylacetat : nƣớc : acid formic = 15: 5: 5 (v:v:v) đƣợc phát

hiện bằng UV-254nm, 366 nm và thuốc thử FeCl3, hơi NH3 [20].

Elisabetta Campeol đã tiến hành phân tích định tính flavonoid trong các

cây thực vật thuộc chi Vicia bằng TLC với hệ dung môi triển khai ethyacetat :

acid formic:acid acetic:nƣớc = 10 : 1,1 : 1,1 : 2,7 (v:v:v:v) hoặc hệ toluen:

ethylacetat: acid formic = 5 : 4 : 1 (v:v:v) [34].

Marica Medić -Šarić đã nghiên cứu về định tính flavonoid bằng TLC đã

đƣa ra đƣợc chín hệ dung môi triển khai đƣợc trình bày ở bảng 1.3 [40].

Bảng 1.3. Một số dung môi khai triển để phân tích flavonoid bằng TLC

STT

Hệ dung môi

Tỷ lệ (v:v:v)

1 2

Toluene:ethyl acetate:formic acid Cyclohexane:ethyl acetate:formic acid

36:12:5 30:15:5

3

Toluene:ethyl acetate:acetic acid

36:12:5

4

Cyclohexane:ethyl acetate:acetic acid

31:14:5

5

n-hexane:ethyl acetate:formic acid

31:14:5

6

Toluene:acetone:formic acid

38:10:5

7

n-hexane:ethyl acetate:acetic acid

31:14:5

8

Petroleum ether:ethyl acetate:formic acid

30:15:5

9

Carbon tetrachloride:acetone:formic acid

35:10:5

27

1.2.2 Phƣơng pháp định lƣợng flavonoid

a) Phương pháp cân: Ứng dụng khi nguyên liệu giàu có flavone hoặc

flavonol và dịch chất ít tạp chất [5, 18].

Cân chính xác khoảng 50 g bột dƣợc liệu, xác định độ ẩm, cho vào túi giấy

lọc rồi cho vào dụng cụ Shoxlet. Thêm perthroether và chiết trong 8 giờ để loại

chất béo, chất màu. Sau đó, lấy túi lọc ra cho bay hơi hết perthoether, tiếp tục

cho túi dƣợc liệu vào dụng cụ chiết Shoxlet và chiết flavonoid toàn phần bằng

methanol đến khi dịch chiết cuối cùng hết phản ứng của flavonoid (không cho

phản ứng với thuốc thử cyanidin). Cô dịch chiết methanol dƣới áp suất giảm

đến cắn. Hòa tan cắn trong 100 ml nƣớc cất nóng, để nguội. Lắc nhiều lần với ethyl acetat cho đến kiệt flavonoid. Cất thu hồi dung môi đƣợc cắn, sấy ở 800C

đến khối lƣợng không đổi, cân.

Hàm lƣợng flavonoid toàn phần trong dƣợc liệu đƣợc tính theo công thức sau:

x100% [flavonoid]tp(%) =

m: khối lƣợng cắn flavonoid thu đƣợc (g)

a: Khối lƣợng dƣợc liệu đem định lƣợng (g)

x%: Độ ẩm của dƣợc liệu.

Phƣơng pháp này đơn giản nhƣng sai số lớn vì ngoài flavonoid còn có rất

nhiều chất khác cũng tan trong phân đoạn ethyl acetat nhƣ tritecpenoid,

coumarin, các phenolic, các saponin có gắn ít đƣờng…

b) Phƣơng pháp trắc quang

Phƣơng pháp này là phƣơng pháp phổ hấp thụ của phân tử trong vùng

UV-VIS. Ở điều kiện thƣờng, các phân tử, nhóm phân tử của chất bền vững và

28

nghèo năng lƣợng. Đây là trạng thái cơ bản, nhƣng khi có một chùm sáng với

năng lƣợng thích hợp chiếu vào thì các điện tử hóa trị trong các liên kết (δ, Π,

n) sẽ hấp thụ năng lƣợng chúm sáng, chuyển lên trạng thái kích thích với năng

lƣợng cao hơn. Hiệu số giữa hai mức năng lƣợng (cơ bản EO và kích thích Em)

chính là năng lƣợng mà phân tử hấp thụ từ nguồn sáng để tạo ra phổ hấp thụ

phân tử của chất [8, 12].

Nguyên tắc: Phƣơng pháp xác định dựa trên việc đo độ hấp thụ ánh sáng

của một dung dịch phức tạo thành giữa chất cần xác định với thuốc thử vô cơ

hay hữu cơ trong môi trƣờng thích hợp khi đƣợc chiếu bởi chùm sáng. Phƣơng

trình định lƣợng của phép đo dựa trên định luật Lamber-Beer: A = K.C

Trong đó: A: Độ hấp thụ quang

K: Hằng số thực nghiệm

C: Nồng độ chất phân tích

Phƣơng pháp này cho phép xác định nồng độ chất ở khoảng 10-5 – 10-7M

và là một trong những phƣơng pháp đƣợc sử dụng khá phổ biến [8, 12].

Đối với flavonoid cho tạo màu khi phản ứng cyanidin, phản ứng kết hợp

với muối diazoni, tạo phức màu với AlCl3, muối titan…[25].

Trần Quang Vinh xác định tổng hàm lƣợng flavonoid trong cây chùm

ngây theo các giai đoạn phát triển. Dựa vào phản ứng của quercetin với AlCl3

2% đo sự hấp thụ của dung dịch thu đƣợc tại bƣớc sóng 415 nm [20].

Hàm lƣợng quercetin (Q%) trong dƣợc liệu đƣợc tính bằng công thức:

Q(% ) =

Trong đó:

Ac: Độ hấp thụ của dung dịch chuẩn. a: Khối lƣợng dƣợc liệu (g).

29

At: Độ hấp thụ của dung dịch thử. h: Hàm lƣợng ẩm của dƣợc liệu

Cc: Nồng độ (μg/ml) dung dịch chuẩn K: Độ pha loãng của mẫu thử

Hàm lƣợng flavonoid toàn phần (F%) trong dƣợc liệu đƣợc tính bằng công thức

F(%) = Q(%) x 2,51

2,51: Hệ số chuyển đổi từ flavonol sang flavonol glycosid (flavonoid).

Lui Alberto Lia SOARES và các cộng sự cũng đã dựa trên phản ứng tạo

màu của flavonoid với AlCl3 2% và đem đo hấp thụ quang ở bƣớc sóng 428

nm. Xác định đƣợc tổng hàm lƣợng của flavonoid trong cây Diệp hạ châu [38].

Hàm lƣợng tổng flavonoid trong Tabernaemontana heyneana Wall. Cũng

đƣợc tính theo chất chuẩn Rutin với điều kiện: Cho Rutin phản ứng tạo màu với

AlCl3 10%+NaNO2 5%+H2O sau đó dung dịch thu đƣợc đem đo ở bƣớc sóng

510 nm [44]. Cũng với điều kiện nhƣ vậy Mudsir Sultana đã sử dụng Quercitin

làm chất chuẩn và định lƣợng hàm lƣợng toàn phần flavonoid trong Ageratum

Conyzoides là 1172,55 ± 17,69 mg [41].

Phƣơng pháp trắc quang có độ nhạy, độ ổn định cũng nhƣ độ chính xác

khá cao và là phƣơng pháp đƣợc sử dụng phổ biến trong phân tích.

c) Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một phƣơng pháp hóa lý dựa vào ái

lực khác nhau của các chất khác nhau với hai pha luôn tiếp xúc và không đồng

tan với nhau, một pha động và một pha tĩnh. Pha động là chất lỏng chảy qua cột

với một tốc độ nhất định, còn pha tĩnh chứa trong cột là một chất rắn đã đƣợc

đƣợc phâ chia dƣới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang

rắn hay một chất mang đã đƣợc biến đổi bằng liên kết hóa học với các nhóm

hữu cơ. Quá trình sắc ký xảy ra do các cơ chế: Hấp phụ, phân bố, trao đổi ion

hoặc rây phân tử [11, 16].

30

Nguyên tắc của quá trình sắc ký trong cột:

Pha tĩnh là yếu tố quan trọng quyết định bản chất của quá trình sắc ký và loại

sắc ký. Nếu pha tĩnh là chất hấp phụ ta có sắc ký hấp phụ, nếu pha tĩnh là chất

trao đổi ion ta có sắc ký trao đổi ion, pha tĩnh là chất đƣợc gắn pha liên kết ta có

sắc ký phân bố, nếu pha tĩnh là gel ta có sắc ký gel hay sắc ký rây phân tử.

Quyết định hiệu quả tách ở đây là tổng hợp các tƣơng tác:

Tổng của 3 tƣơng tác này sẽ quyết định chất nào đƣợc rủa giải ra trƣớc tiên khi

lực lƣu giữ nhỏ nhất và ngƣợc lại.

Thời gian lƣu của một chất là thời gian tính từ lúc tiêm mẫu vào cột đến

khi chất đó ra khỏi cột đạt giá trị cực đại cho pic trên sắc ký đồ:

Hình 1.2: Sắc ký đồ của hai chất và các thông số đặc trƣng

Nếu gọi tR là thời gian lƣu giữ của một chất thì : tR = tR - to

R là thời gian lƣu thực (thời gian lƣu hiệu chỉnh)

31

Trong đó : t’

to là thời gian chết (thời gian không lƣu giữ).

Khi pha động chảy qua cột với một tốc độ không thì thời gian lƣu có thể

thay thế bằng thể tích lƣu. Thể tích lƣu là thể tích pha động thu đƣợc sau cột

trong khoảng thời gian tƣơng ứng với thời gian lƣu [11, 16].

Hiện nay HPLC đƣợc ứng dụng vào việc phân tích định tính và định

lƣợng các hợp chất thiên đang dần đƣợc phổ biến. Flavonoid cũng đƣợc các nhà

khoa học tại các trƣờng đại học, các viện nghiên cứu phân tích rất nhiều bằng

phƣơng pháp HPLC.

Năm 2005, L. Tao và cộng sự Trƣờng Đại Học Khoa Học và Công Nghệ

Trung Quốc đã dùng HPLC xây dựng đƣợc phƣơng pháp phân tích các

flavonoid (Galangin và 3-O-methyl Galangin) trong thân rễ cây Riềng. Với các

điều kiện nhƣ sau: Sử dụng cột tách ZORBAX, Eclipe SB-C18, pha động đƣợc

dùng là MeOH-H2O-H3PO4 với tỷ lệ 60:38:2 (v:v:v). Rửa rải theo phƣơng pháp

đẳng dòng với tốc độ 0,8 ml/phút. Các flavonoid đƣợc phát tại bƣớc sóng 254 nm, nhiệt độ cột tách 400C với thể tích tiêm 10μl [39].

Hoàng Thị Tuyết Nhung đã xây dựng đƣợc phƣơng pháp phân tích định

lƣợng Kaempferol (thuộc hợp chất flavonoid) trong cây Đơn đỏ bằng phƣơng

pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với điều kiện: Cột RP18 (250mm x 4,6mm; 5μm), nhiệt độ cột 250C, pha động là hỗn hợp Methanol-dung dịch

NaH2PO4 0,05M đã điều chỉnh với PH = 2 với acid H3PO4 (55:45); Dùng

Detector tử ngoại khả kiến UV-VIS loại DDA, phát hiện ở bƣớc sóng 362 nm;

tốc độ dòng: 1,4ml/phút; Thể tích tiêm mẫu 20 μl [15].

C-L Ye và các cộng sự cũng đã phân tích đồng thời 2',4'-dihydroxy-

32

methyl-3',5' dimethyl chalcone và ursolic acid bằng HPLC. Sử dụng cột tách

C18 với pha động MeOH-H2O/H3PO4. Các chất đƣợc phát hiện tại bƣớc sóng

220nm [32].

Brás H .de Oliveira và cộng sự đã phân tích định tính, định lƣợng đồng

thời eupafolin và hispidulin trong cây Eupatorium littorale bằng HPLC với điều

kiện: Cột Dynamax C18 (250mm x 4,6mm; 5μm) với pha động là hỗn hợp

MeOH/H2O, tốc độ dòng 1 ml/min. Detecter UV phát hiện ở bƣớc sóng 339 nm

[26].

James M.Harnly đã xác định hàm lƣợng của 20 flavonoid khác nhau

trong 60 mẫu rau, quả và các loại hạt bằng HPLC với cột tách Zorbax Eclipse

XDB-C18 (250mm x 4,6mm, 5μm). Pha động là hỗn hợp methanol +

acetonitrile +trifluoroacetic với tốc độ dòng 1 ml/phút, rửa giải theo chƣơng

trình gradien. Kết quả chỉ ra rằng các flavonoid cho hấp thụ cực đại tốt nhất

trong khoảng từ 200 – 600 nm [37].

Cụ thể : Nhóm anthocyanidin hấp thụ tại bƣớc sóng tại 210 nm

Nhóm flavon hấp thụ cực đại tại bƣớc sóng tại 260 nm

Nhóm flavanon và flavan-3-ol hấp thụ cực đại tại bƣớc sóng tại 278 nm

33

Nhóm flavonol hấp thụ cực đại tại bƣớc sóng tại 360 nm

CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tƣợng nghiên cứu

Nụ và lá vối nhà, Cleistocalyx operculatus (Roxb.) Merr.et Perry thuộc

họ Sim (Myrtaceae) đƣợc thu hái ở các địa phƣơng khác nhau, ở các tỉnh phía Bắc đƣợc trình bày ở bảng 2.1. Sau đó phơi và sấy ở 500C cho đến khô. Các

mẫu nụ và lá vối đƣợc lƣu ở Khoa Hóa phân tích - Tiêu chuẩn, Viện Dƣợc liệu.

Mỗi mẫu nụ và lá vối đƣợc lấy một lƣợng nhỏ nghiền thành bột mịn, đủ dùng

cho việc nghiên cứu

Bảng 2.1: Bảng chi tiết mẫu nụ và lá Vối

STT Tên mẫu

Nơi lấy mẫu

Ngày lấy mẫu Độ ẩm (%)

1

Lá vối

Việt Trì - Phú Thọ

15/3/2012

8,70

2

Lá vối

Xuân Mai - Hòa Bình

20/4/2012

15,10

3

Lá vối

Yên Dũng - Bắc Giang

25/4/2012

9,30

4

Lá vối

Hà Đông – Hà Nội

17/4/2012

11,10

5

Lá vối

Tiên Du – Bắc Ninh

12/4/2012

11,50

6

Lá vối

Tiền Hải - Thái Bình

06/05/2012

10,90

7

Lá vối

Đông triều – Quảng Ninh

15/4/2012

11,5

8

Nụ vối

Hƣng Yên

17/3/2012

11,18

9

Nụ vối

Nam Định

12/3/2012

11,14

10

Nụ vối

Hà Đông - Hà Nội

17/4/2012

7,65

11

Nụ vối

Tp Hà Nam – Hà Nam

10/04/2012

8,00

12

Nụ vối

Chợ Đồng Xuân – Hà Nội

27/04/2012

12,62

13

Nụ vối

Chí Linh – Hải Dƣơng

19/04/2012

6,77

14

Nụ vối

Đồng Hỷ - Thái Nguyên

23/04/2012

7,85

34

2.2 Nội dung nghiên cứu

- Phân lập một flavonoid chính từ nụ vối. Tinh chế hoạt chất đạt độ tinh

khiết cần thiết cho việc định tính, định lƣợng.

- Xây dựng phƣơng pháp định tính flavonoid từ lá và nụ vối.

- Xây dựng phƣơng pháp định lƣợng một flavonoid chính từ lá và nụ vối.

2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu

2.3.1 Chiết xuất, phân lập flavonoid chính

► Chiết xuất: Để chiết đƣợc nhóm chất chứa trong đối tƣợng nghiên cứu,

phải xây dựng đƣợc các quy trình chiết xuất thích hợp. Tùy theo tính chất của

mỗi chất mà sử dụng dung môi có độ phân cực khác nhau. Khảo sát sự ảnh

hƣởng của nhiệt độ đến quá trình chiết xuất (chiết nguội, chiết nóng) để đảm

bảo hợp lý cả hai yêu cầu: Chiết đƣợc tối đa lƣợng chất nghiên cứu và tối thiểu

tạp chất để thuân tiện cho quá trình phâp và tinh chế tiếp theo [21].

Đối với hợp chất flavonoid: Sử dụng phƣơng pháp ngâm lạnh hoặc chiết

nóng với ethanol ở các độ cồn khác nhau.

Chiết dƣợc liệu (nụ vối) với dung môi là ethanol 96%, sau đó đem cất cô

quay để thu hồi dung môi, ta thu đƣợc cắn tổng. Hòa tan cắn tổng với lƣợng

nƣớc thích hợp rồi chiết từng phân đoạn với dung môi có độ phân cực tăng dần:

n-hexan, ethyl acetat, n-butanol ta thu đƣợc các phân đoạn cắn khác nhau.

►Phân lập: Sử dụng sắc ký cột với các loại pha tĩnh hấp phụ (silica gel),

phân bố pha đảo (C18), thấm qua gel (Sephadex LH-20). Tùy theo từng chất mà

chọn pha tĩnh thích hợp hoặc phải kết hợp sử dụng các pha tĩnh khác nhau.

Khảo sát lựa chọn dung môi rửa giải bằng TLC [47].

Phân lập flavonoid chính trong nụ vối bằng phƣơng pháp sắc ký cột

(Column Chromatography): pha tĩnh là silica gel, cỡ hạt 40-63 µm (Merck), pha

động là hệ dung môi hữu cơ có độ phân cực khác nhau (n-hexan, diclomethan,

35

ethyl acetat, aceton, methanol…).

2.3.2 Xác định cấu trúc chất phân lập

Kiểm tra độ tinh khiết bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

HPLC, xác định cấu trúc chất phân lập thông qua phân tích tính chất hóa lý

(cảm quan, nhiệt độ nóng chảy, năng suất quay cực) kết hợp với việc phân tích các phổ hồng ngoại (IR), phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (1H-NMR và 13C-NMR),

khối phổ (MS) và so sánh với dữ liệu trong các tài liệu tham khảo.

2.4 Xây dựng phƣơng pháp định tính flavonoid trong nụ và lá vối

2.4.1 Định tính bằng phƣơng pháp hóa học

Định tính flavonoid chính bằng các phản ứng hóa học thông thƣờng [6].

+ Phản ứng với hơi amoniac.

+ Phản ứng cyanidin.

+ Phản ứng với FeCl3 5%.

+ Phản ứng với kiềm loãng.

2.4.2 Định tính bằng phƣơng pháp sắc ký

Dùng các phƣơng pháp sắc ký: Sắc ký bản mỏng (TLC), sắc ký lỏng hiệu

năng cao (HPLC) để định tính nhóm chất flavonoid trong nụ và lá vối.

a. Định tính bằng TLC

Khảo sát điều kiện phân tích định tính phù hợp áp dụng cho nhóm chất

flavonoid trong nụ và lá vối, gồm có các yếu tố liên quan nhƣ: Cách xử lý mẫu,

pha tĩnh, pha động, cách phát hiện…

Xử lý mẫu (chuẩn bị mẫu chấm sắc ký):

Một trong những ƣu điểm của kỹ thuật TLC là loại sắc ký mở, có pha

tĩnh là các bản mỏng chỉ dùng một lần. Do vậy, việc xử lý mẫu không đòi hỏi

khắt khe nhƣ các loại sắc ký cột khác. Có thể tiến hành bằng phƣơng pháp siêu

âm (sonicating) hoặc phƣơng pháp chiết hồi lƣu trên cách thủy với dung môi

thích hợp. Dung môi methanol đã đƣợc áp dụng phổ biến để chiết với đa số các

36

thành phần hoạt chất. Tuy nhiên, trong một số trƣờng hợp cần thiết ta có thể áp

dụng chiết với các dung môi khác, với mục đích làm giàu thành phần nhóm

chất, hoạt chất cần phân tích và loại bớt tạp chất gây cản trở cho việc tách và

phát hiện nhóm chất, hoạt chất đó.

Pha tĩnh:

Là bản mỏng silica gel GF254. Trƣớc khi sử dụng, bản mỏng đƣợc sấy ở

105 – 1100C khoảng 30 phút, để nguội đến nhiệt độ phòng.

Pha động:

Tiến hành khảo sát lựa chọn hệ dung môi sắc ký phù hợp áp dụng cho

việc tách thành phần nhóm chất flavonoid trong nụ và lá vối. Tiến hành khảo

sát dựa trên cơ sở tham khảo từ tài liệu về các hệ dung môi đã đƣợc áp dụng

tách nhóm chất flavonoid. Ta có thể điều chỉnh, thay đổi tỷ lệ hoặc thành phần

dung môi cho phù hợp. Bên cạnh đó, tiến hành khảo sát có dựa trên cơ sở tham

khảo tính chất phân cực (có ảnh hƣởng đến giá trị Rf của chất phân tích) và tính

lựa chọn của mỗi loại dung môi (có ảnh hƣởng đến sự thay đổi vị trí của các vết

trên sắc ký đồ) để lựa chọn.

Triển khai sắc ký: Đặt bản mỏng gần nhƣ thẳng đứng với bình triển khai,

các vết chấm phải ở trên bề mặt của lớp dung môi khai triển (cách khoảng 5

mm). Đậy kín bình để nguyên ở nhiệt độ thƣờng, không đổi. Khi dung môi đã

triển khai trên bản mỏng đƣợc một đoạn, lấy bản mỏng ra khỏi bình, đánh dấu

mức dung môi, làm bay hơi dung môi còn đọng lại trên bản mỏng rồi hiện vết

bằng cách phun thuốc thử.

Kết quả là các sắc ký đồ TLC của flavonoid chính có giá trị hệ số di

chuyển Rf (đƣợc tính bằng tỉ số giữa quãng đƣờng đi đƣợc của chất cần phân

tích và quãng đƣờng pha động đi đƣợc)

37

b. Định tính bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).

HPLC đƣợc sử dụng kết hợp với TLC để kiểm tra sự có mặt của hợp chất

là đối tƣợng nghiên cứu ngay từ khâu định tính dƣợc liệu và trong quá trình

chiết xuất bằng cách so sánh thời gian lƣu tR, phổ sắc ký đồ của mẫu thử và mẫu

đối chiếu [1, 2].

2.5 Xây dựng phƣơng pháp định lƣợng flavonoid trong nụ và lá vối

2.5.1 Định lƣợng flavonoid toàn phần bằng phƣơng pháp trắc quang

Định lƣợng toàn phần flavonoid trong nụ và lá vối bằng phƣơng pháp tắc

quang: Thực hiện dựa trên phản ứng của flavonoid với AlCl3 sẽ tạo phức màu

hồng có độ hấp thụ ánh sáng cực đại ở bƣớc sóng 510 nm. Đo độ hấp thụ của

dung dịch ở bƣớc sóng 510 nm rồi tính ra hàm lƣợng flavonoid (tính theo chất

chuẩn CO-1 và catechin) tƣơng đƣơng với mẫu chuẩn làm cùng điều kiện.

Khảo sát lựa chọn dung môi thích hợp trong việc định lƣợng flavonoid

toàn phần.

Dựa trên phản ứng tạo phức của flavonoid với thuốc thử tạo màu trong

việc lựa chọn bƣớc sóng xác định.

Xây dựng phƣơng pháp phân tích theo các chỉ tiêu:

+ Tính đặc hiệu

+ Độ lặp lại

+ Độ đúng

+ khoảng tuyến tính

+ Giới hạn của phƣơng pháp

2.5.2 Định lƣợng flavonoid chính bằng phƣơng pháp HPLC

Khảo sát lựa chọn chƣơng trình sắc ký thích hợp để định lƣợng flavonoid

38

chính trong nụ và lá vối.

Dựa trên công thức phân tử và cấu trúc hóa học của flavonoid chính chiết

xuất đƣợc từ dƣợc liệu nụ vối, để tìm các điều kiện sắc ký phù hợp nhƣ: Bản

chất pha tĩnh, thành phần pha động, bƣớc sóng phát hiện, tốc độ dòng pha động,

thể tích tiêm mẫu, nồng độ dung dịch thử, dung môi pha mẫu.

Xây dựng phƣơng pháp phân tích theo các tiêu chỉ tiêu:

- Tính đặc hiệu.

- Độ tuyến tính và khoảng nồng độ tuyến tính.

- Độ chính xác.

- Độ đúng: Độ đúng đƣợc xác định bằng phƣơng pháp thêm chuẩn và

tính thông qua tỷ lệ thu hồi:

Tỷ lệ thu hồi (%) = x 100%

- Giới hạn của phƣơng pháp

- Sự phù hợp của hệ thống sắc ký

2.6 Một số đặc trƣng thống kê để xử lý và đánh giá kết quả

Các số liệu thực nghiệm đƣợc xử lý bằng phƣơng pháp thống kê thông

qua các đặc trƣng sau:

- Giá trị trung bình:

- Phƣơng sai: S2 =

- Độ lệch chuẩn: SD =

39

- Độ lệch chuẩn tƣơng đối: RSD(%) = .100%

2.7 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất, dung môi

2.7.1 Thiết bị, dụng cụ

- Cân kỹ thuật Precisa XT 620M

- Cân phân tích Precisa XT 220A

- Máy cất quay Buchi B481

- Tủ sấy Binder – FD 115

- Đèn tử ngoại

- Hệ thống HPLC _ LC10A, hãng Shimadzu (Nhật Bản)

- Máy TLC chấm mẫu bán tự động CAMAG LINOMAT5, CAMAG

REPROSTAR3.

- Máy UV-VIS 1800, dải đo 190 nm-900 nm, hãng Shimadzu (Nhật Bản)

2.7.2 Hóa chất, dung môi

- Dung môi: methanol, n-hexan, ethyl acetat, toluen… dùng cho sắc ký đạt

tiêu chuẩn phân tích, dung môi dùng trong chiết xuất đạt tiêu chuẩn công

nghiệp đƣợc chƣng cất lại trƣớc khi dùng.

- Bản sắc ký lớp mỏng tráng sẵn Silica gel GF254 (Merck).

- Silica gel sắc ký cột pha thƣờng, cỡ hạt 40-63µm (Merck).

- Hóa chất: các hóa chất để làm các phản ứng định tính bằng phƣơng pháp

hóa học, định tính phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) và định lƣợng bằng

40

phƣơng pháp đo quang, HPLC.

CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Chiết xuất và phân lập một flavonoid chính từ nụ vối

3.1.1. Chiết xuất dƣợc liệu và phân đoạn

Cân 8 kg dƣợc liệu (nụ vối) làm khô, chiết bằng ethanol 96% bằng

phƣơng pháp ngâm lạnh, cho ethanol ngập hết dƣợc liệu, thời gian ngâm là 1

tuần/lần rút dung dịch chiết, ngâm 3 lần (dịch đã nhạt màu). Dung dịch chiết

thu đƣợc, đem cất thu hồi dung môi ethanol và cô cách thủy, thu đƣợc cao toàn

phần (1192 g). Lấy 1000 g cao đem hòa tan một lƣợng vừa đủ 0,5 lít ethanol

96%, và tiếp tục bổ xung thêm 1,5 lít nƣớc cất để hòa tan. Sau đó lắc chiết với

n-hexan theo tỉ lệ 1:1 đến nhạt màu (5 lần), thu hồi dung môi n-hexan đƣợc cao

chiết n-hexan (cao H, 241,5 g). Phần dịch chiết còn lại tiếp tục đem lắc, chiết

với ethyl acetat theo tỉ lệ 1:1 đến nhạt màu (5 lần), cất thu hồi dung môi ethyl

acetat đƣợc cao chiết ethyl acetat (cao E, 640 g). Dung dịch chiết còn lại đƣợc

lắc chiết với n-butanol (5 lần), cất thu hồi n-butanol, ta thu đƣợc cao chiết n-

41

butanol (cao B) Quy trình chiết đƣợc tóm tắt ở sơ đồ 3.1:

Sơ đồ 3.1: Sơ đồ chiết và phân đoạn cao nụ vối

Cao tổng

Hòa tan vào nƣớc

Dung dịch nƣớc

Lắc chiết với n-hexan (làm lặp lại 5lần)

Cao n- hexan

Dung dịch n-hexan

Dung dịch nƣớc

Lắc chiết với ethyl acetat (làm lặp lại 5 lần)

Dung dịch ethy acetat

Dung dịch nƣớc

Cao Ethyl

Lắc chiết với n-butanol (làm lặp lại 5 lần)

Dung dịch n-butanol

Dung dịch nƣớc

Cao n- butanol

3.1.2 Phân lập flavonoid chính trong cao phân đoạn ethyl acetat

Để định hƣớng cho việc phân lập, tiến hành thử định tính flavonoid trong

các cao H, cao E. Lấy 0,02g cao H, cao E hòa tan vào 10ml methanol ta đƣợc

các dung dịch H, E tƣơng ứng.

* Phản ứng tạo màu với FeCl3 5%: Lấy riêng 1 ml dung dịch H, E (ở

trên) cho vào từng ống nghiệm sau đó cho vào mỗi ống nghiệm 1 giọt FeCl3 5%

42

lắc và quan sát màu. Kết quả chỉ ra ở bảng 3.1.

* Phản ứng với NaOH 10%: Lấy riêng 1 ml dung dịch H, E (ở trên) cho

vào từng ống nghiệm sau đó cho vào mỗi ống nghiệm1 giọt NaOH 10% lắc và

quan sát màu. Kết quả chỉ ra ở bảng 3.1

Bảng 3.1: Kết quả định tính sơ bộ flavonoid ở cao H và cao E

Mẫu Thuốc thử hiện màu

Dung dịch NaOH 10% Dung dịch FeCl3 5%

Cao H Không phản ứng Không phản ứng

Cao E Xuất hiện tủa màu vàng Dung dịch màu xanh đen

Qua kết quả định tính sơ bộ bảng 3.1 cho thấy trong phân đoạn cao E có

chứa flavonoid, việc phân lập một flavonoid chính đƣợc thực hiện từ cao E.

* Sắc ký cột:

Hòa một ít cao phân đoạn EtOAc trong methanol, tiến hành khảo sát

bằng phƣơng pháp SKLM để lựa chọn phƣơng pháp chạy sắc ký cột phù hợp

nhất, thử với một số hệ dung môi Hx : ethyl acetat, Hx : cloroform…, kết quả

khảo sát cho hệ dung môi Hx : ethyl acetat là phù hợp nhất. Vì vậy tiến hành

sắc ký cột với pha tĩnh là silica gel pha thuận cỡ hạt 40-63 µm, pha động là Hx :

ethyl acetat với tỉ lệ tăng dần độ phân cực.

* Chuẩn bị silica gel

Cân khoảng 600g silica gel pha thƣờng cho vào cốc có mỏ dung tích

1000 ml, thêm n-hexan cho ngập bề mặt silica gel 4-5 cm, khuấy đều, cho bay

hết khí.

* Chuẩn bị cột sắc ký

Dùng cột thủy tinh trung tính có đƣờng kính 10 cm, chiều dài 100 cm

43

đƣợc lắp thẳng đứng trên giá, phía dƣới cột có van điều chỉnh tốc độ chảy của

dung môi. Lót một lớp bông mỏng ở đáy cột, ngay trên van để chất nhồi sau khi

đƣợc nhồi vào cột không gây tắc. Đổ từ từ silica gel đã chuẩn bị ở trên vào cột

sao cho cột không bị rỗ, bề mặt cột phẳng và để yên cho cột ổn định. Mở khóa

cho dung môi chảy và thêm n-hexan để ổn định cột.

* Chuẩn bị mẫu và đưa lên cột

Cân khoảng 300g cao phân đoạn EtOAc hòa tan hoàn toàn bằng một

lƣợng tối thiểu methanol, rồi đem mẫu đó tẩm với khoảng 100 g silica gel pha

thƣờng. Sau đó đổ phần silica gel đã tẩm mẫu ra khay để bay hơi hết dung môi, rồi đem sấy ở 50oC cho đến khô. Nếu thấy vón cục thì có thể dùng chày và cối

sứ nghiền nhỏ để có đƣợc hạt silica gel đã tẩm chất là mịn nhất. Sau khi chuẩn

bị xong mẫu, đƣa mẫu từ từ vào cột sao cho không bị xáo trộn lớp chất nhồi bên

trong cột, dùng pipet tráng vòng quanh bên trong cột trƣớc khi thêm dung môi

rửa giải.

* Tiến hành sắc ký cột

Tiến hành chạy cột với hệ dung môi n-hexan: ethyl acetat với độ phân

cực tăng dần (tỉ lệ dung môi từ 49:1 đến 1:1). Dùng bình nón có thể tích 250 ml

để hứng dung dịch ra khỏi cột, thu đƣợc 32 bình (200 ml). Tất cả các bình hứng

đều đƣợc kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng. Bằng cách này, ta thấy từ bình 04 đến

bình 09 cho sắc đồ giống nhau có 1 vết màu vàng (hình 3.1), gộp các bình này

lại, cất thu hồi dung môi và cô cách thủy đến khô thu đƣợc chất rắn có màu da

cam, gọi là chất rắn CO-1 (4,329 g). Khi kiểm tra lại bằng phƣơng pháp SKLM

pha thƣờng với 2 hệ dung môi là : n-hexan:ethyl acetat (2:1), CHCl3:MeOH

(20:1), và SKLM pha đảo với hệ dung môi MeOH:nƣớc (20:1), chất rắn CO-1

44

đều cho một vết tròn, màu vàng với giá trị Rf tƣơng ứng bằng 0,47; 0,76; 0,45.

a) Hình ảnh SKLM

b) Hình ảnh chất CO-1

Hình 3.1: Hình ảnh SKLM và chất CO-1 phân lập từ nụ vối

3.1.3. Xác định cấu trúc chất phân lập

Chất rắn CO-1 là tinh thể có màu vàng da cam, có điểm nóng chảy 125- 1270C. Kiểm tra độ tinh khiết bằng máy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) cho

biết chất CO-1 phân lập đƣợc có độ tinh khiết 98,21% tính theo diện tích pic,

sắc ký đồ thể hiện ở hình 3.2

45

Hình 3.2: Sắc ký đồ HPLC của chất CO-1

Phổ UV (MeOH) của chất CO-1 cho đỉnh hấp thụ cực đại ở λ= 340nm,

nằm trong vùng hấp thụ mạnh của các chalcon (300-400nm) [4] .

Hình 3.3: Phổ tử ngoại (UV) chất CO-1

Phổ hồng ngoại cho đỉnh hấp thụ ở νmax = 3371 cm-1 đặc trƣng cho dao động hóa trị của nhóm OH liên kết hydro, đỉnh ở νmax =2938 cm-1 đặc trƣng cho dao động hóa trị của liên kết C-H, đỉnh ở νmax =1626 cm-1 đặc trƣng cho dao động hóa trị của liên kết C=O, đỉnh ở νmax =1537 cm-1 đặc trƣng cho dao động hóa trị của liên kết C=C, đỉnh ở νmax =1166 cm-1 đặc trƣng cho dao động hóa trị

của liên kết C-O. Nhƣ vậy, trong công thức của hợp chất 1 có nhóm –OH,

nhóm C-O, nhóm C=O và liên kết đôi C=C. (xem phụ lục)

Phổ 1H-NMR (CD3OD, 500MHz) : có độ dịch chuyển δ ppm: Có 2 pic

methyl (CH3, δH =2,076, s, và δH 2,13, s), 1 pic methoxy (OCH3, δH 3,64, s),

một nhóm gồm 5 proton thuộc vòng thơm δH 7,405-7,453 và 7,652-7,671. Điều

46

này khẳng định chất CO-1 có vòng thơm. Hai proton có độ dịch chuyển δH 8,02

(d) và δH 7,78 (d) có hằng số tƣơng tác lớn (J=15,5 Hz), chứng tỏ chất CO-1 có

cấu hình trans. (xem phụ lục).

Phổ 13C-NMR (CD3OD, 125MHz) có tất cả 18 tín hiệu cho biết chất

CO-1 có 18 nguyên tử C. Các tín hiệu cho biết có hai nhóm methyl (CH3) có độ

dịch chuyển δC 8,1 và 8,9 ppm, vì độ dịch chuyển của hai nhóm xuất hiện ở

trƣờng cao độ nên nó phải đƣợc gắn vào vòng thơm. Một nhóm methoxy

(OCH3) có δC 62,6 ppm, cũng gắn vào vòng thơm. Phổ 13C-NMR cũng cho biết

có 14 tín hiệu các bon của vòng thơm hoặc liên kết đôi có độ dịch chuyển từ δC

108,5 đến 163,1 ppm, và một nhóm keton (C=O) có độ dịch chuyển δC 194,5

ppm. (xem phụ lục)

Kết hợp số liệu các phổ UV, IR, 1H-NMR và 13C-NMR cho thấy chất

CO-1 có vòng thơm, có nhóm C=O, nhóm OH, nhóm OCH3. Với việc có 18

các bon, nhƣng có 3 các bon đƣợc gắn vào vòng thơm chứng tỏ chất CO-1 có

khung gồm 15 các bon, do đó sẽ là một flavonoid. Kết hợp phổ UV, phổ 1H-

NMR cho biết có 2 proton có cấu hình trans, và phổ 13C-NMR cho biết có một

nhóm C=O có độ dịch chuyển ở trƣờng thấp chúng tôi đi đến kết luận chất CO-

1 là một flavonoid thuộc nhóm chalcon. Kết hợp các tài liệu tham khảo [11,

22], và các dữ kiện phổ thu đƣợc chúng tôi kết luận chất CO-1 là 2',4'-

dihydroxy-6'-methoxy-3',5'-dimethylchalcon, có CTPT là C18H18O4 và KLPT

298 amu. Phổ khối MS cho pic ion phân tử ở [M+H]+, có m/z = 299; ở [M-H]+

có m/z = 297, tƣơng ứng với khối lƣợng phân tử của chất rắn CO-1 là M = 298

amu.

47

Các dữ liệu phổ 1H, và 13C-NMR đƣợc trình bày trong bảng 3.2

Bảng 3.2: Số liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của chất CO-1

Số liệu NMR

Vị trí

13C-NMR

1H-NMR

δC (ppm) δH (ppm) (mult, J in Hz)

1 136,8 -

2 129,3 7,67 (dd, J = 8, J=1,5 Hz)

3 130,0 7,42 (m)

4 131,2 7,41 (m)

5 130,0 7,43 (m)

6 129,3 7,67 (dd, J =8, J=1,5 Hz)

C=O 194,5 -

Α 128,2 7,79 (d, J = 15,5 Hz)

Β 143,5 8,03 (d, J = 15,5 Hz)

1′ 109, 4 -

2′ 162,6 -

3′ 108,5 -

4′ 163,1 -

5′ 111,4 -

6′ 160,2 -

8,1 2,08 (s) 3′-CH3

8,9 2,13 (s) 5′-CH3

48

62,6 3,64 (s) OCH3

Từ các dữ liệu giải phổ IR, UV, 1H-NMR, 13C-NMR và các số liệu đƣợc

trình bày ở bảng 3.1 đã khẳng định chắc chắn công thức phân tử của hợp chất

này. Công thức cấu tạo của chất CO-1 đƣợc trình bày trong hình 3.4.

Hình 3.4: Công thức cấu tạo chất CO-1

Nhƣ vậy flavonoid chính tách đƣợc trong nụ vối là 2′,4′-dihydroxy-

6′methoxy-3′,5′-dimethylchalcone (ký hiệu ngắn gọn là CO-1). Đƣợc xác định thông qua cảm quan, các phổ hồng ngoại (IR), phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (1H và 13C NMR), khối phổ (MS) khi so sánh với các tài liệu tham khảo [14, 27].

Kiểm tra độ tinh khiết bằng HPLC, đo nhiệt độ nóng chảy của CO-1 nhiều lần đều cho kết quả ổn định ở 125-127oC. Nhƣ vậy, có thể sử dụng mẫu chất CO-1

phân lập đƣợc làm chất đối chiếu trong phép xây dựng phƣơng pháp định tính,

định lƣợng flavonoid và chất này trong các mẫu nụ và lá vối.

3.2 Xây dựng phƣơng pháp định tính flavonoid trong lá và nụ vối

3.2.1 Định tính bằng phản ứng hóa học

Lấy 2 g bột dƣợc liệu (nụ, lá vối) cho vào bình nón, chiết siêu âm với 20ml ethanol 900 trong 30 phút, lọc lấy dịch lọc. Dùng dịch lọc để làm các phản

ứng định tính.

49

Phản ứng với hơi amoniac.

Nhỏ vài giọt dung dịch chiết lên miếng giấy lọc, để khô rồi hơ lên miệng

lọ amoniac đặc, quan sát sự thay đổi màu của vết chất thấy vết chất chuyển từ

vàng sang vàng đậm.

Kết luận: Có flavonoid

Phản ứng với kiềm loãng.

Cho 2ml dịch chiết vào ống nghiệm, nhỏ vài giọt dung dịch natri

hydroxid 10%, lắc, dung dịch trong ống nghiệm chuyển màu vàng, sau xuất

hiện tủa vàng.

Kết luận: Có flavonoid

Phản ứng cyanidin (phản ứng Shinoda).

Cho 2ml dịch chiết vào ống nghiệm, thêm ít bột magie kim loại, rồi nhỏ

từ từ vài giọt dung dịch acid hydroclorid đậm đặc. Sau vài phút dung dịch xuất

hiện màu hồng.

Kết luận: Có flavonoid

Phản ứng với dung dịch sắt(III) clorid 5%.

Cho 2ml dịch chiết vào ống nghiệm, thêm vài giọt dung dịch

sắt(III)clorid 5%, lắc sẽ xuất hiện màu xanh đen.

Kết luận: Có flavonoid

Dựa trên các tài liệu tham khảo, các công trình nghiên cứu định tính

flavonoid của các nhà khoa học ở các Trƣờng đại học, các Viện nghiên cứu ở

trong nƣớc và trên thế giới. Trong luận văn này khẳng định lại một lần nữa các

hợp chất vô cơ nhƣ NH3, NaOH, FeCl3…luôn là những thuốc thử cho phản ứng

rất nhạy, tạo màu đặc trƣng cho việc phát hiện flavonoid trong thực vật.

3.2.2 Định tính bằng TLC

50

3.2.2.1 Định tính flavonoid trong dược liệu nụ và lá vối

a) Chuẩn bị mẫu chấm sắc ký

Dung dịch thử: Lấy 1 gam bột dƣợc liệu (nụ, lá vối) cho vào bình nón,

thêm 50 ml methanol (MeOH) rồi đem siêu âm 30 phút, lọc qua giấy lọc, dịch

lọc để làm các phép định tính.

Dung dịch đối chiếu: Dung dịch flavonoid chính (tách đƣợc ở nụ vối)

trong MeOH (hàm lƣợng khoảng 1 mg/ml).

Đƣa chất phân tích lên bản mỏng: Lƣợng mẫu cần đƣa lên bản mỏng là

khoảng 10 μl dung dịch đã pha ở trên. Các vết chấm cùng trên một đƣờng xuất

phát cách mép dƣới của bản mỏng 1,5 cm, đƣờng kính vết chấm 3-5 mm và

cách nhau 15 mm, hai vết chấm ngoài cùng của bản mỏng cách mép ngoài

khoảng 1cm.

b) Hệ dung môi sắc ký: Tiến hành khảo sát triển khai sắc ký cho các hệ

dung môi sau: Hệ 1: Toluen:EtOAc:Aceton:Acid formic =5:2:2:1 (v:v:v )

Hệ 2: EtOAc:Acid acetic:Acid formic:Nƣớc =10:1:1:2 (v:v:v:v )

Hệ 3: n-Hexan : EtOAc : Acid formic =6:3:0,1 (v:v:v )

Hệ 4: EtOAc : Toluen : Acid formic : Nƣớc = 7:3:1,5:1 (v:v:v)

Tiến hành triển khai sắc ký lá, nụ vối và chất rắn CO-1. Qua khảo sát các

hệ dung môi ở trên, chúng tôi thấy với hệ 3 cho kết quả sắc ký đồ tách tốt nhất

(hình 3.5A) nên dùng hệ 3 làm hệ dung môi khai triển.

Tiến hành triển khai chạy sắc ký dịch chiết của nụ, lá và chất đối chiếu

CO-1 trên cùng bản mỏng. Sau đó chúng tôi tiến hành soi ở các bƣớc sóng UV-

51

254 nm, UV-366 nm và ánh sáng trắng.

Hình 3.5A: Sắc ký đồ định tính flavonoid trong nụ và lá vối

C: Chất chuẩn CO-1 N: Nụ vối L: Lá vối

A: UV-254nm

B: Ánh sáng trắng (trƣớc khi phun thuốc thử)

C: UV- 366nm

D: Ánh sáng trắng (sau khi phun thuốc thử)

E: UV-366 sau khi phun thuốc thử

Các sắc ký đồ hình (A,B,C) cho thấy flavonoid trong nụ, lá vối cho các

vết màu đen xám khi soi dƣới UV-254 nm và UV-366 nm. Sau khi phun thuốc thử H2SO4 10% /ethanol và sấy ở 1050C, ở miền ánh sáng trắng cho các vết có màu vàng (Rf =0,47) đặc trƣng của flavonoid.

Với thuốc thử acid boric/acid oxalix với tỷ lệ 2:1 cho ta kết quả sắc ký đồ

ở hình D, E nhƣ sau: Cũng cho một vệt xám đen khi soi ở bƣớc sóng UV-366 nm, Sau khi sấy ở 1050C cho ta một vết màu vàng (Rf = 0,47) đặc trƣng của flavonoid.

Nhƣ vậy có thể sử dụng hệ 3 làm hệ dung môi cho việc triển khai sắc ký

để định tính flavonoid trong việc xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho dƣợc liệu nụ, lá

vối.

52

3.2.2.2 Định tính flavonoid trong cao phân đoạn EtOAc

a) Chuẩn bị dịch chấm sắc ký: hòa tan một ít cao đặc nụ vối và cao phân

đoạn EtOAc trong MeOH. Dùng bản mỏng silica gel 60F254 đã tráng sẵn và hoạt hóa ở 110oC/ 60 phút. b) Hệ dung môi khai triển:

Hệ 1: Toluen : EtOAc : Aceton : Acid formic = 5:2:2:1 (v:v:v )

Hệ 2: EtOAc : Acid acetic : Acid formic : Nƣớc = 10:1:1:2 (v:v:v )

Hệ 3: Toluen : EtOAc : Acid formic = 6:4:1 (v:v:v )

Hệ 4: EtOAc : Toluen : Acid formic : Nƣớc = 7:3:1,5:1 (v:v:v )

Qua khảo sát các hệ dung môi khác nhau, hệ dung môi 3 cho kết quả tách

các chất có trong cao EtOAC của nụ vối là tốt nhất. Cho nên dùng hệ 3 làm hệ

dung môi khai triển và kết quả đƣợc trình bày ở hình 3.5B và bảng 3.3.

A B C D

Hình 3.5B: Sắc ký đồ định tính flavonoid trong cao ETOAC

1: Cao tổng nụ vối. 2: Cao phân đoạn EtOAc nụ vối

(A). Quan sát ở UV 254nm

53

(C). Hơ amoniac (B).Quan sát ở UV 365nm (D).Nhúng H2SO4 10%/cồn, sấy ở 110oC/5’.

Bảng 3.3. Kết quả SKLM cao phân đoạn EtOAc

Màu sắc

TT Rf x 100

UV 254 nm UV 365 nm

AS thƣờng (Hơ amoniac) Cam nhạt Nâu nhạt Nâu nhạt Tím nhạt

Nâu đậm Nâu nhạt Nâu nhạt Nâu đậm Nâu đậm Nâu nhạt Nâu nhạt Nâu nhạt Nâu nhạt Nâu nhạt

Lam đậm Xanh nhạt Xanh nhạt Xanh sáng Xanh sáng Lam nhạt Lam nhạt Xanh sáng

AS thƣờng H2SO4/cồn Nâu nhạt Tím đậm Tím nhạt Tím nhạt Tím nhạt Tím nhạt Nâu nhạt Tím nhạt

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

89,7 76,9 69,2 64,1 53,8 46,1 39,2 37,2 24,4 19,2

Trên sắc ký đồ cho thấy ở UV-254 nm, UV-365 nm và sau khi nhúng

H2SO4 10%/ cồn, cao phân đoạn EtOAc có 10 vết có Rf và màu sắc tƣơng

đƣơng với cao đặc nụ vối. Khi hơ amoniac thì cao đặc nụ vối và cao phân đoạn

EtOAc đều có 4 vết có Rf và màu sắc tƣơng đƣơng.

Nhƣ vậy dựa vào cấu trúc, độ phân cực của flavonoid và khả năng tách

trên bản mỏng, chúng tôi đã đƣa ra đƣợc 2 hệ dung môi là: n-Hexan : EtOAc :

Acid formic (6:3:0,1) và Toluen : EtOAc : Acid formic (6:4:1) phù hợp để định

tính sự có mặt của flavonoid trong dƣợc liệu vối bằng phƣơng pháp TLC.

3.2.3 Định tính bằng HPLC

* Chuẩn bị dung dịch lá vối: Cân chính xác khoảng 1g bột dƣợc liệu,

thêm chính xác khoảng 25,00 ml methanol, đem siêu âm 30 phút, làm lặp 2 lần,

để nguội, bổ sung lƣợng methanol đã mất cho đủ 50,00ml. Lọc, đem đi xác định

hàm lƣợng.

* Chuẩn bị dung dịch nụ vối: Cân chính xác khoảng 1g bột dƣợc liệu,

54

thêm chính xác khoảng 25,00 ml methanol, đem siêu âm 30 phút, làm lặp 2 lần,

để nguội, bổ sung lƣợng methanol đã mất cho đủ 50,00 ml. Lọc, hút ra chính

xác 1ml đem hòa tan định mức thành 10,00ml bằng methanol, sau đó đem đi

tiêm sắc ký.

* Chuẩn bị dung dịch mẫu chuẩn: Cân chính xác 1,10 mg chất CO-1,

thêm chính xác 1,00 ml methanol, sau đó đem siêu âm trong 10 phút. Hút chính

xác 0,50 ml đem pha loãng bằng methanol tới 5,00 ml để đƣợc nổng độ của

CO-1 là 0,11 mg/ml, sau đó đem tiêm sắc ký.

Kết quả định tính bằng phƣơng pháp hóa học và bằng TLC đã chỉ ra rằng

hoạt chất flavonoid chính trong nụ và lá vối là chất rắn CO-1. Vì vậy chúng tôi

chỉ tiến hành xây dựng phƣơng pháp định tính hoạt chất chính này bằng phƣơng

pháp HPLC.

Hệ thống sắc ký:

- Hệ thống HPLC – LC 10A, Shimadzu, Nhật Bản. - Cột bondapak TM C18 (3,9mm ID x 300mm; 5μm) hãng Millipore

- Detector diod array SPD-M10A: 341 nm

Pha động: Methanol (A) và dung dịch NaH2PO4 0,05M (B)

Điều kiện sắc ký: - Tốc độ dòng: 0,7 ml/phút

- Thể tích tiêm: 10μl

- Rửa giải theo chƣơng trình đẳng dòng A:B = 80:20 (v/v)

Sau khi khảo sát các hệ dung môi và các điều kiện khác nhau, tìm đƣợc

điều kiện phân tích chất rắn CO-1 nhƣ đã xác định ở trên. Sắc ký đồ thu đƣợc

cho 1 pic tách rõ ràng, nhiễu nền thấp, thể hiện qua sắc ký đồ của mẫu đối chiếu

và mẫu thử nụ, lá vối. Trên sắc ký đồ (hình 3.6 C, N, L ) của mẫu thử nụ và lá

vối đều có pic có thời gian lƣu trùng với thời gian lƣu (tR) của pic CO-1 trong

55

sắc ký đồ của mẫu đối chiếu là 9,3 phút.

Sắc ký đồ chất đối chiếu (C)

Sắc ký đồ của lá vối (L)

Sắc ký đồ của nụ vối (N)

Hình 3.6 : Sắc ký đồ của mẫu đối chiếu CO-1 và nụ, lá vối

Qua tiến hành thí nghiệm tìm ra điều kiện định tính CO-1 trong nụ và lá

vối bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) thông qua thời gian lƣu tR. Trong

bản dự thảo Dƣợc điển Việt Nam V chƣa có qui định cho việc định tính

flavonoid bằng HPLC. Do đó, dự kiến sẽ áp dụng kết quả này để xây dựng tiêu

chuẩn cơ sở cho nguyên liệu cây vối.

3.3 Xây dựng phƣơng pháp định lƣợng flavonoid trong lá và nụ vối

3.3.1 Xây dựng bằng phƣơng pháp trắc quang

3.3.1.1 Tính đặc hiệu của phƣơng pháp

Tiến hành thực hiện đo quang mẫu trắng, làm lặp lại 6 lần với 2 loại nền

mẫu nhƣ sau:

Loại 1: Lấy (1ml) H2O cất cho vào bình định mức có dung tích 10 ml có

chứa sẵn 4ml H2O cất. Thêm vào bình 0,3 ml NaNO2 5%, sau khoảng 5 phút

thêm 0,3 ml AlCl3 10 %, sau 6 phút tiếp, cho thêm 2ml NaOH 1M và sau đó

thêm H2O cất cho đủ 10ml. Dung dịch đƣợc trộn đều đem đo không cho tín

56

hiệu.

Loại 2: Lấy (1ml) MeOH cho vào bình định mức có dung tích 10ml có

chứa sẵn 4ml MeOH phân tích. Thêm vào bình 0,3 ml NaNO2 5%, sau khoảng

5 phút thêm 0,3 ml AlCl3 10 %, sau 6 phút tiếp, cho thêm 2ml NaOH 1M và sau

đó thêm MeOH cho đủ 10ml. Dung dịch đƣợc trộn đều đem đo thấy cho tín

hiệu.

Nhận thấy nền mẫu loại 1 cho phức tan không màu khi cho các thuốc thử

vào. Còn nền mẫu loại 2 thì tạo kết tủa Al(OH)3 khi cho các thuốc thử vào vì

trong môi trƣờng MeOH độ tan của Al(OH)3 giảm mạnh, nên ảnh hƣởng đến

việc đo quang. Do đó nền mẫu loại 1 phù hợp cho việc tiến hành phân tích xác

định hàm lƣợng flavonoid toàn phần trong nụ và lá vối.

3.3.1.2 Độ lặp lại của phƣơng pháp

Để xác định độ lặp lại của phƣơng pháp tiến hành với 6 thí nghiệm riêng

biệt cho mẫu nụ vối Hƣng yên.

Chuẩn bị mẫu: Cân chính xác khoảng 1g nụ vối Hƣng yên tiến hành chiết

với 25 ml MeOH làm 2 lần. Lọc, và bổ xung lƣợng MeOH cho đủ 50 ml. Sau

đó đem đi đo quang, kết quả cho thấy các số liệu thống kê nằm trong điều kiện

cho phép (bảng 3.4), có thể áp dụng điều kiện đã lựa chọn để định lƣợng

flavonoid trong mẫu dƣợc liệu nụ và lá vối.

Bảng 3.4: Kết quả độ lặp lại của phương pháp trắc quang

1

2 1,0064 0,181 3 1,0110 0,184 4 1,0365 0,191 5 1,0189 0,196

6 1,0831 0,193 SD = 0,83.10-2 ; RSD = 4,45% STT mmẫu(g) 1,0041 0,174 Abs Số liệu thống kê

Kết quả ở bảng 3.4 cho thấy phƣơng pháp có độ lặp lại có thể chấp nhận

đƣợc thông qua RSD = 4,45% (< 5%).

57

3.3.1.3 Xây dựng đƣờng chuẩn

Xây dựng đường chuẩn bằng chất đối chiếu CO-1: Tiến hành pha một

dãy dung dịch đối chiếu CO-1 (chất tách đƣợc từ nụ vối) với nồng độ chính xác

là 12, 24, 36, 48 , 72 và 100 mg/l. Kết quả đƣợc trình bày ở bảng 3.5 Dựa trên

phần mềm excel để vẽ đồ thị đƣờng chuẩn ở (hình 3.7).

Bảng 3.5: Kết quả xây dựng đường chuẩn theo chất đối chiếu CO-1

12 24 36 48 72 100 Nồng độ (mg/l)

0,042 0,082 0,120 0,160 0,231 0,332 A510 (Abs)

Hình 3.7: Đường chuẩn xác định flavonoid toàn phần theo CO-1

Từ kết quả ở bảng 3.5 và hình 3.7 kết quả khảo sát trên cho thấy với

nồng độ của chất đối chiếu CO-1 từ 12-100 mg/l có sự tƣơng quan tuyến tính

giữa nồng độ và độ hấp thụ quang. Ta đƣợc y = 0.0033x + 0.0026 với hệ số tƣơng quan R2 = 0.9990. Dựa trên phần mềm Originpro 7.5 tính đƣợc độ lệch chuẩn của phƣơng trình hồi quy là Sy= 0,00366 và SA= 5,04.10-5 ; SB = 0,0028.

58

Tra bảng ta t(0,95; 5) = 2,571 phƣơng trình hồi quy đầy đủ: y = (0,0033 ± 1,30.10-4)x + (0,0026± 0,0072)

Xây dựng đường chuẩn bằng chất chuẩn catechin: Tiến hành pha một

dãy dung dịch chuẩn catechin (Sigma) với các nồng độ chính xác là 45, 90, 180,

360 và 450 mg/l. Kết quả đƣợc trình bày ở bảng 3.6. Dựa trên phần mềm excel

để vẽ đồ thị đƣờng chuẩn ở (hình 3.8).

Bảng 3.6: Kết quả xây dựng đường chuẩn theo chất chuẩn catechin

Nồng độ (mg/l) 45 90 180 360 450

0,107 0,214 0,457 0,890 1,091 Độ hấp thụ quang A510(Abs)

Hình 3.8: Đường chuẩn xác định flavonoid toàn phần theo catechin

Kết quả ở bảng 3.6 và hình 3.8 kết quả khảo sát trên đã chỉ ra rằng với

nồng độ của chất chuẩn catechin từ 45-450 mg/l có sự tƣơng quan tuyến tính

giữa nồng độ và độ hấp thụ quang. Ta đƣợc y = 0,0024x + 0,002 với hệ số tƣơng quan R2 = 0.9993. Tra bảng đƣợc t(0,95; 4) = 2,776. Dựa trên phần mềm

Originpro 7.5 ta tính đƣợc độ lệch chuẩn của phƣơng trình hồi quy nhƣ sau: Sy = 0,01289 và Sa= 3,70.10-5 ; Sb = 0,01013. Phƣơng trình hồi quy đầy đủ là: y = (0,0024 ± 1,07.10-4)x + (0,002 ± 0,0028)

59

3.3.1.4 Giới hạn phƣơng pháp.

a) Giới hạn phát hiện LOD và giới hạn định lượng LOQ:

Để tiến hành xác định LOD và LOQ tiến hành chuẩn bị các dung dịch

mẫu trắng bằng cách lấy vào 10 bình định mức cỡ 10 ml: Cho vào bình có chứa

sẵn khoảng 4 ml nƣớc cất + 0,3 ml NaNO2 5% + 0,3 ml AlCl3 10% + 2 ml

NaOH 1M sau đó định mức bằng nƣớc cất hai lần, sau khoảng 10 phút thì đem

đi đo độ hấp thụ quang của dãy dung dịch trên ở bƣớc sóng 510 nm (với dung

dịch so sánh là nƣớc cất) ta thu đƣợc kết quả nhƣ trong bảng 3.7.

Bảng 3.7: Kết quả xác định độ lệch chuẩn của mẫu trắng

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

STT

A510 0,002 0,002 0,003 0,002 0,004 0,002 0,003 0,002 0,002 0,004

Kết quả trên ta tính đƣợc giá trị trung bình: = 0,0026

Giá trị độ lệch chuẩn: SD = 0,843.10-3

Giới hạn phát hiện LOD và LOQ của phƣơng pháp khi dùng chất CO-1

làm chất đối chiếu:

LOD = 3. = 3. = 0,77 mg/l

LOQ = 10. = 10. = 2,55 mg/l

Giới hạn phát hiện LOD và LOQ của phƣơng pháp khi dùng chất chuẩn

catechin làm chuẩn: LOD = 3. = 3. = 1,05 mg/l

60

LOQ = 10. = 10. = 3,51 mg/l

b) Giới hạn LOL: Xác định bằng cách nới rộng nồng độ ở điểm trên của

đƣờng chuẩn cho đến khi tƣơng quan giữa nồng độ và độ hấp thụ quang không

còn tuyến tính nữa.

Đối với chất đối chiếu CO-1:

Bảng 3.8: Kết quả xác định nồng độ giới hạn LOL của chất đối chiếu CO-1

48

72

100

110

120

130

Nồng độ CO-1 (mg/l)

0,160

0,231

0,332

0,351

0,376

0,381

A510

Hình 3.9: Đồ thị xác định nồng độ giới hạn LOL của CO-1

Kết quả bảng 3.8 và hình 3.9 cho thấy nồng độ giới hạn LOL là 120 mg/l,

tại nồng độ này trở đi thì đồ thị của độ hấp thụ quang theo nồng độ không còn

tuyến tính.

Nhƣ vậy khoảng tuyến tính của phƣơng pháp xác định theo chất đối

chiếu CO-1 là khoảng từ 2,55 – 120 mg/l.

Đối với chất chuẩn catechin:

Bảng 3.9: Kết quả xác định nồng độ giới hạn LOL của catechin

Nồng độ catechin (mg/l)

500 900 1000 1100 1200 1300

61

1,217 2,246 2,534 2,712 2,798 2,834 A510

Hình 3.10: Đồ thị xác định nồng độ giới hạn LOL của catechin

Kết quả ở bảng 3.9 và hình 3.10 cho thấy nồng độ giới hạn LOL là 1000

mg/l, tại nồng độ này trở đi thì đồ thị của độ hấp thụ quang theo nồng độ không

còn tuyến tính.

Nhƣ vậy khoảng tuyến tính của phƣơng pháp xác định theo chất chuẩn

catechin là khoảng từ 3,51 – 1000 mg/l.

3.3.1.5 Độ đúng của phƣơng pháp

Để xác định độ đúng thực hiện với một dung dịch mẫu đối chiếu CO-1

có nồng độ chính xác 12 mg/l. Sau đó tiến hành phân tích mẫu chuẩn đó lặp lại

6 lần, kết quả đƣợc ghi ở bảng 3.10

Bảng 3.10: Kết quả xác định độ đúng của phương pháp

1 2 3 4 5 6 STT

0,043 0,042 0,044 0,041 0,041 0,042 A510

12,367 12,000 12,700 11,700 11,700 12,000 Hàm lƣợng

Số liệu thống kê = 12,78; SD = 0,86

Kết quả ở bảng 3.10 ta có giá trị = 12,78; SD = 0,86 từ đó tính giá trị ttn

62

theo công thức sau ở dƣới và so sánh với tc(p):

[24] ttn =

Trong đó: ttn: Giá trị t thực nghiệm

tc(α,k): Giá trị tra bảng với ý nghĩa 0,05 và bậc tự do k= n-1

μ: Giá trị thực

: Giá trị trung bình của phƣơng pháp thử nghiệm

: Phƣơng sai của phƣơng pháp thực nghiệm

n: số lần thực nghiệm

= 2,22 Ta có ttn =

Tra bảng t(0,95;5) = 2,57 > ttn = 2,22.

Như vậy : tc > ttn : Không có sự khác nhau về kết quả của giá trị trung

bình so với giá trị tham chiếu ở mức ý nghĩa α = 0,95, tức là phƣơng pháp có độ

đúng đạt yêu cầu → Phƣơng pháp không mắc sai số hệ thống.

3.3.1.6 Độ ổn định của phƣơng pháp

Cách 1: Tiến hành đo độ hấp thụ quang của chất CO-1 có nồng độ 12

mg/l và của catechin có nồng độ 100 mg/l. Sau đó dùng hàm chuẩn studen (t)

để đánh giá. Kết quả đƣợc thể hiện ở bảng 3.11A

Bảng 3.11A : Kết quả đánh giá độ ổn định của phương pháp theo cách 1

STT

1 0,043 2 0,042 3 0,044 4 0,041 5 0,041 6 0,042 CO-1 A510

0,242 0,243 0,242 0,241 0,243 Catechin 0,242

1 = 0,0422 ; S1 = 11,70.10-4

63

Ta có : Đối với chất CO-1:

2 = 0,2422 ; S2 = 7,54.10-4

Đối với chất catechin :

= Ta có: Ftn = = 1,55 > 1 . Ta So sánh Ftn với Fc(0,05 ;5 ;5).

Tra bảng ta có Fc(0,05 ;5 ;5) = 5,0503 > Ftn = 1,55 : Nhƣ vậy hai phƣơng sai

không có sự khác nhau có ý nghĩa, hai phƣơng pháp có độ lặp lại tƣơng đồng.

Cách 2: Tiến hành đo độ hấp thụ quang của chất chuẩn catechin có nồng

độ 100 mg/l ở 2 bƣớc sóng khác nhau là 510 nm và 415 nm. Kết quả đƣợc trình

bày ở bảng 3.11B

Bảng 3.11B : Kết quả đánh giá độ ổn định phương pháp theo cách 2

1 0,168 0,242 2 0,169 0,242 3 0,170 0,243 4 0,168 0,242 5 0,169 0,241 6 0,168 0,243 STT A415 A510

Ta có: = 0,1687; S1 = 8,17.10-4

= 0,2422 ; S2 = 7,54.10-4

= Ta có: Ftn = = 1,17 > 1. Ta So sánh Ftn với Fc(0,05 ;5 ;5).

Tra bảng ta có Fc(0,05 ;5 ;5) = 5,0503 > Ftn = 1,17 : Nhƣ vậy hai phƣơng sai

không có sự khác nhau có ý nghĩa, phƣơng pháp có độ lặp lại tƣơng đồng.

Kết Luận chung: Phƣơng pháp có độ ổn định.

3.3.1.7 Quy trình và kết quả xác định flavonoid toàn phần trên mẫu thực

Áp dụng quy trình xây dựng đƣợc để định lƣợng một số mẫu nụ và lá vối

đƣợc thu hái tại các tỉnh miền bắc Việt Nam.

* Dung dịch mẫu :: Cân chính xác khoảng 1g mẫu dƣợc liệu (nụ, lá vối)

64

đã sấy khô, nghiền mịn, đã đƣợc xác định độ ẩm rồi cho chiết siêu âm với 25 ml

methanol trong 30 phút. Lọc lấy dịch lọc, bổ xung MeOH đã bay hơi cho đủ 25

ml, sau đó đem đi đo quang xác định flavonoid toàn phần nhƣ sơ đồ 3.2.

Sơ đồ 3.2 : Quy trình định lƣợng flavonoid toàn phần

Dƣợc liệu Vối (1g)

Chiết siêu âm với 25 ml MeOH

Dịch chiết

Lọc, bổ xung lƣợng MeOH đã bay hơi

Dịch lọc

Đo quang xác định hàm lƣợng

Lấy (1ml) dịch chiết thu đƣợc cho vào bình định mức có dung tích 10ml

có chứa sẵn 4ml H2O cất. Thêm vào bình 0,3 ml NaNO2 5%, sau khoảng 5 phút

thêm 0,3 ml AlCl3 10 %, sau 6 phút tiếp, cho thêm 2ml NaOH 1M và sau đó

thêm H2O cất cho đủ 10ml. Dung dịch đƣợc trộn đều và đem đi đo xác định độ

hấp thụ quang so với mẫu trắng tại 510 nm. Song song thực hiện mẫu catechin

chuẩn với các dung dịch có nồng độ chính xác là 45, 90, 180, 3600 và 450 mg/l.

Hoặc thực hiện mẫu chất đối chiếu CO-1 với các dung dung dịch có nồng độ

65

chính xác là 12, 24, 36, 48, 72 và 100 mg/l.

Hàm lƣợng flavonoid toàn phần trong nụ và lá vối đƣợc tính theo khối

lƣợng chất chuẩn catechin (g) và chất đối chiếu CO-1 (g). Đƣợc tính trong 1 g

khối lƣợng mẫu dƣợc liệu khô tuyệt đối. Giá trị kết quả của hàm lƣợng

flavonoid toàn phần đƣợc làm lặp lại 3 lần và kết quả ở bảng 3.12 đƣợc biểu

diễn : ± SD

Bảng 3.12 : Kết quả xác định flavonoid toàn phần

STT

mmẫu (g)

Tên mẫu (nơi thu hái)

Hàm lƣợng flavonoid toàn phần tính theo

CO-1 (mg/g)

Các mẫu lá Bắc Giang

1,0028

Hàm lƣợng flavonoid toàn phần tính theo Catechin (mg/g) 30,33 ± 1,060

22,42 ± 1,060

1

2

Bắc Ninh

1,0017

20,73 ± 1,040

15,44 ± 1,040

3

Hà Đông (HN)

1,0028

21,81 ± 1,230

16,23 ± 1,230

4

Hòa Bình

1,0180

29,70 ± 1,320

21,99 ± 1,320

5

Phú Thọ

1,0066

23,74 ± 1,160

17,62 ± 1,160

6

Quảng Ninh

1,0221

22,61 ± 0,840

16,81 ± 0,840

7

Thái Bình

1,0380

22,69 ± 0,840

16,87 ± 0,840

Các mẫu nụ

1,0020

39,23 ± 1,630

28,91 ± 1,630

8 Chợ Đồng Xuân(HN) 9

Hƣng Yên

1,0014

42,11 ± 1,630

30,99 ± 1,630

10

Nam Định

1,0032

40,93 ± 2,230

30,13 ± 2,230

11

Hải Dƣơng

1,0045

39,23 ± 2,200

28,88 ± 2,200

12

Hà Đông (HN)

1,0052

34,98 ± 1,620

25,79 ± 1,620

13

Hà Nam

1,0066

38,51 ± 1,160

28,36 ± 1,160

14

Thái Nguyên

1,0013

37,43 ± 1,620

27,57 ± 1,650

66

Đã xác định hàm lƣợng flavonoid toàn phần của 14 mẫu lá và nụ vối theo

hai chất chuẩn là CO-1 và Catechin.

Để đánh giá kết quả 2 tập số liệu xác định hàm lƣợng flavonoid toàn phần trong

lá vối theo chất chuẩn catechin và chất đối chiếu CO-1. Dùng chuẩn F (Fisher)

và chuẩn t-student.

Ta có: = 24,516 = 15,0 n1 = 7 (số lần thí nghiệm)

= 18,197 = 8,20 n2 = 7 (số lần thí nghiệm)

Trong đó:

, là khối lƣợng trung bình và phƣơng sai của hàm lƣợng flavonoid toàn

phần trong lá vối tính theo chất chuẩn catechin

, là khối lƣợng trung bình và phƣơng sai của hàm lƣợng flavonoid toàn

phần trong lá vối tính theo chất đối chiếu CO-1.

So sánh phƣơng sai:

= 3,35 [24]. Ta có: Ftn =

Fc(α,k1,k2) = Fc(0,05 ;6 ;6) = 4,2839 (Fc : giá trị tra bảng). [19]

Vậy Fc(0,05 ;6 ;6) = 4,2839 > Ftn = 3,35 : Hai phƣơng sai không có sự khác nhau

có nghĩa → hai tập số liệu có độ lặp lại tƣơng đồng.

So sánh hai giá trị trung bình :

Ta có: = = 146,12

= 1,05 [24]. ttn =

67

tc(α,k) : Giá trị t tra bảng mức ý nghĩa α, bậc tự do k = n1+n2-2

tra bảng ta đƣợc tc(0,05;12) = 2,28 [19].

Vậy tc(0,05;12) = 2,28 > ttn = 1,05 : Nhƣ vậy không có sự khác nhau có nghĩa

của hai giá trị trung bình.

Đánh giá kết quả hàm lƣợng flavonoid có trong nụ và lá vối. So sánh hai cặp số

liệu flavonoid toàn phần trong nụ và lá vối đƣợc tính theo chất chuẩn catechin.

Ta có: = 24,516 = 15,00 n1 = 7 (số lần thí nghiệm)

= 38,916 = 5,39 n2 = 7 (số lần thí nghiệm)

Trong đó:

, là khối lƣợng trung bình và phƣơng sai của hàm lƣợng flavonoid toàn

phần trong lá vối.

, là khối lƣợng trung bình và phƣơng sai của hàm lƣợng flavonoid toàn

phần trong nụ vối.

So sánh phƣơng sai:

= 7,74 > 1 [24]. Ta có: Ftn =

Fc(α,k1,k2) = Fc(0,05 ;6 ;6) = 4,2839 (Fc : giá trị tra bảng) [19].

Vậy Fc(0,05 ;6 ;6) = 4,2839 < Ftn = 7,35 : Hai phƣơng sai có sự khác nhau có

nghĩa → hai tập số liệu có độ lặp lại không tƣơng đồng.

So sánh hai giá trị trung bình :

68

= 2,39 [24]. ttn =

- 2 [24]. tc(α,k): Giá trị t tra bảng mức ý nghĩa α, bậc tự do k =

tra bảng t 1 phía được tc(0,05; 8) = 1,86 [19].

> có ý Vậy tc(0,05;12) = 1,86 < ttn = 2,39 : Nhƣ vậy sự khác nhau giữa

nghĩa thống kê.

Hàm lƣợng flavonoid toàn phần xác định theo chất chuẩn CO-1: Trong

các mẫu lá vối trong khoảng 15,443 – 22,418 mg/g. Trong nụ vối khoảng từ

25,791 – 30,995 mg/g.

Hàm lƣợng flavonoid toàn phần xác định theo chất chuẩn catechin: Trong

các mẫu lá vối trong khoảng 20,728 – 30,331 mg/g. Trong nụ vối khoảng từ

34,978 – 42,114 mg/g.

Qua bảng 3.12 nhận thấy hàm lƣợng flavonoid toàn phần trong nụ vối

cao hơn so với hàm lƣợng flavonoid toàn phần trong lá vối.

3.3.2 Xây dựng phƣơng pháp định lƣợng flavonoid chính bằng HPLC

Chất CO-1 là chất bột màu vàng da cam đƣợc xác định là flavonoid

chính trong nụ và lá vối, tan trong nƣớc và tan tốt trong methanol, ethyl acetat,

cloroform. Cấu trúc phân tử CO-1 có chứa nhân thơm nên CO-1 có khả năng

hấp thụ các bức xạ ở vùng tử ngoại. Dựa vào những tính chất trên chúng tôi dự

kiến sử dụng chƣơng trình sắc ký pha đảo sử dụng cột C18. Để xây dựng định

lƣợng CO-1, tiến hành khảo sát các thông số sau: Tỷ lệ dung môi trong pha

động, loại dung môi pha mẫu, bƣớc sóng cho độ hấp thụ cực đại, nồng độ của

69

dung dịch…

Dung môi pha mẫu: Do CO-1 dễ tan trong methanol nên chúng tôi lựa

chọn methanol làm dung môi hòa tan mẫu.

* Dung dịch mẫu đối chiếu: Cân và hòa tan CO-1 (đã tách đƣợc trong nụ

vối), trong methanol để đƣợc dung dịch có hàm lƣợng chính xác khoảng

0,0055; 0,011; 0,0275; 0,055 và 0,11 mg/ml.

* Dung dịch mẫu thử nụ và lá vối: Đƣợc chuẩn bị nhƣ trong mục 3.2.3

Hàm lƣợng flavonoid chính trong lá và nụ vối đƣợc tính theo phƣơng trình

tuyến tính ở phần khảo sát độ tuyến tính của mẫu chuẩn.

Pha động: Hỗn hợp dung môi methanol và dung dịch muối NaH2PO4

0,05M (hòa tan 6,9g NaH2PO4. H2O trong 1 lít nƣớc, lọc qua màng lọc 0,45μm).

Kết quả khảo sát pha động đối với CO-1: Qua phân tích, kết hợp tham

khảo tài liệu thu đƣợc kết quả trình bày ở bảng 3.13 nhƣ sau:

Bảng 3. 13: Kết quả khảo sát pha động

TT Pha động Nhận xét

Dung dịch đối chiếu: Thời gian lƣu quá dài,

1 MeOH-NaH2PO40,05M không phù hợp (tR = 41 phút)

(50:50)

Dung dịch đối chiếu: Diện tích lớn nhƣng píc

2 MeOH-NaH2PO40,05M không cân đối, thời gian lƣu dài (tR=35 phút),

(65:35) không phù hợp

Dung dịch đối chiếu: Diện tích píc lớn, píc

3 MeOH-NaH2PO40,05M gọn, cân đối, tR = 9,3 phút.

(80:20) Dung dịch thử: Dƣợc liệu nụ và lá vối cũng

cho píc cân đối, tách tốt và có tR = 9,3 phút.

70

Kết luận: Phù hợp

Với điều kiện sắc ký và phƣơng pháp xử lý mẫu đã lựa chọn đã đƣa ra đƣợc điều kiện sắc ký: Cột bondapak TM C18 (3,9mm ID × 300mm, 5μm); Pha

động MeOH-NaH2PO4 (80:20); Tốc độ dòng: 0,7 ml/phút; Nhiệt độ cột: Nhiệt

độ phòng: Thể tích tiêm mẫu: 10 μl: Detector: 341 nm xác định đƣợc khi quét

phổ UV (hình 3.3). Sắc ký đồ thu đƣợc cho pic tách rõ ràng, nhiễu nền thấp, thể

hiện qua sắc ký đồ mẫu đối chiếu nhƣ hình 3.2.

3.3.2.1 Khảo sát tính thích hợp của hệ thống

Để đánh giá tính thích hợp của hệ thống sắc ký, tiến hành pha một mẫu

đối chiếu theo chỉ dẫn ở mục 3.3.2, có nồng độ 0,053 mg/ml, tiến hành sắc ký 6

lần với điều kiện sắc ký đã lựa chọn và hệ thống HPLC sử dụng là phù hợp và

đảm bảo sự ổn định của phép phân tích định lƣợng chất CO-1. Kết quả khảo sát

tính thích hợp của hệ thống đƣợc ghi ở bảng 3.14.

Bảng 3.14. Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống

Thời gian lƣu

Diện tích pic

Các thông số thống kê

Lần tiêm

1

9,12766

2190950

2

9,07053

2186244

SD = 21052

3

9,18479

2205546

RSD = 0,95 (%)

4

9,47704

2245278

5

9,53417

2214240

6

9,41771

2213154

Kết quả trên cho thấy các điều kiện sắc ký đã lựa chọn và hệ thống HPLC

là phù hợp và đảm bảo sự ổn định của phép phân tích định lƣợng CO-1.

71

3.3.2.2 Khoảng tuyến tính của phƣơng pháp

Chuẩn bị một dãy gồm 5 dung dịch mẫu đối chiếu CO-1 có nồng độ

chính xác khoảng 0,0055 mg/ml đến 0,11 mg/ml rồi tiến hành chạy sắc ký nhƣ

điều kiện đã mô tả. Kết quả khảo sát đƣợc trình bày trong bảng 3.15 và đƣờng

chuẩn lập đƣợc, đƣợc thể hiện ở hình 3.15.

Bảng 3.15: Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính

Dung dịch Nồng độ (mg/ml) Diện tích pic (AU.s)

1 0,11 4575033

2 0,055 2483455

3 0,0275 1138335

4 0,011 529218

5 0,0055 269653

6 0 27465

Sử dụng phần mềm origin 7.5 vẽ đƣờng chuẩn và tính toán

Hình 3.11: Đường chuẩn xác định hàm lượng CO-1 trong nụ và lá vối

72

Kết quả đƣợc tính theo phần mềm Origin 7.5 thu đƣợc: y = a + b.x

Với a = 54599,803; b = 4,16056*107 ; Sa = 46041,883; Sb = 890693,073 R2 = 0,99908

Γa = t(0,95, 4).Sa = 2,131841*46041,883 = 98153,9739

Γb = t(0,95, 4).Sb = 2,131841*890693,073 = 1898815,935

Phƣơng trình hồi quy đầy đủ của đƣờng chuẩn có dạng Y = a + b.x có

dạng nhƣ sau : y = a + b.x = (a ± Γa) + (b ± Γb).x

yi = (54599,803 ± 98153,9739) + (4,16056x107 ± 1898815,935). CC.01 (1)

Trong đó : yi là diện tích pic khi đo đƣợc sắc ký phổ (AU.s).

CCO-1: Nồng độ chất đối chiếu CO-1 (mg/ml).

Để kiểm tra phƣơng pháp này có mắc sai số hệ thống không, ta kiểm tra

sự sai khác giữa a = 54599,803 với giá trị 0, xem sự sai khác đó có ý nghĩa

thống kê hay không → Kiểm tra sự sai khác của a so với giá trị 0:

Nếu coi a = 0 → y’ = b’x với b’=

Bảng 3.16: Giá trị hệ số bi

0,0055 0,011 0,0275 0,055 0,11 C(mg/ml)

269653 529218 1138335 2483455 4575033 Spic

49027818 48110727 41394000 45153727 41591209 bi

→ b’= = = 45055496

2 =

2 =

Tức là khi a =0 thì y = 45055496. x

73

. Áp dụng công thức : Sy ; Sy’ ; Ftính=

Bảng 3.17: Các đại lượng thống kê

Hàm Bậc tự do

y’ = b’x 2

y = a + bx Tổng các bình phƣơng 156988.106 26282.106 3 Phƣơng sai 280.106 94.106

= → Ftính = = 8,87 < Fbảng (0,95 ;3 ;2) = 19,164.

Nhƣ vậy sự khác nhau giữa a và giá trị 0 là không có ý nghĩa thống kê,

nên ta có thể coi a =0. Vậy phƣơng pháp nghiên cứu trên không mắc sai số hệ

thống.

Kết quả khảo sát trên cho thấy với khoảng nồng độ của CO-1 từ 0,0055

mg/ml đến 0,110 mg/ml có sự tƣơng quan tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic CO-1 trên sắc ký đồ (hệ số tƣơng quan R2 = 0,99908).

3.3.2.3 Độ lặp lại của phương pháp

Độ lặp lại của phƣơng pháp đƣợc xác định bằng cách tiến hành 6 thí

nghiệm riêng biệt cho mẫu chứa chất đối chiếu CO-1 có nồng độ 0,042 mg/ml

(Bảng 3.18 A). Áp dụng để định lƣợng một mẫu nụ vối thu hái ở Hƣng Yên cho

thấy các số liệu thống kê nằm trong điều kiện cho phép (Bảng 3.18 B). Kết quả

thu đƣợc cho thấy có thể áp dụng chƣơng trình đã lựa chọn để định lƣợng chất

CO-1 trong mẫu dƣợc liệu nụ và lá vối.

Bảng 3.18 A: Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp bằng mẫu CO-1

1 2 3 4 5 6 Lần tiêm

(AU.s) 1663046 1712229 1725100 1730613 1666705 1727390

74

SD = 31102; RSD = 1,82(%) Các thông số thống kê

Bảng3.18 B: Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp bằng mẫu thực

Tên mẫu thử

Số mẫu định lƣợng Hàm lƣợng tìm thấy % Các số liệu thống kê

Nụ vối Hƣng Yên

6

1,86

SD = 0,0346 ;

RSD = 1,696%

3.3.2.4 Độ đúng của phƣơng pháp

Độ đúng của phƣơng pháp đƣợc xác định bằng phƣơng pháp thêm chất

đối chiếu CO-1.

Thêm vào mẫu thử (nụ vối Hƣng Yên) đã đƣợc xác định hàm lƣợng một

lƣợng chính xác chất chuẩn sao cho tổng nồng độ của chúng vẫn nằm trong

khoảng tuyến tính đã khảo sát. Độ đúng của phƣơng pháp đƣợc xác định từ tỉ lệ

thu hồi của chất đối chiếu thu đƣợc từ kết quả định lƣợng so với lƣợng chất

chuẩn thêm vào.

- Dung dịch chuẩn : Tiến hành pha dung dịch nhƣ mục 3.3.2 đƣợc dung

dịch chuẩn có nồng độ 0,044 mg/ml.

- Mẫu thử : Cân chính xác 1,0007g nụ vối Hƣng Yên, chiết siêu âm với

50ml MeOH, trong vòng 30 phút, sau đó bổ xung lƣợng MeOH đã mất. Rồi lọc

lấy dịch lọc, hút chính xác 1ml dịch lọc + 1ml dung dịch chuẩn đem pha loãng

bằng MeOH thành 10ml bằng bình định mức.

Hiệu suất thu hồi đƣợc tính theo công thức sau :

H(%) = 100%.(Ccó thêm chuẩn - Cnền)/Cchuẩn đƣợc thêm vào

75

kết quả thu đƣợc ghi ở bảng 3.19

Bảng 3.19: Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp

Tên mẫu thử

% tìm lại đƣơc trung bình

Số liệu thống kê

Số lần định lƣợng

Lƣợng thêm vào (mg)

Lƣợng tìm lại đƣợc trung bình

6

0,044

0,043

97,73

RSD = 2,16 %

Mẫu nụ vối Hƣng Yên

Qua bảng trên cho thấy, phƣơng pháp phân tích định lƣợng HPLC có khả

năng thu hồi lại cao hơn 90% có thể chấp nhận đƣợc. Nhƣ vậy phƣơng pháp

này có độ đúng cao.

3.3.2.5 Giới hạn của phƣơng pháp

Giới hạn phát hiện (LOD): Là nồng độ thấp nhất của chất phân tích mà

hệ thống phân tích còn cho tín hiệu phân tích khác có nghĩa với tín hiệu mẫu

trắng hay tín hiệu nền [19].

Giới hạn định lượng (LOQ): Là nồng độ thấp nhất của chất phân tích mà

hệ thống phân tích định lƣợng đƣợc với tín hiệu phân tích khác có ý nghĩa định

lƣợng với tín hiệu của mẫu trắng hay tín hiệu của nền [19].

Để xác định LOD, ta phân tích mẫu chuẩn ở nồng độ còn có thế xuất hiện

tín hiệu của chất phân tích và xác định tỷ lệ tín hiệu chia cho nhiễu đƣờng nền

(S/N) [19].

Phân tích mẫu chuẩn ở nồng độ 44 μg/ml, sau đó pha loãng dần đến khi

dung dịch chuẩn không còn xuất hiện tín hiệu của chất phân tích. Tiến hành

phân tích theo các điều kiện đã lựa chọn, ở nồn độ 0,031 μg/ml đƣợc coi là giới

hạn phát hiện (LOD) của phƣơng pháp (Bảng 3.20) thể hiện qua việc tỷ lệ tín

76

hiệu chia cho nhiễu đƣờng nền (S/N) đạt trong khoảng 2-3 [19].

Ta có S/N = = =3

Trong đó: S là chiều cao tín hiệu của chất phân tích

N là nhiễu đƣờng nền.

Bảng 3.20: Kết quả xác định nồng độ giới hạn LOD

44

4,4

0,489

0,244

0,061

0,031

0,0015

Nồng độ (μg/ml)

1814600 229743

74145

64267

57010

55780

Diện tích pic

Không có tín hiệu

Hình 3.12: Chiều cao tín hiệu phát hiện LOD

Qua bảng 3.20 và hình 3.12 xác định đƣợc giới hạn phát hiện (LOD) của

phƣơng pháp xác định CO-1 là 0,031 μg/ml.

Nhƣ vậy suy ra giới hạn định lƣợng LOQ = 3,3 × LOD = 0,1023 μg/ml.

Xác định giới hạn LOL: Xác định bằng cách nới rộng điểm trên của

đƣờng chuẩn cho đến khi tƣơng quan giữa nồng độ và diện tích píc không còn

77

tuyến tính nữa.

0,11

0,1375

0,22

0,275

0,367

0,55

Bảng 3.21: Kết quả xác định nồng độ giới hạn LOL

Nồng Độ

(mg/ml)

7119423 12105281 14809513 16490167 20791750

Diện tích Píc 4575033

Hình 3.13: Đồ thị xác định nồng độ giới hạn LOL

Từ kết quả (Bảng 3.21 và Hình 3.13) cho thấy nồng độ giới hạn LOL là

0,275 mg/ml, tại nồng độ này trở đi trên đồ thị cho thấy diện tích píc và nồng

độ không còn tuyến tính. Nhƣ vậy, khoảng nồng độ tuyến tính CO-1 để định

lƣợng cho kết quả tốt nhất đƣợc xác định nằm trong khoảng 0,1-275 μg/ml.

3.3.2.6 Đánh giá sai số và độ lặp của phƣơng pháp

Để đánh giá sai số và độ lặp lại của phƣơng pháp ta dựng đƣờng chuẩn,

pha 3 mẫu có nồng độ ở điểm đầu, điểm giữa và điểm cuối của khoảng tuyến

tính. Thực hiện đo mỗi mẫu 6 lần trong các điều kiện nhƣ nhau và đã đƣợc chọn

78

ở trên.

Sai số tính theo công thức: %X = .100

Trong đó: %X: Sai số phần trăm tƣơng đối

Si: Diện tích pic thu đƣợc

St: Diện tích thu đƣợc theo đƣờng chuẩn

Độ lặp lại của phƣơng pháp đƣợc xác định theo các đại lƣợng S2 và

%RSD. Các đại lƣợng này đƣợc tính theo công thức nhƣ mục 2.6.

Bảng 3.22: Bảng kết quả đánh giá sai số của phương pháp

Mẫu

1

2

3

0,0055

0,0275

0,11

CC.01(mg/ml)

274600

1154600

4454600

Spic

%X

%X

%X

Lần đo

Si

Si

Si

1

269653

1,80

1138335

1,41

4475033

0,46

2

269534

1,84

1136425

1,57

4475642

0,47

3

269763

1,76

1137653

1,47

4474832

0,45

4

269742

1,77

1136872

1,54

4476321

0,49

5

269364

1,91

1138356

1,41

4475086

0,46

6

269583

1,83

1137672

1,47

4473762

0,43

269607

1,82

1137552

1,48

4475113

0,46

Stb

SD

5,5.10-2

6,6.10-2

2.10-2

RSD (%)

3,02

4,46

4,35

Kết quả khảo sát cho thấy độ lệch chuẩn và sai số tƣơng đối của phƣơng

pháp đều nhỏ và nằm trong giới hạn cho phép (10%). Qua đó cho thấy phƣơng

pháp phân tích ổn định, có độ lặp lại tốt, đồng thời có độ chính xác cao, phù

79

hợp cho việc xác định hàm lƣợng CO-1 trong nụ và lá vối.

3.3.2.7 Kết quả định lƣợng flavonoid chính (CO-1) trên mẫu thực

Áp dụng quy trình đã xây dựng đƣợc để định lƣợng một số mẫu nụ và lá

vối thu hái tại miền bắc Việt Nam.

Các dung dịch mẫu chuẩn, mẫu thử đƣợc chuẩn bị nhƣ phần mục 3.3.3

Bảng 3. 23: Kết quả định lượng hoạt chất trong một số mẫu nụ và lá vối

STT

Hàm lƣợng chất CO-1

(A

Tên mẫu (nơi thu hái)

(mg/g)

U.s)

Khối lƣợng cân (g)

Độ ẩm (%)

Các mẫu nụ vối

1,0709

12,62 1324731

16,81 ± 0,058

1

Chợ Đồng Xuân (HN)

1,0007

11,18 1377958

18,61 ± 0,184

2

Hƣng Yên

1,0113

11,14 1022567

13,45 ± 0,160

3

Nam Định

1,0032

7,65

1143549

14,69 ± 0,093

4

Hải Dƣơng

1,0057

6,77

1048407

13,24 ± 0,030

5

(% kl/kl) 1,68 1,86 1,35 1,47

Hà Đông (HN)

1,0266

8,00

1066353

13,36 ± 0,125

6

Hà Nam

1,0003

7,85

1067456

13,74 ± 0,173

7

Thái Nguyên

1,32

Các mẫu lá vối Bắc Giang

1,0020

9,30

3447931

4,661 ± 0,058

8

Bắc Ninh

1,0017

11,50 3158279

4,376 ± 0,053

9

1,34 1,37 0,47

Hà Đông (HN)

1,0028

11,10 3178280

4,377 ± 0,029

10

0,44

Hòa Bình

1,0180

15,10 3379762

4,792 ± 0,030

11

0,44

Phú Thọ

1,0066

8,70

3449983

4,625 ± 0,045

12

0,48

Quảng Ninh

1,0221

11,50 3312138

4,493 ± 0,023

13

0,46

Thái Bình

1,0380

10,90 3258986

4.327 ± 0,029

14

0,49

80

0,43

Kết quả định lƣợng các mẫu thu hái tại một số địa phƣơng ở miền bắc

Việt Nam cho biết hàm lƣợng CO-1 trong lá vối nằm trong khoảng 0,43 -

0,49%, thấp hơn nhiều so với hàm lƣợng trong nụ vối trong khoảng 1,32 –

1,86%. Kết quả nghiên cứu này gợi ý cho việc xây dựng tiêu chuẩn cho dƣợc

liệu nụ và lá vối để kiểm nghiệm chất lƣợng dƣợc liệu vối sử dụng cho y học cổ

81

truyền.

KẾT LUẬN

1. Đã phân lập đƣợc một flavonoid chính (2',4'-dihydroxy-6'-methoxy-3',5'-

dimethylchalcone) trong nụ vối làm chất đối chiếu trong xây dựng phƣơng pháp

định tính, định lƣợng flavonoid.

Xác định đƣợc độ tinh khiết của flavonoid chính bằng HPLC (98,21%).

2. Đã xây dựng đƣợc phƣơng pháp định tính flavonoid trong nụ và lá vối bằng

các phản ứng hóa học, sắc ký bản mỏng (TLC), sắc ký lỏng hiệu năng cao

(HPLC).

Đã đƣa ra các phản ứng định tính flavonoid trong nụ và lá vối gồm: phản

ứng với các thuốc thử NH3, NaOH, (Mg + HCl), và FeCl3.

Tìm ra đƣợc hệ dung môi định tính flavonoid trong sắc ký bản mỏng

(TLC) gồm: Hệ 1: n-Hexan : EtOAc : Acid formic = 6:3:0,1 (v:v:v ) và hệ 2: Toluen

: EtOAc : Acid formic = 6:4:1 (v:v:v).

Định tính đƣợc flavonoid chính bằng HPLC thông qua thời gian lƣu (tR =

9,3 phút) và so sánh với chất đối chiếu CO-1 đƣợc tách từ nụ vối.

3. Xây dựng đƣợc phƣơng pháp định lƣợng flavonoid:

a) Bằng phƣơng pháp trắc quang

Xây dựng đƣợc phƣơng pháp định lƣợng flavonoid toàn phần theo chất

đối chiếu CO-1 (đƣợc tách từ nụ vối) và theo catechin.

Xác định đƣợc khoảng tuyến tính và đƣờng chuẩn xác định lƣợng

flavonoid là ; Giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng của phép đo nằm trong

khoảng LOD = 0,77 mg/l, LOQ = 2,55 mg/l (theo chất đối chiếu CO-1) và

LOD = 1,05 mg/l, LOQ = 3,51 mg/l (theo chất chuẩn catechin) ; Độ đúng, độ

82

ổn định của phƣơng pháp phù hợp.

Đã xác định đƣợc hàm lƣợng flavonoid toàn phần trong 14 mẫu nụ và lá

vối thu hái ở các tỉnh miền bắc Việt Nam. Kết quả cho biết hàm lƣợng trong các

mẫu nụ là 25,791 – 30,995 mg/g, mẫu lá 15,443 – 22,418 mg/g (tính theo chất

đối chiếu CO-1). Tính theo chất chuẩn catechin : mẫu nụ là 34,978 – 42,114

mg/g, mẫu lá 20,728 – 30,331 mg/g. Kết quả đã đánh giá đƣợc hàm lƣợng

flavonoid trong nụ vối cao hơn trong lá vối có ý nghĩa thống kê.

b) Bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Đƣa ra đƣợc điều kiện, dung môi phù hợp chạy sắc ký trong việc định

lƣợng flavonoid chính trong nụ và lá vối

Xác định đƣợc khoảng tuyến tính (0,1 – 275 μg/ml) và lập đƣờng chuẩn

của flavonoid.

Xác định đƣợc giới hạn phát hiện (LOD = 0,031 μg/ml) và giới hạn định

lƣợng của phép đo (LOQ = 0,1023 μg/ml) .

Đánh giá đƣợc sai số và độ lặp lại của phép đo.

Đã xác định đƣợc hàm lƣợng của 2',4'-dihydroxy-6'-methoxy-3',5'-

dimethylchalcone trong một số mẫu lá (4,3272 – 4,7924 mg/g) và nụ vối

83

(13,2437 – 18,6095 mg/g) thu hái ở các tỉnh phía Bắc.

Tài liệu tham khảo

I. Tiếng việt

1. Bộ Y tế (2005), Kiểm nghiệm thuốc, NXB Y học, Hà Nội. tr. 72-79.

2. Bộ Y tế (2007), Hóa phân tích II, NXB Y học, Hà Nội. tr.13-20.

3. Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Chƣơng, Nguyễn Thƣợng

Dong, Đỗ Trung Đàm, Phạm Văn Hiển, Vũ Ngọc Lộ, Phạm Duy Mai, Phạm

Kim Mãn, Đoàn Thị Nhu, Nguyễn Tập, Trần Toàn – Viện Dƣợc liệu (2004),

Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, tập II NXB Y học, tr. 1065-1066.

4. Võ Văn Chi (1997), Từ điển cây thuốc Việt Nam, NXB Y học, tr. 1330.

5. Dược điển Việt Nam 3, NXB Y học 2004.

6. Nguyễn Văn Đàn, Nguyễn Viết Tựu (1985), Phương pháp nghiên cứu hóa

học cây thuốc, NXB Y Học.

7. Đào Thị Thanh Hiền (2000), “Góp phần nghiên cứu cây vối (Cleistocalyx

operculatus (Roxb.) Merr. et Perry Myrtaceae)”, Luận văn tốt nghiệp Thạc sỹ

Dƣợc học, Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội.

8. Trần Tứ Hiếu, Từ Vọng Nghi, Nguyễn Xuân Trung, Nguyễn Văn Ri (2003),

Các phương pháp phân tích công cụ, NXB Đại Học Quốc Gia Hà Nội.

9. Trần Hùng (2007), Giáo trình, Phương pháp nghiên cứu dược liệu, Đại học

Y Dƣợc Tp HCM.

10. Đỗ Tất Lợi (2001), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam. NXB Y học, Hà

Nội, tr. 423.

11. Phạm Luận (2000), Giáo trình, Cơ sở lý thuyết sắc ký lỏng hiệu năng cao,

Đại Học Khoa Học Tự Nhiên-ĐHQGHN

12. Phạm Luận (2004), Cơ sở lý thuyết của phương pháp phân tích phổ hấp thụ

84

quang phân tử UV-VIS, Đại Học Khoa Học Tự Nhiên-ĐHQGHN

13. Hoàng Thị Lý (2011), Xây dựng tiêu chuẩn dược liệu nụ vối, khóa luận tốt

nghiệp dƣợc sĩ, Trƣờng đại học Dƣợc Hà nội.

14. Trƣơng Thị Tuyết Mai, Nguyễn Thị Lâm, Nguyễn Công Khẩn, Nguyễn Văn

Chuyển, Nagashima Fumie “Tác dụng chống oxy hóa của nụ vối trên ống

nghiệm và trên chuột tiểu đường” Tạp chí Y học dự phòng, 2009, số 5 (104).

15. Hoàng Thị Tuyết Nhung (2012), Nghiên cứu chiết xuất và tinh chế

Conessin, Kaempferol, Nuciferin từ dược liệu làm chất chuẩn đối chiếu trong

kiểm nghiệm thuốc, Luận án Tiến sỹ - Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội.

16. Nguyễn Văn Ri, giáo trình môn học, Các phương pháp tách, Đại học Khoa

học Tự Nhiên - ĐHQGHN

17. Ngô Văn Thu, Bài giảng dược liệu, tập 1, Bộ y tế và Bộ giáo dục Hà Nội.

18. Nguyễn Thị Kim Tuyến, Nguyễn Văn Thanh, Hoàng Văn Lựu, Chu Đình

Kính (2010). “Tách và xác định cấu trúc một số hợp chất từ nụ và hoa cây vối

(Cleistocalyx operculatus (Roxb) Merr. et Perry) ở Nghệ An”. Tạp chí Dược

học 405, tr. 44-46.

19. Tạ Thị Thảo, giáo trình môn học, Thống kê trong hóa phân tích, Đại học

Khoa học Tự Nhiên-ĐHQGHN.

20. Trần Quang Vinh (2009), Sự thay đổi hàm lượng flavonoid trong lá của cây

chùm ngây (Moringa oleifera Lam.) theo các giai đoạn phát triển, Luận văn

thạc sĩ Trƣờng Đại học hoa Khọc Tự Nhiên - ĐHQG HCM

21. Viện Dƣợc liệu (2008), Chiết xuất dược liệu, NXB Khoa học và Kỹ thuật,

Hà Nội. tr. 11-29, 39-49, 66-76.

22. Viện Dƣợc liệu – Sở Y tế tỉnh Nghệ an (2009), Cây thuốc Nghệ an, tr. 606-

85

608.

23. Viện Dƣợc liệu (2006), Nghiên cứu thuốc từ thảo dược, NXB Khoa học và

Kỹ thuật, Hà Nội, tr. 494.

24. Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia, Thẩm định phương

pháp trong phân tích hóa học và vi sinh vật, NXB khoa học và kỹ thuật Hà nội.

II. Tiếng anh

25. Arvouet A., B. Vennat, A. Pourrat and Legret (1994), “Sandardisation of an

extract of Propolis and identification of the major compounds”, J. Pharm.

Belgg., Vol. 49 pp. 462-468.

26. Brás H. de Oliveira , Tomoe Nakashima ,José D. de Souza Filho and

Fabiano L. Frehse (2001), “HPLC Analysis of Flavonoids in Eupatorium

littorale” J. Braz. Chem. Soc., Vol. 12, No. 2, pp. 243-246.

27. Byung-Sun Min, To Dao Cuong, Joo-Sang Lee, Beom-Soo Shin, Mi Hee

Woo, Tran Manh Hung (2010), “Cholinesterase Inhibitors from Cleistocalyx

operculatus Buds”, Archives of Pharmacal Research 33(10), pp. 1665-1670.

28. Byung Sun Min, To Dao Cuong, Joo-Sang Lee, Mi Hee Woo, and Tran

Manh Hung (2010), “Flavonoids from Cleistocalyx operculatus Buds and their

Cytotoxic Activity” Bull. Korean Chem. Soc., Vol.31, No.8. pp. 2392-2394

29. Chun-Lin Ye ,Jian-Wen Liu , Dong-Zhi Wei Yan-Hua Lu , Feng Qian

(2005), “In vivo antitumor activity by 2',4'-dihydroxy-6'-methoxy-3',5'-

dimethylchalcone in a solid human carcinoma xenograft model”, Cancer

Chemotherapy and Pharmacology 56(1), pp. 70-74.

30. Chun-Lin Ye, Jian-Wen Liu, Dong-Zhi Wei, Yan-Hua Lu, Feng Qian

(2004), “In vitro anti-tumor activity of 2',4'-dihydroxy-6'-methoxy-3',5'-

dimethylchalcone against six established human cancer cell lines”,

86

Pharmacological Research 50(5), pp. 505-510.

31. Chun-Lin Ye, Yan-Hua Lu, Dong-Zhi Wei (2004), “Flavonoids from

Cleistocalyx operculatus”, Phytochemistry 65(4), pp. 445–447

32. C-L Ye, Y-H Lu, X-D Li, D-Z Wei (2005), “HPLC analysis of a bioactive

Chalcone and tritecpence in the buds of Cleistocalys operculatus” South

African Journal of Botany, 71 (3&4) pp. 312-315.

33. Dao Trong Tuan et al. (2010), “C-Methylated flavonoids from Cleistocalyx

operculatus and their inhibitory effects on novel influenza A (H1N1)

neuraminidase”. Journal of Natural Products 73, pp. 1636-1642.

34. Elisabetta Campeol, Serena Catalano, Roberto Cremon Ini and Ivano Morell

(2000), “Flavonoids analysis of Vicia species of Narbonensis complex: V.

kalakhensis Khatt. Maxt & Bisby and V.eristalioides Maxt” Caryologia Vol.

53, No.1, pp. 63-68.

35. Feng Quian, Chun-Lin Ye, Dong-Zhi Wei, Yan-Hua Lu, Song-Lin Yang

(2005), “In vitro and in vivo reversal of cancer cell multidrug resistance by

2',4'-dihydroxy-6'-methoxy-3',5'-dimethylchalcone”, Journal of Chemotherapy

17(3), pp. 309-314.

36. Han-Yao Huang, Jian-Lei Niu, Yan-Hua Lu (2012), “Multidrug resistance

reversal effect of DMC derived from buds of Cleistocalyx operculatus in

human hepatocellular tumor xenograft model”, Journal of the science of food

and agriculture 92(1), pp. 135-140.

37. James M. Harnly, Robert F. Doherty, Gary R. Beecher, Oanne M.Holden,

David B. Haytowitz, Seema Bhagwat, and Susan Gebhardt,(2006), “Flavonoid

Content of U.S. Fruits, Vegetables, and Nuts” J. Agric. Food Chem. 54, pp.

87

9966−9977.

38. Lui Alberto Lira Soares, Valquíria Link Bassani, George González Ortega

& Pedro Ros Petrovick (2003), “Total Flavonoid Determination for the Quality

Control of Aqueous Extractives from Phyllanthus niruri L.” Lat. Am. J. Pharm.

22 (3), pp. 203-207.

39. L.-Tao, Z-T.Wang, E.-Y.Zhu, Y.-H.Lu, D.-Z.Wei (2006), “HPLC analysis

of bioactive flavonoids from the rhizome of Alipinia officinarum” South African

Journal of Botany 72 (2006), pp. 163-166.

40. Marica Medić-Šarić, Ivona Jasprica, Asja Smolčić-Bubalo and Ana Mornar

(2004), “Optimization of chromatographic conditions in thin layer

chromatography of flavonoids and phenolic acids” Croat. Chem. Acta 77(1-2),

pp. 361-366.

41. Mudasir Sultana, Pawan Kumar Verma, Rajinder Raina, Shahid Prawez &

M A Dar “Quantitative Analysis of Total Phenolic, flavonoids and Tannin

Contents in Acetone and n-hexane Extracts of Ageratum conyzoides”

International Journal of ChemTech Research CODEN( USA): IJCRGG

ISSN : 0974-4290 Vol. 4, No.3, pp. 996-999

42. Nguyen Thi Dung , Jung Min Kim, Sun Chul Kang (2008), “Chemical

composition, antimicrobial and antioxidant activities of the essential oil and the

ethanol extract of Cleistocalyx operculatus (Roxb.) Merr and Perry buds”, Food

and Chemical Toxicology 46, pp. 3632–3639.

43. Tevini, M., Iwanzik, W., Teramura, A.H. (1983), “Effects of UV-B

radiation on plants during mild water stress-II. Effects on growth, protein and

88

flavonoid contcent”, Z. Pflanzenphysiol. 110, pp. 459-467.

44. T. Sathishkumar, Baskar.R, Shanmugam.S, Rajasekaran.P, Sadasivam.S

and Manikandan.V “Optimization of flavonoids extraction from the leaves of

Tabernaemontana heyneana Wall. using L16 Orthogonal design” Nature and

Science, 6(3), 2008, ISSN: 1545-0740

45. Truong Tuyet Mai, Nguyen Van Chuyen (2007), “Anti-hyperglycemic

activity of an aqueous extract from flower buds of Cleistocalyx operculatus

(Roxb.) Merr and Perry”, Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry 71(1),

pp. 69-76.

46. Truong Tuyet Mai, Nghiem Nguyet Thu, Pham Gia Tien, Nguyen Van

Chuyen (2007), “Alpha-Glucosidase inhibitory and antioxidant activities of

Vietnamese edible plants and their relationship with polyphenol contents”,

Journal of Nutritional Science and Vitaminology 53(3), pp. 267-276.

47. Waksmundzka H. M., Sherma J., Kowalska T. (2008), “Thin layer

89

Chromatography in Phytochemistry”, CRC Press, Florida. pp. 3-15.