Luận văn Thạc sĩ Hóa học: Tổng hợp dẫn xuất chitosan pluronic và khảo sát ảnh hưởng của dung dịch đệm lên hiệu quả dẫn truyền paclitaxel và quercetin

BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-----------------------------

Huỳnh Hoàng Hạnh

TỔNG HỢP DẪN XUẤT CHITOSAN-PLURONIC VÀ KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA DUNG DỊCH ĐỆM LÊN HIỆU QUẢ DẪN TRUYỀN PACLITAXEL VÀ QUERCETIN

LUẬN VĂN THẠC SĨ: HÓA PHÂN TÍCH

Hồ Chí Minh – 03/2021

BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-----------------------------

Huỳnh Hoàng Hạnh

TỔNG HỢP DẪN XUẤT CHITOSAN-PLURONIC VÀ KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA DUNG DỊCH ĐỆM LÊN HIỆU QUẢ DẪN TRUYỀN PACLITAXEL VÀ QUERCETIN

Chuyên ngành: Hóa phân tích

Mã số: 8 44 01 18

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA PHÂN TÍCH

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC :

Người hướng dẫn 1 : TS. Lê Hoàng Sinh

Người hướng dẫn 2 : PGS. TS. Trần Ngọc Quyển

Hồ Chí Minh – 03/2021

LỜI CAM ĐOAN

Công trình được thực hiện tại phòng Hóa Dược – Viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng – Viện Hàn Lâm Khoa Học Công Nghệ Việt Nam tại thành phố Hồ Chí Minh.

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi và được sự hướng dẫn khoa học của TS. Lê Hoàng Sinh và PGS.TS. Trần Ngọc Quyển. Các nội dung nghiên cứu, kết quả trong đề tài này là trung thực và chưa công bố dưới bất kỳ hình thức nào trước đây.

TP. Hồ Chí Minh, tháng 02 năm 2021

Huỳnh Hoàng Hạnh

i

LỜI CÁM ƠN

Trong thời gian học tập và nghiên cứu với sự nỗ lực của bản thân và với sự giúp đỡ của tất cả mọi người để hoàn thành luận văn. Tôi xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến:

Các Thầy Cô trong Bộ Môn Hóa – Khoa Hóa học – Học Viện Khoa học và Công nghệ - Viên Hàn Lâm Khoa Học và Công nghệ Việt Nam đã truyền đạt cho tôi nhiều kiến thức bổ ích trong quá trình học tập.

TS. Lê Hoàng Sinh – Đại học Duy Tân và PGS.TS. Trần Ngọc Quyển – Viện Khoa Học Vật Liệu Ứng Dụng – Viện Khoa Học và Công nghệ Việt Nam, người đã định hướng nghiên cứu và tận tình hướng dẫn tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài.

Bạn Đặng Thị Lệ Hằng (Nghiên cứu viên), bạn Nguyễn Đình Trung (Nghiên cứu viên) và nhóm nghiên cứu tại phòng Vật Liệu Hóa Dược – Viện Khoa Học Vật Liệu Ứng Dụng – Viện Hàn Lâm Khoa Học và Công nghệ Việt Nam đã nhiệt tình hướng dẫn, cùng tham gia nghiên cứu và tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp tôi hoàn thành đề tài.

Sau cùng xin cám ơn đến gia đình, bạn bè và đồng nghiệp đã động viên

giúp đỡ tôi an tâm học tập và hoàn thành tốt đề tài nghiên cứu này.

ii

Danh mục các ký hiệu và chữ viết tắt

Acetonitril Hóa chất ACN

CP Chitosan-Pluronic F127 Hóa chất

DI Nước deionized Hóa chất

DLS Dynamic Light Scattering Tán xạ ánh sáng động học

Et Ethanol Hóa chất

F127 Pluronic F127 Hóa chất

HPLC High Performance Liquid Chromatography Sắc kí lỏng hiệu năng cao

NMR Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

Nitrophenyl chloroformate Hóa chất NPC

Phosphate-buffered saline Hóa chất PBS

Poly (ethylene oxide) Hóa chất PEO

Poly (propylene oxide) Hóa chất PPO

Paclitaxel Hóa chất PTX

Quercetin Hóa chất QU

TEM Transmission Electron Microscopy Kính hiển vi điện tử truyền qua

THF Tetrahydrofuran Hóa chất

iii

Danh mục các bảng

Bảng 2.1. Chương trình dung môi chạy máy sắc ký HPLC............................ 25

Bảng 2.2. Mẫu dung dịch chuẩn để khảo sát tính tuyến tính của PTX ........... 27

Bảng 2.3. Kết quả khảo sát độ tuyến tính của QU .......................................... 33

Bảng 3.1. Tính tương thích của hệ thống HPLC đối với mẫu PTX …………41

Bảng 3.3. Kết quả khảo sát độ tuyến tính ....................................................... 43

Bảng 3.2. Kết quả giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng ........................ 44

Bảng 3.4. Kết quả khảo sát độ đúng ............................................................... 45

Bảng 3.5. Kết quả khảo sát độ lặp lại .............................................................. 46

iv

Danh mục các hình vẽ

Hình 1.1. Tương tác ion .................................................................................... 7

Hình 1.2. Tương tác kỵ nước ............................................................................ 8

Hình 1.3. Quá trình nhả chậm thuốc theo thời gian của nanogel mang thuốc .. 9

Hình 1.4. Số người tử vong do ung thư năm 2018 ........................................ 10

Hình 1.5. Pluronic từ copolyme khối PEO-PPO-PEO . .................................. 11

Hình 1.6. Cấu trúc của chitosan (hay Poliglusam; Deacetylchitin; Poly-(D) glucosamine) ................................................................................................... 12

Hình 1.7. Cấu tạo phân tử Paclitaxel............................................................... 16

Hình 1.8. Cấu tạo phân tử của Quercetin ........................................................ 17

Hình 2.1. Phương trình phản ứng tổng hợp NPC-F127-NPC……………….21

Hình 2.2. Phương trình phản ứng tổng hợp NPC-F127-OH……………….. 22

Hình 2.3. Phương trình phản ứng tổng hợp copolymer chitosan-pluronic F127 (CP-F127)……………………………………………………………... 23

Hình 2.4. Đồ thị biểu diễn tỉ lệ giữa nồng độ QU và độ hấp thụ……………33

Hình 3.1. Công thức cấu tạo NPC-F127-NPC……………………………….35

Hình 3.2. Phổ IR của NPC-F127-NPC……………………………………… 35

Hình 3.3. Phổ 1H-NMR của NPC-F127-NPC………………………………. 36

Hình 3.4. Công thức cấu tạo NPC-F127-Ami………………………………. 37

Hình 3.5. Phổ 1H-NMR của NPC-F127-ami……………………………….. 38

Hình 3.6. Công thức cấu tạo Chitosan- Pluronic F127………………………39

Hình 3.7. Phổ IR của Chitosan-Pluronic F127……………………………… 39

Hình 3.8. Phổ 1H-NMR của Chitosan-Pluronic F127………………………. 40

Hình 3.9. Sắc ký đồ ghép thể hiện độ đặc hiệu của 3 mẫu: mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu thử…………………………………………………………….42

v

Hình 3.10. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và diện tích peak tương ứng của chất chuẩn PTX……………………………………….. 43

Hình 3.11. Sắc ký đồ ghép của các mẫu lập đường chuẩn………………….. 44

Hình 3.12. Hình chụp TEM và đo DLS của hệ copolymer sau khi nang hóa thuốc PTX và QU…………………………………………………………… 47

Hình 3.13. Kết quả thế zeta hệ copolymer trước (A) và sau (B) khi mang thuốc PTX và QU…………………………………………………………… 47

Hình 3.14. Biểu đồ tốc độ giải phóng thuốc PTX từ hệ copolymer CP (1:15) trong PBS (pH=7,4)…………………………………………………………. 50

Hình 3.15. Biểu đồ tốc độ giải phóng thuốc QU từ hệ copolymer CP (1:15) trong PBS (pH=7,4)…………………………………………………………. 51

vi

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN .............................................................................................. i

LỜI CÁM ƠN ................................................................................................... ii

Danh mục các ký hiệu và chữ viết tắt .............................................................. iii

Danh mục các bảng .......................................................................................... iv

Danh mục các hình vẽ ....................................................................................... v

MỤC LỤC ....................................................................................................... vii

TÓM TẮT ......................................................................................................... 1

ABSTRACT ...................................................................................................... 2

MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 3

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ............................................................................. 5

1.1. TỔNG QUAN VỀ NANOGEL VÀ UNG THƯ ................................... 5

1.1.1. Tổng quan về nanogel ..................................................................... 5

1.1.2. Tổng quan về ung thư ..................................................................... 9

1.2. TỔNG QUAN VỀ PLURONIC VÀ CHITOSAN .............................. 10

1.2.1. Pluronic ......................................................................................... 10

1.2.2. Chitosan ......................................................................................... 12

1.3. XÁC NHẬN GIÁ TRỊ SỬ DỤNG CỦA PHƯƠNG PHÁP ............... 13

1.3.1. Tính tương thích hệ thống ............................................................. 14

1.3.2. Khoảng tuyến tính ......................................................................... 14

1.3.3. Độ đúng ......................................................................................... 14

1.3.4. Độ chụm ........................................................................................ 14

1.3.5. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng ................................... 15

1.4. TỔNG QUAN VỀ HOẠT CHẤT PACLITAXEL VÀ QUERCETIN 16

1.4.1. Hoạt chất paclitaxel ....................................................................... 16

vii

1.4.2. Hoạt chất quercetin ....................................................................... 17

1.5. CÁC NGHIÊN CỨU QUỐC TẾ VÀ TRONG NƯỚC ....................... 18

1.5.1. Quốc tế .......................................................................................... 18

1.5.2. Trong nước .................................................................................... 18

CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 20

2.1. VẬT LIỆU ........................................................................................... 20

2.1.1. Hóa chất ........................................................................................ 20

2.1.2. Thiết bị và dụng cụ ........................................................................ 20

2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU........................................................ 21

2.2.1. Tổng hợp hệ copolymer Chitosan-Pluronic .................................. 21

2.2.2. Tổng hợp hệ Chitosan-Pluronic mang Paclitaxel và Quercetin .... 24

2.2.3. Xây dựng phương pháp thẩm định Paclitaxel ............................... 24

2.2.4. Đánh giá đặc tính cấu trúc của hệ copolymer ............................... 30

2.2.5. Đánh giá khả năng mang và phóng thích thuốc của hệ copolymer CP ............................................................................................................ 31

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................. 35

3.1. KẾT QUẢ TỔNG HỢP HỆ COPOLYMER CHITOSAN – PLURONIC………………………………………………………………. 35

3.1.1. Kết quả tổng hợp NPC-F127-NPC ............................................... 35

3.1.2. Kết quả tổng hợp NPC-F127-Ami ................................................ 37

3.1.3. Kết quả tổng hợp hệ copolymer Pluronic F127 đã hoạt hóa với Chitosan ................................................................................................... 39

3.2. XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP THẨM ĐỊNH PALITACXEL ......... 41

3.2.1. Khảo sát tính tương thích hệ thống ............................................... 41

3.2.2. Độ đặc hiệu ................................................................................... 41

3.2.3. Khảo sát khoảng tuyến tính ........................................................... 42

viii

3.2.4. Giới hạn phát hiện – Giới hạn định lượng .................................... 44

3.2.5. Độ đúng ......................................................................................... 45

3.2.6. Độ lặp lại ....................................................................................... 45

3.3. KẾT QUẢ CỦA CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ CẤU TRÚC CỦA HỆ COPOLYMER ............................................................................ 46

3.3.1. Kết quả của phương pháp đo TEM, DLS của hệ copolymer mang PTX và QU .............................................................................................. 46

3.3.2. Kết quả thế zeta của hệ copolymer trước và sau khi mang thuốc PTX và QU .............................................................................................. 47

3.4. KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG NANG HÓA VÀ PHÓNG THÍCH THUỐC CỦA HỆ COPOLYMER CP .......................................... 48

3.4.1. Kết quả đánh giá khả năng nang hóa PTX và QU ........................ 48

3.4.2. Kết quả tốc độ giải phóng thuốc PTX và QU ............................... 49

CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................. 52

4.1. KẾT LUẬN: ......................................................................................... 52

4.1.1. Tổng hợp dẫn xuất chitosan-pluronic ........................................... 52

4.1.2. Xây dựng phương pháp xác định PTX bằng HPLC ...................... 52

4.2. KIẾN NGHỊ: ........................................................................................ 53

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

ix

TÓM TẮT

Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành điều chế hệ nanogel Chitosan-

Pluronic với tỉ lệ khối lượng là 1:15. Dựa vào kết quả đánh giá cấu trúc và tính

chất của copolymer, sau đó nang hóa QU và PTX để bước đầu đánh giá cấu

trúc, hình thái cũng như một số hoạt tính của hệ nanogel. Cấu trúc của

Copolymer được xác định bằng cách đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR

và phổ FT-IR. Hình thái và kích thước hạt nanogel được kiểm tra thông qua

kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) và máy đo tán xạ ánh sáng động học

(DLS) và thế Zeta. Hiệu quả nang hóa và phóng thích thuốc QU 10% và PTX

2% được kiểm tra lần lượt bằng phương pháp đo phổ tử ngoại khả biến UV-Vis

và phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Đồng thời, xây dựng được

một quy trình xác định và đánh giá hàm lượng PTX trong mẫu CP bằng máy

sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với đầu dò UV-Vis được khảo sát. Quy trình

sử dụng cột InertSustain C18 (4,6 x 250 mm, 5µm) và bước sóng phát hiện là

227 nm, hệ pha động là dung dịch 0,1% phosphoric Acid – Acetonitril, kiểu

rửa giải đẳng môi. Kết quả thẩm định cho thấy quy trình có độ đặc hiệu cao,

đạt độ tuyến tính với R2= 0,9997, đạt độ lặp lại với RSD = 0,19 %, đạt độ đúng

với tỷ lệ phục hồi khoảng 90-107%, giới hạn phát hiện (LOD) là 0,15 ppm và

giới hạn định lượng (LOQ) là 0,5 ppm.

1

ABSTRACT

In this study, a nanogel system based pluronic F127-grafted chitosan

(CP-F127) was fabricated for quercetin/paclitaxel codelivery system. 1H-NMR

and FT-IR spectrum proved that the fabricating method of the CP-F127

copolymer was successful. The morphology and size of nanogel were

investigated by transmission electron microscopy (TEM), dynamic light

scattering (DLS), respectively. To measure the drug loading (DL) and

entrapment efficiency (EE) of nanoformulation, Ultra Violet-Visible (UV-Vis)

and high-performance liquid chromatography (HPLC) were performed. HPLC

method coperating with UV-Vis detector showed the best description for the

assay of PTX encapsalated in CP-F127 samples. The assay was conducted with

a InertSustain C18 column (15 cm x 4,6 mm, 5 µm) and UV detection at 227

nm. The program was achieved isocratically with a mobile phase of 0.1%

phosphoric acid – acetonitrile (v/v). The method was high specificity, linearity

with R2 = 0.9997, repeatability with RSD = 0.19%, accurary with recovery rate

of about 90-107%, the limit of detection and the limit of quantification are 0.15

ppm and 0.5 ppm, respectively.

2

MỞ ĐẦU

Sự phát triển mạnh mẽ về khoa học công nghệ nhờ vào các kết quả nghiên cứu có tính đột phá trong lĩnh vực như vật liệu nano polymer. Các vật liệu từ nano polymer được quan tâm phát triển nghiên cứu như dendrimer, naonogel-nanocapsule, polymer micelle-liposome… đã được ứng dụng nhiều trong lĩnh vực y dược và nghiên cứu vật liệu mới, tuy có nhiều hướng nghiên cứu khác nhau nhưng quan tâm nhiều nhất là hướng nghiên cứu: Nano polymer là thành phần gia cường do các hợp chất cao phân tử để tạo vật liệu mới và ứng dụng nano polymer làm chất dẫn thuốc, đưa thuốc đến đúng tế bào đích.

Mặc dù các chất điều trị hiện nay như cisplatin hoặc 5-FU .. cho thấy sự tiềm năng trong điều trị ung thư, tuy nhiên, liệu pháp điều trị bằng các thuốc này còn chưa phát huy được tính dược dụng quan trọng của nó. Các triệu chứng phụ kèm theo như độc tủy, nhiễm độc thận thường xảy ra với gần 80% ca bệnh điều trị bằng cisplatin. Bên cạnh đó, sự phát triển của ngành hóa hợp chất thiên nhiên, rất nhiều hoạt chất có dược tính thú vị, tiềm năng làm thuốc điều trị như curcumin, quercetin,… Tuy vậy, các hợp chất này hầu hết chỉ dừng ở mức có hoạt tính dược do những hạn chế liên quan đến sinh khả dụng, đặc biệt là khả năng hòa tan. Bên cạnh đó, sự phát triển các hệ thuốc mới dựa trên gốc của thuốc cũ cũng cho thấy nhiều nhược điểm, ví dụ: công nghệ sử dụng để tổng hợp phức tạp, quá trình loại bỏ các dung môi hữu cơ và tinh sạch sản phẩm gặp nhiều khó khăn do sự có mặt các đồng phân hoặc các sản phẩm phụ và hiệu suất phản ứng thường không cao. Nhờ cách mạng về công nghệ nano, hệ thống mang thuốc nano đã được giới thiệu vào cuối những năm 1990, đã trở thành một trong những giải pháp tối ưu để nâng cao hiệu quả của sự dụng thuốc. Thông qua việc gói thuốc vào hệ thống chất mang, tính sinh khả dụng của thuốc cải thiện rõ rệt, trong khi tính dược lý của thuốc không bị thay đổi. Bằng phương pháp trên, các triệu chứng phụ kèm theo khi sử dụng thuốc trong điều trị được giảm đáng kể. Đặc biệt, các hệ chất mang được phát triển đều dựa trên các tiêu chí về tương hợp sinh học cao, tránh các kích thích liên quan đến hệ miễn dịch; do đó, thay vì phát triển các loại thuốc mới dựa trên gốc của thuốc cũ, việc sử dụng hệ thống chất mang thuốc trở thành xu thế nóng trong lĩnh vực dược phẩm

3

ngày nay, đặc biệt là các nước có trình độ kỹ thuật chưa phát triển mạnh như Việt Nam.

Hiện nay, nghiên cứu và phát triển của hệ chất mang thuốc đã phát triển nhanh chóng trong những năm gần đây. Do hệ chất mang có các ứng dụng điều trị vượt trội hơn rất nhiều so với cách điều trị thuốc thông thường ở đa dạng các bệnh.

Tiêu biểu trong đó, có các hệ dẫn đã được cho phép của FDA, một tổ chức có nhiệm vụ kiểm tra và cấp phép các sản phẩm thương mại như là hệ dẫn thuốc dựa trên chất mang lipid (lipid-based drug delivery systems) - DaunoXome® (Gilead Sciences, Inc) hay như hệ dẫn thuốc trên cơ sở polymer. Trong nước, nghiên cứu về hệ dẫn truyền thuốc đang là lĩnh vực mới thu hút nhiều sự quan tâm. Nhóm nghiên cứu của PGS.TS. Trần Ngọc Quyển đã tạo ra nhiều hệ chất mang khác nhau như liposome, dendrimer, polymeric micelles …Để tạo được hệ chất mang có tiềm năng ứng dụng trong y học, các nguyên tắc cơ bản về tính tương hợp sinh học, độ ổn định, kích thước cũng như khả năng nang hóa thuốc là những cơ bản trong quá trình điều chế, khả năng kiểm soát tốc độ nhả thuốc của hệ chất mang là điều kiện tiên quyết cần phải đạt được trước khi tiến hành các thử nghiệm tiếp theo, đang thu hút sự quan tâm của giới khoa học trong lĩnh vực nghiên cứu này. Tuy nhiên, hiện tại việc nghiên cứu về khả năng nhả chậm của hệ chất mang còn nhiều hạn chế và thiếu thông tin khoa học đầy đủ trong việc lựa chọn môi trường tối ưu để nhả thuốc. Do đó, việc nghiên cứu và tìm hiểu về sự ảnh hưởng của môi trường dung dịch đệm lên quá trình nhả thuốc của hệ chất mang sẽ giúp cho việc nghiên cứu cũng như điều chế chất mang dễ dàng và thuận lợi hơn.

Trên cơ sở đó, đề tài nghiên cứu luận văn thạc sĩ của tôi là “Tổng hợp dẫn xuất chitosan-pluronic và khảo sát ảnh hưởng của dung dịch đệm lên hiệu quả dẫn truyền paclitaxel và quercetin”.

4

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN

1.1. TỔNG QUAN VỀ NANOGEL VÀ UNG THƯ

1.1.1. Tổng quan về nanogel

Công nghệ nano (nanotechnology): là ngành công nghệ liên quan đến việc nghiên cứu, phân tích, thiết kế, chế tạo và ứng dụng các cấu trúc, thiết bị và hệ thống bằng việc điều khiển hình dáng, kích thước của các hạt và vật liệu trên quy mô từ 1 đến 100 nanomet (nm). Sự phát triển mạnh mẽ công nghệ này đang được quan tâm, nghiên cứu và đã được ứng dụng trong các lĩnh vực mới như tổng hợp các vật liệu nano và phát hiện hoặc sử dụng tính chất hóa lý, tính chất quan và điện của chúng. Hiện nay, công nghệ nano được nghiên cứu và sử dụng rộng rãi và nhanh chóng đạt được tầm quan trọng trong nhiều lĩnh vực của đời sống như: hóa học, sinh học, y học, xúc tác… đặc biệt hơn là trong hóa dược phẩm. Trong ngành công nghiệp dược phẩm, hàng loạt phẩn tử mới có hoạt tính sinh học mạnh nhưng khả năng hòa tan trong nước kém, thời gian bán hủy ngắn, độ ổn định kém,… khả năng ứng dụng trong dược phẩm sẽ bị ảnh hưởng và sẽ đối mặt với nhiều thách thức khi muốn phát triển thành thuốc [1]. Kích thước nano: Nano (viết tắt là n) là một tiền tố được viết liền trước một đơn vị đo lường quốc tế để chỉ đơn vị nhỏ gấp 109 lần (1 nanomet =10-9 met). Độ lớn này được công nhận năm 1960. Thuật ngữ nano (có nguồn gốc từ tiếng Hy Lạp là nanos) dùng để chỉ một phần tỉ của vật nào đó. Nanomet là một phần tỉ của met, tức là có kích cỡ khoảng 10 nguyên tử hydrogen [1].

Nanogel: Thuật ngữ nanogel được định nghĩa là những hạt gel có kích thước nano (1-100 nm), các hạt nanogel thường được tạo thành từ những polymer tổng hợp hoặc polymer sinh học có liên kết ngang. Cấu trúc nanogel thường có những khoảng không gian trống và các đặc tính như sự trương nở, phân hủy dần theo thời gian. Nên thích hợp cho việc tải và giải phóng phân tử các chất khác [2]. Vì vậy, nanogel gây sự chú ý với sự vận chuyển thuốc và các chất sinh học, quá trình vận chuyển thuốc vào trong cơ thể mang hiệu suất cao và vận chuyển nhiều loại thuốc ung thư. Việc phân phối thuốc và các hạt nano polymer với polyethylene glycol (1990 và 1994) làm tăng thời gian lưu thông, duy trì thời gian điều trị hiệu quả, giảm thiểu thời gian hồi phục và giảm thiệt

5

hại cho các tế bào khỏe mạnh…Tại mô ung thư, sự phát triển của tế bào ung thư đòi hỏi sự tăng sinh mạch máu, các vi mạch máu mới được hình thành tại các mô ung thư và kích thước lên đến vài trăm nanomet. Do đó, kích thước nhỏ hơn 10 nm, khi biến tính với một số polymer tương hợp sinh học sẽ nhỏ hơn 50 nm, nên khả năng khuyết tán của chất mang thuốc đến vùng mô tập trung các tế bào ung thư nhanh và khá dễ dàng. Mặt khác với kích thước nano, nanogel có thể tải được hầu hết các loại thuốc đang điều trị nhiều loại ung thư hiện nay và đang được sử dụng rộng rãi làm chất mang nanogel trong lĩnh vực dược phẩm. [3].

Chất mang nanogel: là một loại vật liệu nanogel được dùng như một phương tiện vận chuyển hợp chất khác, ví dụ như thuốc, phổ biến thường là polymer, micelles, liposome, dendrimer… có kích thước dao động trong khoảng 1-100 nm [4,5]. Do kích thước nhỏ nên chất mang nano có thể vận chuyển thuốc đến những vị trí đặc biệt, cho phép phân phối thuốc vào đúng các cơ quan hoặc tế bào mục tiêu mà không ảnh hưởng đến các tế bào khác [6]. Từ đó cho thấy lợi ích đầy tiềm năng trong phương pháp hóa trị liệu vì chúng làm giảm thiểu các độc tính trên tế bào lành.

Đa số các thuốc chống ung thư không những gây độc cho tế bào bệnh mà còn tác động lên tế bào lành. Hơn nữa, các dược chất này nhanh chóng bị miễn nhiễm bởi các tế bào ung thư. Việc dùng hóa trị liệu đưa vào trong cơ thể có tế bào ung thư thì làm tăng khả năng điều trị bệnh nhưng không làm giảm các tác dụng phụ của thuốc mang lại, vì vậy kết hợp hóa trị liệu với chất mang vận chuyển thuốc nhằm mục đích giải quyết các vấn đề nói trên. Sử dụng hệ chất mang thuốc trên cơ sở hạt kích thước nano có thể giảm thiểu các tác dụng phụ, tăng độ hòa tan, tăng hiệu quả điều trị của nhiều loại thuốc và kéo dài thời gian tồn tại của thuốc trong hệ tuần hoàn máu. Các hệ chất mang thuốc này có khả năng hướng đích, kiểm soát nhả thuốc tại tế bào ung thư dựa trên sự khác nhau về đặc điểm sinh học giữa các tế bào ung thư và tế bào lành, và quan trọng hơn là làm cho tế bào ung thư mất tính khả năng kháng thuốc [5].

6

Các tương tác tạo nanogel

Trong chuỗi Pluronic có liên kết ngang vật lý có thể được tạo thành nhờ nhiều yếu tố môi trường tác động như pH, nhiệt độ, lực ion… và một loạt các tương tác hóa lý khác như tương tác kỵ nước, tương tác ion, liên kết hydro… [5].

Tương tác ion

Sự nghiên cứu rộng rãi của tương tác tĩnh điện để tạo liên kết ngang trong quá trình gel hóa. Phương pháp này có một lợi thế là sự phân hủy sinh học có thể xảy ra như sự phân ly ion trong ngoại bào, phá vỡ mạng lưới liên kết ngang [5].

Tương tác ion xảy ra giữa một phân tử polymer và một phân tử nhỏ hoặc giữa hai phân tử polymer trái dấu để tạo liên kết ngang trong gel hạt nano, nhằm tạo ra chuỗi phân tử ba chiều thích hợp cho mang thuốc và nhả thuốc. Ví dụ, vi cầu dextran được hình thành do tương tác phức tạp giữa các vi hạt tích điện trái dấu. Một ví dụ về liên kết ngang giữa một phân tử polymer và một phân tử nhỏ: liên kết polypeptide elastin được hình thành thông qua tương tác tĩnh điện giữa dư lượng ion dương lysine và ion âm phopho hữu cơ trong điều kiện sinh lý [5].

Hình 1.1. Tương tác ion [5]

Tương tác kỵ nước

Các phân tử polymer có chứa một đầu ưa nước và một đầu kỵ nước có thể được tạo thành bằng phản ứng trùng hợp hoặc bằng cách trực tiếp tạo ra

7

một khối copolymer. Các phân tử copolymer này có thể hòa tan trong nước ở nhiệt độ thấp. Tuy nhiên, khi nhiệt độ tăng, phần kỵ nước có xu hướng xoay vào trong đề giảm thiểu diện tích bề mặt tiếp xúc trực tiếp với nước. Nhiệt độ mà tại đó xảy ra hiện tượng gel hóa phụ thuộc vào nồng độ của các polymer, độ dài đầu kỵ nước và cấu trúc hóa học polymer [5]. Copolymer của poly (ethyleneoxide) - poly (propylenoxide)-poly(ethyleneoxide) (PEO-PPO-PEO) là polymer được sử dụng rộng rãi nhất trong lĩnh vực gel hóa [7].

Hình 1.2. Tương tác kỵ nước

Ứng dụng trong mang nhả thuốc của nanogel

Quá trình phân phối thuốc cần đảm bảo được các yếu tố như đưa thuốc

đến đúng vị trí, vào đúng thời điểm và đúng nồng độ. Vì vậy với để đáp ứng

được vấn đề này, các polymer thông minh được nghiên cứu làm các chất mang

để phân phối thuốc. Các polymer mang thuốc này cho phép đưa thuốc vào đúng

vị trí và nhả thuốc ra ngoài khi có các kích thích của môi trường. Ví dụ như

trong điều trị bệnh tiểu đường tuýp 1 các nhà nghiên cứu đưa insulin có thể

tiêm dưới da, và hydrogel sẽ giải phóng insulin ra ngoài một cách từ từ để thay

thế việc tiêm insulin nhiều lần. Hoặc sử dụng hydrogel như một chất bảo vệ

insulin khỏi acid dạ dày, nhằm đảm bảo việc insulin được hấp thu an toàn vào

cơ thể bằng đường uống. Tương tự trong điều trị ung thư các nhà nghiên cứu

đang cố gắng tạo ra các loại thuốc tiêm và uống có khả năng mang thuốc trúng

đích (hydrogel nhạy pH: tế bào ung thư phát triển trong môi trường pH thấp)

8

và nhả chậm thuốc từ đó hạn chế khả năng gây độc của thuốc cũng như giảm

chi phí điều trị cho bệnh nhân [30,31].

Hình 1.3. Quá trình nhả chậm thuốc theo thời gian của nanogel mang thuốc

1.1.2. Tổng quan về ung thư

Các khối u ác tính và u là bất kỳ sự tăng sinh bất thường của các tế bào được gọi là ung thư, có thể là lành tính hoặc ác tính. Một khối u lành tính vẫn bị giới hạn ở vị trí ban đầu, không xâm lấn vào các mô bình thường cũng như không lan đến các vị trí cơ thể xa. Một khối u ác tính, có các đặc điểm: làm tăng tốc chu kỳ tế bào; thay đổi bộ gen; tăng tính di động của tế bào; hóa trị liệu; thay đổi bề mặt tế bào; bài tiết các yếu tố lytic, khả năng xâm lấn cả mô bình thường và lan rộng khắp cơ thể thông qua hệ thống tuần hoàn hoặc bạch huyết di căn [9]. Chỉ có khối u ác tính được gọi đúng là ung thư, và chính khả năng xâm lấn và di căn của chúng khiến ung thư trở nên nguy hiểm. Trong khi các khối u lành tính thường có thể được loại bỏ bằng phẫu thuật.[10]

Ở phần lớn các nước trên thế giới tỷ lệ ung thư có xu hướng tăng nhanh. Tổ chức Y tế thế giới(WHO) và Cơ quan Nghiên cứu Ung thư Quốc Tế (IARC) nhận định đây là đại dịch đang xảy ra trong hiện tại. Theo thống kê tình hình trên toàn cầu tháng 12/2018 có hơn 18 triệu ca bệnh mới và gần 9,6 triệu người chết do ung thư, trong đó gần 60% là ở các nước châu Á và các nước đang phát triển. Hiện khoảng 43,8 triệu người đang sống với ung thư. [11] Nếu không có biện pháp can thiệp các con số này sẽ còn tăng nhanh chóng. Và cũng theo WHO, IARC trong 185 quốc gia, vùng lãnh thổ có tỷ lệ mắc và tử vong do ung thư nhiều nhất thế giới, Việt Nam đứng thứ 100. Tính đến 2018, Việt Nam có

9

hơn 164 nghìn ca bệnh mới và hơn 114 nghìn người tử vong do ung thư, 300 nghìn người đang sống với ung thư. Năm bệnh ung thư phổ biến nhất ở Việt Nam là ung thư gan, phổi, dạ dày, ung thư vú và ung thư trực tràng. [12]

Hình 1.4. Số người tử vong do ung thư năm 2018 [11]

1.2. TỔNG QUAN VỀ PLURONIC VÀ CHITOSAN

1.2.1. Pluronic

Pluronic được cấu tạo từ polyetylen oxit (PEO) và polypropylene oxit (PPO) viết tắt PEO-PPO-PEO là những chất hoạt động bề mặt cao phân tử không ion. Bằng việc thay đổi thành phần copolyme (tỷ lệ PO/EO) và phân tử lượng (chiều dài khối PEO và PPO) trong quá trình tổng hợp dẫn đến việc tạo ra các sản phẩm có tính chất phù hợp với các yêu cầu khác trong nhiều lĩnh vực áp dụng trong công nghiệp như tẩy rửa, mỹ phẩm, dược phẩm (chữa vết thương). Bản chất lưỡng ái của copolyme tan tốt trong dung dịch nước là chúng có khả năng tự kết hợp lại tạo thành một trạng thái vi cấu trúc được tạo thành bởi các chất hoạt động bề mặt phân tử thấp, phụ thuộc vào nồng độ, thành phần copolyme và nhiệt độ [14].

So với các loại vật liệu khác như kim loại, thủy tinh, gốm sứ,… polyme là loại vật liệu duy nhất mà trọng lượng phân tử của chúng có thể được điều

10

chỉnh từ thấp đến cực cao để cung cấp những đặc tính khác nhau. Thông thường, các polyme có trọng lượng phân tử lớn thúc đẩy sự tương tác giữa các phân tử trong chuỗi polyme làm cho tính chất hóa học, vật lý và tính chất cơ học tốt hơn các polyme có trọng lượng phân tử nhỏ. Ví dụ, các polyme có trọng lượng phân tử cao thường có nhiệt độ nóng chảy, ổn định và sức bền cơ học lớn hơn các loại polyme có trọng lượng phân tử thấp. Polyme có rất nhiều ứng dụng và được sử dụng ở môi trường có nhiệt độ và lực cơ học từ thấp đến trung bình. Tuy nhiên, polyme gần như mất các tính chất quan trọng khi sự thay đổi của những yếu tố này tăng đáng kể. Ví dụ, ở pH rất axit hoặc rất kiềm, nhiệt độ cao, lực cơ học cao, hoặc các dung môi mạnh có thể làm suy giảm các polyme hoặc làm suy yếu lực liên kết giữa các phân tử. [15]

Hình 1.5. Pluronic từ copolyme khối PEO-PPO-PEO [17].

Ngoài ra, pluronic còn có một đặc tính rất đặc trưng là tính biến đổi thể tích bởi nhiệt độ. Khi ở nhiệt độ thấp (0 – 4 oC), dung dịch pluronic với một nồng độ thích hợp sẽ tồn tại ở trạng thái lỏng, nhưng khi tăng nhiệt độ lên nhiệt độ phòng (20 ~ 25 oC) thì lại chuyển sang dạng gel rắn. Tuy nhiên, dạng gel này sẽ bị thoái biến và chuyển về dạng lỏng ban đầu nếu hạ nhiệt độ xuống. Nguyên nhân do nhóm PEO ưa nước còn PPO thì kị nước nên khi hoà tan trong nước nó tạo thành dạng micelles với nhân là PPO và lớp vỏ ngoài là PEO [16]. Việc tăng nhiệt độ sẽ dẫn đến việc sự loại nước và cấu trạng thay đổi tại vùng chứa các nhóm kỵ nước, kết quả là các nhóm PPO có xu hướng tiến lại gần nhau và tạo thành các micelles polyme bền nhiệt động học, ngăn chặn PEO tiếp xúc với nước và gel được hình thành [16,17].

11

1.2.2. Chitosan

Chitosan một polysacarit mạch thẳng, là dẫn xuất đề axetyl hoá của chitin, trong đó nhóm (–NH2) thay thế nhóm (-COCH3) ở vị trí C(2). Chitosan được cấu tạo từ các mắt xích D-glucozamin liên kết với nhau bởi các liên kết b-(1-4)-glicozit, do vậy chitosan có thể gọi là poly b-(1-4)-2-amino-2-deoxi-D- glucozơ hoặc là poly b-(1-4)-D- glucozamin (cấu trúc III).

Hình 1.6. Cấu trúc của chitosan (hay Poliglusam; Deacetylchitin; Poly-(D) glucosamine)

Chitosan được chuyển hóa từ Chitin, là polyme hữu cơ tự nhiên duy nhất mang điện tích dương do đó có những nhóm amino tự do tích điện dương và có khả năng chuyển thành dạng dung dịch nhớt khi hòa tan trong môi trường axit yếu, điều này khiến cho chitosan có những đặc tính đặc biệt, hơn là nhóm amit của chitin.

Chitosan không độc, dùng an toàn cho người, chúng có tính tương hợp sinh học cao với cơ thể, có khả năng tự phân hủy sinh học. Nó là chất mang lý tưởng trong hệ thống vận chuyển thuốc, và còn sử dụng an toàn trong ghép mô. Chitosan có nhiều tác dụng sinh học đa dạng như: tính kháng nấm, tính kháng khuẩn với nhiều chủng loại khác nhau, kích thích sự phát triển của tế bào, cầm máu, chống sưng u. Ngoài ra, chitosan còn được ứng dụng nhiều trong công nghiệp thực phẩm, y tế, y dược, mỹ phẩm…

Do đó việc kết hợp chitosan và pluronic có thể sẽ giải quyết vấn đề tồn tại to lớn khi sử dụng pluronic riêng lẻ khống chế quá trình nhả chậm của các hoạt chất có tác dụng chữa bệnh trên từ các hệ hydrogel nhạy cảm nhiệt.

12

Trong phạm vi nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành tổng hợp hệ nanogel nhạy nhiệt trên cơ sở chitosan ghép pluronic F127 (hay còn được biết đến với tên gọi Pluronic F127) thông qua liên kết giữa nhóm amine trên chitosan và nhóm NPC được gắn trên pluronic.

1.3. XÁC NHẬN GIÁ TRỊ SỬ DỤNG CỦA PHƯƠNG PHÁP

Xác định giá trị sử dụng của phương pháp (hay còn gọi là thẩm định phương pháp) là quá trình khẳng định bằng cách kiểm tra và cung cấp bằng chứng khách quan cho thấy các yêu cầu cụ thể đối với mục đích sử dụng nhất định đã được đáp ứng.

Trong đó “mục đích sử dụng nhất định” chính là yêu cầu cần thử nghiệm đối với từng thông số bằng một phương pháp phân tích nhất định, “bằng chứng khách quan” chính là số liệu thực nghiệm thu được trong quá trình thực hiện phép thử, và “khẳng định” chính là việc so sánh bằng chứng khách quan có được với một hệ thống tiêu chuẩn đánh giá xem các bằng chứng đó có thoả mãn hay không.

Xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp có hai dạng: Đối với phương pháp tiêu chuẩn: Xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp (Method Verification) là quá trình đánh giá phương pháp tiêu chuẩn được áp dụng trong hệ thống điều kiện tiêu chuẩn về tiện nghi môi trường, hoá chất thiết bị có đưa ra được kết quả có độ chính xác đạt yêu cầu hay không.

Đối với phương pháp không tiêu chuẩn, hoặc phương pháp do phòng thí nghiệm tự xây dựng: Xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp (Method Validation) là quá trình đánh giá phương pháp dựa trên cơ sở đánh giá kết quả đo trên cùng một mẫu thử khi sử dụng một phương pháp tiêu chuẩn khác hoặc dựa trên việc phân tích các mẫu chuẩn được chứng nhận.

Việc xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp luôn đi kèm với việc công bố giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng của phương pháp đó, ước lượng độ không đảm bảo đo tại các nồng độ thường gặp trong khoảng làm việc của phương pháp.[13]

13

1.3.1. Tính tương thích hệ thống

Kiểm tra tính tương thích hệ thống là một phần không thể tách rời trong

nhiều quy trình phân tích. Đánh giá tính thích hợp của hệ thống là những phép

thử nhằm đánh giá tính thích hợp của toàn hệ thống phân tích được cấu thành

bởi các yếu tố như máy móc thiết bị, hệ thống điện, cách tiến hành phân tích và

mẫu thử. Các thông số của phép thử tính tương thích của hệ thống được thiết

lập cho từng quy trình riêng biệt phụ thuộc vào loại quy trình được thẩm định.

Các thông số này đặc biệt quan trọng trong các phương pháp sắc ký.

1.3.2. Khoảng tuyến tính

Khoảng tuyến tính của một phương pháp phân tích là khoảng nồng độ ở đó có sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng đo được và nồng độ chất phân tích.

Khoảng làm việc của một phương pháp phân tích là khoảng nồng độ giữa giới hạn trên và giới hạn dưới của chất phân tích (bao gồm cả các giới hạn này), tại đó được chứng minh là có thể xác định được bởi phương pháp nhất định với độ đúng, độ chính xác và độ tuyến tính như đã nêu.

1.3.3. Độ đúng

“Độ đúng (accuracy) là thước đo độ tin cậy của phương pháp, mô tả độ gần tới giá trị thực của đại lượng đo được”. (Thông tư 21/2012/TT-BTNMT). Để đánh giá độ chính xác của phương pháp, tiến hành bố trí thí nghiệm để xác định độ thu hồi đối với mẫu thêm chuẩn hoặc xác định độ chệch đối với mẫu chuẩn được chứng nhận.

1.3.4. Độ chụm

“Độ tập trung hoặc độ chụm (precision) là mức độ tập trung của các giá trị đo lặp của cùng một thông số”. Để đánh giá độ tập trung của phương pháp, tiến hành bố trí thí nghiệm và đánh giá kết quả đo mẫu lặp. Nếu kết quả đo các mẫu lặp càng gần nhau thì phương pháp có độ tập trung tốt và ngược lại.

- Độ lặp lại: là sự thay đổi của kết quả đo trên cùng một mẫu thử trong

14

khoảng thời gian ngắn. Độ lặp lại thể hiện sự sai khác về kết quả đo trong điều kiện các thông số thực hiện phương pháp là cố định: hoá chất, thiết bị, mẫu thử, người phân tích.

- Độ tái lập: là sự thay đổi của kết quả đo trên cùng một mẫu thử trong khoảng thời gian dài. Độ tái lập thể hiện sự sai khác về kết quả đo khi cùng một mẫu thử được phân tích bởi cùng một phương pháp nhưng do 2 phòng thí nghiệm tiến hành độc lập (so sánh liên phòng). Tuy nhiên, trong quá trình áp dụng, để giảm bớt chi phí phân tích cho so sánh liên phòng, có thể tiến hành xác định độ tái lập trung gian (hay còn gọi là độ tái lặp nội bộ) khi dùng cùng một mẫu thử trong khoảng thời gian phân tích kéo dài, cùng một phương pháp nhưng do các thí nghiệm viên khác nhau thực hiện song song. Kết quả đo được tổng hợp và xử lý thống kê để tính toán độ tái lập trung gian tương tự với độ tái lặp.

1.3.5. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng

Giới hạn phát hiện của phương pháp (method detection limit – viết tắt là MDL, hoặc Limit of Detection – viết tắt là LOD) là giá trị nồng độ thấp nhất của một chất cần phân tích có độ chính xác đến 99%, nồng độ chất cần phân tích lớn hơn 0.

Trên cùng một phương pháp phân tích, các phòng thí nghiệm khác nhau sẽ công bố các giới hạn phát hiện khác nhau tuỳ thuộc vào tay nghề của nhân viên, sự hoạt động ổn định của máy móc thiết bị và chất lượng của các hoá chất/ chất chuẩn. Trong trường hợp các yếu tố nêu trên không đảm bảo yêu cầu, giới hạn phát hiện của phương pháp sẽ tăng lên nhiều lần so với khuyến nghị của phương pháp gốc. Do đó, việc xác định và công bố giới hạn phát hiện của phương pháp sẽ thể hiện được năng lực của phòng thí nghiệm.

Giới hạn định lượng của phương pháp (Limit of Quantitation – viết tắt là LOQ) là giới hạn thấp nhất của chất cần phân tích có thể định lượng được bằng cách phân tích đáp ứng được yêu cầu về độ chính xác. Giới hạn định lượng thường lớn hơn giới hạn phát hiện của phương pháp.

15

Giới hạn phát hiện (LOD) của một phương pháp phải được tính trên nền thật của mẫu và trải qua toàn bộ các bước xử lí mẫu. Do đó giá trị này chính xác nhất cho việc đánh giá một phương pháp phân tích. Có nhiều cách để xác định giới hạn phát hiện của phương pháp.

1.4. TỔNG QUAN VỀ HOẠT CHẤT PACLITAXEL VÀ QUERCETIN

1.4.1. Hoạt chất paclitaxel

Paclitaxel là một chất ức chế phân bào được sử dụng trong điều trị ung thư, thuộc nhóm Taxane. Paclitaxel được phát hiện vào năm 1967 là kết quả của một dự án khảo sát hợp chất tự nhiên trong điều trị ung thư của Viện Nghiên Cứu ung thư Quốc gia Hoa Kỳ; Monroe Wall và Mansukh Wani đã cô lập thuốc từ vỏ cây Thông đỏ (Taxus brevifolia) và được đặt tên là Taxol. Cho đến nay đã có nhiều nhóm nghiên cứu tổng hợp thành công Paclitaxel như Robert A. Holton năm 1993, Wender vào năm 1997, Kuwajima và Mukaiyama vào năm 1998, Danishefsky vào năm 1996 và Takahashi vào năm 2006 [18,19].

Công thức phân tử: C14H51NO14 Cảm quan: bột mịn, mài trắng Khối lượng phân tử: 853,9 g/mol

Hình 1.7. Cấu tạo phân tử Paclitaxel

Paclitaxel là một trong những chất trị liệu hóa học hiệu quả nhất trong điều trị nhiều loại bệnh ung thư bao gồm ung thư buồng trứng, ung thư vú, ung thư đại tràng, bàng quang, thực quản, phổi, đa u tủy. Tuy nhiên do độ hòa tan kém trong nước và chỉ số điều trị thấp nên ứng dụng lâm sàng của Paclitaxel

16

vẫn còn hạn chế. Bệnh nhân sau khi dùng paclitaxel thường kèm theo các tác nhân phụ như sung huyết, ngoại ban, kém ăn [20]. Vì vậy, vấn đề là cần làm tăng độ tan, nâng cao hiệu quả trị liệu và đồng thời làm giảm tác dụng phụ loại thuốc này bằng cách năng hóa thuốc trong một chất mang nanogel.

1.4.2. Hoạt chất quercetin

Quercetin (QU) là một hợp chất phenol được tìm thấy trong nhiều loài cây thiên nhiên, trong nhiều sản phẩm thực phẩm, các loại thuốc nhuộm tự nhiên,…

Quercetin (3,3’,4’,5,7-pentahydroxyflavone) thuộc nhóm polyphenolic. Các hợp chất flavonoid hầu như được tìm thấy phổ biến ở thực vật và thực phẩm bắt nguồn từ thực vật. QU thường xuyên ở dạng glycosides (các chất dẫn xuất của đường). Tên gọi QU được sử dụng từ năm 1857 và có nguồn gố từ quercetum-rừng sồi [21].

Tên IUPAC: 2-(3,4 – dihydroxyphenyl) – 3,5,7-trihydroxy-4H-chromen-

4-one.

Tên thông thường khác: Sophoretin, Meletin, Xanthaurine, Quercerol,

Quercitin, Quertine, Flavin meletin. Công thức phân tử: C15H10O7 Cảm quan: bột mịn, màu vàng Khối lượng mol: 302,236 g/mol

Hình 1.8. Cấu tạo phân tử của Quercetin

QU có tác dụng chống oxy hóa mạnh, hỗ trợ chống lại các tế bào gốc tự do và chống viêm nên có thể giúp giảm chứng viêm và được sử dụng để điều trị xơ vữa động mạch, tiểu đường, phòng ngừa ung thư vì nó sẽ loại bỏ tất cả

17

các gốc tự do trong cơ thể và trung hòa chúng từ đó hạn chế sự phát triển của tế bào ung thư…

1.5. CÁC NGHIÊN CỨU QUỐC TẾ VÀ TRONG NƯỚC

1.5.1. Quốc tế

Năm 2010, Tác giả Jong Hoon Choi và cộng sự đã tổng hợp thành công hệ nanogel Heparin-Pluronic F127 mang enzyme Ribonuclease A (RNase A) diệt tế bào ung thư [22].

(PLGA) phủ

Năm 2010, Tác giả Yong-Il Chung và cộng sự sử dụng các hạt nano poly(lactide-co-glycolide) lên hệ nanogel Heparin- Pluronic/Chitosan-Pluronic để tăng hiệu suất tấn công khối u so với khi dùng hạt PLGA riêng lẻ, thí nghiệm được thực hiện trên chuột nhắt với khối u có kí hiệu SCC7 [23].

Năm 2011, Tác giả Soon Hong Yuk và cộng sự dùng polyethylene glycol lỏng (PEG) hòa tan thuốc chống ung thư Paclitaxel (PTX), đóng gói trong Pluronic F68, sau đó cố định trên Heparin/glycol Chitosan và đông khô. Hệ thống nanogel mang PTX được thử hoạt tính trên chuột có mang khối u [24].

1.5.2. Trong nước

Năm 2015, Tác giả Trần Hữu Dũng đã nghiên cứu ứng dụng của polymer

Pluronic nhạy nhiệt trong điều trị các tổn thương bỏng[25].

Năm 2016, Nguyễn Thị Bích Trâm cùng nhóm nghiên cứu tại phòng Vật Liệu Hóa Dược - Viện Khoa Học Vật Liệu Ứng Dụng cũng đã tổng hợp thành công copolymer Chitosan – Pluronic F127 nhạy nhiệt ứng dụng dẫn truyền thuốc[26].

Năm 2016, Nguyễn Ngọc Thể và cộng sự đã tổng hợp thành công hệ nanogel Heparin-Pluronic F127 mang được các loại thuốc kỵ nước như 5- fluorouracil (5-FU), Erlotinib hydrochloride (Erlo) và Cisplatin (Cis) với hiệu suất cao hơn so với khi dùng hệ PAMAM G4.0-Pluronic F127 [27].

Năm 2016, nhóm tác giả Nhat-Anh N. Tong, Thi Phuong Nguyen, Cuu Khoa Nguyen & Ngoc Quyen Tran đã tổng hợp thành công hệ nanogel Heparin-

18

Pluronic F127 mang Cisplatin hydrate nhả chậm và đánh giá hoạt tính ức chế tế bào ung thư phổi NCI-H460 [28].

19

CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. VẬT LIỆU

2.1.1. Hóa chất

Hóa chất Nguồn gốc STT Khối lượng phân tử (g/mol)

Pluronic (F127) 12600 Sigma 1

Chitosan >100000 Sigma 2

3-amino-1-propanol (99%) 75,11 Acros Organics 3

201,56 Acros Organics 4 p-nitrophenyl chloroformate (NPC)

THF (Tetrahydrofuran) 72,11 Acros Organics 5

Diethyl ether 74,12 Acros Organics 6

Paclitaxel 853,90 Merck 7

Quercetin 302,236 Merck 8

Ethanol 46,07 Merck 9

Acetonitril 41,05 Daejung, Korea 10

Nước DI Việt Nam 11

2.1.2. Thiết bị và dụng cụ

2.1.2.1. Dụng cụ

- Bình cầu cổ nhám hai cổ 100 mL. - Bình cầu cổ nhám hai cổ 500 mL. - Bình cầu cổ nhám ba cổ 250 mL. - Ống nhỏ giọt, ống đong, becher (50mL, 100 mL, 250 mL), bình định

mức (10 mL, 25 mL, 50 mL, 100 mL).

- Phễu lọc hút chân không, micropipette, cá từ, khóa nhám cung cấp

nitơ, nhiệt kế, bếp khuấy nhiệt, hai van khóa, giá đỡ.

- Túi thẩm tách Spectra Por Regenerated Cellulose Membrane MWCO

12000-14000.

- Hủ bi 10 mL, 5 mL, 2 mL.

20

2.1.2.2. Thiết bị

- Máy cô quay chân không Buxchi Rotavapor R-200, Heating Bath B-

490.

- Tủ hút chân không OV-01, tủ sấy, máy khuấy từ có hiệu chỉnh nhiệt

độ: OMNILAB, type RCT S26 batch Inpected UPAE 117537. - Cân phân tích điện tử - HADAM AEP-250G (5 số lẻ). - Máy phân tích hồng ngoại Fourior FTIR (Fourior transform infrared

spectroscopy).

- Máy đông khô, FDU-1200 EYELA - Máy siêu âm, Hielscher – Đức. - Máy vortex, Velp – Ý - Máy ly tâm, Hermle – Đức - Máy đo kích thước hạt (DLS) và thế Zeta, SZ-100 HORIBA Scientific - Máy quang phổ UV-1800, Shimadzu – Nhật - Máy HPLC (PerkinElmer PDA Flexar)

2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1. Tổng hợp hệ copolymer Chitosan-Pluronic

2.2.1.1. Tổng hợp NPC-Pluronic-NPC

Phương trình phản ứng:

Hình 2.1. Phương trình phản ứng tổng hợp NPC-F127-NPC

21

Cân 15 gam F127 (12600 gam/mol) cho vào bình cầu 3 cổ 250mL, hút chân không trong 1 giờ 30 phút (loại hơi nước). Đồng thời gia nhiệt cho bếp đến khi bếp đạt 80 °C và F127 tan hết. Sau đó, khóa bơm, dẫn khí N2, cho 0,5 gam (0,0024 mol) NPC vào bình cầu và khuấy từ ở nhiệt độ 70-80 °C. Phản ứng thực hiện trong 5 giờ. Dừng gia nhiệt, cho 40 mL THF vào và khuấy ở nhiệt độ phòng.

Dung dịch thu được đem đi tủa trong 250 mL diethyl ether ở nhiệt độ 0 °C, thời gian 3 giờ. Hỗn hợp được lọc hút chân không. Sản phẩm thu được tiếp tục được rửa lại với diethyl ether. Sau đó, sản phẩm được đem cô quay để loại hoàn toàn dung môi còn sót lại đến khối lượng không đổi. Sản phẩm thu được ở dạng bột có màu trắng mịn, lấy một ít mẫu đem đi đo phổ 1H-NMR để xác định cấu trúc F127 sau khi hoạt hóa bởi NPC.

2.2.1.2. Tổng hợp NPC-Pluronic-OH

Phương trình hóa học

Hình 2.2. Phương trình phản ứng tổng hợp NPC-F127-OH

Cho 15 gam NPC-F127-NPC đã cô quay vào bình 3 cổ, hòa tan với 50 mL THF. Nhỏ giọt 3-amino-1-propanol (0,0012 mol và d=0,982 gam/lit) đã pha loãng vào dung dịch 50 mL THF, khuấy từ trong 12 giờ ở nhiệt độ phòng.

22

Dung dịch thu được đem đi tủa trong 250 mL diethyl ether ở nhiệt độ 0 oC, thời gian 3 giờ.

Sau đó hỗn hợp được lọc hút chân không, sản phẩm được đem đi cô quay để loại hoàn toàn dung môi còn sót lại đến khối lượng không đổi. Sản phẩm thu được có màu trắng mịn, lấy một ít chất rắn đem đi đo phổ 1H-NMR để xác định cấu trúc NPC-F127-NPC sau khi gắn với 3-amino-1-propanol.

2.2.1.3. Tổng hợp hệ copolymer Chitosan-Pluronic (CP)

Phương trình hóa học

Hình 2.3. Phương trình phản ứng tổng hợp copolymer chitosan-

pluronic F127 (CP-F127)

Cân 0,25g Chitosan hoà tan trong nước cất ở môi trường pH~3 được tạo ra bởi dung dịch HCl 0,1% và khuấy đều trong 24 giờ, điều chỉnh pH về 5,5 rồi đem lưu trữ ở nhiệt độ 4 °C cho phản ứng tiếp theo. NPC–F127–Amin 3,75g hoà tan trong nước cất ở nhiệt độ 4 °C, khuấy khoảng 1 giờ, rồi đem giữ ở nhiệt độ 4 °C trong 24 giờ. Dung dịch NPC- F127- Amin được cho vào dung dịch Chitosan lạnh và khuấy trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng và giữ lạnh ít nhất 24 giờ trước khi đem

23

thẩm tách với mang cellulose (12000-14000 MW). Thẩm tách trong nước cất diễn ra trong khoảng một tuần trước khi đem mẫu đi đông khô.

2.2.2. Tổng hợp hệ Chitosan-Pluronic mang Paclitaxel và Quercetin

2.2.2.1. Tổng hợp hệ copolymer Chitosan-Pluronic mang Quercetin

Hòa tan 200 mg CP vào 2 mL nước DI, khuấy từ trong khoảng 4h, ở nhiệt độ từ 4 °C-10 °C, đến khi mẫu tan hoàn toàn. 20 mg QU được hòa tan trong 10 mL dung môi Ethanol. Nhỏ từ từ từng mL dung môi Ethanol vào dung dịch CP đang khuấy từ cho đến khi mẫu được phân tán hoàn toàn, tạo thành dung dịch trong suốt. Nhỏ từ từ dung dịch QU vào dung dịch CP. Đánh siêu âm hỗn hợp QU và CP trong vòng 1 phút, để tạo thành dung dịch đồng nhất. Sau đó cô quay loại bỏ dung môi, thêm vào 10 mL nước DI để hòa tan lại mẫu. Sau đó ly tâm loại phần tủa lấy phần nước trong đem đông khô thu được sản phẩm là CP – QU 10% có dạng rắn, màu vàng nhạt.

2.2.2.2. Tổng hợp hệ copolymer Chitosan-Pluronic mang Paclitaxel

Hòa tan 200 mg CP-QU 10% vào 2 mL nước DI, khuấy từ ở nhiệt độ từ 4 °C-10 °C, đến khi mẫu tan hoàn toàn. 4 mg PTX được hòa tan trong 10 mL dung môi Ethanol. Nhỏ từ từ từng mL dung môi Ethanol vào dung dịch CP-QU 10% đang khuấy từ cho đến khi mẫu được phân tán hoàn toàn, tạo thành dung dịch trong suốt. Nhỏ từ từ dung dịch PTX vào dung dịch CP. Đánh siêu âm hỗn hợp PTX và CP trong vòng 1 phút, để tạo thành dung dịch đồng nhất. Sau đó cô quay loại bỏ dung môi, thêm vào 10 mL nước DI để hòa tan lại mẫu. Sau đó ly tâm loại phần tủa lấy phần nước trong đem đông khô, thu được sản phẩm là CP - QU 10% và PTX 2% có dạng rắn, màu vàng nhạt.

2.2.3. Xây dựng phương pháp thẩm định Paclitaxel

 Thiết bị: máy HPLC PERKIN ELMER gồm: Degasser, quaternary

pump, DAD detector.

 Bước sóng phân tích: 227 nm

 Thể tích tiêm mẫu: 20µL

 Pha tĩnh: cột InertSustain C18 (5µm),4,6 x 250 mm

24

 Pha động: kênh A: 0,1% phosphoric Acid, kênh B: Acetonitril, tốc độ

dòng: 1 mL/phút

Bảng 2.1. Chương trình dung môi chạy máy sắc ký HPLC

%B %A Thời gian (phút)

50 50 1

50 50 3

95 5 10

95 5 9

2.2.3.1. Chuẩn bị dung dịch chuẩn và dung dịch thử PTX

- Dung dịch chuẩn gốc 100 mg/L: Cân chính xác 1 mg mẫu PTX chuẩn, cho vào bình định mức 10 mL, thêm khoảng 3 mL dung môi methanol, lắc đều. Siêu âm trong 20 phút. Thêm dung môi methanol vừa đủ đến vạch, lắc đều để yên trong 5 phút.

- Mẫu thử 50 mg/L: Cân chính xác 0,5 mg mẫu chứa PTX, cho vào bình định mức 10 mL, thêm khoảng 3 mL dung môi methanol. Lắc đều, siêu âm 20 phút. Thêm Methanol vừa đủ đến vạch, lắc đều, để lắng 5 phút. Lọc qua màng lọc 0,45 µm.

- Mẫu chuẩn 50 mg/L: Hút 5 ml dung dịch chuẩn gốc 100 mg/L thêm vào bình định mức 10 mL, thêm dung môi methanol vừa đủ đến vạch, lắc đều, để yên trong 5 phút. Lọc dung dịch qua màng lọc 0,45 μm.

2.2.3.2. Khảo sát tính tương thích hệ thống

Cách tiến hành:

- Cân bằng cột sắt ký bằng pha động trong 60 phút.

- Tiến hành sắc ký mẫu chuẩn 50 mg/L, 6 lần liên tiếp

- Khảo sát các thông số: Diện tích peak, số đĩa lý thuyết N, hệ số không

đối xứng T.

25

- Tính độ lệch chuẩn tương đối (%RSD) của các thông số trên theo công

thức:

Trong đó:

- % RSD: độ lệch chuẩn tương đối, để biểu diễn sự sai lệch giữa các dữ

liệu

- SD: Độ lệch chuẩn, phản ánh độ phân tán của các dữ liệu

: giá trị trung bình

Yêu cầu:

- Độ lệch chuẩn tương đối % RSD của diện tích peak: ≤ 2,0 %

- Độ lệch chuẩn tương đối % RSD của thời gian lưu: ≤ 2,0 %

- Số đĩa lý thuyết của đỉnh chính N: ≥ 2000.

- Giá trị trung bình của Hệ số không đối xứng T: ≤ 2,5 (13)

2.2.3.3. Độ đặc hiệu

Cách tiến hành:

Chuẩn bị 3 mẫu dung dịch: mẫu trắng, mẫu thử, mẫu chuẩn:

- Mẫu trắng: Chuẩn bị 20 mL dung môi methanol. Lọc qua màng lọc 0,45

μm.

- Mẫu thử 5 mg/L: Hút 2 ml dung dịch thử 50 mg/L thêm vào bình định mức 20 mL, thêm dung môi methanol vừa đủ đến vạch, lắc đều, để yên trong 5 phút.

- Mẫu chuẩn 50 mg/L.

Sắc ký lần lượt 3 mẫu đã chuẩn bị tại cùng điều kiện sắc ký.

26

Yêu cầu:

- Sắc ký đồ mẫu trắng không cho peak ở trong khoảng thời gian lưu tương

ứng với thời gian lưu của chất chuẩn.

- Sắc ký đồ mẫu thử cho peak có thời gian lưu tương tự với peak của chất

chuẩn trong sắc ký đồ mẫu chuẩn.

- Trên sắc ký đồ mẫu thử, nếu có xuất hiện thêm các peak khác peak của

chất cần phân tích (peak tạp), thì các peak tạp này phải tách hoàn toàn với peak

của chất cần phân tích đồng thời đáp ứng các yêu cầu chung của phương pháp

sắc ký lỏng được quy định.

2.2.3.4. Khảo sát khoảng tuyến tính

Cách tiến hành: từ dung dịch chuẩn gốc S0 100 mg/L, pha tiếp 6 mẫu

dung dịch chuẩn ở các nồng độ từ 1 mg/L đến 50 mg/L:

Bảng 2.2. Mẫu dung dịch chuẩn để khảo sát tính tuyến tính của PTX

Cách pha

Nồng độ PTX

Dung dịch

(mg/L)

Thể tích cần định mức (mL)

S0 (mL)

chuẩn

1 1 0.1

5 0.5

2 3 10 1 10 4 20 2

5 40 4

6 50 5

Lọc 6 mẫu qua màng lọc 0,45 μm. Tiến hành sắc ký trên 6 mẫu dung dịch chuẩn và lập đường biểu diễn tương quan giữa diện tích và nồng độ chuẩn để xác định phương trình hồi quy.

Yêu cầu: Hệ số tương quan: R2 0,995

27

2.2.3.5. Giới hạn phát hiện – Giới hạn định lượng

Phương pháp xác định LOD, LOQ:

LOD có thể được xác định dựa vào độ dốc của đường chuẩn và độ lệch

chuẩn của tín hiệu đo, theo công thức sau:

Trong đó:

- LOD: nồng độ giới hạn phát hiện (mg/L)

- SD: Độ lệch chuẩn của tín hiệu

- a: độ dốc của đường chuẩn

Giá trị a có thể dễ dàng tính được từ đường chuẩn, giá trị SD được tính dựa trên độ lệch chuẩn của mẫu chuẩn ở nồng độ nhỏ gần LOD, lặp lại 6 lần.(13)

Tính giá trị LOQ theo công thức sau: (13)

Trong đó:

LOQ: nồng độ giới hạn định lượng (mg/L)

LOD: nồng độ giới hạn phát hiện (mg/L)

Cách tiến hành:

- Pha loãng mẫu chuẩn 50 mg/L đến 1 mg/L.

- Tiến hành sắc ký mẫu 6 mg/L với 6 lần song song, tại cùng điều kiện

sắc ký.

, độ lệch chuẩn SD, LOD, LOQ. (13) - Tính giá trị trung bình

2.2.3.6. Độ đúng

Phương pháp: Việc xác định độ đúng có thể được thực hiện thông qua xác định độ thu hồi của phương pháp. Bằng cách thêm chuẩn vào mẫu thử, phân

28

tích các mẫu thêm chuẩn, lặp lại tối thiểu ba lần bằng phương pháp khảo sát, tính độ thu hồi theo công thức sau: (13)

- Cm+c : Nồng độ chất phân tích trong mẫu thêm chuẩn Trong đó: (mg/L)

- Cm : Nồng độ chất phân tích trong mẫu thử (mg/L)

- Cc: Nồng độ chuẩn thêm (lý thuyết) (mg/L)

Cách tiến hành:

- Cân chính xác 0,25 mg mẫu PTX hòa tan trong methanol và định mức

trong bình định mức 100 mL thu được dung dịch mẫu thô (dung dịch A) có

nồng độ lý thuyết 2,5 mg/L.

- Cân chính xác lần lượt mẫu chuẩn 0,2 mg, 0,25 mg, 0,3 mg hòa tan

trong bình định mức 10 mL bằng methanol. Hút 1 mL lần lượt các dung dịch

chuẩn có nồng độ 20 mg/L, 25 mg/L và 30 mg/L, pha loãng trong bình định

mức 10 mL bằng dung dịch A, được các dung dịch với nồng độ của mẫu chuẩn

thay đổi 80 %, 100 % và 120 % so với mẫu thử.

- Tiến hành phân tích ở mỗi nồng độ trên với 3 lần liên tiếp tại cùng điều

kiện sắc ký. Tính hàm lượng của mẫu thử thêm chuẩn ở từng nồng độ, % độ

phục hồi (R%) ở từng nồng độ thêm vào, độ lệch chuẩn tương đối (% RSD).

Yêu cầu: Tỷ lệ phục hồi ở từng nồng độ và các mẫu ở mỗi nồng độ phải

đạt trong khoảng 90 – 107 %, % RSD ≤ 2,0 % (13)

2.2.3.7. Độ lặp lại

Độ lặp lại được khảo sát bằng cách tiến hành làm đo lặp lại 6 lần trên

cùng một mẫu.

Cách tiến hành :

29

- Chuẩn bị mẫu thử nồng độ 50 mg/L.

- Tiến hành định lượng mẫu 6 lần với điều kiện sắc ký đã được tối ưu

hóa. Kết quả đánh giá dựa trên độ lệch chuẩn tương đối % RSD của nồng độ.

Yêu cầu: % RSD ≤ 2,0 %

2.2.4. Đánh giá đặc tính cấu trúc của hệ copolymer

2.2.4.1. Đánh giá cấu trúc của hệ copolymer bằng phổ cộng hưởng từ

hạt nhân 1H-NMR

Để đánh giá các cấu trúc của NPC-Pluronic-NPC, NPC-Pluronic-OH, và CP ta dùng phương pháp đo cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR để chứng minh việc tổng hợp đã thành công. Polymer được hòa tan trong dung môi Deutereted Cloroform (CDCl) hoặc nước D2O sau đó đo phổ proton 1H-NMR bằng máy phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Bruker Advance 500MHz) tại Viện Hóa Học- Viện Hàn Lâm Khoa Học Và Công Nghệ Việt Nam với chất chuẩn là tetramethyl silane (TMS) có độ dịch chuyển δ (ppm) bằng 0. Dựa vào độ dịch chuyển hóa học của các proton trên phổ đồ để nhận biết sự có mặt của các nhóm chức khác nhau.

2.2.4.2. Đánh giá cấu trúc của hệ copolymer bằng phổ hồng ngoại (IR)

Để đánh giá các cấu trúc của NPC-Pluronic-NPC, NPC-Pluronic-OH, và CP ta dùng phương pháp phân tích phổ hồng ngoại (IR) để chứng việc tổng hợp đã thành công.

Cân 0,01 mg mẫu cần phân tích lần lượt là NPC-Pluronic-NPC, NPC- Pluronic-OH, và CP trộn đều với 1mg KBr ép thành màng mỏng, mẫu được đo ở bước sóng 4000 – 400 cm-1, ghi nhận kết quả phổ.

2.2.4.3. Đánh giá kích thước của hệ copolymer

* Phương pháp tán xạ ánh sáng động học (DLS)

Kích thước hạt được xác định bằng phương pháp tán xạ ánh sáng động học đo bởi máy HORIBA SZ-100 tại Viện Khoa Học Vật Liệu Ứng Dụng- Viện Hàn Lâm Khoa Học Và Công Nghệ Việt Nam.

30

Các mẫu được hòa tan trong nước DI với nồng độ 100 ppm ở nhiệt độ khoảng 15 oC, dùng phương pháp đánh sóng siêu âm để phân tán hoàn toàn mẫu trong nước, lọc lại mẫu để loại bỏ phần thuốc tự do. Tiến hành đo kích thước hạt các mẫu bằng máy HORIBA SZ-100 ở 25 °C.

* Sử dụng kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM)

Kính hiển vi điển tử truyền qua sử dụng chùm điện tử có năng lượng cao chiếu xuyên qua mẫu vật rắn mỏng và sử dụng các thấu kính từ để tạo ảnh với độ phóng đại lớn (có thể tới hàng triệu lần), ảnh có thể tạo ra trên màn huỳnh quang, hay trên film quang học, hay ghi nhận bằng các máy chụp kỹ thuật số. Chính vì tính chất chiếu xuyên vào vật liệu mà kích thước, sự tách rời và sự phân bố của PTX-QU được bọc trong gel có thể được đánh giá. Hình TEM được đánh giá dựa vào độ phóng đại (scale) trên hình chụp TEM để ước tính kích thước mẫu có đạt kích thước nano hay không.

Hình dạng và kích thước hạt nano được hiển thị rõ ràng hơn thông qua hình ảnh phóng đại gấp nhiều lần trong hình ảnh TEM của kính hiển vi điện tử truyền qua( JEM-1400 JEOL) tại Trường Đại Học Bách Khoa- TP. Hồ Chí Minh.

Các mẫu cũng được chuẩn bị cùng điều kiện như phương pháp tán xạ ánh sáng động học nêu trên. 1 µL dung dịch mẫu trong nước DI nồng độ 100 ppm được nhỏ giọt trên khung lưới và để khô tự nhiên ở 25 °C trong khoảng 6- 7 phút trước khi đặt khung lưới này vào dung dịch uranyl acetate 1% w/w, lắc nhẹ. Tiến hành đo mẫu bằng máy TEM( JEM-1400 JEOL) ở 25 °C.

2.2.5. Đánh giá khả năng mang và phóng thích thuốc của hệ

copolymer CP

2.2.5.1. Khả năng mang và phóng thích thuốc PTX của hệ copolymer

 Xác định khả năng mang PTX

Hàm lượng PTX chứa trong hệ nano được xác định bằng phương pháp HPLC với bước sóng hấp thu lớn nhất ở 227 nm. Mẫu CP mang PTX được hòa tan với methanol với nồng độ 100 ppm đánh siêu âm 10 phút và lọc qua màng

31

0,45 µm. Mẫu được tiêm trực tiếp vào máy HPLC với chương trình chạy của mục 2.2.3 nhằm xác định hàm lượng PTX có trong mẫu.

 Khảo sát khả năng giữ thuốc PTX của hệ CP trong môi trường đệm

Việc khảo sát khả năng phóng thích thuốc PTX ở tỷ lệ 2% trong hệ

copolymer CP được thực hiện bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao.

Xác định nồng độ Paclitaxel nhả ra từ hệ copolymer CP, trong môi trường PBS (phosphate-buffered saline) pH bằng 7,4 chuẩn bị 1 mL mẫu hệ copolymer CP ở 6000 ppm trong đó nồng độ PTX trong mẫu 120 ppm.

𝑡−1 𝑖=1

Sau đó cho vào màng thẩm tách 3,5 kDa, thẩm tách trong 10 mL dung dịch PBS, ở điều kiện 37 °C và khuấy từ 50 vòng/phút. Sau mỗi khoảng thời gian khác nhau 0h, 0,5h, 3h, 6h, 24h; 48h hút ra 2 mL dung dịch PBS có chứa PTX đã được phóng thích, sau đó cho vào 2 mL PBS mới vào bình thẩm tách để đảm bảo thể tích dung dịch không bị thay đổi. Lượng PTX phóng thích ra được tính theo công thức:

Q = CtV + Vi∑ 𝐶𝑖

Trong đó:

- Q : Lượng PTX được nhả ra từ nanogel

- Ct : Nồng độ ở thời điểm thứ t

- V : Tổng Thể tích của đệm PBS

- Vi : Thể tích PBS được thay thế

- Ci : Nồng độ PTX nhả ra tại thời điểm i

2.2.5.2. Khả năng mang và phóng thích thuốc QU của hệ copolymer

 Xác định khả năng mang QU

Hàm lượng quercetin chứa trong hệ nano được xác định bằng phương pháp quang phổ tử ngoại UV- Vis (Agilent 8453 UV-Vis Spectrophotometer) với bước sóng hấp thu lớn nhất ở 374 nm. Quercetin tinh khiết được hòa tan trong ethenol : D2O (1:1) với các nồng độ 0-5 ppm để dựng đường chuẩn, mẫu được cho vào cuvet, đặt cuvet vào máy Agilent 8453 UV-Vis

32

Spectrophotometer và tiến hành đo mẫu. Kết quả khảo sát độ tuyến tính của QU được trình bày ở bảng 2.3.

Bảng 2.3. Kết quả khảo sát độ tuyến tính của QU

Dung dịch chuẩn Nồng độ (mg/L) Độ hấp thụ (Abs)

1 0 0

2 0,5 0,035

3 1,0 0,076

4 1,5 0,114

5 3,0 0,226

6 5,0 0,380

Phương trình hồi quy y = 0,07602x – 8.14927.10-4

Hệ số tương quan R² = 0.9999

Hình 2.4. Đồ thị biểu diễn tỉ lệ giữa nồng độ QU và độ hấp thụ

 Khảo sát khả năng giữ thuốc QU của hệ CP trong môi trường đệm

Xác định nồng độ QU nhả ra từ hệ copolymer CP trong môi trường PBS (phosphate-buffered saline), pH bằng 7,4 chuẩn bị 1 mL mẫu hệ copolymer CP ở nồng độ 2000 ppm chứa 200 ppm QU, sau đó cho vào màng thẩm tách 3,5

33

𝑛−1

kDa, thẩm tách trong 10 mL dung dịch PBS, ở điều kiện 37 oC và khuấy từ 50 vòng/phút, mỗi mẫu lặp lại 3 lần để đảm bảo độ tin cậy. Sau mỗi khoảng thời gian khác nhau 0h, 0,5h, 3h, 6h, 24h; 48h hút ra 2 mL dung dịch PBS có chứa QU đã được phóng thích, sau đó cho vào 2 mL PBS mới vào bình thẩm tách để đảm bảo thể tích dung dịch không bị thay đổi. Lượng QU phóng thích ra được tính theo công thức:

𝑖=1

𝑄 = 𝐶𝑛𝑉𝑠 + 𝑉𝑡 ∑ 𝐶𝑛−1

Trong đó:

- Q: lượng QU được giải phóng từ nanogel lũy tuyến

- Cn: nồng độ ở thời điểm t.

- Vs: thể tích của PBS

- Vt: thể tích mẫu.

𝑛−1 𝑖=1

∑ : nồng độ của QU được giải phóng theo thời gian i. 𝐶𝑛−1

34

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. KẾT QUẢ TỔNG HỢP HỆ COPOLYMER CHITOSAN - PLURONIC

3.1.1. Kết quả tổng hợp NPC-F127-NPC

3.1.1.1. Công thức cấu tạo NPC-F127-NPC

Hình 3.1. Công thức cấu tạo NPC-F127-NPC

3.1.1.2. Kết quả phổ hồng ngoại (IR) của NPC-F127-NPC

Hình 3.2. Phổ IR của NPC-F127-NPC

Dựa vào phổ IR của NPC-F127-NPC ta thấy có các tín hiệu đặc trưng

như sau:

Các tín hiệu peak tại vị trí 2884 cm-1, 1526 cm-1, 1112 cm-1 lần lượt thể hiện sự liên kết của các nhóm CH2, C=O và C-O điều này chứng tỏ sự hiện diện của Pluronic có trong mẫu. Bên cạnh đó, tín hiệu peak tại 1769 cm-1 chứng tỏ có sự có mặt của nhóm (-NO2) đặc trưng cho NPC.

35

3.1.1.3. Kết quả phổ 1H NMR của NPC-F127-NPC

Hình 3.3. Phổ 1H-NMR của NPC-F127-NPC

Đối với sản phẩm hoạt hóa NPC của Pluronic, phổ cộng hưởng từ hạt

nhân xuất hiện các tính hiệu đặc trưng như sau:

Một mũi đơn ở vị trí 1,08 ppm chứng tỏ sự có mặt của proton H trên dây

PPO ở vị trí liên kể với nhóm (-CH3).

Một mũi đơn ở vị trí 3,62 ppm chứng tỏ sự có mặt của proton H trên dây

PPO ở vị trí liên kết với nhóm (-CH2-CH2-).

Đặc biệt là tín hiệu ở vị trí 4,42 ppm chứng tỏ sự có mặt của proton H trên dây PEO ở vị trí liên kết với nhóm (-CH2-O-NPC). Tín hiệu này chỉ xuất hiện khi Pluronic được hoạt hóa.

Ngoài ra còn có hai tín hiệu ở hai mũi vị trí 7,38 ppm và 8,22 ppm chứng tỏ sự có mặt của proton H trên NPC ở vị trí liên kết với nhóm (-CH) trên vòng benzene.

Kết quả tổng hợp NPC-F127-NPC [29].

Công thức tính hiệu suất chất đã hoạt hóa, ta dựa vào phổ 1H-NMR như

sau:

36

Trong đó:

X%: Hiệu suất chất đã hoạt hóa

SH(a), SH(b): Lần lượt là diện tích tích phân của pic a và b

: Tổng số proton của nhóm –CH3 trên dây PPO của F127

: Tổng số proton của nhóm –CH trên vòng benzen của NPC

Hiệu suất : x%= ×100 = 97%

Kết luận: Đã gắn thành công NPC vào hai đầu F127 với hiệu suất hoạt

hóa 97%.

3.1.2. Kết quả tổng hợp NPC-F127-Ami

3.1.2.1. Công thức cấu tạo NPC-F127-Ami

Hình 3.4. Công thức cấu tạo NPC-F127-Ami

37

3.1.2.2. Kết quả phổ 1H-NMR của NPC-F127-Ami

Hình 3.5. Phổ 1H-NMR của NPC-F127-ami

Để ngăn sự hình thành F127 – dimer do nhóm NPC rất dễ dàng bị thay thế, 1 lượng dư 3-amino-1-propanol được sử dụng để khóa một đầu NPC trên mạch của Pluronic đã được hoạt hóa.

Phổ 1H-NMR cho thấy việc khoá nhóm NPC trên Pluronic rất thành công. Đối với sản phẩm thế một phần 3-amino-1-propanol của F127 hoạt hóa NPC, ngoài những peak cộng hưởng đặc trưng cho các proton trên NPC-F127- NPC thì ta còn thấy có tín hiệu peak cộng hưởng ở vị trí 4,42 ppm thể hiện proton H trên dây PEO ở vị trí liên kết với nhóm (-CH2-O-NPC) chuyển một phần đáng kể về vùng 4,2 ppm do sự thay thế NPC bằng 3-amino-1-propanol. Độ thế 3-amino-1-propanol càng cao, tín hiệu ở 4,42 ppm sẽ càng tăng cường độ. Chứng tỏ 1 đầu NPC được thay thế bởi 3-amino-1-propanol.

38

3.1.3. Kết quả tổng hợp hệ copolymer Pluronic F127 đã hoạt hóa

với Chitosan

3.1.3.1. Công thức cấu tạo Chitosan- Pluronic F127

Hình 3.6. Công thức cấu tạo Chitosan- Pluronic F127

3.1.3.2. Kết quả phổ hồng ngoại (IR) của Chitosan- Pluronic F127

Hình 3.7. Phổ IR của Chitosan-Pluronic F127

39

So sánh với kết quả phổ IR của NPC-F127-NPC và NPC-F127-Ami, tín hiệu hoạt hoá của F127 không còn xuất hiện. Bên cạnh đó tín hiệu đặc trưng của pluronic F127, sự xuất hiện dao động dãn của (-NH(C=O)-C-O-) trên mạch chitosan (1635 cm-1) củng cố thêm bằng chứng cho sự hình thành của amine bậc 2.

3.1.3.3. Kết quả phổ 1H-NMR của Chitosan- Pluronic F127

Hình 3.8. Phổ 1H-NMR của Chitosan-Pluronic F127

Việc tổng hợp hydrogel Chitosan-Pluronic thông qua liên kết là p-NPC đã thành công tạo ra liên kết cộng hoá trị amine trong Chitosan-Pluronic copolyme. Kết quả thể hiện trong hình 3.8 xác nhận sự thành công của việc ghép 2 polyme, bên cạnh sự triệt tiêu các tín hiệu peak của p-NPC (δ ~ 7,4 và 8,3 ppm), phổ còn cho thấy tín hiệu proton nhóm methyl của mạch chitosan (peak g) và tín hiệu proton của F127 (peak a). Ngoài ra, sự xuất hiện peak f tại (δ ~ 2,90-2,92), đại diện cho sự có mặt của proton nhóm methylene trên mạch carbon liên kết trực tiếp với nhóm amine tham gia vào phản ứng liên kết gắn F127 lên mạch sườn chitosan.

40

3.2. XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP THẨM ĐỊNH PALITACXEL

3.2.1. Khảo sát tính tương thích hệ thống

Bảng 3.1. Tính tương thích của hệ thống HPLC đối với mẫu PTX

Thời

Số đĩa lý thuyết

Hệ số không đối

Diện tích peak

Mẫu

gian lưu

(N)

xứng (T)

1

11,322

3568067

31218

0,01400

2

11,323

3561426

31221

0,01401

3

11,321

3574900

31215

0,01401

4

11,324

3568518

31224

0,01403

5

11,320

3571354

31212

0,01406

6

11,325

3575609

31227

0,01404

TB

11,323

3569979

31220

0,01400

SD

0,002

5,229

%RSD

0,02

0,15

- % RSD 6 lần tiêm lặp lại của thời gian lưu: 0,02% < 2% - % RSD 6 lần tiêm lặp lại của diện tích peak: 0,14% < 2% - Giá trị trung bình của số đĩa lý thuyết của đỉnh chính: 31220 > 2000 - Giá trị trung bình của Hệ số không đối xứng T: 0,014 < 2,5 Kết luận: Phương pháp đạt tính tương thích hệ thống.

3.2.2. Độ đặc hiệu

Khảo sát 3 mẫu bao gồm: Mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu thử.

Nhận xét:

- Các peak PTX của mẫu chuẩn và mẫu thử có hình dạng đối xứng

- Sắc ký đồ mẫu trắng không cho peak ở trong khoảng thời gian lưu tương

ứng với thời gian lưu của mẫu chuẩn và mẫu thử.

- Sắc ký đồ mẫu thử cho peak PTX có thời gian lưu tương tự với peak

của PTX trong sắc ký đồ mẫu chuẩn.

41

- Trên sắc ký đồ mẫu thử có xuất hiện thêm peak khác, peak này tách hoàn toàn với peak của PTX và đáp ứng các yêu cầu chung của phương pháp sắc ký lỏng.

Kết luận: Phương pháp đạt độ đặc hiệu

Hình 3.9. Sắc ký đồ ghép thể hiện độ đặc hiệu của 3 mẫu: mẫu trắng,

mẫu chuẩn và mẫu thử

3.2.3. Khảo sát khoảng tuyến tính

Tiến hành kháo sát độ tuyến tính giữa nồng chất cần định lượng với diện tích peak tương ứng trên chất chuẩn PTX. Chuẩn bị một dãy nồng độ dung dịch chuẩn biến thiên trong khoảng 1-50 mg/L. Kết quả khảo sát nồng độ tuyến tính được trình bày ở bảng 3.3.

Nhận xét:

Kết quả phân tích cho thấy diện tích peak và nồng độ PTX phụ thuộc tuyến tính với nhau chặt chẽ, thể hiện hệ số tương quan: R2 = 0,9997, khoảng nồng độ tuyến tính từ 1-50 mg/l. Do đó có thể sử dụng phương pháp đường chuẩn để định lượng PTX trong mẫu thật.

42

Bảng 3.2. Kết quả khảo sát độ tuyến tính

Dung dịch chuẩn Nồng độ (mg/L) Diện tích peak

1 1 74216

2 5 338795

3 10 696232

4 20 1394440

5 40 2720183

6 50 3568067

Phương trình hồi quy y = 70912x - 13247

Hệ số tương quan R² = 0,9997

Hình 3.10. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và

diện tích peak tương ứng của chất chuẩn PTX

43

Hình 3.11. Sắc ký đồ ghép của các mẫu lập đường chuẩn

3.2.4. Giới hạn phát hiện – Giới hạn định lượng

Bảng 3.3. Kết quả giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng

Diện tích peak Số liệu thông kế Mẫu thử

1 469664 n = 6

2 474628

3 473918

4 477464

5 471791

SD = 3257,32 LOD = 0.,5 mg/l LOQ = 0,50 mg/l 6 478173

Kết luận:

- Giới hạn phát hiện LOD: 0,15 mg/L

- Giới hạn định lượng LOQ: 0,50 mg/L

44

3.2.5. Độ đúng

Khảo sát độ đúng bằng phương pháp thêm mẫu thử đã biết trước hàm lượng một lượng chính xác chất chuẩn tương ứng với 80%, 100%, 120% mẫu thử. Kết quả khảo sát được trình bày ở bảng 3.4.

Bảng 3.4. Kết quả khảo sát độ đúng

Hiệu suất

Nồng độ

Diện tích

Nồng độ xác

thu hồi

TB %RSD

thêm vào

Mẫu

peak

định (mg/L)

Mẫu thử 170457 2,50

(R%)

(mg/L)

267394,52 4,45 94,00 2,10

266860,80 4,30 93,20 1,49 94,00 1,95

Mẫu thử thêm chuẩn 80% 266614.00 4,19 91,60 1,90

358484,20 5,19 103,60 2,60

373440,30 5,40 104,00 102,90 1,47 2,80

Mẫu thử thêm chuẩn 100% 347044,83 5,03 101,20 2,50

390481,60 5,64 101,60 3,10

441844,90 6,38 103,20 101,60 1,57 3,80

Mẫu thử thêm chuẩn 120% 387324,10 5,60 100 3,10

Kết luận: Các nồng độ khảo sát đều có thu hồi nằm trong khoảng 90 – 107%, %RSD ở 3 mẫu đều nhỏ hơn 2%. Phương pháp phân tích đạt yêu cầu về độ đúng.

3.2.6. Độ lặp lại

Một phương pháp phân tích có độ tin cậy cao, ngoài yêu cầu vể độ đún người ta còn chú ý đến độ lặp lại giữa các lần đo khi cùng một điều kiện phân tích.

Độ lặp lại của phương pháp được tiến hành trên mẫu chuẩn PTX nồng

độ 30 mg/L.

Kết quả khảo sát được trình bày ở bảng 3.5.

45

Bảng 3.5. Kết quả khảo sát độ lặp lại

Mẫu thử Diện tích peak Nồng độ (mg/l) Số liệu thông kê

1 2147845 30,47

2 2149993 30,50 n = 6

3 2145700 30,44

4 2152141 30,53

SD = 0,06 %RSD = 0,19 5 2143558 30,41

6 2154289 30,56

Kết luận:

Với độ lệch chuẩn tương đối %RSD của nồng độ là 0,19% nhỏ hơn 2,0%.

Qua kết quả khảo sát, ta thấy dao động giữa các kết quả thử nghiệm có độ lặp lại cao. Phương pháp phân tích ổn định, ít bị ảnh hưởng bởi sai số hệ thống và sai số ngẫu nhiên. Do đó, quy trình có thế áp dụng để phân tích mẫu trong kiểm nghiệm.

3.3. KẾT QUẢ CỦA CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ CẤU TRÚC CỦA HỆ COPOLYMER

3.3.1. Kết quả của phương pháp đo TEM, DLS của hệ copolymer

mang PTX và QU

Kết quả chụp TEM cho thấy hình dạng, kích thước các hạt nanogel thông qua kính điện tử truyền qua TEM thường nhỏ hơn phép đo DLS là do trong phép đo DLS mẫu được hòa tan trong nước nên các hạt nanogel bị phủ một lớp hydrate [8], còn trong ảnh TEM thì các hạt nanogel làm đã được làm khô tự nhiên. Cho nên ta thấy trong hình TEM có thể quan sát tháy rõ các hạt có dạng hình cầu và đường đường kính trung bình thể hiện trong ảnh TEM là 90,1± 6,4 nm.

46

Hình 3.12. Hình chụp TEM và đo DLS của hệ copolymer sau khi nang D hóa thuốc PTX và QU

3.3.2. Kết quả thế zeta của hệ copolymer trước và sau khi mang

-

41,8mV

thuốc PTX và QU

B

Hình 3.13. Kết quả thế zeta hệ copolymer trước (A) và sau (B) khi

mang thuốc PTX và QU

Thế zeta được xác định bằng cách quan sát chuyển động của các hạt nano trong trường điện thế. Đối với những hạt có kích thước nano thì giá trị của điện thế zeta cao lực đẩy sẽ kìm hãm lực hút làm cho chất phân tán khó liên kết lại

47

với nhau và ngược lại. Giá trị điện thế zeta chỉ ra mức độ lực đẩy giữa các phân tử có cùng điện tích hay giữa các phân tử tiếp nối nhau.

Thế zeta là hiệu điện thế xuất hiện trong lớp điện kép ở ranh giới giữa pha rắn và pha lỏng, tức điện thế trên bề mặt của các hạt nanogel trong nước. So sánh kết quả thế zeta của của các hệ nanogel trước và sau khi nang hóa thuốc nhận thấy rằng các hệ nanogel khi chưa mang thuốc thế zeta có giá trị dương rất cao 59,3 mV vì trong hệ có gắn Chitosan mang tính dương điện. Sau khi nang hóa thuốc thế zeta các mẫu đều giảm xuống -41,8 mV, điều này có thể được giải thích do các thuốc có tính âm điện (PTX;QU) đã được gắn kết với Chitosan bằng một lực hút tĩnh điện, xảy ra sự trung hòa điện làm tính dương điện trên Chitosan bị giảm và thế zeta của hệ nanogel giảm xuống.

3.4. KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG NANG HÓA VÀ PHÓNG THÍCH THUỐC CỦA HỆ COPOLYMER CP

3.4.1. Kết quả đánh giá khả năng nang hóa PTX và QU

a) Kết quả nang hóa QU

Để tăng hiệu quả ứng dụng của QU, hoạt chất được điều chế dưới dạng

nano trong môi trường chất hoạt động bề mặt CP là một copolymer ghép nhạy

nhiệt (do đặc tính của pluronic F127). Việc kết hợp QU phân tán trong hệ sẽ

cải thiện tính kỵ nước của QU và tạo ra hiệu quả cộng hợp của 2 vật liệu.

Hợp chất copolymer CP có màu trắng trong và hệ nanogel CP-QU 10%

này cũng có màu vàng đặc trưng rất dễ dàng xác định được nồng độ bằng

phương pháp UV-vis với hệ dung môi ethanol:nước cất (1:1) tại bước sóng 374

nm.

Hàm lượng QU nang hóa trong các chất mang nano (EE% và DL%) được

xác định gián tiếp thông qua kết quả đo UV-vis và công thức sau, trong đó

Wtotal-QU là lượng thuốc QU ban đầu và lượng QU được nang hóa trong chất

mang nano là WQU .

48

%𝐸𝐸 = × 100% 𝑊 𝑄𝑈 𝑊𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑄𝑈

%𝐷𝐿 = × 100% 𝑊 𝑄𝑈 𝑊𝑄𝑈 + 𝑊𝐶𝑃

Kết quả thực nghiệm cho thấy, đối với hệ nanogel mang QU, hiệu suất mang thuốc %EE đạt 91,8%, lượng QU có trong hệ nanogel là DL là 8,35%

b) Kết quả nang hóa PTX

%𝐸𝐸= (𝐿ượ𝑛𝑔 𝑃𝑇𝑋 đượ𝑐 𝑔𝑖ữ 𝑙ạ𝑖 𝑡𝑟𝑜𝑛𝑔 𝑣ậ𝑡 𝑙𝑖ệ𝑢 𝐶𝑃 chia cho 𝑇ổ𝑛𝑔

𝑙ượ𝑛𝑔 𝑃𝑇𝑋 đ𝑒𝑚 đ𝑖 𝑛𝑎𝑛𝑔 ℎó𝑎) × 100%

%𝐷𝐿= (𝐿ượ𝑛𝑔 𝑃𝑇𝑋 đượ𝑐 𝑔𝑖ữ 𝑙ạ𝑖 𝑡𝑟𝑜𝑛𝑔 𝑣ậ𝑡 𝑙𝑖ệ𝑢 𝐶𝑃 chia cho 𝑇ổ𝑛𝑔

𝑙ượ𝑛𝑔 𝑚ẫ𝑢 )×100%

Kết quả thực nghiệm cho thấy, đối với hệ nanogel mang PTX, hiệu suất mang thuốc %EE đạt 92.99%, lượng PTX có trong hệ nanogel là DL là 1.82%

3.4.2. Kết quả tốc độ giải phóng thuốc PTX và QU

a) Kết quả tốc độ giải phóng thuốc PTX của hệ copolymer CP (1:15)

Nồng độ thuốc trong mỗi khoảng thời gian xác định bằng phương pháp HPLC với ACN:H2O = 95% : 5% là pha động. Nhiệt độ cột duy trì ở 45 °C. Tính toán nồng độ thuốc giải phóng ra dựa trên đường chuẩn PTX đã được xây dựng trong phần thẩm định phương pháp PTX.

Tốc độ giải phóng thuốc từ hệ copolymer CP (1:15) được thực hiện túi thẩm tách trong dung dịch đệm PBS (pH=7,4). Hình 3.14 biểu đồ cho thấy hệ mẫu có thể giải phóng thuốc từ từ trong khoảng thời gian 24h. Sau 3h, chỉ có 2,545 ± 0,07% lượng Paclitaxel được giải phóng từ hệ mẫu.Từ 4h-10h và từ 12h-24h lượng thuốc được giải phóng với tốc độ không đổi. Điều này cho thấy hệ copolymer CP (1:15) sau khi nang hóa PTX có pha ổn định trong hệ đệm PBS (pH=7,4).

49

Hình 3.14. Biểu đồ tốc độ giải phóng thuốc PTX từ hệ copolymer CP

(1:15) trong PBS (pH=7,4)

b) Kết quả tốc độ giải phóng thuốc QU của hệ copolymer CP (1:15)

Trên hình 3.15 biểu đồ thể hiện khả năng giải phóng QU từ hệ copolymer CP (1:15) và QU tự do. Sau 12 h khảo sát khả năng phóng thích QU tỷ lệ phóng thích thuốc QU tự do là 100%. Trong khi đó mẫu hệ copolymer CP (1:15) khảo sát cùng thời gian thì hiện tốc độ chậm hơn rất nhiều so với mẫu QU tự do. Hình 3.15 là biểu đồ thể hiện tốc độ giải phóng hệ copolymer CP (1:15) mang QU, qua kết quả thu được ta thấy mẫu hệ copolymer CP (1:15) có tố độ chậm. Điều này được lý giải như sau, vật liệu hệ copolymer CP (1:15) được kết hợp từ Poloxamer P407 (F127) và chitosan. Pluronic F127 được sử dụng và nghiên cứu nhiều nhất trong các loại poloxamer trên thị trường, với nồng độ 20% w /w trong nước, có thể chuyển dung dịch thành dạng gel trong bằng cách làm ấm hệ gel từ nhiệt độ phòng (25 °C) đến nhiệt độ cơ thể (gần 37 °C). Tính năng phản ứng nhiệt này đã làm cho nó hấp dẫn đối với một số ứng dụng bao gồm công thức dược phẩm tiêm và thuốc bôi, trong đó nguyên liệu có thể chảy qua

50

một dụng cụ hoặc ống tiêm trước khi tạo gel khi tiếp xúc với cơ thể (35-37 °C). Bởi vì tính tương thích sinh học và không độc hại của chúng đã được sử dụng rộng rãi trong ứng dụng y sinh. Còn về chitosan trong cấu trúc hệ copolymer CP (1:15) là chất biopolymer thường thu được từ vỏ ngoài của giáp xác. Để sản xuất chitosan, chitin được sử dụng sau khi chiết xuất và khử acetyl. Chitosan thể hiện điện tích dương và do đó thu hút các mô và bề mặt mang điện tích âm. Dung dịch nước chitosan đậm đặc dẫn đến sự hình thành gel. Việc kết hợp giữa F127 và chitosan đã tạo ra vật liệu hydrogel nhạy cảm nhiệt độ cùng khả năng trương nở phụ thuộc vào pH môi trường do đặc tính của CS, hệ gel hệ copolymer CP (1:15) mang điện tích dương. Khi chúng mang hóa QU, với bản chất là một hoạt chất chống oxi hóa mang điện tích âm, nên sự tương tác giữa hệ CS-F127 với QU sẽ mạnh, bởi ở đây xảy ra đồng thời tương tác tĩnh điện của khung sườn chitosan và tương tác kỵ nước của các phân tử F127.

Hình 3.15. Biểu đồ tốc độ giải phóng thuốc QU từ hệ copolymer CP

(1:15) trong PBS (pH=7,4)

51

CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

4.1. KẾT LUẬN:

Đề tài với nội dung là “Tổng hợp dẫn xuất chitosan-pluronic và khảo sát ảnh hưởng của dung dịch đệm lên hiệu quả dẫn truyền Paclitaxel và Quercetin” Sau thời gian thực hiện đã thu được các kết quả như sau :

4.1.1. Tổng hợp dẫn xuất chitosan-pluronic

- Tổng hợp thành công dẫn xuất chitosan-pluronic, cấu trúc vật liệu được

đánh giá qua phổ 1H-NMR, IR

- Điều chế thành công hệ nanogel CP nang hóa PTX 2% và QU 10%

- Vật liệu có khả năng giữ hoạt chất ổn định trong môi trường đệm.

4.1.2. Xây dựng phương pháp xác định PTX bằng HPLC

- Xây dựng phương pháp xác định và đánh giá hàm lượng PTX trong mẫu CP bằng máy sắc ký lỏng hiệu năng cao. Phương pháp đã đạt những thông số sau:

- Tính tương thích của hệ thống: các thông số độ lặp lại của thời gian lưu, diện tích peak, số đĩa lý thuyết và hệ số bất đối xứng T đều đạt điều kiện để phân tích định lượng.

- Phương pháp có tính đặc hiệu đối với PTX.

- Ước lượng giới hạn định lượng của phương pháp là 0,5 mg/L và phương

pháp có thể phát hiện được PTX với hàm lượng lớn hơn 0,15 mg/L.

- Khoảng tuyến tính của phương pháp nằm trong khoảng 1-50 mg/L. Phương trình hồi quy dạng y = 70912x – 13247 với hệ số tương quan R2 = 0,9997

- Độ đúng của phương pháp được khảo sát dựa vào giá trị độ thu hồi của mẫu thử được thêm chuẩn ở các khoảng hàm lượng 2; 2,5; 3 mg/L. Kết quả cho thấy ở ba khoảng nồng độ thêm vào cho hiệu suất thu hồi dao động từ 93,2– 102,9%.

52

- Độ lặp lại của phương pháp được xác định dựa vào giá trị độ lặp lại của kết qua đo mẫu thêm chuẩn, kết quả cho thấy tính lặp rất cao của phương pháp với giá trị độ lệch chuẩn tương đối %RSD là 0,19%.

4.2. KIẾN NGHỊ:

- Đề tài này đã dừng lại ở mức độ khảo sát mang và nhả thuốc in-vitro. Tuy vậy, đề tài đã góp phần cho thấy tính tiềm năng của copolymer CP-F127 mang PTX và QU trong lĩnh vực y học. Để đưa nghiên cứu này vào cuộc sống, đề tài cần được nghiên cứu sâu và rộng hơn như:

- Khảo sát khả năng mang và nhả thuốc của vật liệu trên các loại thuốc

khác nhau, để có đánh giá tổng quan về vật liệu.

- Khảo sát in-vivo, chứng minh khả năng tương hợp sinh học với cơ thể,

góp phần quan trọng trong việc điều trị các căn bệnh hiện nay.

- Khảo sát thời gian giải phóng thuốc của vật liệu trong dung dịch đệm pH=5.5 nhằm đánh giá hiệu quả giải phóng thuốc của vật liệu trong môi trường sinh lý tế bào ung thư.

- Xây dựng phương pháp thẩm định PTX bằng UV-vis nhằm tối ưu hóa

thời gian, chi phí trong việc định lượng PTX trong vật liệu nano mang PTX.

53

TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] Cao Văn Dư và các cộng sự (2013), Nghiên cứu tổng hợp và điều chỉnh kích thước hạt nano đồng trong hệ glycerin/PVP, Tạp chí Hóa học, 51(2), tr.745-749

[2] Morimoto N and et al. (2006), Nanogel Engineered Designs for Polymeric Drug Delivery, Polymeric Drug Delivery Volume II - Polymeric Matrices and Drug Particle Engineering ACS Symposium Series 924. American Chemical Society pp.88-101.

[3] Frank Alexis and et al. (2010), Nanoparticle technologies for cancer therapy, Drug delivery, Handbook of Experimental Pharmacology, p.55-86

[4] Peer, D., Kar, J., Hong, S., Farokhzad, O., Margalit, L.R.(2007). Nanocarriers as an emerging platform for cancer therapy. Nature. 2: 751-760

[5] Escobar-Chávez J. J, López-Cervantes M, Naïk A, Kalia Y. N, QuintanarGuerrero D, Ganem-Quintanar A (2006), Applications of thermo- reversiblePluronic F-127 gels in pharmaceutical formulations, J Pharm Pharmaceut Sci. pp. 339-348

[6] Nhat-Anh N. Tong and et al. (2016), Aquated Cisplatin and Heparin- Pluronic Nanocomplexes Exhibiting Sustainable Release of Active Platinum Compound and NCI-H460 Lung Cancer Cell Anti-proliferation, Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition, 27(8), p.709-720

[7] Nguyễn Hữu Đình, Trần Thị Đà (1999), Ứng dụng một số phương pháp phổ nghiên cứu cấu trúc phân tử, NXB Giáo Dục.

[8] Ming Yan and et al. (2007), Fabrication of Single Carbonic Anhydrase Nanogel against Denaturation and Aggregation at High Temperature, Biomacromolecules, 8(2), p.560-565.

[9] Baba A. I. and Câtoi C. (2007), "Tumor cell morphology", The Publishing House of the Romanian Academy,

[10] Cooper G. M. and Hausman R. (2000), "A molecular approach", The Cell. 2nd ed. Sunderland, MA: Sinauer Associates,

54

[11] IARC (2018), "All Cancers", http://gco.iarc.fr/today/data/factsheets/cancers/39-All-cancers-fact-sheet.pdf.

[12] IARC (2018),"Viet Nam", http://gco.iarc.fr/today/data/factsheets/populations/704-viet-nam-fact- sheets.pdf.

[13] Phạm Xuân Đà, 2010, Thẩm định phương pháp trong phân tích “Hóa học & Vi sinh vật”, NXB Khoa học và kỹ thuật.

[14] Alexander V.Kabanov and P.Lemieux (2008), Pluronic block copolymers, Adraced Drug Delivery Reviews, 54, p. 223-233.

[15] L.Li, L.H. Lim, Q.Wang, S.P. Jiang (2008), Thermoreversible micellization and gelation of a blend of pluronic polymers, 49, p. 1952–1960.

[16] D.S. Jones, M.L. Bruschi, O. De Freitas, M.P.D. Gremiao, E.H.G. Lara, G.P.Andrews, Rheological (2009), mechanical and mucoadhesive properties of thermoresponsive, bioadhesive binary mixtures composed of poloxamer 407 and carbopol 974P designed as platforms for implantable drug delivery systems for use in the oral cavity, Int. J. Pharm, 372, p. 49–58.

[17] Jong Hoon Choi, Yoon Ki Joung, Jin Woo Bae, Jang Won Choi, Tran Ngoc Quyen và Ki Dong Park (2011), Self-Assembled Nanogel of Pluronic- Conjugated Heparin as a Versatile Drug Nanocarrier, Macromolecular Research, Vol.19, No. 2, p 180-188.

[18] Wim Bouquet (2009) Drug Deliver of Paclitaxel for An Intraperitoneal Chemotherapy, Laboratory of Pharmaceutial Technology, p.6-12.

[19] Ping Ma and Russell J. Mumper (2003), Paclitaxel Nano – Delivery Systems: A Comprehensive Review, Nanomedicine & Nanotechnology, Vol 1, p.1-16.

[20] Lê Nguyễn Nguyệt Minhvà cộng sự (2014), Nghiên cứu cải thiện độ tan của Paclitaxel để bào chế thuốc tiêm,Tạp chí Y được học-Quân sự, 2, 23-24, 2014.

55

[21] Dung H. T. K. (2003), "Nghiên cứu tổng hợp một số dẫn xuất của Quercetin, xác định hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm của chúng", Luận văn thạc sĩ - ĐHQG HCM - ĐH Bách Khoa.

[22] Jong Hoon Choi and et al. (2010), Intracellular delivery and anti-cancer effect of self-assembled heparin-Pluronic nanogels with RNase A, Journal of Controlled Release 147, p.420–427

[23] Yong-Il Chung and et al. (2010), The effect of surface functionalization of PLGA nanoparticles by heparin- or chitosan-conjugated Pluronic on tumor targeting, Journal of Controlled Release 143, p.374–382

[24] Soon Hong Yuk and et al. (2011), Enhancement of the Targeting Capabilities of the Paclitaxel-Loaded Pluronic Nanoparticles with a Glycol Chitosan/Heparin Composite, Molecular pharmaceutics, 9(2), p.230-236

[24] Dũng, T.H. (2015), Ứng dụng của polymer Pluronic F127 nhạy nhiệt trong điều trị các tổn thương bỏng, Tạp chí Dược học, 54(11), p. 02-09.

[26] Nguyễn Thị Bích Trâm, Đ.T.L.H., Lê Thị Thu Thắm, Nguyễn Đại Hải, Nguyễn Cửu Khoa, Trần Ngọc Quyển (2016), Nghiên cứu điều chế hydrogel nhạy nhiệt trên cơ sở copolyme ghép chitosan-pluronic F127 định hướng ứng dụng trong chữa lành vết thương , Tạp chí Hóa học, 54(5): 603-607.

[27] Ngoc The Nguyen and et al. (2016), Pluronic – Grafted Copolymers as Nanoplatforms for Effectively Delivering Hydrophobic Anticancer Drugs, Advances in Research, 8(1), p.1-11.

[28] Nhat-Anh N. Tong and et al. (2016), Aquated Cisplatin and Heparin- Pluronic Nanocomplexes Exhibiting Sustainable Release of Active Platinum Compound and NCI-H460 Lung Cancer Cell Anti-proliferation, Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition, 27(8), p.709-720

[29]. Ngoc Quyen Tran and Yoon Ki Joun (2012), Heparin cọnjugated pluronic nanogels as Multi- Drug Nanocarriers for combination chemotherapy, moleculer pharmaceutics, 2013.10, p. 685-686.

56

[30] H Park, K Park, WSW Shalaby. “Biodegradable hydrogels for drug delivery”. CRC Press Book 38

[31] Pal, K., Banthia, A.K., and Majuma, D. K., 2009. Polymeric hydrogels: characterization and biomedical applications-a mini review. Designed monomers and polymers, 12, pp 197-220

57

PHỤ LỤC

Phụ lục 1: Tính tương thích của hệ thống HPLC đối với mẫu PTX

Phụ lục 2: Kết quả giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng

Phụ luc 3: Kết quả dựng đường chuẩn Paclitaxel trong dung môi ACN:H2O (9:1)

Phụ lục 4: Kết quả khảo sát độ đúng

Phụ lục 5: Kết quả khảo sát độ lặp lại

Phụ lục 6: Đường chuẩn của QU trong EtOH : H2O (1:1)

Phụ lục 7: Tỷ lệ phần trăm phóng thích PTX theo thời gian

SD SD CP-F127-PTX (%) PTX (%)

Thời gian (h) 1 3 5 7 9 40,93 50,76 75,83 86,53 100,51 0,61 8,29 10,19 11,72 4,26 Thời gian (h) 0,5 1 2 3 6 12 24 36 48 0 1,5 11,3 14,6 19,2 28,7 35,0 36,7 39,7 0,65 0,50 1,37 1,71 2,00 2,00 2,44 3,57 4,35

Phụ lục 8: Tỷ lệ phần trăm phóng thích QU theo thời gian

SD SD QU (%) CP-F127-QU (%)

Thời gian (h) 1 3 5 7 9 12 44,60 51,66 57,31 72,79 76,61 82,95 3,14 3,91 4,02 2,24 2,89 3,19 8,31 16,34 22,19 25,04 27,59 29,95 37,69 41,74 2,79 2,91 2,78 2,09 2,21 2,29 2,32 2,76

Thời gian (h) 1 2 3 6 12 24 36 48