Luận văn Thạc sĩ Khoa học lâm nghiệp: Nghiên cứu đặc điểm lâm học và mức độ đa dạng về di truyền của loài Quế thanh hóa (Cinnamomum cassia Blume) tại Thanh Hóa

Chia sẻ: Tri Tâm | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:133

Thêm vào BST

Báo xấu

40
lượt xem 3
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu của đề tài là đánh giá được đặc điểm lâm học và mức độ đa dạng di truyền làm cơ sở cho việc bảo tồn, phát triển, nâng cao năng suất chất lượng tinh dầu của rừng Quế tại khu vực nghiên cứu. Mời các bạn cùng tham khảo nội dung chi tiết.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Khoa học lâm nghiệp: Nghiên cứu đặc điểm lâm học và mức độ đa dạng về di truyền của loài Quế thanh hóa (Cinnamomum cassia Blume) tại Thanh Hóa

i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, công trình đƣợc thực hiện dƣới sự hƣớng dẫn của TS. Phạm Minh Toại và TS. Nguyễn Văn Thịnh. Các số liệu và kết quả nghiên cứu của đề tài là trung thực và chƣa từng đƣợc ai công bố trong bất kỳ các công trình khác, nếu có gì sai tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm. Hà Nội, ngày tháng 10 năm 2016 Tác giả luận văn Long Thị Minh Nguyệt
ii LỜI CẢM ƠN Luận văn đƣợc hoàn thành tại Trƣờng Đại học Lâm Nghiệp theo chƣơng trình đào tạo Thạc sĩ 2014-2016. Lời đầu tiên, cho phép tôi đƣợc bày tỏ lòng biết ơn tới thầy giáo hƣớng dẫn TS. Phạm Minh Toại và TS. Nguyễn Văn Thịnh đã dành nhiều thời gian công sức giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện Luận văn. Tôi đã nhận đƣợc sự giúp đỡ tận tình của các thầy cô giáo, cán bộ nhân viên khoa Sau Đại học và Trƣờng Đại học Lâm nghiệp. Để có thể hoàn thành luận văn, tôi c ng đã nhận đƣợc sự giúp đỡ về tài liệu, nơi thực tập của Ban quản lý khu bảo tồn Thiên nhiên Xuân Liên, các phòng chức năng huyện Thƣờng Xuân- Thanh Hóa. Tôi xin cảm ơn tất cả những sự giúp đỡ quý báu đó. Xin chân thành cảm ơn các anh chị đang công tác tại Phòng Lâm Sinh - Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam, Viện Di truyền Nông Nghiệp đã hỗ trợ và giúp đỡ tôi hoàn thành Luận văn. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến ngƣời thân trong gia đình và bạn bè gần xa đã động viên, giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này. Hà Nội, ngày tháng 10 năm 2016 Tác giả luận văn Long Thị Minh Nguyệt
iii MỤC LỤC Trang Trang phụ bìa LỜI CAM ĐOAN .............................................................................................. i LỜI CẢM ƠN ................................................................................................... ii MỤC LỤC ........................................................................................................ iii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT .................................................................. v DANH MỤC CÁC BẢNG............................................................................... vi DANH MỤC CÁC HÌNH ............................................................................... vii ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................... 1 Chƣơng 1 TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU ....................................... 3 1.1. Trên thế giới ............................................................................................... 3 1.1.1. Nghiên cứu về đặc điểm lâm học ............................................................ 3 1.1.2. Nghiên cứu về đa dạng di truyền Quế..................................................... 7 1.2. Ở Việt Nam .............................................................................................. 15 1.2.2. Một số nghiên cứu về Quế .................................................................... 20 Chƣơng 2 MỤC TIÊU, ĐỐI TƢỢNG, PHẠM VI, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU................................................................... 24 2.1. Mục tiêu nghiên cứu................................................................................. 24 2.2. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu............................................................ 24 2.2.1. Đối tƣợng nghiên cứu............................................................................ 24 2.2.2. Phạm vi nghiên cứu ............................................................................... 24 2.3. Nội dung nghiên cứu ................................................................................ 24 2.3.1. Nghiên cứu đặc điểm lâm học của loài Quế ......................................... 24 2.3.2. Đánh giá đa dạng di truyền các giống Quế ........................................... 24 2.3.3. Đề xuất một số giải pháp nhằm bảo tồn và phát triển Quế tại Thanh Hóa . 24 2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu.......................................................................... 24
iv 2.4.1. Nghiên cứu các đặc điểm lâm học ........................................................ 24 2.4.2. Phƣơng pháp đánh giá đa dạng di truyền Quế ...................................... 32 Chƣơng 3 ĐẶC ĐIỂM KHU VỰC NGHIÊN CỨU...................................... 36 3.1. Điều kiện tự nhiên .................................................................................... 36 3.1.1. Vị trí địa lý ............................................................................................ 36 3.1.2. Địa hình ................................................................................................. 36 3.1.3. Khí hậu .................................................................................................. 37 3.2. Tài nguyên thiên nhiên ............................................................................. 37 3.2.2. Tài nguyên rừng .................................................................................... 37 3.2.3. Tài nguyên biển ..................................................................................... 38 3.2.4. Tài nguyên khoáng sản.......................................................................... 39 3.2.5. Tài nguyên nƣớc.................................................................................... 39 3.3. Nguồn nhân lực ........................................................................................ 39 3.3.1. Dân số.................................................................................................... 39 3.3.2. Lao động................................................................................................ 40 Chƣơng 4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ............................. 41 4.1. Đặc điểm lâm học của loài Quế ............................................................... 41 4.1.1. Đặc điểm sinh vật học, sinh thái học, hình thái và vật hậu................... 41 4.1.2. Nghiên cứu một số đặc điểm cấu trúc tầng cây cao.............................. 45 4.1.3. Nghiên cứu đặc điểm cấu trúc Quế tái sinh .......................................... 60 4.2. Đánh giá đa dạng di truyền của Quế ........................................................ 66 4.2.1. Kết quả tách chiết ADN tổng số ........................................................... 66 4.2.2. Kết quả phân tích đa dạng di truyền, xác định mối quan hệ di truyền giữa 32 mẫu giống Quế ................................................................................... 66 4.3. Đề xuất một số giải pháp nhằm bảo tồn và phát triển Quế tại Thanh Hóa ......................................................................................................................... 76 KẾT LUẬN, TỒN TẠI, KHUYẾN NGHỊ ..................................................... 77 TÀI LIỆU THAM KHẢO
v DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Ký hiệu Tên gọi Đơn vị D1.3 Đƣờng kính ngang ngực thân cây (vị trí 1.3m) cm Dt Đƣờng kính tán lá cây m Hvn Chiều cao thân cây vút ngọn m Hdc Chiều cao thân cây dƣới cành m N Dung lƣợng mẫu Cây OTC Ô tiêu chuẩn m2 ODB Ô dạng bản m2 r Hệ số tƣơng quan R2 Hệ số xác định S2 Phƣơng sai mẫu m/cm, ̅ Trung bình mẫu cây…
vi DANH MỤC CÁC BẢNG STT Tên bảng Trang 2.1 Phiếu mô tả đặc điểm hình thái của loài Quế 25 2.2 Biểu điều tra tầng cây cao 26 2.3 Biểu điều tra cây tái sinh 27 2.4 Danh sách 32 mẫu giống Quế nghiên cứu 32 2.5 Thành phần phản ứng PCR-RAPD 33 2.6 Chu trình chạy PCR-RAPD 34 Phân bố thực nghiệm số cây theo đƣờng kính ngang ngực của Quế 4.1 46 tại khu vực nghiên cứu 4.2 Phân bố N/D1.3 của Quế tại khu vực nghiên cứu 47 Phân bố thực nghiệm số cây theo chiều cao vút ngọn của Quế tại 4.3 52 khu vực nghiên cứu 4.4 Nắn phân bố N/Hvn của Quế tại khu vực nghiên cứu 53 4.5 Tƣơng quan Hvn/D1.3 của Quế tại khu vực nghiên cứu 58 4.6 Tƣơng quan Dt/D1.3 của Quế tại khu vực nghiên cứu 59 Phẩm chất và nguồn gốc tái sinh ở các vị trí khác nhau của Quế tại 4.7 61 khu vực nghiên cứu Bảng phân bố tái sinh theo cấp chiều cao ở các vị trí khác nhau của 4.8 63 Quế tại khu vực nghiên cứu Phân bố tái sinh Quế ở các vị trí khác nhau theo mặt phẳng nằm 4.9 65 ngang tại khu vực nghiên cứu 4.10 Bảng thống kê số băng thu đƣợc trên từng mồi 68 4.11 Hệ số tƣơng đồng di truyền giữa 32 mẫu Quế nghiên cứu 73
vii DANH MỤC CÁC HÌNH STT Tên hình Trang 4.1 Hình thái thân cây Quế tại Xuân Cao- Thƣờng Xuân 42 4.2 Rừng quế 20 tuổi – tại Vinh Quang, Xuân Cao, Thƣờng Xuân 42 4.3 Hình thái lá Quế tại Xuân Cao - Thƣờng Xuân 43 4.4 Cành mang hoa, quả - khi khai thác Quế tại Xuân Lẹ, huyện 44 Thƣờng Xuân 4.5 Hạt Quế chín sau khai thác tại Xuân Lẹ- Thƣờng Xuân 44 4.6 Biểu đồ thể hiện phân bố N/D1.3 của Quế tại tuổi 20 48 4.7 Biểu đồ thể hiện phân bố N/D1.3 của Quế tại tuổi 21 49 4.8 Biểu đồ thể hiện phân bố N/D1.3 của Quế tại tuổi 22 50 4.9 Biểu đồ thể hiện phân bố N/Hvn của Quế tại tuổi 20 54 4.10 Biểu đồ thể hiện phân bố N/Hvn của Quế tại tuổi 21 55 4.11 Biểu đồ thể hiện phân bố N/Hvn của Quế tại tuổi 22 56 4.12 Tái sinh hạt và tái sinh chồi của cây Quế tại thôn Không Yên Nhân- 62 Thƣờng Xuân 4.13 Tái sinh Quế ở các cấp chiều cao khác nhau tại thôn Không Yên 64 Nhân - Thƣờng Xuân 4.14 Ảnh điện di ADN tổng số của 32 mẫu giống Quế 66 4.15 Kết quả điện di sản phẩm RAPD-PCR của 32 mẫu giống nghiên 69 cứu với đoạn mồi UBC728; (M: marker 1kb) 4.16 Kết quả điện di sản phẩm RAPD-PCR của 32 mẫu giống nghiên 70 cứu với đoạn mồi OPA12; (M: marker 1kb) 4.17 Kết quả điện di sản phẩm RAPD-PCR của 32 mẫu giống nghiên 70 cứu với đoạn mồi OPN20; (M: marker 1kb) 4.18 Kết quả điện di sản phẩm RAPD-PCR của 32 mẫu giống nghiên 71 cứu với đoạn mồi OPM12; (M: marker 1kb) 4.19 Kết quả điện di sản phẩm RAPD-PCR của 32 mẫu giống nghiên 71 cứu với đoạn mồi UBC701; (M: marker 1kb) 4.20 Sơ đồ mối quan hệ di truyền giữa các mẫu giống Quế nghiên cứu 74
1 ĐẶT VẤN ĐỀ Quế (Cinamomum cassia Blume) là loài cây đa tác dụng đƣợc trồng rộng rãi ở Việt Nam. Trƣớc đây Quế đƣợc trồng tập trung ở Yên Bái, Thanh Hóa, Nghệ An, Quảng Nam, Quảng Ngãi. Tuy nhiên, do mở rộng vùng trồng nên đến nay Quế đƣợc trồng ở nhiều tỉnh của nƣớc ta nhƣ Cao Bằng, Bắc Kạn, Ninh Bình, Nghệ An, Quảng Bình, Khánh Hòa,… Sản phẩm chính của Quế là vỏ và là mặt hàng xuất khẩu có giá trị. Từ xa xƣa “Sâm, Nhung, Quế, Phụ” đã là 4 vị thuốc bổ trong các bài thuốc dân gian của ông cha ta, tinh dầu Quế đƣợc dùng làm hƣơng liệu, chất thơm trong bánh kẹo, vỏ Quế đƣợc dùng trong các bài thuốc để chữa một số bệnh về đƣờng tiêu hoá, đƣờng hô hấp, kích thích sự tuần hoàn của máu, lƣu thông huyết mạch, làm cho cơ thể ấm lên, chống lại giá lạnh và làm chất sát trùng (Đỗ Tất Lợi,1970) [18]. Gỗ Quế với vân thớ mịn, dễ gia công và có mùi thơm thƣờng đƣợc sử dụng làm đồ thủ công mỹ nghệ cao cấp trên thị trƣờng. Quế là sản phẩm đƣợc đánh giá cao không chỉ ở trong nƣớc mà còn đƣợc thị trƣờng thế giới ƣa chuộng. Quế đƣợc trồng ở Thanh Hóa chủ yếu ở các huyện Thƣờng Xuân, Ngọc Lặc, Quan sơn, Lang Chánh, trong đó diện tích nhiều và lớn nhất là ở Thƣờng Xuân của tỉnh Thanh Hóa. Tại tỉnh Thanh Hóa, vào những năm 80 của thế kỷ XX, huyện Thƣờng Xuân có trên 1.000 ha Quế, tập trung chủ yếu ở Lâm trƣờng Thƣờng Xuân và rải rác trong các hộ dân. Sau năm 1986, diện tích Quế bị khai thác ồ ạt, ngƣời dân không quan tâm đến trồng mới, cùng với giá Quế bán ra thị trƣờng thấp nên cây Quế dần bị phá bỏ. Đặc biệt, từ năm 2000 đến nay, do giá Quế quá rẻ, nhiều hộ chỉ khai thác diện tích Quế còn lại, không trồng mới mà chuyển sang trồng các loại cây lâm nghiệp khác nhƣ Keo, Bạch đàn,… Bởi vậy, nhiều giống Quế quý hiếm ngày càng bị mai một. Theo thống kê của Chi cục Phát triển Lâm nghiệp tỉnh Thanh Hóa, đến năm 2013, huyện Thƣờng Xuân diện tích Quế hiện chỉ còn khoảng 180 ha và tập trung chủ yêu ở các xã: Xuân Cao, Vạn Xuân, Xuân Chinh, Xuân Lẹ,…, Tuy nhiên, cây Quế trồng ở các hộ dân mang tính tự phát, cách chăm sóc, khai thác, chế biến chỉ mang tính truyền thống, chƣa áp dụng tiến bộ khoa học - kỹ thuật nên đã làm cho
2 cây Quế suy thoái, hàm lƣợng tinh dầu không cao. (Chi cục Phát triển Lâm nghiệp tỉnh Thanh Hóa [51]). Hiện nay các nghiên cứu trên đối tƣợng cây Quế ở nƣớc ta chủ yếu tập trung vào mô tả đặc điểm hình thái, phân bố, đặc điểm sinh lý, sinh thái, giá trị sử dụng. Ngoài ra c ng có một số nghiên cứu về kỹ thuật nhân giống, chọn tạo giống mới có năng suất cao, kỹ thuật gây trồng, sơ chế và tách chiết tinh dầu Quế. Trong khi ở nƣớc ta có một số xuất xứ Quế cho năng suất chất lƣợng dầu cao, điển hình nhƣ Quế đƣợc trồng ở Thanh Hóa. Đây là các xuất xứ Quế có thể phát triển theo hƣớng sản suất tinh dầu thành hàng hóa. Nhƣng cho đến nay việc nghiên cứu các đặc điểm lâm học c ng nhƣ xác định giá trị và khai thác, phát triển nguồn gen của xuất xứ Quế này ở nƣớc ta vẫn chƣa đƣợc quan tâm đúng mức. Các nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử để nhận biết nguồn gen, xác định dòng/giống, nghiên cứu phát sinh loài và phân tích đa dạng di truyền chƣa đƣợc thực hiện. Do vậy, đề tài “Nghiên cứu đặc điểm lâm học và mức độ đa dạng về di truyền của loài Quế thanh hóa (Cinnamomum cassia Blume) tại Thanh Hóa” đƣợc tiến hành nhằm nâng cao năng suất, chất lƣợng tinh dầu và khai thác tối ƣu tiềm năng của rừng Quế, góp phần bảo tồn nguồn gen cây rừng và phát triển kinh tế xã hội.
3 Chƣơng 1 TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1. Trên thế giới 1.1.1. Nghiên cứu về đặc điểm lâm học 1.1.1.1. Về đặc điểm hình thái, sinh thái, giá trị sử dụng Quế Ấn Độ (đƣợc gọi là cây Teijat vùng Hindi) có tên khoa học là Cinamomumtamala Ness là loài cây nhỏ, thƣờng xanh. Lá của loài cây này có vị nóng nhƣ hành và mùi nhẹ nhƣ hạt tiêu. Lá Quế Ấn Độ đƣợc sử dụng rộng rãi trong dân chúng vùng phía Bắc Ấn Độ nhƣ một thứ gia vị chủ yếu để chế biến thức ăn cho con ngƣời (Dẫn theo: Đỗ Tất Lợi, 1985) [19]. Vỏ của loài Quế C.tamala là nguyên liệu chính của một loại gia vị có tên gọi là Teijat đƣợc buôn bán trên thị trƣờng. C. tamala phân bố ở hầu hết các vùng Himalaya nhiệt đới, cận nhiệt đới và mở rộng đến vùng Đông Bắc Ấn Độ, đến độ cao 2.000m. Loài cây này c ng mọc ở Nêpal, Băng La Đét và Myanma. Trong thời gian 1994 – 1997, Baruah và Nath đã xác định đƣợc 5 taxon của loài Cinnamomum là: C. tamala, C. bejolghota, C. impressinervirum, C. supuuratum và 1 taxon chƣa biết tên ở vùng đông Bắc Ấn Độ. Các taxon này đều đƣợc nhân dân trong vùng dùng làm gia vị Teijat. (Akahil B. và Subhan C. Nath., 2004) [32]. Quế Inđônêsia có tên khoa học là C. burmannii Nees hay Quế Java, Quế Fagot, Quế Padang, Quế Batavia, Quế Korintji, Quế Vera. Quế Inđônêsia hay Quế cinamon là vỏ khô của cây Quế (C. Burmannii) mọc ở vùng Inđônêsia – Malaysia và đƣợc trồng làm hàng hóa ở bán đảo Timor. Quế Inđonêsia có phân bố từ mặt biển đến độ cao 2.000m. Trung tâm trồng Quế là vùng Padang, ở độ cao từ 500 – 1.300m. Một biến chủng của loài này có lá non màu đỏ sinh trƣởng ở độ cao hơn trong vùng núi Korintji (còn gọi là Kerinci). (Akahil B. và Subhan C. Nath., 2004) [32]. Ở Ấn Độ (cây Teijat), lá đƣợc thu hàng năm ở các cây trẻ, khỏe và luân phiên đối với cây già và yếu. Lá thƣờng đƣợc bó thành từng bó, phơi ngoài nắng, rồi đem bán. Sản lƣợng mỗi cây khoảng 9 – 19 kg/năm. Trồng teijat là một bộ phận trong hệ thống nông lâm kết hợp ở Ấn Độ (Dẫn theo: Đỗ Tất Lợi, 1985) [19]. Loại có chất lƣợng tốt hơn và đƣợc buôn bán trên thị trƣờng thế giới với tên
4 gọi Quế Korintji. Trung tâm chính gây trồng Quế là Jambi và Đông Sumatra có diện tích mỗi vùng khoảng 59.490 ha và 28.893 ha với sản lƣợng 42.590 tấn vỏ Quế Cinamon. Hầu hết sản lƣợng vỏ đƣợc xuất khẩu, số lƣợng dùng trong nƣớc rất ít. Năm 1998, Inđônêsia xuất khẩu 36.202 tấn vỏ, thu đƣợc 31,7 triệu USD. Thị trƣờng nhập khẩu chính là Mỹ, Đức, Hà Lan. Khoảng 85 – 90% sản lƣợng xuất khẩu đều từ Đông Sumatra (Akahil B. và Subhan C. Nath., 2004) [32]. Ở Trung Quốc, Quế Bình là địa phƣơng trồng Quế nhiều nhất tỉnh Quảng Tây với khoảng 40% diện tích đất rừng. Quế đƣợc trồng ở 10 xã của Quế Bình với diện tích 6.800 ha. Riêng ở xã Đông Hƣng đã có 60 ha rừng Quế.. Mục tiêu trồng Quế ở đây là lấy vỏ, tuy nhiên trong năm đầu, trƣớc khi khai thác tận thu lá lần cuối để cất tinh dầu. Hàng năm ngƣời dân ở đây thu đƣợc khoảng 1.000 tấn và 70 tấn tinh dầu (Nguyen Kim Dao, 2004) [43]. Ngô Châu, Quảng Tây là nơi có khí hậu rất tƣơng đồng với Việt Nam, vì vậy ở đây rất thích hợp với trồng Quế, Hồi, Bạch đàn. Tổng diện tích đất lâm nghiệp của Ngô Châu khoảng 924.000 ha trong đó đất trồng Quế là 50.000 ha. Vỏ Quế và tinh dầu Quế là mặt hàng xuất khẩu chủ yếu của Ngô Châu. Công tác chế biến vỏ Quế trƣớc đây thƣờng làm thủ công nay đã chuyển sang tinh chế. Quế ở vùng Ngô Châu đƣợc kinh doanh nhƣ sau: 5-6 năm sau khi trồng chặt lấy vỏ và lá để bán hay cất tinh dầu. Gốc Quế đƣợc để lại để kinh doanh quế chối sau 5-6 năm sẽ cho thu hoạch lần 2. Số chu kỳ tùy thuộc vào điều kiện đất đai và chăm sóc. Nếu đất tốt cộng với chăm sóc đầy đủ thì có thể thu hoạch nhƣ vậy cho đến khi nào cây sinh trƣởng kém mới tiến hành trồng lại. Vỏ Quế Ngô Châu đƣợc xuất khẩu với tên gọi là Quế Tây Giang. (Nguyen Kim Dao, 2004) [43]. 1.1.1.2. Nghiên cứu về quy luật cấu trúc sinh trưởng của lâm phần Quy luật phân bố số cây theo cỡ kính (N-D1.3) Việc mô phỏng phân bố số cây theo đƣờng kính là quy luật kết cấu cơ bản của lâm phần đƣợc nhiều tác giả quan tâm, kiểu phân bố này thƣờng đƣợc biểu diễn dƣới dạng hàm toán học phong phú.
5 Meyer (1934) đã mô tả phân bố N/D1.3 bằng phƣơng trình toán học có dạng đƣờng cong giảm liên tục và đƣợc gọi là phƣơng trình Meyer. Còn Pierlot (1966) cho rằng, việc nắn đƣờng thực nghiệm bằng phƣơng trình m sẽ mất đi những sai số ở những cỡ kính nhỏ và đề xuất nên dùng hàm Hyperbol để nắn đƣờng thực nghiệm là tốt hơn cả. Theo Balley (1973) sử dụng hàm Weibull, Schifel biểu thị đƣờng cong cộng dồn phần trăm số cây bằng đa thức bậc ba (Dẫn theo: Phạm Ngọc Giao (1995) [05]), Naslund (1936, 1937) xác lập quy luật phân bố Charlier cho phân bố N/D của lâm phần thuần loài, đều tuổi sau khép tán (Dẫn theo: Phạm Ngọc Giao (1995)[05]). J.L.F Batista và H.T.Z Docouto (1992) trong khi nghiên cứu 19 ô tiêu chuẩn với 60 loài của rừng nhiệt đới ở Maranhoo-Brazin đã dùng hàm Weibull để nắn phân bố số cây theo đƣờng kính và nhận xét rằng: Hàm Weibull mô phỏng rất tốt phân bố này. Quy luật phân bố số cây theo chiều cao (N-Hvn) Phần lớn các tác giả khi nghiên cứu cấu trúc lâm phần theo chiều thẳng đứng đã dựa vào phân bố số cây theo chiều cao. P.W.Richards (1952) trong rừng mƣa nhiệt đới đã dùng phƣơng pháp vẽ các phẫu diện đồ đứng với các kích thƣớc khác nhau tùy theo mục đích nghiên cứu. Các phẫu đồ đã mang lại hình ảnh khái quát về cấu trúc tầng tán, phân bố số cây theo chiều thẳng đứng, từ đó rút ra các nhận xét và đề xuất ứng dụng thực tế. Nhìn chung, các nghiên cứu về cấu trúc theo hƣớng định lƣợng trên cơ sở thống kê sinh học vẫn tập trung vào phân bố số cây theo đƣờng kính và chiều cao. Các hàm toán học đƣợc sử dụng để mô phỏng rất đa dạng và phong phú, nhƣng khi kiểm tra bằng tiêu chuẩn phù hợp của thống kê toán học thƣờng chỉ đạt ở mức trung bình. Xu hƣớng nghiên cứu các quy luật phân bố của nhân tố điều tra chủ yếu tập trung vào tìm các hàm toán học thích hợp để mô phỏng. Tương quan giữa chiều cao với đường kính ngang ngực (Hvn - D1.3) Qua nhiều nghiên cứu của các tác giả đi trƣớc cho thấy mối tƣơng quan giữa đƣờng kính và chiều cao là tƣơng quan chặt chẽ. Theo quy luật sinh trƣởng của cây rừng- khi tuổi tăng lên thì đƣờng kính và chiều cao c ng tăng lên. Tuy nhiên quy
6 luật này chỉ tồn tại trong một giới hạn cho phép của cây rừng trong quá trình sinh trƣởng. Trong lâm phần, khi tuổi tăng lên thì tỷ lệ H/D c ng tăng, từ đó đƣờng cong biểu thị quan hệ H/D có thể bị thay đổi. Đƣờng cong luôn dịch chuyển lên phía trên khi tuổi lâm phần tăng lên. Phƣơng trình toán học cụ thể biểu thị mối quan hệ này rất phong phú và đa dạng. Tiurin.Đ.V (1927) đã phát hiện hiện tƣợng chiều cao tƣơng ứng với mỗi cỡ kính cho trƣớc luôn tăng theo tuổi, đó là kết quả tự nhiên của phân cấp sinh trƣởng; đƣờng cong biểu thị quan hệ giữa H - D có thể thay đổi dạng và luôn dịch chuyển lên phía trên khi tuổi lâm phần tăng lên, khi ông xác lập đƣờng cong chiều cao các cấp tuổi khác nhau. Tiourin.A.V (1932) và Krauter.G.(1958) nghiên cứu tƣơng quan giữa chiều cao với đƣờng kính ngang ngực dựa trên cơ sở cấp đất và cấp tuổi. Kết quả cho thấy, khi dãy phân hóa thành các cấp chiều cao thì mối quan hệ này không cần xét đến cấp đất hay cấp tuổi, c ng nhƣ không cần xét đến tác động của hoàn cảnh và tuổi, vì những nhân tố này đã đƣợc phản ánh trong kích thƣớc của cây, nghĩa là đƣờng kính và chiều cao trong quan hệ đã bao hàm tác động của hoàn cảnh và tuổi. Petterson.H (1955) (Dẫn theo: Nguyễn Trọng Bình, 1996) [01], đề xuất phƣơng trình tƣơng quan: 1 b a 3 h  1.3 d (1.1) Curtis.R.O (1967) [49] đã mô phỏng quan hệ chiều cao (H) với đƣờng kính (D) và tuổi (A) theo dạng phƣơng trình: 1 1 1 LogH = D + b1* D A + b2* + b3* DA (1.2) Trong đó: bi là các tham số của phƣơng trình Sau đó, tác giả nắn theo từng định kỳ 5 năm, tƣơng ứng với định kỳ kiểm tra tài nguyên rừng Lĩnh Sam. Tại từng tuổi nhất định phƣơng trình có dạng: 1 LogH = b0 + b1* D (1.3)
7 Kennel.R (1971) kiến nghị một cách khác mô phỏng tƣơng quan H-D là: tìm một phƣơng trình thích hợp cho lâm phần, sau đó xác lập mối liên hệ giữa các tham số phƣơng trình với tuổi. Tương quan giữa đường kính tán với đường kính ngang ngực (Dt-D1.3) Tán cây là chỉ tiêu quan trọng để xác định không gian dinh dƣỡng của cây cá lẻ. Tán cây còn thể hiện sức sống, khả năng sinh trƣởng, tăng trƣởng của cây nên có quan hệ mật thiết đến sinh trƣởng đƣờng kính ngang ngực. Ilvessalo [36], Willing [38] qua nghiên cứu đã đi đến kết luận là, có mối quan hệ mật thiết giữa đƣờng kính tán với đƣờng kính ngang ngực. Tùy theo loài cây và điều kiện sống, mối liên hệ này đƣợc thể hiện khác nhau nhƣng phổ biến nhất là dạng phƣơng trình đƣờng thẳng: DT = a + b.D1.3 (1.4) 1.1.2. Nghiên cứu về đa dạng di truyền Quế Các chỉ thị để phân tích đa dạng về di truyền Để đánh giá bản chất di truyền của các cá thể dựa vào hệ gen của chúng, các marker ADN đã đƣợc ứng dụng trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu của sinh học phân tử nhƣ: Xây dựng thƣ viện bộ gen, xác định cây phát sinh chủng loại, đánh giá đa dạng di truyền, xác định quan hệ họ hàng. Ở thực vật, có nhiều loại marker phân tử đã đƣợc ứng dụng trong các nghiên cứu. Các marker ADN phổ biến trong nghiên cứu sinh học phân tử ở thực vật là: RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism), Microsatellite (hay SSR- Simple Sequence Repeat), RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA), AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) và ISSRs (Inter - Simple Sequence Repeats ). 1.1.2.1. Chỉ thị dựa trên cơ sở lai ADN Chỉ thị RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism - Đa hình chiều dài các mảnh phân cắt giới hạn): RFLP đƣợc các nhà di truyền học lần đầu tiên đƣa ra trong nghiên cứu lập bản đồ các gen liên quan đến bệnh ở ngƣời (Botstein và cộng sự, 1980). Các đa hình RFLP sinh ra bởi những đột biến tự nhiên ở những
8 điểm cắt enzym giới hạn trong ADN bộ gen, ví dụ nhƣ đảo đoạn, thêm đoạn, mất đoạn, hoặc sự mất đi hay thêm vào của một hay nhiều nucleotit khác nhau tuỳ thuộc vào đặc điểm riêng biệt của mỗi giống, loài, thậm chí mỗi cá thể. Mỗi một loài sinh vật có một bộ ADN genom đặc hiệu trong cấu trúc, vì vậy khi sử dụng những enzym giới hạn để cắt phân tử ADN của hệ gen, ngƣời ta có thể nhận biết đƣợc những đoạn ADN có chiều dài khác nhau bằng kỹ thuật lai ADN với những mẫu dò (probe) (Botstein và cộng sự, 1980) [34]. Chỉ thị RFLP là chỉ thị đồng trội, nghĩa là có khả năng biểu hiện tất cả các alen của cùng một locut gen. Do vậy, có thể phân biệt đƣợc các cá thể đồng hợp tử (AA hoặc aa) và các cá thể dị hợp tử (Aa). Đây là đặc điểm ƣu việt của loại chỉ thị này. Hạn chế của phƣơng pháp này là tiêu tốn nhiều thời gian và sức lực, đòi hỏi nhiều trang thiết bị phòng thí nghiệm, đặc biệt là tiêu hao một lƣợng lớn ADN mà số lƣợng đa hình thu đƣợc rất ít ỏi, thậm chí ở một số loài khó nhận đƣợc đa hình (Botstein và cộng sự, 1980) [33]. 1.1.2.2. Chỉ thị phân tử dựa trên kỹ thuật PCR Phản ứng chuỗi trùng hợp (Polymerase Chain Reaction - PCR) đƣợc Kary phát minh năm 1985. Phƣơng pháp này đã nhanh chóng đƣợc sử dụng hầu hết ở các phòng thí nghiệm trên toàn thế giới (Nair S và cộng sự, 1996). Nhờ vào việc phát hiện ra loại enzym chịu nhiệt đƣợc tách từ một loại vi khuẩn sống ở suối nƣớc nóng có tên là Thermus aquaticus hoạt động tốt nhất ở nhiệt độ 70-800C, ngƣời ta đã kết hợp với những tính chất cơ bản của ADN là có khả năng duỗi xoắn ở một nhiệt độ thích hợp, có khả năng bắt cặp với những đoạn ADN có trình tự nucleotit bổ sung với đoạn ADN khuôn mẫu và có khả năng nhân đôi dƣới xúc tác của enzym đặc hiệu để nhân bội những đoạn ADN khuôn mẫu. Phản ứng PCR dựa trên nguyên tắc tổng hợp ADN nhờ enzym ADN Polymerase chịu nhiệt (Taq, Pfu…) với sự có mặt của đoạn ADN khuôn mẫu, ADN mồi, các nucleotit (dNTP) gồm dATP, dCTP, dGTP, dTTP và ion Mg2+ hoạt động nhƣ một chất xúc tác. Tuỳ theo bản chất của những đoạn mồi sử dụng mà có những hệ thống chỉ thị đặc trƣng gồm chỉ thị STS, RAPD, SSR, AFLP,v.v… Việc sáng chế ra máy PCR sau đó giúp thực hiện đƣợc những phản ứng nhân bội ADN dễ dàng (Nair S và cộng sự, 1996) [42].
9 1.1.2.3. Chỉ thị STS (Sequence Tagged Sites) STS Olson nêu ra lần đầu tiên vào năm 1989 để nghiên cứu lập bản đồ gen ở ngƣời ngay sau khi kỹ thuật PCR ra đời (Olson M. và cs., 1989). STS đƣợc đƣa ra nhờ việc xác định trình tự 2 đầu các đoạn mẫu dò RFLP, trên cơ sở đó ngƣời ra thiết kế mồi dùng cho phản ứng PCR (Olson M. và cộng sự, 1989) [44]. 1.1.2.4. Chỉ thị AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) AFLP đƣợc sử dụng rộng rãi trong những nghiên cứu lập bản đồ gen và xác định chỉ thị phân tử liên kết gen. Kỹ thuật tạo ra các loại chỉ thị này đƣợc gọi là nhân bội chọn lọc những mảnh cắt giới hạn (Selective Restriction Fragment Amplication). Phƣơng pháp linh hoạt này có thể phát hiện đƣợc sự có mặt của những mảnh cắt giới hạn trong bất kỳ loại ADN nào (Vos và cộng sự, 1995) [49]. Phƣơng pháp xác định có hiệu quả tính biến dị của ADN là sử dụng một nhóm enzyme đặc hiệu gọi là enzyme giới hạn. Những enzyme này sản sinh ra từ nhiều loại vi sinh vật khác nhau. Chúng có khả năng nhận biết những vị trí "đích" hay còn gọi là những vị trí giới hạn, chứa một trật tự nucleotide đặc thù trong ADN và sau đó cắt ADN tại trật tự đó. Vì vậy, một đoạn lớn của phân tử ADN sau khi đƣợc xử lý bởi enzyme này sẽ bị cắt thành nhiều mảnh nhỏ có kích thƣớc khác nhau. Sự khác nhau về kích thƣớc các đoạn đƣợc tạo ra do xử lý enzyme giới hạn đối với các phân tử ADN đƣợc gọi là đa dạng chiều dài đoạn giới hạn (Restriction Fragment Length Polymorphisms - RFLP). Kỹ thuật này đƣợc Botstein và cộng sự (1980) [34] sử dụng nhƣ là chỉ thị trực tiếp vào năm 1980. RFLP đƣợc sử dụng để lập bản đồ di truyền, phân tích quan hệ di truyền tiến hoá, phân loại (Miller và cộng sự, 1990) [40]. Kỹ thuật RFLP có nhiều hạn chế do phải sử dụng một lƣợng lớn ADN cho việc cắt giới hạn, lai Southern (Southern blotting and hybridization), kỹ thuật phức tạp và tốn kém. 1.1.2.5. Chỉ thị vi vệ tinh (Microsatellite hay Simple Sequence Repeates- SSR) SSR hay còn gọi là vi vệ tinh, là những đoạn trình tự ADN đơn giản lặp lại nối tiếp và chỉ gồm 1- 6bp. (Litt and Luty, 1989; Jacob và cộng sự, 1991). Hiện tƣợng các SSR trong cơ thể sinh vật nhân chuẩn là khá phổ biến ở động vật và thực
10 vật. Tuy nhiên, tùy từng loài mà số lƣợng các nucleotide trong mỗi đơn vị lặp lại có thể thay đổi từ một đến hàng chục và số lƣợng đơn vị lặp lại có thể biến động từ hai đến hàng chục lần hoặc nhiều hơn. Thông thƣờng có các kiểu lặp lại (Jacob HJ và cộng sự, 1991) [37], (Lee SC và cộng sự, 2010) [39]: - Lặp lại hoàn toàn: Các đơn vị lặp lại sắp xếp nối tiếp nhau. - Lặp lại không hoàn toàn: Xen kẽ vào các đơn vị lặp lại là một hoặc một số nucleotide khác. - Lặp lại phức tạp: Xen kẽ giữa các đơn vị lặp lại khác nhau. Thông thƣờng, các SSR có mặt chủ yếu ở các vùng dị nhiễm sắc của nhiễm sắc thể nhƣ vùng tâm động hoặc các đầu mút, chúng giữ vai trò quan trọng trong việc điều hoà phiên mã đối với các gen hoạt động ở vùng nguyên nhiễm sắc, góp phần làm tăng tính ổn định cơ học của nhiễm sắc thể trong các quá trình phân bào và có thể chứa đựng những thông tin di truyền liên quan đến sự xác định giới tính ở cả động vật và thực vật. Bản chất đa hình của SSR có thể đƣợc sinh ra do sự nhân bội từ DNA tổng số của hệ gen nhờ sử dụng hai đoạn mồi bổ trợ với trình tự gần kề hai đầu của vùng lặp lại. Sự khác nhau về độ dài ở locus SSR đƣợc phát hiện bởi sự nhân đoạn ADN nhờ phản ứng PCR. Kích thƣớc của sản phẩm PCR đƣợc xác định một cách chính xác bằng điện di trên gel agarose hoặc gel polyacrylamide với sự khác nhau về độ dài có thể rất nhỏ (2bp). Chỉ thị SSR dùng để đánh giá đa dạng di truyền, xác lập quan hệ di truyền của cây trồng, chọn lọc tính kháng bệnh, một số tính trạng có quan hệ chặt chẽ với năng suất ở cây lúa, lập bản đồ, nghiên cứu locus tính trạng số lƣợng (QTL). 1.1.2.6. Chỉ thị RAPD (Random Amplified Polymorphic ADN) RAPD đƣợc sinh ra bởi phản ứng PCR do sự nhân bội những đoạn ADN hệ gen, sử dụng những đoạn mồi đơn lẻ, ngẫu nhiên (random primer) dài khoảng 9-10 nucleotit dƣới nhiệt độ kết cặp thấp (khoảng 370C) (Williams và cộng sự, 1990). Sản phẩm của phản ứng đƣợc phân tách bằng điện di trên gel agarose, nhuộm trong ethidium bromide và quan sát dƣới tia cực tím. RAPD sinh ra những chỉ thị trội bởi
11 sự có mặt hay vắng mặt những băng ADN đặc trƣng. Hạn chế của loại chỉ thị này so với chỉ thị đồng trội RFLP là không phân biệt đƣợc thể dị hợp tử. Mặc dù vậy, chỉ thị này vẫn là một công cụ hữu hiệu trong việc lập bản đồ ở những dòng nhị bội, những dòng cận phối hay các quần thể lai trở lại. Lợi thế của loại chỉ thị này là không cần biết những thông tin về trình tự (William và cs., 1993). Do chỉ thị RAPD có hạn chế là độ nhạy bị phụ thuộc vào điều kiện của phản ứng, đôi khi kết quả không lặp lại đƣợc nên ngƣời ta đã khắc phục bằng cách nhân dòng những băng RAPD đặc hiệu, xác định trình tự của chúng rồi thiết kế những đoạn mồi dài khoảng 20bp từ cả hai đầu và gọi là chỉ thị SCARs (Sequence Characterized Amplified Region) - Những ưu điểm của kỹ thuật RAPD Về mặt kỹ thuật: Kỹ thuật RAPD dễ thực hiện và dễ thành công do không cần biết trƣớc trình tự bộ gene của đối tƣợng cần nghiên cứu, thao tác đơn giản, chất lƣợng. ADN khuôn không cần độ tinh sạch cao. Thời gian thực hiện nhanh, khả năng nhân bản cao. Về mặt kinh tế: Chi phí thực hiện thấp. Kỹ thuật RAPD thƣờng đƣợc sử dụng kết hợp với những kỹ thuật cao cấp khác để đánh giá đa dạng di truyền và nhận diện chỉ thị phân tử có độ tin cậy cao. - Ứng dụng cũa kỹ thuật RAPD Kỹ thuật RAPD đƣợc phát minh và sử dụng ngay sau khi kỹ thuật PCR ra đời, mặc dù cho kết quả có độ tin cậy không cao nhƣng vẫn còn đƣợc sử dụng do ƣu điểm dễ thực hiện và chi phí thấp. Những ứng dụng của kỹ thuật RAPD: Đánh giá đa dạng di truyền: đã đƣợc áp dụng trên các đối tƣợng: cúc lai, cà phê, bắp, đậu nành, lúa mì, lúa mạch, dâu tây, khoai tây, cà chua,vv... Cần quan tâm đến yếu tố nồng độ ADN, điều kiện thí nghiệm, chƣơng trình chạy PCR và cần lựa chọn primer thích hợp cho sự đa hình cao. Đối với nấm bệnh thực vật thì kỹ thuật RAPD đã đƣợc áp dụng để phân tích đa dạng di truyền của nhiều loại nấm khác nhau: Leptosphaeria maculans (Desm.), Ces. et de Not, Corynespora cassiicola, (Dẫn theo: Nguyễn Thị Minh Thƣ, 2007) [30].
12 - Những cải tiến của kỹ thuật RAPD Đã có vài cải tiến của kỹ thuật RAPD đƣợc mô tả. Kỹ thuật thứ nhất là sử dụng cùng lúc 2 primer khác nhau thay vì sử dụng 1 primer nhƣ kỹ thuật RAPD thông thƣờng. Phƣơng pháp này có thể làm tăng hoặc giảm đi số băng so với khi sử dụng một primer. Việc lựa chọn, sử dụng cùng lúc 2 primer khác nhau một cách phù hợp c ng có thể làm tăng tính đa hình của những primer cho sản phẩm ít đa hình. Cải tiến thứ 2 là cắt ADN bằng các enzyme giới hạn trƣớc hoặc sau khi thực hiện phản ứng PCR. Sự cắt này c ng có thể tạo ra hai kết quả. Một là có thể làm giảm số lƣợng các băng khó xác định (complex band), điều đó làm dễ dàng hơn cho việc đánh giá đa dạng di truyền. Hai là tạo ra sự đa hình ở các mẫu có hạn chế về sự đa hình. Tuy nhiên việc sử dụng những cải tiến tuỳ thuộc vào chiến lƣợc nhằm làm tăng số chỉ thị đa hình có thể hoặc đạt đƣợc các chỉ thị đồng trội. Những cải tiến này có hạn chế là làm giảm đi lợi thế của kỹ thuật RAPD cụ thể là tốc độ, giá thành và sử dụng phức tạp hơn (Kurt Weising và ctv, 1995). 1.1.2.7. Nghiên cứu đa dạng di truyền các giống thuộc chi Cinnamomum Quế là một trong những loài cây gia vị quan trọng nhất ở Sri Lanka và nó đóng góp tới 70% sản lƣợng vỏ quế trên thế giới. Có 9 loài Cinnamomum tìm thấy ở Sri Lanka. Mặc dù nó là một loại cây gia vị rất quan trọng ở Sri Lanka nhƣng việc phân loại của các loài này gây ra nhiều tranh cãi. Những loài này đƣợc xác định dựa vào hình thái hoa, lá, nhụy hoa, các đặc điểm sinh lý, sinh hóa và các thành phần tinh dầu… Kỹ thuật phân tử đƣợc sử dụng để xác định chính xác các loài này. Sự khác biệt về di truyền giữa các loài Cinnamomum: C. verum, C. citriodorum, C. capparu-coronde, C. dubium, C. litseafolium, C. rivulorum, C. sinharajaense và C. camphora tìm thấy ở Sri Lanka đã đƣợc nghiên cứu bằng cách phân tích trình tự nucleotide của các vùng cpDNA khác nhau và vùng ITS của rDNA. Chúng tôi có thể xác định đƣợc một số vị trí khác biệt về trình tự cpDNA của trnL intron, trnL- trnF IGS, trnT-trnL IGS, trnH- psbA IGS và vùng ITS của rDNA. Mặc dù không có nhiều khác biệt giữa các vùng cpDNA mà chúng tôi nghiên cứu, nhƣng kết quả này sẽ góp phần vào việc phân loại đa dạng di truyền của các loài Cinnamomum ở Sri
13 Lanka ở mức ADN. Tuy nhiên. Vùng ITS của rDNA đƣợc xem là rất hữu ích cho việc xác định loài (Pushpa D. A và cộng sự, 2009) [45]. Chi Cinnamomum Scha. bao gồm một số loài có giá trị kinh tế cao. Quả, vỏ cây và lá cây của Cinnamomum đƣợc sử dụng làm gia vị và làm thuốc trong y học. Cinnamomum là chi lớn nhất trong họ Lauraceae gồm 250 loài, phân bố ở Ấn Độ, Sri-Lanka và Australia. Ở Nam-Ấn Độ, chi Cinnamomum đƣợc đại diện bởi 12 loài đặc hữu và loài C. Verum nhập nội. Tinh dầu của ba loài viz.,C. zeylanicum, C.cassia và C. Camphora có giá trị thƣơng mại trong y học. Các hợp chất chính trong thân và vỏ rễ chứa 75% Cinnamaldehyde và 56% Camphor. Dầu chiết xuất từ vỏ thân cây có mùi thơm của các gia vị và hƣơng vị cay ngọt. Nó đƣợc sử dụng chủ yếu trong chế biến hƣơng liệu thực phẩm, gia vị đồ ăn nhanh, nƣớc sốt, dƣa chua, bánh nƣớng, bánh kẹo, nƣớc giải khát, thuốc lá và dƣợc phẩm. Chi Cinnamomum bao gồm số lƣợng lớn các dòng/giống, vì vậy việc phát triển các marker phân tử là công cụ mạnh mẽ trong việc xác định các loài khác nhau. Marker phân tử c ng đƣợc chứng minh là tốt nhất trong việc nhận biết nguồn gen, xác định dòng/giống, nghiên cứu phát sinh loài và phân tích đa dạng di truyền. Mục tiêu của nghiên cứu này là đánh giá mối quan hệ di truyền giữa tám loài thuộc chi Cinnamomum ở Nam-Ấn Độ sử dụng 40 marker RAPD. Tám loài Cinnamomum đã đƣợc lấy mẫu từ vùng phân bố tự nhiên của chúng ở phía Tây Ghats của Karnataka, Tamil Nadu và Kerala. DNA tổng số đƣợc chiết xuất từ lá non theo phƣơng pháp CTAB có cải tiến. Kết quả sử dụng 40 mồi RAPD thu đƣợc 111 băng DNA trong đó có 98% đa hình. Mồi OPB-17 nhân lên đƣợc số băng lớn nhất là 16 băng. Mồi OPA19 và OPB-16 nhân lên đƣợc số băng nhỏ nhất là 3 băng. Số băng nhân lên trung bình là 8,54 băng/mồi. Kích thƣớc băng nhân lên đƣợc cao nhất là 4200bp và thấp nhất là 100bp. Hệ số tƣơng đồng di truyền dao động từ 0,17 (giữa C.zeylanicum và C.travancoricum) đến 0,81 (giữa C.macrocarpum và C.travancoricum). Dựa vào sơ đồ hình cây, 8 loài thuộc chi Cinnamomum đƣợc chia thành 2 nhóm. Nhóm A gồm C. malabatrum, C.sulphuratum, C.macrocarpum, C.travancoricum, C.wightii, C. nicolsonianum và C. walaiwarense. Nhóm B gồm duy nhất loài C.zeylanicum. Nhƣ