Luận văn Thạc sĩ Khoa học lâm nghiệp: Nghiên cứu đặc điểm sinh học của nấm Đông trùng hạ thảo tuyết (Isaria tenuipes) có phân bố ở Việt Nam

Chia sẻ: Tri Lộ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:91

Thêm vào BST

Báo xấu

32
lượt xem 11
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Đề tài nghiên cứu nhằm 3 mục tiêu: Tìm hiểu một số đặc điểm của hệ sợi trong nuôi cấy thuần khiết của các chủng nấm đã thu thập được; đánh giá hoạt tính sinh học của chủng nấm thông qua hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm bệnh của chúng; đánh giá khả năng hình thành thể quả trên giá thể nhân tạo.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Khoa học lâm nghiệp: Nghiên cứu đặc điểm sinh học của nấm Đông trùng hạ thảo tuyết (Isaria tenuipes) có phân bố ở Việt Nam

i LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành chương trình đào tạo cao học tại trường Đại học Lâm nghiệp, nhằm vận dụng kiến thức đã học vào thực tiễn, làm quen với công tác nghiên cứu khoa học và khả năng tổng hợp phân tích vấn đề, tác giả tiến hành thực hiện Luận văn tốt nghiệp cao học. Trong quá trình thực hiện và hoàn thiện luận văn, tác giả đã nhận được nhiều sự quan tâm, giúp đỡ và đóng góp của cán bộ Phòng nghiên cứu Bảo vệ Thực vật rừng – Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam, Khoa đào tạo sau Đại học - Trường Đại học Lâm nghiệp, từ gia đình và bạn bè đồng nghiệp. Tác giả xin chân thành cảm ơn sự ủng hộ, giúp đỡ đó. Đặc biệt tác giả muốn gửi lời cảm ơn sâu sắc tới PGS. TS. Phạm Quang Thu, người thầy trực tiếp hướng dẫn khoa học đã tận tình quan tâm, tạo điều kiện thuận lợi và truyền đạt những kiến thức quý báu trong suốt quá trình thực hiện. Luận văn được hoàn thiện trên cơ sở tham khảo nhiều tài liệu có liên quan và ý kiến đóng góp của nhiều nhà chuyên môn và sự nỗ lực của tác giả. Tuy nhiên do khả năng, điều kiện và thời gian còn hạn chế, chủ đề nghiên cứu hoàn toàn mới nên luận văn không tránh khỏi những thiếu sót. Tác giả rất mong nhận được ý kiến đóng góp, xây dựng của các nhà khoa học cũng như của bạn bè đồng nghiệp để Luận văn được hoàn thiện. Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, tháng 3 năm 2013 Tác giả
ii MỤC LỤC Trang Trang phụ bìa Lời cảm ơn ...................................................................................................... ..i Mục lục ............................................................................................................ .ii Danh mục các bảng .......................................................................................... iv Danh mục các hình .......................................................................................... ..v ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................. ..1 Chương 1 TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU ..................................... ..2 1.1. Nghiên cứu ở ngoài nước ........................................................................... 2 1.1.1. Nghiên cứu về phân loại nhóm nấm Đông trùng hạ thảo và nấm Đông trùng hạ thảo tuyết (Isaria tenuipes)................................................................. 2 1.1.2. Nghiên cứu về thành phần hóa học của I. tenuipes ................................ 2 1.1.3. Nghiên cứu về giá trị dược liệu của nấm Đông trùng hạ thảo ............... 4 1.1.4. Nghiên cứu về nuôi trồng thể quả trên giá thể và nuôi cấy sinh khối hệ sợi ...................................................................................................................... 6 1.2. Nghiên cứu ở trong nước ........................................................................... 7 1.2.1. Nghiên cứu về thành phần loài các loài nấm ký sinh côn trùng và nấm đông trùng hạ thảo ............................................................................................ 7 1.2.2. Nghiên cứu về giá trị dược liệu............................................................... 8 1.2.3. Nghiên cứu về nuôi trồng thể quả trên giá thể và nuôi cấy sinh khối hệ sợi ...................................................................................................................... 9 Chương 2 MỤC TIÊU - ĐỐI TƯỢNG - NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................................................................ 11 2.1. Mục tiêu nghiên cứu................................................................................. 11 2.2. Đối tượng nghiên cứu............................................................................... 11 2.3. Nội dung nghiên cứu. ............................................................................... 11 2.3.1. Phân lập các chủng nấm Isaria tenuipes ở Việt Nam ........................... 11 2.3.2. Đặc điểm sinh học của hệ sợi trong nuôi cấy thuần khiết .................... 11 2.3.3. Nghiên cứu hoạt tính của các chủng nấm ............................................. 11
iii 2.3.4. Nghiên cứu khả năng hình thành thể quả trên giá thể nhân tạo .......... 11 2.4. Phương pháp nghiên cứu.......................................................................... 12 2.4.1. Phương pháp phân lập .......................................................................... 12 2.4.2. Đặc điểm sinh học của hệ sợi trong nuôi cấy thuần khiết .................... 12 2.4.3. Phương pháp nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm bê ̣nh của chủng nấm Isaria tenuipes. ............................................................................. 14 2.4.4. Phương pháp nghiên cứu khả năng hình thành thể quả trên giá thể nhân tạo ........................................................................................................... 15 Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ........................................................... 16 3.1. Nghiên cứu đặc điểm hình thái, giải phẫu và đặc điểm sinh trưởng của chủng nấ m Isaria tenuipes .............................................................................. 16 3.1.1. Kế t quả điề u tra, phân lập và nghiên cứu đặc điể m sinh trưởng các chủng nấ m Isaria tenuipes tại vườn Quố c gia Ba Vì ...................................... 16 3.1.2. Nghiên cứu đặc điểm hình thái, giải phẫu nấ m Isaria tenuipes ........... 19 3.2. Nghiên cứu đặc điểm sinh học của hệ sợi nấm trong điều kiện nuôi cấy thuần khiết ....................................................................................................... 20 3.2.1. Nghiên cứu xác định môi trường dinh dưỡng tối ưu cho nhân sinh khối hệ sợi ............................................................................................................... 20 3.2.2. Nghiên cứu xác định nhiêt độ không khí tối ưu cho quá trình nhân sinh khối hệ sợi. ...................................................................................................... 25 3.2.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của pH môi trường đến sinh trưởng của hệ sợi .. 29 3.3. Phương pháp nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm bê ̣nh của chủng nấm Isaria tenuipes. ............................................................................. 33 3.3.1. Bước đầu đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của nấm Isaria tenuipes ... 33 3.3.2. Bước đầu đánh giá hoạt tính kháng nấm của nấm Isaria tenuipes ...... 36 3.4. Nghiên cứu đánh giá khả năng hình thành thể quả trên giá thể nhân ta ̣o .... 40 3.4.1. Nghiên cứu đánh giá khả năng hình thành thể quả trên giá thể lỏng . 40 3.4.2. Nghiên cứu nuôi trồng thể quả nấm Isaria tenuipes trên nhộng tằm .. 50 KẾT LUẬN - TỒN TẠI - KIẾN NGHỊ .......................................................... 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO
iv DANH MỤC CÁC BẢNG TT Tên bảng Trang Thành phần sinh hoá và nguyên tố khoáng trong nấm I. 1.1 tenuipes 3 Thành phần acid amin trong nấm đông trùng hạ thảo I. 1.2 tenuipes 4 Thành phần vitamin trong nấm Đông trùng hạ thảo I. 1.3 tenuipes 4 3.1 Đặc điểm và kết quả phân lập các chủng nấm ở Ba Vì 16 Kết quả xác định môi trường dinh dưỡng nhân sinh khối hệ 3.2 sợi nấm Isaria tenuipes 21 Xác định nhiệt độ không khí tố i ưu cho sinh trưởng của 3.3 nấm 26 Sinh trưởng của nấ m I. tenuipes ở các pH môi trường khác 3.4 nhau 29 Đường kính vòng ức chế khuẩn B. subtilis của nấm I. 3.5 tenuipes 33 Đường kính vòng ức chế nấm F. oxysporum của nấm I. 3.6 tenuipes 37 Xác định môi trường dinh dưỡng tối ưu nuôi trồng thể quả 3.7 nấm Isaria tenuipes 40 Kết quả xác định nhiệt độ không khí tố i ưu cho nuôi trồng 3.8 thể quả 43 Kết quả xác định nhiệt độ không khí tố i ưu cho nuôi trồng 3.9 thể quả 46 Kết quả nghiên cứu khả năng hình thành thể quả của nấm 3.10 Isaria tenuipes trên giá thể nhộng tằm 51
v DANH MỤC CÁC HÌNH TT Tên hình Trang 3.1 Hệ sợi nấm BV2 18 3.2 Hệ sợi nấm BV4 18 3.3 Hệ sợi nấm BV5 18 3.4 Hệ sợi nấm BV6 18 3.5 Hệ sợi nấm BV11 19 3.6 Hệ sợi nấm BV16 19 3.7 Hệ sợi nấm BV17 19 3.8 Thể quả nấm 20 3.9 Bào tử vô tính 20 Sinh trưởng hê ̣ sơ ̣i nấ m ở các môi trường dinh dưỡng khác 3.10 nhau 22 3.11 Sự khác nhau về đô ̣ dầ y hê ̣ sơ ̣i nấ m 22 Trọng lươ ̣ng tươi hê ̣ sơ ̣i ở các môi trường dinh dưỡng khác 3.12 nhau 23 Tro ̣ng lươ ̣ng khô hê ̣ sơ ̣i ở các môi trường dinh dưỡng khác 3.13 nhau 24 3.14 Sinh trưởng của nấ m ở thang nhiê ̣t đô ̣ không khí khác nhau 27 3.15 Tro ̣ng lươ ̣ng tươi hệ sơi ở các nhiệt độ không khí khác nhau 28 3.16 Tro ̣ng lươ ̣ng khô hệ sợi ở các nhiệt độ không khí khác nhau 28 Hê ̣ sơ ̣i nấm nuôi cấy trên môi trường CT5 ở các pH khác 3.17 nhau 30 Hê ̣ sơ ̣i nấm nuôi cấy trên môi trường CT7 ở các pH khác 3.18 nhau 30 3.19 Trọng lượng tươi hệ sợi ở pH môi trường khác nhau 32 3.20 Trọng lượng khô hệ sợi ở pH môi trường khác nhau 32 Đường kính vòng ức chế khuẩn B. subtilis của nấm I. 3.21 tenuipes 34
vi Khả năng kháng khuẩn Bacillus subtilis của nấm Isaria 3.22 tenuipes 35 Khả năng kháng khuẩn của nấm Isaria tenuipes và đối 3.23 chứng 36 Đường kính vòng ức chế nấm F. oxysporum của nấm I. 3.24 tenuipes 38 3.25 Khả năng kháng nấm của nấm Isaria tenuipes và đối chứng 39 3.26 Thể quả nấ m ở CT2,CT4 41 3.27 Thể quả nấ m ở CT5 41 Tro ̣ng lươ ̣ng tươi thể quả ở các môi trường dinh dưỡng 3.28 khác nhau 42 Tro ̣ng lươ ̣ng khô thể quả ở các môi trường dinh dưỡng khác 3.29 nhau 42 3.30 Thể quả nấm ở các thang nhiệt độ khác nhau 44 Tro ̣ng lươ ̣ng tươi thể quả ở các nhiệt độ không khí khác 3.31 nhau 45 Tro ̣ng lươ ̣ng khô thể quả ở các nhiệt độ không khí khác 3.32 nhau 45 3.33 Thể quả nấ m I. tenuipes trên các pH môi trường khác nhau 47 3.34 Trọng lượng khô thể quả ở pH môi trường khác nhau 48 3.35 Trọng lượng khô thể quả ở pH môi trường khác nhau 49 3.36 Hê ̣ sơ ̣i nấ m I. tenuipes 49 3.37 Thể quả nấ m I. tenuipes 53 3.38 Thể quả nấm sau 20 ngày 53 3.39 Thể quả nấm sau 30 ngày 53 3.40 Thể quả nấm sau 35 ngày 53 3.41 Thu hoạch thể quả nấm 53
1 ĐẶT VẤN ĐỀ Nấm đông trùng hạ thảo tuyết (Isaria tenuipes (Peck.) Samson), tên trước đây là (Paecilomyces tenuipes Peck.) là một loài nấm dược liệu được nuôi trồng và sử dụng lâu đời ở Hàn Quốc. Trong tự nhiên, loại nấm này tồn tại ở hai giai đoạn: giai đoạn hữu tính có tên là Cordyceps takaomontana Yakushiji, còn giai đoạn vô tính có tên là Isaria tenuipes Peck. Đây là một loài nấm có giá trị dược liệu quý, tác dụng chủ yếu trong điều trị và hỗ trợ điều trị bệnh ung thư nhờ tác dụng về dược lý và sinh học của chúng. Một hợp chất hóa học có hoạt tính sinh học có giá trị dược liệu chứa trong thể quả ở giai đoạn hữu tính và ở giai đoạn vô tính của loài nấm này là 4-acetyl- 12,13-epoxyl-9-trichothecene-3,15-diol (Oh, G.S. et.al. 2001). Đây là hợp chất đang được dùng để điều trị bệnh ung thư, đặc biệt là bệnh máu trắng ở các nước trên thế giới, đặc biệt được sử dụng rộng rãi ở Hàn Quốc (Eiji Yokoyama et al., 2003). Đây là một loài nấm dược liệu quý và lần đầu tiên được mô tả và được ghi nhận có phân bố ở Việt Nam. Qua các đợt điều tra, Trung tâm nghiên cứu bảo vệ rừng - Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam đã thu được một số mẫu Đông trùng hạ thảo tại rất nhiều nơi như: Vườn Quốc gia Ba Vì, Vườn quốc gia Tam Đảo, Khu bảo tồn thiên nhiên Tây Yên Tử,... và nguồn gen các loài này đang đươ ̣c lưu giữ bảo quản ta ̣i phòng. Việc nhân nuôi và gây trồng nhân tạo thành công loài nấm này có ý nghĩa vô cùng to lớn trong việc bảo tồn và phát triển loài này ở Việt Nam. Để nhân nuôi nhân ta ̣o thành công loài nấ m này thì không thể không biết được đặc điểm sinh học của chúng. Nghiên cứu đặc điểm sinh học của các loài nấm Isaria tenuipes là cơ sở khoa học quan trọng được xem như yếu tố quyết định đến sự thành bại của việc nuôi trồng thể quả nấm nhân tạo. Với những lý do trên, tôi tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu đặc điểm sinh học của nấm Đông trùng hạ thảo tuyết (Isaria tenuipes) có phân bố ở Việt Nam” nhằm góp phần bảo tồn, nghiên cứu ứng dụng và phát triển bền vững các loài Đông trùng hạ thảo quý hiếm. Thành công của đề tài sẽ có ý nghĩa rất lớn trong nghiên cứu khoa học và y học nước nhà, đặc biệt là cơ sở để tiếp tục nghiên cứu quy trình nuôi trồng nhân tạo loại nấm thần dược này.
2 Chương 1 TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1. Nghiên cứu ở ngoài nước 1.1.1. Nghiên cứu về phân loại nhóm nấm Đông trùng hạ thảo và nấm Đông trùng hạ thảo tuyết (Isaria tenuipes) Dựa trên đặc điểm hình thái cũng như đặc điểm về cấu trúc phân tử, các loài nấm đông trùng hạ thảo được xếp trong 162 đơn vị phân loại thuộc 2 họ Cordycipitaceae và Ophiocordycipitaceae [14]. Isaria tenuipes là một loài nấm phổ biến được tìm thấy tại nhiều khu vực miền núi Hàn Quốc [21]. Hình dạng nấm có thể mọc riêng lẻ hay thành cụm nhóm. Có thể mọc thẳng hoặc đột xuất nhánh, và có thể dài lên 45 mm, thân cây nấm chủ yếu là màu vàng chanh và bên trên có bột màu trắng [13]. Theo hệ thống phân loại truyền thống loài nấm Isaria tenuipes được xếp vào họ Clavicipitaceae [11]. Đây là một loài nấm dược liệu được nuôi trồng và sử dụng lâu đời ở Hàn Quốc. Trong tự nhiên, trên cùng một ký chủ, rất dễ dàng thấy 2 dạng thể quả: dạng thể quả chứa bào tử hữu tính (stromata) có tên go ̣i là Cordyceps takaomontana Yakushiji & Kumazawa và dạng thể quả chứa bào tử vô tính (synnemata) chính là Isaria tenuipes. 1.1.2. Nghiên cứu về thành phần hóa học của I. tenuipes Nấm I. tenuipes xâm nhiễm nhộng hay sâu non và sau đó hình thành các dạng thể quả màu vàng mọc thẳng hay phân nhánh ra bên ngoài mình của vật chủ. Theo y học truyền thống của Trung Hoa, dạng thể quả của nấm I. tenuipes có giá trị cao về mặt dược liệu do các tác dụng về dược lý và sinh học của chúng. Các hoạt chất Ergosterol peroxide và Acetoxyscirpenediol tách chiết từ nấm I. tenuipes nuôi cấy nhân tạo có khả năng ức chế các dòng tế bào ung thư ở người như tế bào khối u dạ dày, tế bào ung thư gan, tế bào ung thư ruột kết - ruột thẳng. Hoạt tính của Acetoxyscirpenediol mạnh hơn Cisplatin là hoạt chất đang được dùng điều trị cho các bệnh nhân ung thư hiện
3 nay là 4 đến 6,6 lần [16] . Một hợp chất hóa học có hoạt tính sinh học có giá trị dược liệu chứa trong thể quả ở giai đoạn hữu tính và ở giai đoạn vô tính của loài nấm Isaria tenuipes này là 4-acetyl-12,13-epoxyl-9-trichothecene- 3,15-diol [17]. Đây là hợp chất đang được dùng để điều trị bệnh ung thư, đặc biệt là bệnh máu trắng ở các nước trên thế giới, đặc biệt được sử dụng rộng rãi ở Hàn Quốc [10]. Trong dạng thể quả của nấm Isaria tenuipes còn chứa các hợp chất sinh học và giá trị dược phẩm cao, chẳng hạn như adenosine và N6-(2- hydroxyethyl) adenosine [13]. Có tác dụng tăng cường hệ thống miễn dịch và lấy lại năng lượng, tương tự các chức năng bổ của nhân sâm. Một số thành phần sinh hoá, nguyên tố khoáng, acid amin và các vitamin trong nấm đông trùng hạ thảo I. tenuipes đã được xác định như sau [30]: Bảng 1.1: Thành phần sinh hoá và nguyên tố khoáng trong nấm I. tenuipes STT Chỉ tiêu Đơn vị tính Hàm lượng 1 Protein % chất khô 7,75 2 Mannitol % chất khô 1,21 3 Lipid % chất khô 7,77 4 Cu mg/kg 21,1 5 Fe mg/kg 43,9 6 Mn mg/kg 22,2 7 Se mg/kg 0,32 8 Zn mg/kg 2,55 9 Ca mg/10g 12,0 10 Cr mcg/10g 0,80 11 K mg/10g 186,0 12 Na mg/10g 3,0
4 Bảng 1.2: Thành phần acid amin trong nấm đông trùng hạ thảo I. tenuipes Hàm Hàm TT Acid amin ĐV TT Acid amin ĐV lượng lượng 1 Alanin % 1,40 10 Methionine % 0,25 2 Glycin % 1,32 11 Glutamic acid % 2,46 3 Valin % 1,00 12 Phenylalanine % 1,30 4 Leucin % 1,44 13 Lysine % 2,66 5 Isoleucin % 0,69 14 Histidine % 0,80 6 Threonine % 0,83 15 Tyrosine % 2,89 7 Serin % 0,73 16 Cystine % 0,12 8 Proline % 2,83 17 Arginine % 5,30 9 Asparatic acid % 1,44 18 Tryptophan % 0,29 Bảng 1.3: Thành phần vitamin trong nấm Đông trùng hạ thảo I. tenuipes STT Acid amin Đơn vị tính Hàm lượng 1 Vitamin B1 mcg/10g 89,4 2 Vitamin B3 mg/10g 0,37 3 Vitamin B6 mcg/10g 19,1 4 Vitamin C mg/10g 1,25 5 Vitamin E mg/10g 0,23 6 Vitamin A mg/10g 0,12 7 Vitamin D mg/10g 242,0 1.1.3. Nghiên cứu về giá trị dược liệu của nấm Đông trùng hạ thảo Nấm Đông trùng hạ thảo là một loại nấm là loại dược liệu quý, rất tốt cho sức khoẻ, phù hợp với mọi lứa tuổi. Đông trùng hạ thảo là một vị thuốc bồi bổ hết sức quý giá, có tác dụng tích cực với rấ t nhiề u bệnh như rối loạn
5 tình dục, thận hư, liệt dương, di tinh, hay có tác dụng làm tăng cường công năng của tuyến thượng thận, cải thiện được chức năng thận, nâng cao năng lực miễn dịch, kháng khuẩn, kháng virus, chống ung thư và chất phóng xạ. Isaria tenuipes là một loài nấm có giá trị dược liệu quý, tác dụng chủ yếu trong điều trị và hỗ trợ điều trị bệnh ung thư nhờ tác dụng về dược lý và sinh học của chúng. Những hợp chất có hoạt tính chống khối u hoặc tác động đến hệ thống miễn dịch như: Leucinostatins A, D, Polygalactosamine, Saintopin, Sphingofungins E và F, UCE1022, Paeciloquinones A, B, C, D, E và F, Ergosterol peroxide, Acetoxyscirpenediol, … Đă ̣c biê ̣t, hoạt chất Ergosterol peroxide và Acetoxyscirpenediol trong nuôi cấy nhân tạo có khả năng ức chế các dòng tế bào ung thư ở người như khối u dạ dày, ung thư gan, ung thư ruột kết - ruột thẳng được tách chiết và thử nghiệm trên lâm sàng. Không chỉ vậy loài nấm Isaria tenuipes còn được phát hiện có hàm lượng dinh dưỡng cao: giàu các vitamin D, vitamin B1, vitamin B6, và nhiều nguyên tố khoáng như K, Fe, Mg, Cu... (Borchers et al., 1999; Liu et al., 1996; Lee et al., 1996). Trong thể quả của nấm Isaria tenuipes còn chứa các hợp chất sinh học và giá trị dược phẩm cao, chẳng hạn như adenosine và N6-(2-hydroxyethyl) adenosine [13]. Nấm này đã được sử dụng như một loại thuốc dân gian truyền thống hoặc như là một thực phẩm thành phần tăng cường hệ thống miễn dịch và lấy lại năng lượng, tương tự như các chức năng bổ của nhân sâm. Một kết quả thí nghiệm về sức sống của chuột cho thấy chuột uống dịch nấm đông trùng hạ thảo chiết trong nước, chiết trong cồn và đối chứng (được uống nước vô trùng) đều sống khỏe mạnh trong 4 tuần thí nghiệm và biểu hiện bình thường về hình thái, tập tính trong ăn, uống và các hoạt động khác trong cả 2 lần thí nghiệm dù liều dùng cho chuột/ngày là rất cao so với thể trọng của chuột. Điều này cho thấy với liều uống hàng ngày tương đương
6 890mg nấm đông trùng hạ thảo Isaria tenuipes/kg thể trọng là an toàn đối với chuột bạch. Thời gian bơi của chuột được uống dịch chiết nấm trong nước và trong cồn đều dài hơn so với đối chứng. Chuột đối chứng có thời gian bơi dao động từ 3 đến 4 giờ, còn ở các công thức được uống dịch chiết của nấm thường là trên 5 giờ. Điều đó cho thấy nấm đã tăng cường khả năng vận động của chuột. 1.1.4. Nghiên cứu về nuôi trồng thể quả trên giá thể và nuôi cấy sinh khối hệ sợi Trong những năm gần đây cùng với phương pháp nuôi cấy hệ sợi nấm trong môi trường lỏng (Xu và cs, 2003; 2004; 2006) thì phương pháp nuôi cấy nấm nhân tạo trên giá thể tằm - nhộng để sản xuất nấm ở qui mô lớn làm dược liệu hoặc thức ăn bổ dưỡng rất phát triển tại các nước như Nhật Bản, Trung Quốc và Hàn Quốc [22]; Kikuchi và cs, 2004. Nuôi cấy thu sinh khối hệ sợi cũng được các tác giả tiến hành trên môi trường dinh dưỡng lỏng với thành phần như sau: 40 g/lít đường glucose, 10 g/lít cao nấm men, 0.5 g/lít KH2PO4, 0.5 g/lít K2HPO4:3H2O, và 0.5 g/lít MgSO4.7H2O. Ở Hàn Quốc dạng bào tử vô tính Isaria tenuipes đã được nuôi cấy trên môi trường có chứa nhộng tằm, kết quả cho thấy tỷ lệ số ng cao nhất đạt 97,6% trên các giống tằm được thử nghiệm. Trọng lượng tươi của bào tử vô tính Isaria tenuipes khác nhau tùy theo từng mùa, dao động từ 1,44 ~ 0,94 g. Đạt cao nhất khi nuôi cấy vào mùa xuân. Bào tử vô tính của I. tenuipes sản xuất trên nhộng là màu trắng hoặc màu trắng sữa, và tương tự về hình dạng và màu sắc thể quả thu thập trong tự nhiên [20]. Trong những năm gần đây cùng với phương pháp nuôi cấy hệ sợi nấm trong môi trường lỏng thì phương pháp nuôi cấy nấm nhân tạo trên giá thể nhộng tằ m [15]. Ngoài ra nấm cũng được nuôi cấy trên môi trường gạo và nhộng tằm [20].
7 Thành phần môi trường nuôi cấy nấm luôn là đề tài để các nhà khoa học nghiên cứu tìm ra môi trường thích hợp nhất phù hợp với mục đích nuôi cấy. Thành phần trong 1 lít môi trường [9]: 50g glucose, 1.84g NH4NO3, 0.39g KH2PO4, 1.42g Na2HPO4.12H2O, 0.60g MgSO4.7H2O, 0.1mg KCl, 2mg MnSO4.H2O, 10mg CoCl2.6H2O, 2mg Na2MoO4·2H2O, 20mg ZnSO4.7H2O, 3mg of CuSO4·5H2O, 2mg of FeSO4.7H2O and 60mg of EDTA. Trong thành phần này KH2PO4 phosphate làm ảnh hưởng đến sinh khối của nấm tuy nhiên lại có khả năng kích thích làm tăng số lượng thể quả. 1.2. Nghiên cứu ở trong nước 1.2.1. Nghiên cứu về thành phần loài các loài nấm ký sinh côn trùng và nấm đông trùng hạ thảo Các loài nấm ký sinh côn trùng như Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae,... đã được nghiên cứu về những vấn đề khác nhau như điều tra thành phần loài, loài sâu bị ký sinh, phân lập và nuôi cấy trong phòng thí nghiệm và đặc biệt là nhân sinh khối, tạo chế phẩm để phòng trừ một số loài sâu hại đối với cây nông nghiệp và cây lâm nghiệp. Phân lập và sử dụng nấm Beauveria để phòng trừ mọt hại nông sản [2]. Nghiên cứu sản xuất với quy mô công nghiệp và thử nghiệm trên diện rộng chế phẩm nấm ký sinh côn trùng Beauveria và Metarhizium được thể hiện nhiều trong các công trình nghiên cứu của [7]. Trong báo cáo tổng kết đề tài "Nghiên cứu xây dựng công trình nuôi trồng nấm đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris (L.:Fr.) có giá trị dược liệu và thương mại cao" của PGS.TS Phạm Quang Thu [6] cho thấy đã điều tra được rất nhiều mẫu nấm của Isaria tenuipes. Loài nấm I. tenuipes này lần đầu tiên được phát hiện và mô tả ở Việt Nam vào năm 2010 [4]. Loài nấm này phân bố ở rừng tự nhiên nhiệt đới lá rộng thường xanh ở độ cao từ 800 - 1000 m so với mực nước biển. Hiêṇ đã phát hiêṇ đươ ̣c nhiề u mẫu nấ m Isaria
8 tenuipes ở các Vườn Quốc gia Ba Vì - Hà Nội và Vườn Quốc gia Tam Đảo - Vĩnh Phúc, Vườn Quố c gia Tây Yên Tử - Quảng Ninh. Nấm mọc đơn lẻ hoặc mọc thành cụm, chùm trên nhộng thuộc bộ Cánh vẩy [5]. 1.2.2. Nghiên cứu về giá trị dược liệu Tác dụng của đông trùng hạ thảo cũng được nhiều tác giả Việt Nam khẳng định. Theo tài liệu tổng hợp của y học cổ truyền Việt Nam thì đông trùng hạ thảo có tác dụng bổ phế và thận, ích khí, chỉ huyết và trừ đờm. Chủ trị: trị ho lâu ngày, yếu mệt, thổ huyết, nhiều mồ hôi, di tinh, đau lưng mỏi gối. Thận kém biểu hiện như bất lực, xuất tinh và đau lưng dưới và đầu gối: Dùng đông trùng hạ thảo với Sơn thù du, Sơn dược và Thỏ ti tử, hoặc dùng độc vị đông trùng hạ thảo. Ho và hen mạn tính hoặc ho có đờm máu, do phế hư: Dùng đông trùng hạ thảo với Sa sâm, A giao và Xuyên bối mẫu. Ra mồ hôi nhiều do cơ thể mệt, ốm: đông trùng hạ thảo nấu với thịt gà, vịt hoặc heo [29]. Đỗ Tất Lợi (1977) [1] cho rằng Đông trùng hạ thảo là một vị thuốc bổ, dùng để chữa trị thần kinh suy nhược, chữa ho, ho lao, bổ tinh khí, chữa đau lưng, bổ thận. Liều dùng 6 - 12 g với hình thức ngâm rượu. Một số sản phẩm từ nấm Đông trùng hạ thảo I. tenuipes [30]: - Nấm khô: Nấm tươi sau khi thu hoạch được sấy ở 600C trong 24 giờ và bảo quản trong tùi nylon hàn kín. - Rượu Đông trùng hạ thảo: phát triển sản phẩm rượu từ nấm Đông trùng hạ thảo nhằm mục đích tăng cường thể lực. Thành phần của rượu bao gồm: Nấm khô được ngâm trong rượu nếp với tỷ lệ 20 gr nấm khô trong 1lít rượu. Rượu có màu vàng nâu, mùi vị thơm, ngon. - Viên nang Đông trùng hạ thảo: Bột nấm Đông trùng hạ thảo bổ sung thêm chất phụ gia được trộn ướt bằng máy trộn siêu tốc rồi sấy tầng sôi ở 700C trong 20 phút. Sau đó trộn khô, đóng viên nang, mỗi viên 400mg. Đóng lọ 50 viên.
9 1.2.3. Nghiên cứu về nuôi trồng thể quả trên giá thể và nuôi cấy sinh khối hệ sợi Ở Việt Nam thì các nghiên cứu về nuôi trồng thể quả nấm đông trùng hạ thảo Isaria tenuipes có rất ít. Quy trình sản xuất đông trùng hạ thảo trên tằm dâu của tiến sỹ Nguyễn Mậu Tuấn [30] tại Trung tâm Nghiên cứu Thực nghiệm Nông Lâm nghiệp Lâm Đồng tại Bảo Lộc hoàn tất đã mở ra một hướng đi mới đầy triển vọng cho Lâm Đồng trong việc sản xuất dược liệu quý trên diện rộng. Đây là người đầu tiên trong nước đưa ra được qui trình hoàn chỉnh về sản xuất đông trùng hạ thảo trên con tằm dâu, một loại côn trùng được người dân nuôi từ rất lâu đời và với qui trình này có thể sản xuất đại trà loại dược liệu quý này ngay trên đất Lâm Đồng. Cho đến nay tiến sỹ Tuấn đã hoàn thiện 2 qui trình nuôi cấy đông trùng hạ thảo ở 2 sản phẩm là nhộng trùng thảo (Cordyceps militaris) trên nhộng tằm dâu và đông trùng hạ thảo tằm dâu (Cordyceps takaomontana hay Isaria tenuipes (còn gọi là Paecilomyces tenuipes)) trên con tằm dâu. Theo Tiến sỹ Nguyễn Xuân Thám [30], Phó Giám đốc Sở Khoa học Công nghệ Lâm Đồng, việc hoàn tất qui trình sản xuất đông trùng hạ thảo trên tằm dâu có ý nghĩa đặc biệt cho những người làm nghiên cứu sinh học trên đất Lâm Đồng, mở ra một hướng đi mới cho việc nghiên cứu sản xuất các loại dược liệu ở địa phương phục vụ phát triển kinh tế xã hội. Nhận xét: Từ phần tổng quan tài liệu những nghiên cứu về Đông trùng hạ thảo cho thấy: nấm Đông trùng hạ thảo là một loài nấm có giá trị dược liệu quý, chữa trị được nhiều loài bệnh nan y như ung thư, kháng khuẩn, chống oxy hóa và các bệnh về yếu sinh lý.
10 Nghiên cứu về thành phần loài, giá trị dược liệu và nuôi trồng thể quả được tiến hành nghiên cứu với trình độ cao ở nhiều nước trên thế giới và đạt được kết quả tốt. Tại Việt Nam, những nghiên cứu về thành phần loài nấm Đông trùng hạ thảo được công bố vào năm 1996 và 2001 có 3 loài nấm thuộc chi Cordyceps. Về thành phần hóa học và giá trị dược liệu chưa được nghiên cứu nhiều, từ các nguồn tài liệu khác nhau, các nhà khoa học đã khẳng định nấm Đông trùng hạ thảo là một dược liệu quý và hiếm. Từ những cơ sở lý luận trên, việc nghiên cứu hệ thống về nấm Đông trùng hạ thảo ở Việt Nam là rất cần thiết. Việc phân lập thuần khiết các chủng nấm ở Việt Nam để lưu trữ nguồn gen và tiến hành xác định hàm lượng để tuyển chọn chủng có tiềm năng dược liệu cao. Đây là cơ sở ban đầu để tiếp tục nghiên cứu quy trình nuôi trồng nấm trong điều kiện ở Việt Nam.
11 Chương 2 MỤC TIÊU, ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Mục tiêu nghiên cứu. - Tìm hiểu một số đặc điểm của hệ sợi trong nuôi cấy thuần khiết của các chủng nấm đã thu thập được. - Đánh giá hoạt tính sinh học của chủng nấm thông qua hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm bệnh của chúng. - Đánh giá khả năng hình thành thể quả trên giá thể nhân tạo. 2.2. Đối tượng nghiên cứu Chủng nấm Isaria tenuipes sưu tầm ở Vườn quốc gia Ba Vì. 2.3. Nội dung nghiên cứu. 2.3.1. Phân lập các chủng nấm Isaria tenuipes ở Việt Nam - Phân lâ ̣p và nghiên cứu đặc điểm sinh trưởng của hệ sợi nấm trong nuôi cấy thuần khiết. - Nghiên cứu đặc điểm hình thái nấ m Isaria tenuipes. 2.3.2. Đặc điểm sinh học của hệ sợi trong nuôi cấy thuần khiết - Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến sinh trưởng của hệ sợi. - Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ không khí đến sự sinh trưởng của hệ sợi. - Nghiên cứu ảnh hưởng của pH môi trường đến sinh trưởng của hệ sợi. 2.3.3. Nghiên cứu hoạt tính của các chủng nấm - Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các chủng Isaria tenuipes. - Đánh giá hoạt tính kháng nấm của các chủng Isaria tenuipes. 2.3.4. Nghiên cứu khả năng hình thành thể quả trên giá thể nhân tạo - Thí nghiệm nuôi trồng các chủng Isaria tenuipes trên giá thể lỏng - Thí nghiệm nuôi trồng các chủng Isaria tenuipes trên nhộng tằm.
12 2.4. Phương pháp nghiên cứu. 2.4.1. Phương pháp phân lập 2.4.1.1. Phương pháp phân lập và nghiên cứu đặc điểm sinh học của hệ sợi trong nuôi cấy thuần khiết Phân lâ ̣p nấ m: Môi trường phân lập nấm Đông trùng hạ thảo là môi trường PDA (Potato Dextrose Agar). Môi trường sau khi pha xong được hấp khử trùng ở 121oC trong thời gian 20 phút sau đó được đổ vào các hộp lồng vô trùng. Chọn thể quả nấm tươi mới, non không bị sâu bệnh. Tách lấy bô ̣t bào tử nấ m cấy vào môi trường dinh dưỡng. Sau đó cất giữ mẫu trong tủ định ôn ở nhiệt độ 25oC. Khi sơ ̣i nấ m bắ t đầ u xuấ t hiêṇ chọn sợi nấm không bị tạp nhiễm mọc ra từ mô nấm cấy truyền sang môi trường dinh dưỡng mới. Sau khi tách sợi nấm khoảng 2 - 3 lần, sợi nấm không bị nhiễm khuẩn, nấm tạp và sợi nấm mọc đồng nhất thì được sợi nấm thuần khiết. Đặc điểm sinh trưởng của hệ sợi nấm trong nuôi cấy thuần khiết: Các chủng nấm được cấy trên môi trường chuẩn PDA và được nuôi trong tủ định ôn có nhiệt độ 250C. Định kỳ theo thời gian 05 ngày quan sát mô tả cách thức mọc, màu sắc, và đo tốc độ sinh trưởng của hệ sợi và khả năng sinh bào tử vô tính (bào tử chồi) của nấm. Sử dụng phương pháp quan sát, mô tả, đo đếm và chụp ảnh dưới sự hỗ trợ của kính hiển vi quang học và kính soi nổi. 2.4.1.2. Nghiên cứu đặc điểm hình thái của nấm Isaria tenuipes Nhận biết đặc điểm hình thái qua quan sát, mô tả, chụp ảnh (hình dạng, kích thước, màu sắc…) bằng mắt thường, kính hiển vi soi nổi Olympus SZ- PT và kính hiển vi quang học Olympus BX50, xem đặc điểm của nấm như thể quả, bào tử, (hình dạng, kích thước, màu sắc, cách thức sắp xếp…). 2.4.2. Đặc điểm sinh học của hệ sợi trong nuôi cấy thuần khiết 2.4.2.1. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến sinh trưởng và phát triển của hệ sợi.
13 Nấ m đươ ̣c nuôi cấy trên 07 môi trường dinh dưỡng lỏng với thành phần như sau: TT Công thức Mô tả công thức thí nghiệm 1 40 g/lít glucose + 10 g/lít peptone + 0.5 g/lít KH2PO4 Công thức 1 + 0.5 g/lít K2HPO4:3H2O + 0.5 g/lít MgSO4.7H2O. 40 g/lít succose + 10 g/lít peptone + 0.5 g/lít KH2PO4 2 Công thức 2 + 0.5 g/lít K2HPO4:3H2O, + 0.5 g/lít MgSO4.7H2O. 40 g/lít maltose + 10 g/lít peptone + 0.5 g/lít KH2PO4 3 Công thức 3 + 0.5 g/lít K2HPO4:3H2O, và 0.5 g/lít MgSO4.7H2O. 40 g/lít fructose + 10 g/lít peptone + 0.5 g/lít KH2PO4 4 Công thức 4 + 0.5 g/lít K2HPO4:3H2O, + 0.5 g/lít MgSO4.7H2O. 40 g/lít glucose + 10 g/lít peptone + 0.5 g/lít KH2PO4 5 Công thức 5 + 0.5 g/lít K2HPO4:3H2O, + 0.5 g/lít MgSO4.7H2O + 10g/lit yeast extract. 6 Công thức 6 200 g/lít khoai tây + 20 g/lít glucoze. 30 g/lít glucose + 3 g/lít peptone + 0.5 g/lít KH2PO4 7 Công thức 7 + 0.5 g/lít K2HPO4:3H2O, + 0.5 g/lít MgSO4.7H2O + 3 g/lit yeast extract + 5g/l nhộng. Môi trường được pha chế theo đúng tỷ lệ, hấp khử trùng ở 121 oC và được đổ vào các lọ thuỷ tinh sạch, để nguội và cấy nấm. Mỗi loài nấm được cấy trên 10 bình thuỷ tinh, thí nghiệm lặp lại 03 lần. Sinh trưởng của hệ sợi đánh giá thông qua tro ̣ng lươ ̣ng tươi, tro ̣ng lươ ̣ng khô hê ̣ sơ ̣i. Xử lý số liệu bằng Excel và SPSS. 2.4.2.2. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ không khí đến sinh trưởng và phát triển của hệ sợi Sau khi cấy nấm vào hộp lồng chứa môi trường thích hợp đặt vào các thang nhiệt độ không khí khác nhau: 100C, 150C, 200C, 250C, 300C và 350C.
14 Chỉ tiêu đánh giá là sinh trưởng của hệ sợi, và sự hình thành bào tử vô tính (bào tử chồi). Mỗi thang nhiê ̣t đô ̣ được cấy trên 10 bình thuỷ tinh, thí nghiệm lặp lại 03 lần. Xử lý số liệu bằng Excel và SPSS. 2.4.2.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của độ pH môi trường đến sinh trưởng và phát triển của hệ sợi. Nấm đươ ̣c cấ y trong các thang pH khác nhau: 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9. pH của môi trường đươ ̣c điề u chin ̉ h bằng dung dịch HCL 10% và KOH 10%. Sau khi đã điều chỉnh pH môi trường đem hấp khử trùng ở 121 0C tương đương 1 atm trong 20 phút. Cấy nấm vào các lọ chứa môi trường thích hợp có độ pH khác nhau, theo dõi ở thang nhiệt độ 250C và độ ẩm không khí thích hợp. Chỉ tiêu đánh giá là sinh trưởng của hệ sợi, và sự hình thành bào tử vô tính (bào tử chồi). Mỗi thang pH được cấy trên 10 bình thủy tinh, thí nghiệm lặp lại 03 lần. Xử lý số liệu bằng Excel và SPSS. 2.4.3. Phương pháp nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm bê ̣nh của chủng nấm Isaria tenuipes. Chuẩn bị dịch nuôi cấy: Nuôi cấy hệ sợi nấm của các chủng nấm Đông trùng hạ thảo cần thử hoạt tính trên môi trường lỏng sau 25 ngày lọc lấy dịch nuôi cấy. Các chất có hoạt tính sinh học do hệ sợi nấm Đông trùng hạ thảo tạo ra có trong dịch nuôi cấy. 2.4.3.1. Phương pháp nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn của chủng nấm Isaria tenuipes. Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn: Khuẩn được chọn để đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của nấm Isaria tenuipes loài Bacillus subtilis. Môi trường PDA được đổ ra các hộp lồng để nguội trang khuẩn Bacillus subtilis đều trên mặt thạch, giữa hộp lồng khoan lấy 01 giếng thạch có đường kính 10mm, cho 01ml dịch nuôi cấy nấm vào giếng ở giữa hộp lồng. Nuôi cấy nấm trong điều kiện 250C, xác định đường kính vòng ức chế. Mỗi loài nấm thí nghiệm với 05 hộp lồng với 03 lần nhắc lại.