Luận văn Thạc sĩ Khoa học Lâm nghiệp: Nghiên cứu nhân giống thông caribê (Pinus caribaea Morelet ) bằng phương pháp nuôi cấy in vitro

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:61

Thêm vào BST

Báo xấu

28
lượt xem 2
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Đề tài “Nghiên cứu nhân giống Thông caribê (Pinus caribaea Morelet) bằng phương pháp nuôi cấy in vitro” nhằm tạo được nguồn mẫu sạch đủ lớn từ 2 loại nguyên liệu (hạt chín, chồi cành từ thực địa). Phát triển quy trình nhân nhanh chồi in vitro hiệu quả, hệ số nhân chồi cao. Mời các bạn cùng tham khảo!

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Khoa học Lâm nghiệp: Nghiên cứu nhân giống thông caribê (Pinus caribaea Morelet ) bằng phương pháp nuôi cấy in vitro

1 BỘ GIÁO DỤC & ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP & PTNT TRƯỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP ------------------ NGUYỄN VĂN PHONG NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG THÔNG CARIBÊ ( Pinus caribaea Morelet ) BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY IN VITRO LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC LÂM NGHIỆP HÀ NỘI - 2009
2 BỘ GIÁO DỤC & ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP & PTNT TRƯỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP ------------------- NGUYỄN VĂN PHONG NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG THÔNG CARIBÊ ( Pinus caribaea Morelet ) BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY IN VITRO Chuyên ngành: Lâm học Mã số: 60. 62. 60 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC LÂM NGHIỆP NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. CHU HOÀNG HÀ HÀ NỘI - 2009
1 ĐẶT VẤN ĐỀ Việc nâng cao chất lượng rừng, sử dụng các loài cây có giá trị về kinh tế và môi trường, sinh trưởng nhanh, thích ứng được nhiều điều kiện sinh thái, lập địa không tốt là chiến lược phát triển của ngành Lâm nghiệp từ năm 2010 đến 2020. Bên cạnh việc lựa chọn các loài cây bản địa cho trồng mới, khoanh nuôi làm giàu rừng, công tác nghiên cứu, khảo nghiệm trồng thử các loài cây ngoại lai đóng vai trò rất quan trọng (Quyết định số 18/2007/QĐ-TTg ngày 5 tháng 2 năm 2007 của thủ tướng chính phủ) [1]. Hiện nay, Thông caribê (Pinus caribaea Morelet), là một trong những loài cây lâm nghiệp đang được quan tâm phát triển [11], [19]. Thông caribê thuộc họ thông (Pinaceae) với 3 biến chủng là: Pinus caribaea var caribaea, Pinus caribaea var hondurensis và Pinus caribaea var bahamensis có phân bố tự nhiên ở vùng Trung Mỹ. Thông caribê đã được du nhập vào nhiều nước khác nhau, chủ yếu là các nước thuộc vùng nhiệt đới và á nhiệt đới. Ở Việt Nam, Thông caribê được đưa vào trồng khảo nghiệm từ năm 1963 tại vùng Đà Lạt (Lê Đình Khả, 2003). Đây là loài cây lá kim sinh trưởng nhanh, thẳng đẹp, cành nhánh nhỏ hơn Thông Ba lá, Thông Mã vĩ và Thông nhựa, gỗ có thớ thẳng mịn, độ bóng vừa phải, thường được sử dụng làm ván ép (Bredenkamp và Van Vuuen, 1987). Ngoài ra Thông caribê còn được sử dụng làm gỗ xây dựng, gỗ trụ mỏ, ván dăm, ván ép, bột sợi giấy dai, gỗ đóng tàu thuyền, gỗ đóng Contenơ, gỗ đóng nội thất, lấy nhựa… Thông caribê còn có một lợi thế khác là có khả năng thích ứng với nhiều vùng sinh thái khác nhau của nước ta [3], [9], [11], [19]. Khả năng gây trồng Thông cairibê ở nước ta đã được công bố trong tiêu chuẩn ngành (04TCN 68 - 2004). Theo quyết định số 62/2006 QĐ-BNN, ngày 16/8/2006 của Bộ trưởng Bộ Nông nghiệp & PTNT về chiến lược phát triển giống cây lâm nghiệp giai đoạn 2006 - 2020, nhu cầu lượng cây giống Thông
2 caribê cần hàng năm trong giai đoạn 2006 – 2015 là 14.000.000 cây/năm. Đây là số lượng cây giống cần rất lớn, hiện nay Thông caribê hiện được trồng bằng hạt sinh trưởng khá nhanh. Tuy vậy, việc nhân giống sinh dưỡng, đặc biệt là nhân giống bằng hom và nuôi cấy mô là cơ sở để tạo nguồn giống có chất lượng di truyền đồng đều, giữ được đặc điểm di truyền của cây lấy mẫu, làm cơ sở cho công tác khảo nghiệm dòng vô tính của những cây trội được chọn lọc. Nhân cây vô tính dễ dàng chủ động được nguồn giống, không bị ảnh hưởng bởi mùa vụ và thời tiết. Nhân giống sinh dưỡng Thông caribê đã và đang được nhiều nhà khoa học trong và ngoài nước quan tâm nghiên cứu và bước đầu thu được một số kết quả khả quan như: nhân giống bằng hom đã tạo được lượng lớn cây giống với tỉ lệ hom ra rễ 93,3%…. Ở Việt Nam, nghiên cứu thăm dò nhân giống in vitro Thông caribê đã được một số nơi nghiên cứu [7], [23] nhưng đạt hệ số nhân chồi thấp 1,7 lần (Phạm Thị Kim Thanh, 2007) và chưa xây dựng được quy trình để có thể ứng dụng trong sản xuất. Xuất phát từ cơ sở trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu nhân giống Thông caribê (Pinus caribaea Morelet) bằng phương pháp nuôi cấy in vitro”. Với mục tiêu nghiên cứu như sau: + Tạo được nguồn mẫu sạch đủ lớn từ 2 loại nguyên liệu (hạt chín, chồi cành từ thực địa). + Phát triển quy trình nhân nhanh chồi in vitro hiệu quả, hệ số nhân chồi cao. Nội dung nghiên cứu chính + Tạo mẫu sạch từ hạt và chồi cành của cây Thông caribê. + Tạo đa chồi trong điều kiện nuôi cấy in vitro. + Thử nghiệm khả năng tạo rễ in vitro cây Thông caribê.
3 Chương 1. TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 1.1. Giới thiệu cây Thông caribê 1.1.1. Nguồn gốc, phân loại và phân bố Thông caribê (Pinus caribaea Morelet) là loài cây nhiệt đới, họ thông (Pinaceae) và nằm trong bộ thông (Coniferales) ngành hạt trần (Gynospermae) [3]. Thông caribê là loài thông bản địa ở vùng Trung Mỹ. Dựa vào sự phân bố tự nhiên của loài ở các vùng địa lý khác nhau, Thông caribê được chia thành 3 biến chủng (Luckhof, 1964; Lamb, 1973) như sau: - Pinus caribaea var hondurensis (PCH) phân bố dọc bờ biển Đại Tây Dương vùng Trung Mỹ, từ Belize tới bắc Nicaragua, từ 120 đến 180 vĩ độ Bắc, từ 83030’ tới 89025’ kinh độ Tây. PCH mọc tự nhiên ở Belize, Guatemala, Honduras và Nicaragua ở độ cao dưới 1000m so với mặt nước biển. Cây trưởng thành có thể cao tới 35 - 40m, sinh khối đạt khoảng 10 - 40m3/ha/năm. - Pinus caribaea var bahamensis (PCB) phân bố ở quần đảo Bahamas và Caicos (240 - 270 vĩ độ Bắc, 71040’ - 790 kinh độ Tây). Cây mọc ở độ cao gần 12m so với mặt nước biển, cây trưởng thành cao khoảng 15 - 20m. - Pinus caribaea var caribaea (PCC) phân bố ở phía tây Cuba và trên đảo thông (220 - 230 vĩ độ Bắc, 82020’ - 84015’ kinh độ Tây). Cây mọc tự nhiên ở độ cao dưới 280m so với mặt nước biển. Vùng phân bố tự nhiên của PCH từ bờ biển vào sâu trong lục địa nên sự biến động của các yếu tố khí hậu là khá lớn. Ví dụ nhiệt độ mùa đông ở nội địa của Belize có thể xuống tới 50C, trong khi mùa hè có thể nóng tới 370C. Tuy nhiên, nhiệt độ không bao giờ xuống tới mức đóng băng. Lượng mưa phân bố không đều giữa các vùng, biến động từ 1.500mm/năm ở núi thông (Belize) tới 3.900 mm/năm ở Bluefields (Nicaragua). Những lâm phần thông ở sâu trong lục địa có lượng mưa thấp hơn so với ven biển. Lượng mưa hàng năm ở thung lũng sông Choluteca ở Hunduras có thể xuống tới 660mm với 6
4 tháng lượng mưa không vượt quá 40mm/tháng. Vì phân bố ở vùng Trung Mỹ, PCH thích hợp với nhiều loại đất, từ đất cát xốp, thoát nước tốt, đất phù sa dọc bờ biển Đại Tây Dương tới các loại đất trong lục địa được hình thành từ các loại đá mẹ phiến thạch, granite, schist và đá cát với độ PH từ 4 đến 5, tầng đất từ dày tới mỏng. Đất sét chặt bí, thoát nước không tốt không thích hợp với Thông caribê [6]. Quần đảo Bahamas và Caicos, nơi PCB mọc tự nhiên có khí hậu ấm áp, mùa đông khô và không có sương muối. Biến động về nhiệt độ không quá lớn giữa các mùa trong năm. Nhiệt độ trung bình dao động từ khoảng 220C ở tháng lạnh nhất tới 280C ở tháng nóng nhất. Lượng mưa trung bình năm là 1.185mm và tập trung chủ yếu ở các tháng 9 và 10. Lượng mưa biến động từ khoảng 177mm ở tháng có lượng mưa nhiều nhất tới 32mm ở tháng khô nhất. Mùa khô từ tháng 11 tới tháng 4 năm sau. PCB nơi nguyên sản mọc tốt trên đất phong hoá từ đá vôi san hô, thoát nước tốt. Loại đất này khá nông, nghèo dinh dưỡng và chứa đựng nhiều ôxít sắt bị rửa trôi từ tầng đá vôi. Vì được hình thành từ đá vôi nên có tính kiềm cao, độ PH = 8,4 hoặc có thể cao hơn. Tuy nhiên, nấm cộng sinh ở rễ của PCB phát triển tốt ở đất có tính kiềm cao và có thể sẽ là nguyên nhân chủng này không được gây trồng nhiều ở ngoài nơi phân bố tự nhiên của chúng. PCC sinh trưởng ở điều kiện biến động lớn về nhiệt độ thì phát triển kém. Nhiệt độ thấp nhất và cao nhất ở Cuba có thể là từ 120C tới 340C. Lượng mưa biến động từ 1.060mm/năm ở bờ biển phía Nam tới 1.794mm/năm ở đảo thông. Vùng phân bố của PCC cũng có một mùa đông khô và lượng mưa tập trung vào một số tháng mùa hè. PCC nơi nguyên sản thích hợp với đất phát triển trên đá mẹ phiến thạch hoặc đá cát, thoát nước tốt, độ PH < 5. PCC không sinh trưởng trên đất đá vôi mặc dù dạng đất này có rất nhiều ở Cuba [10].
5 1.1.2. Đặc điểm sinh học và sinh thái học Thông caribê cao 15 - 40m, đường kính có thể trên 100cm. Thân thẳng tán hình tháp. Cành nghiêng sau xoè rộng. Vỏ màu nâu nhạt, nứt dọc sau bong từng mảng dài. Chồi hình trụ tròn màu nâu thẫm. Lá hình kim mọc cụm trên đầu cành ngắn, mỗi cụm 3 lá ít khi 4 hoặc 5 lá. Lá dài 15 - 25cm đường kính 1,5mm màu xanh vàng, hai mặt trên có dải phấn trắng, mép có răng cưa nhỏ. Bẹ bao quanh gốc cụm lá dài 10 - 20mm màu nâu nhạt gồm nhiều lá hình vẩy trong suốt, sống lâu. Nón đực hình trụ, dài 1,3 - 3,2cm. Nón cái trên đầu cành non hình viên chuỳ dài 5 - 10cm, đường kính 2,5 - 3,8cm. Nón cái chín trong 2 năm, lúc đầu màu tím hồng sau màu xanh, khi chín hoá gỗ màu nâu. Nón có cuống ngắn thuờng vẹo và quặp về phía cành. Vẩy nón hình thoi, mặt vẩy mỏng hơi lồi, giữa có một gai nhọn gần 1mm. Hạt hình trứng dài 6mm, đường kính 3mm. Vỏ hạt nâu có nhiều chấm tròn. Hạt có cánh mỏng dài 2 - 2,5cm. Hệ rễ hỗn hợp, nơi tầng đất dày rễ cọc ăn sâu, nơi tầng đất mỏng hệ rễ bên rất phát triển. Là cây ưa sáng, nhạy cảm với sương giá và lửa, là một trong những loài cây lá kim mọc nhanh trên thế giới, ở lập địa thích hợp cây 15 tuổi tăng trưởng bình quân năm có thể đạt 1,5m chiều cao và 2,5cm đường kính. Ra nón tháng 3 - 4. Nón chín tháng 7 - 8 năm sau. 1.1.3. Giá trị sử dụng Gỗ màu vàng nhạt, lõi màu đỏ, có thớ thẳng mịn, độ bóng vừa phải, thường được dùng làm ván ép. Thân thẳng, dễ cưa xẻ nhưng phụ thuộc nhiều vào độ tuổi tương đối cứng tỉ trọng 0,5 - 0,7. Có thể dùng trong xây dựng, làm trụ mỏ, tiện khắc và bột sợi giấy dai, gỗ đóng tàu thuyền, gỗ đóng Contenơ, gỗ đóng đồ nội thất…và cho nhiều nhựa chất lượng cao [3].
6 Với tốc độ sinh trưởng nhanh và khả năng thích ứng rộng với các vùng sinh thái khác nhau trên thế giới, đáp ứng được nhiều mục tiêu kinh tế. Vì thế Thông caribê là loài cây rừng đặc biệt để trồng rừng công nghiệp, được rất nhiều nước nhập giống gây trồng, chủ yếu là các nước thuộc vùng nhiệt đới và á nhiệt đới. Việt Nam là một nước nhiệt đới có các điều kiện địa lý khá tương đồng với sự phân bố tự nhiên của Thông caribê. Do vậy mà loài Thông caribê được đưa vào trồng khảo nghiệm ở nước ta từ năm 1963 và đã có những thành công nhất định [10], [19]. 1.1.4. Tình hình sản xuất, gây trồng trong và ngoài nước * Ở ngoài nước: Thông caribê đã được dẫn nhập và gây trồng ở trên 65 nước trên thế giới. Giới hạn vĩ độ vùng trồng được mở rộng đáng kể so với nơi nguyên sản, từ vĩ độ 550 nam ở Argentina tới 330 vĩ độ bắc ở Ấn độ. Giới hạn kinh độ cũng được mở rộng từ 1800 kinh độ Đông ở fiji tới 1580 kinh độ Tây ở Hawaii. Độ cao vùng trồng biến động từ mặt nước biển tới 1200m ở Zaire, 1220m ở Nigeria, trên 1820m ở Uganda và 2400m ở Kenya [11]. Như vậy, Thông caribê đã được gây trồng trên tất cả các dạng khí hậu của các nước nhiệt đới và cận nhiệt đới. Vùng phân bố rừng trồng của loài đã được mở rộng cả về độ vĩ và độ kinh, cả từ vùng có khí hậu miền núi tới khí hậu cận miền núi và vùng ven biển. Ở Malaysia, Thông caribê được trồng trên diện tích lớn và cho sinh khối bình quân khoảng 17m3/ha/năm. Ở Đặc khu miền Bắc Australia, các xuất xứ tốt nhất của PCH sau 10 năm sinh trưởng rất nhanh, cho sinh khối bình quân 22m3/ha/năm. Ở bang Queensland (cũng thuộc Australia), ở 9,5 tuổi, PCH đạt 16 - 18m3/ha/năm trong khi biến chủng PCB đạt khoảng 14,8m3/ha/năm [38]. * Ở trong nước: Thông caribê được dẫn nhập đầu tiên vào nước ta năm 1963 để trồng thử nghiệm tại Lang Hanh và Lang Linh thuộc tỉnh Lâm Đồng
7 (Lê Đình Khả, 1990; Phí Quang Điện, 2001). Loài thông này đã được trồng thử ở Vĩnh Yên, Phú Thọ, Ninh Bình, Hà Giang, Tuyên Quang, Quảng Ninh, Bắc Giang, Quảng Nam, Đà Nẵng, gần đây trồng ở Đông Nam bộ và Tây Nguyên. Kết quả bước đầu cho thấy có thể gây trồng và cho hiệu quả kinh tế ở một số địa phương. Sau đó Trung tâm nghiên cứu Giống cây rừng (Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam), Trung tâm nghiên cứu cây nguyên liệu giấy Phù Ninh phối hợp với nhiều cơ quan bố trí khảo nghiệm Thông caribê ở nhiều vùng sinh thái khác nhau trong cả nước, như: Đại Lải (Vĩnh Phúc), Ba Vì (Hà Nội), Yên Thế (Bắc Giang), Yên lập (Quảng Ninh), Đại Huệ (Nghệ An), Đông Hà (Quảng Trị), Tiền Giang (Thừa Thiên Huế), Sông Mây (Đồng Nai), Hàm Thuận Nam (Bình Thuận)… Các kết quả bước đầu cho thấy đây là loài cây sinh trưởng nhanh, thích nghi sinh thái rộng, có nhiều triển vọng để gây trồng trên nhiều dạng lập địa của nước ta, đặc biệt là biến chủng PCH (Stahl, 1984; Phí Quang Điện, 1989, 2001). Ví dụ, trên lập địa nghèo kiệt ở Yên Lập (Quảng Ninh) Thông caribê cho năng suất khoảng 8 - 10m3/ha/năm. Ở Đại Lải (Vĩnh Phúc), chủng PCH trồng trên đất feralít tầng trung bình, phát triển trên đá mẹ phiến thạch sét, thoát nước tốt, ở tuổi 15 đạt 16 - 18m3/ha/năm. Thông caribê biến chủng PCH trồng năm 1984 tại Đông Hà (Quảng Trị) cho sinh trưởng bình quân là 2m/năm về chiều cao và 2,7cm/năm về đường kính. Có nhiều nơi, Thông caribê không những sinh trưởng tốt mà còn ra hoa kết hạt chắc từ tuổi 14 - 15 trở đi, có thể thu hái, gieo ươm tạo cây con như ở Đại Lải (Vĩnh Phúc), Tiền Phong (Thừa Thiên Huế), Đông Hà (Quảng Trị)… Ví dụ, hạt giống PCH tại Đại Lải đạt tỉ lệ nảy mầm tới 90%, cây con tạo từ nguồn hạt này sinh trưởng tốt, ít sâu bệnh. Cây con 1 tuổi ở rừng trồng đạt chiều cao trung bình là 1,17m, đường kính gốc đạt 1,8cm. Từ 3 đến 8 tuổi, cây sinh trưởng nhanh hơn đạt chiều cao trung bình khoảng 1,8 - 2m/năm,
8 đường kính D1,3 = 1,6 - 1,8cm/năm. Từ đây chúng ta thấy ở 1 - 2 tuổi cây sinh trưởng khá tốt trên cả 6 vùng địa lý - lập địa khác nhau, từ tuổi 3 PCH sinh trưởng vượt PCC, sâu đục ngọn cây bắt đầu xuất hiện (tỉ lệ từ 2,5 - 3%), ở PCH nhiều hơn PCC. Là một trong những loài cây chủ lực trồng rừng tổ trên đất nghèo xấu phổ biến ở Việt Nam (Đại Lải và Đông Hà là những khu vực điển hình), những kinh nghiệm có được cùng với những kết quả nghiên cứu đã và đang được tiến hành, nghiên cứu của luận văn mong góp phần giúp các cơ sở trồng rừng sản xuất Thông caribê đạt được kết quả tốt nhất, thiết thực đóng góp chương trình trồng mới 5 triệu ha rừng của đất nước và kế hoạch phát triển nghề rừng đến năm 2020 [6]. 1.2. Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật và ứng dụng Sự biệt hoá và phản biệt hoá cùng với tính toàn năng của tế bào thực vật là cơ sở lý luận vững chắc để nghiên cứu kỹ thuật nuôi cấy in vitro. Nuôi cấy in vitro là một phương thức nhân giống dựa trên cơ sở của phân bào nguyên nhiễm, lối phân bào về cơ bản không có sự tổ hợp lại của thể nhiễm sắc trong quá trình phân chia, vì thế đây là phương thức nhân giống truyền đạt các biến dị di truyền của cây mẹ cho cây in vitro. Cây in vitro không những giữ được các hình thái giải phẫu của cây mẹ, giữ được các biến di truyền mong muốn mà còn giữ được các biến dị di truyền về sinh trưởng nhanh và cho năng suất cao của chúng. Nhân giống in vitro là phương thức giữ được ưu thế lai đời F1 và khắc phục được hiện tượng phân ly đời F2, nhân giống in vitro làm rút ngắn chu kỳ sinh sản, rút ngắn thời gian thực hiện chương trình cải thiện giống cây rừng và là phương thức nhân nhanh các loài cây quí hiếm đang bị khai thác cạn kiệt. Đây là phương thức góp phần bảo tồn nguồn gen cây rừng và nhân giống bổ sung cho các loài cây khó thu hái và bảo quản hạt [12], [8], đặc biệt là nhân nhanh số lượng lớn nguồn giống tốt phục vụ chương trình trồng rừng.
9 Vì thế, nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy in vitro là một trong những công cụ có hiệu quả nhất cho chọn giống cây rừng, là phương thức đang được áp dụng phổ biến để nhân giống các dòng vô tính có năng suất cao. Ngày nay cùng với công nghệ gen, nuôi cấy mô tế bào là một phần quan trọng không thể thiếu, thúc đẩy ứng dụng công nghệ sinh học trong cải thiện cuộc sống của con người. Hai nhiệm vụ lớn của công nghệ sinh học thực vật ở nước ta từ nay tới năm 2020 là: Tạo ra các giống cây trồng mới bằng phương pháp công nghệ sinh học thực vật, đặc biệt là công nghệ gen và nhân nhanh các giống, dòng ưu việt bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro [28]. Kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào thực chất là kỹ thuật điều khiển phát triển sự phát sinh hình thái của tế bào thực vật một cách có định hướng dựa vào sự phân hoá và phản phân hoá của tế bào thực vật. Để điều khiển được sự phát sinh hình thái của tế bào, người ta bổ sung vào môi trường nuôi cấy hai nhóm chất điều hoà sinh trưởng thực vật chính là auxin và cytokinin. Tỉ lệ hàm lượng của 2 nhóm chất điều hoà sinh trưởng này trong môi trường nuôi cấy khác nhau sẽ định hướng cho sự phát sinh hình thái (phát sinh chồi, rễ, hoặc mô sẹo) của mô nuôi cấy khác nhau. Trong môi trường nuôi cấy, tỉ lệ nồng độ auxin/cytokinin thấp thì mô nuôi cấy phát sinh theo hướng tạo chồi, tỉ lệ này cao thì mô nuôi cấy sẽ tạo mô sẹo [29], [5]. 1.2.1. Phương pháp nhân giống in vitro Phương pháp nhân giống in vitro đã bổ sung cho các kỹ thuật nhân giống vô tính cổ điển như: chiết cành, ghép, giâm hom, tách dòng… Nhân giống in vitro hay vi nhân giống trong ống nghiệm là một trong bốn lĩnh vực ứng dụng chính của công nghệ tế bào thực vật (bao gồm: làm sạch virus, nhân nhanh các giống cây quý, sản xuất và chuyển hoá sinh học các hợp chất tự nhiên và cải biến về mặt di truyền các giống cây rừng) và đã mang lại hiệu quả kinh tế lớn nhất [2]. Có 3 phương thức để tạo cây in vitro:
10 a. Hoạt hoá chồi nách Hoạt hoá chồi nách bằng cách phá vỡ hiện tượng ưu thế ngọn khi nuôi cấy các đỉnh chồi hoặc đoạn thân mang mắt ngủ. Theo phương pháp này thì sự hoạt hoá của chồi nách diễn ra theo hai cách: - Cách 1: Cây phát triển trực tiếp từ chồi đỉnh hoặc chồi nách (xảy ra khi nuôi cấy loài cây hai lá mầm như: khoai tây, hoa cúc, cây thuốc lá…) - Cách 2: Tạo cụm chồi từ đỉnh hoặc chồi nách (xảy ra với cây một lá mầm như: Cây lúa, cây mía…) b. Phương pháp tạo chồi bất định Chồi bất định là chồi được hình thành từ các cơ quan, các bộ phận khác của cây, không phải là phôi. Ví dụ như: chồi hình thành từ mô sẹo (callus). Tạo chồi bất định sử dụng các bộ phận của cây như: đoạn thân, mô lá, giẻ hành. Trong quá trình này cần thực hiện quá trình phản phân hoá và tái sinh tế bào để bắt tế bào sôma hình thành chồi trực tiếp hoặc gián tiếp thông qua giai đoạn phát triển mô sẹo. c. Phương pháp tạo phôi vô tính Trong quá trình nuôi cấy in vitro, phôi có thể hình thành từ các tế bào sôma gọi là phôi vô tính. Các phôi vô tính có thể tái sinh thành cây hoàn chỉnh hoặc có thể được sử dụng làm nguyên liệu để sản xuất hạt giống nhân tạo. Tương tự như tạo chồi bất định, để tạo phôi vô tính cũng cần thực hiện quá trình phản phân hoá và tái sinh tế bào để tách các tế bào sôma, hình thành phôi trực tiếp hoặc gián tiếp thông qua giai đoạn phát triển mô sẹo. Sự hình thành phôi trải qua 2 bước chính sau: - Bước 1: Sự phân hoá các tế bào có khả năng phát sinh phôi. Trong quá trình này cần môi trường giàu auxin vì auxin giúp cho việc cảm ứng để tạo các tế bào phôi, đồng thời auxin giúp kích thích cho quá trình phát triển số lượng tế bào thông qua việc liên tiếp phân chia tế bào. Các tế bào có khả năng
11 phát sinh phôi là các tế bào nhỏ, nhân lớn, nhiều hạch nhân, không có không bào, tế bào chất đậm đặc, giàu protêin, ARN thông tin. - Bước 2: Sự phát triển của phôi mới hình thành. Môi trường nuôi cấy của giai đoạn này phải nghèo hoặc không có auxin, với nồng độ auxin cao thì kích thích sự tạo thành phôi nhưng ức chế cho quá trình phân hoá và phát triển tiếp theo của phôi này. Như vậy, với nồng độ chất điều tiết sinh trưởng hợp lý là rất quan trọng để có các phản hồi thích hợp, nếu nồng độ thấp có thể gây sốc cho phản ứng và nồng độ cao có thể gây ức chế hoặc gây độc [22]. 1.2.2. Các yếu tố ảnh hưởng tới kết quả nuôi cấy in vitro - Môi trường nuôi cấy Môi trường nuôi cấy bao gồm hai loại là môi trường hoá học và môi trường vật lý, chúng quyết định đến sự thành bại của quy trình nhân giống in vitro. Ngoài chức năng làm giá thể cho mẫu cấy, môi trường nuôi cấy còn có nhiệm vụ chính là cung cấp các chất dinh dưỡng cần thiết để cho mẫu cấy tồn tại, phân hoá và phát triển. Vấn đề đặt ra ở đây là khi tiến hành nuôi cấy phải lựa chọn được môi trường thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển tối ưu ở từng giai đoạn của quá trình nuôi cấy và với từng đối tượng nuôi cấy cụ thể. - Môi trường hoá học: cung cấp các chất dinh dưỡng cơ bản cần thiết cho sự sinh trưởng và phân hoá của mô trong suốt quá trình nuôi cấy in vitro. Thành phần của môi trường hoá học thay đổi theo loài cây, bộ phận cây, mục đích nuôi cấy, nhưng nhìn chung thường gồm các nhóm chất sau [2], [30]. + Nhóm các nguyên tố đa lượng: Nguyên tố đa lượng là những nguyên tố muối khoáng được sử dụng ở nồng độ trên 30ppm, bao gồm các nguyên tố sau: N, P, K, S, Mg và Ca...Các nguyên tố này có chức năng tham gia vào quá trình trao đổi chất của tế bào và có chức năng xây dựng nên thành tế bào. Môi trường nhiều nitơ thích hợp cho việc hình thành chồi. Môi trường nhiều kali sẽ giúp cho quá trình trao đổi chất diễn ra mạnh.
12 + Nhóm các nguyên tố vi lượng: Nguyên tố vi lượng là những nguyên tố khoáng được sử dụng ở nồng độ dưới 30ppm, gồm có: Fe, Cu, Zn, Mo, Co, Mn, Bo…Tuy chỉ cần một lượng nhỏ trong môi trường nuôi cấy, nhưng chúng là thành phần không thể thiếu cho sự sinh trưởng và phát triển của mô. Nếu thiếu Fe quá trình phân chia của tế bào bị rối loạn, thiếu Bo mô nuôi cấy phát triển mô sẹo rất nhanh, nhưng có hiệu suất tái sinh thấp. Hàm lượng của các nguyên tố đa lượng và các nguyên tố vi lượng phụ thuộc vào từng môi trường nuôi cấy và từng đối tượng nuôi cấy. + Nguồn carbon: Mặc dù mẫu cấy vẫn có khả năng quang hợp, nhưng rất yếu, vì vậy buộc phải bổ sung nguồn carbon để mẫu nuôi cấy có thể tổng hợp được các chất hữu cơ giúp tế bào phân chia. Thông thường nguồn carbon bổ sung là đường sucrose và glucose với liều lượng 20-30 g/lít. Trong trường hợp cần thiết có thể thay thế bằng các loại đường khác như: maltose, lactose hay fructose. + Các vitamin: Mô và tế bào thực vật khi nuôi cấy in vitro vẫn có khả năng tự tổng hợp được một số vitamin cần thiết nhưng không đáp ứng đủ nhu cầu sinh trưởng và phát triển nhanh của chúng. Vì vậy, phải bổ sung thêm các loại vitamin cần thiết vào môi trường nuôi cấy để góp phần tạo các co- enzyme xúc tác các phản ứng sinh hoá trong tế bào. Các vitamin thường được sử dụng như: B1 (Thiamin), B2 (Ribofravin), B3 (Axit panthotenic), B5 (Axit nicotinic), B6 (piridoxin) với nồng độ phổ biến là 0,5 - 1mg/l. Myo - inositol cũng hay được sử dụng vì nó có vai trò quan trọng trong sinh tổng hợp thành tế bào thực vật. + Các chất phụ gia hữu cơ: Các chất phụ gia được đưa vào môi trường nuôi cấy nhằm kích thích sự sinh trưởng của mô sẹo và các cơ quan như: nước dừa, khoai tây, chuối, dịch chiết nấm men. Trong thành phần của nước dừa chứa các axit amin, axit hữu cơ, đường, Myo - inositol và các chất có
13 hoạt tính auxin, cytokinin. Ngoài ra, Khoai tây và Chuối cũng hay được sử dụng, vì trong thành phần của chúng có chứa một số vitamin và các kích thích tố có tác dụng tích cực đến sự sinh trưởng, phát triển của mẫu cấy. + Các chất điều hoà sinh trưởng: Các chất điều hoà sinh trưởng có vai trò hết sức quan trọng đến kết quả nuôi cấy in vitro, quyết định sự thành công của toàn bộ quá trình nuôi cấy. Nó ảnh hưởng tới sự biệt hoá, phản biệt hoá và sự sinh trưởng của tế bào, đặc biệt là sự biệt hoá các cơ quan như chồi và rễ. Nhu cầu về chất điều hòa sinh trưởng đối với từng loài cây và từng giai đoạn nuôi cấy là khác nhau. Vì vậy, để nuôi cấy in vitro thành công cần phải tiến hành các nghiên cứu cụ thể để tìm ra nồng độ cũng như tỉ lệ các chất điều hoà sinh trưởng phù hợp. Trong nuôi cấy mô, tế bào thực vật thường sử dụng 3 nhóm chất chính là auxin, cytokinin và gibberellin. Các chất thuộc nhóm auxin có tác dụng kích thích sự giãn tế bào, sự hình thành rễ bất định và mô sẹo. Trong nuôi cấy mô tế bào thường sử dụng bốn loại auxin là: IAA (Indol acetic acid), IBA (Indol butyric acid), NAA (Naphthyl acetic acid) và 2.4-D (2,4-Dicloro phenoxy axetic axit). Các loại auxin thường được sử dụng ở nồng độ từ 0,1-5,0mg/lít tuỳ từng loài cây, từng loại chất và từng giai đoạn nuôi cấy. Các chất thuộc nhóm cytokinin có tác dụng kích thích sự phân chia tế bào và hình thành chồi. Các chất thuộc nhóm này thường được sử dụng là: Kinetin và BAP (Benzyl amino purin). Tỉ lệ giữa auxin và cytokinin quy định sự biệt hoá của mô, tế bào theo hướng tạo chồi, tạo rễ hoặc hình thành mô sẹo. Theo nhiều nghiên cứu cho thấy trong môi trường nuôi cấy nếu tỉ lệ auxin/cytokinin cao thì mô sẽ biệt hoá theo hướng tạo rễ, nếu thấp mô sẽ biệt hoá theo hướng tạo chồi, còn nếu tỉ lệ này gần bằng 1 thì mẫu nuôi cấy sẽ biệt hoá theo hướng tạo mô sẹo.
14 Các chất thuộc nhóm gibberellin có tác dụng kích thích sự giãn tế bào, kéo dài lóng, đốt thân, cành cây. Ngoài ra, nó còn có tác dụng phá tính ngủ nghỉ ở củ, hạt, ức chế tạo rễ phụ cũng như tạo chồi phụ. Chất thường được sử dụng nhất trong nhóm này là GA3. Ngoài ba nhóm chất trên còn có các chất có tác dụng ức chế sự sinh trưởng và phát triển khác như ethylen. Chất này cũng gây ảnh hưởng khá rõ đến sự phát sinh hình thái của một số cây trồng trong nuôi cấy in vitro. + Độ pH của môi trường: là yếu tố quan trọng, nó ảnh hưởng trực tiếp tới quá trình hấp thụ các chất dinh dưỡng từ môi trường vào mẫu cấy. Thực tế đã chứng minh khi pH thấp (pH< 4,5) hoặc cao (pH >7) đều gây ra ức chế sinh trưởng, phát triển của mô và tế bào nuôi cấy. Cụ thể, nếu pH của môi trường giảm mạnh sẽ làm rối loạn quá trình trao đổi Fe, làm giảm hay ngừng hẳn quá trình sinh trưởng của mẫu cấy. Thông thường độ pH dao động trong khoảng từ 5,5 - 6,5 trong nuôi cấy mô - tế bào thực vật. - Môi trường vật lý: Nhiệt độ và ánh sáng là hai nhân tố vật lý có ảnh hưởng cơ bản và quan trọng nhất trong nuôi cấy in vitro. + Nhiệt độ: là nhân tố vật lý quan trọng ảnh hưởng rõ rệt đến sự phân chia tế bào và các quá trình trao đổi chất trong mô cấy, đồng thời nó ảnh hưởng tới sự hoạt động của auxin do đó nó ảnh hưởng trực tiếp đến khả năng ra rễ của cây mô. Nhiệt độ nuôi cấy cần được giữ ổn định ở 25 ± 20C. + Ánh sáng: các nghiên cứu đã cho thấy ánh sáng rất cần thiết cho sự phát triển và phát sinh hình thái của mẫu cấy. Nó phụ thuộc rất nhiều vào thời gian chiếu sáng, cường độ và chất lượng ánh sáng. Đặc biệt thời gian chiếu sáng phải phù hợp với đặc tính sinh vật học của loài cây và bộ phận nuôi cấy. Thời gian chiếu sáng thường biến động từ 12 - 16 giờ/ngày. Ánh sáng của đèn huỳnh quang với cường độ 2000 - 3000 lux, tương đương với khoảng cách 30 cm từ đèn chiếu sáng tới mô nuôi cấy hoặc dùng ánh sáng tự nhiên với cường
15 độ thấp là phù hợp với nuôi cấy in vitro. Nuôi cấy mô sẹo có thể không cần ánh sáng. Chất lượng ánh sáng cũng ảnh hưởng không nhỏ tới kết quả nuôi cấy. Ánh sáng đỏ làm tăng chiều cao thân, chồi hơn so với ánh sáng trắng. Ánh sáng xanh ức chế sự vươn cao, nhưng lại có ảnh hưởng tốt tới sinh trưởng của mô sẹo. 1.2.3 Các bước chính trong nhân giống in vitro Theo George (1993) [22], quá trình nhân giống in vitro bao gồm các bước sau: Bước 1: Chọn lọc và chuẩn bị cây mẹ Trước khi tiến hành nhân giống in vitro cần chọn lọc cẩn thận các cây mẹ (cây cho nguồn mẫu nuôi cấy). Các cây này cần phải sạch bệnh, đặc biệt là bệnh virus và ở giai đoạn sinh trưởng mạnh. Việc trồng các cây mẹ trong điều kiện thích hợp với chế độ chăm sóc và phòng trừ sâu bệnh hiệu quả trước khi lấy mẫu cấy sẽ làm giảm tỉ lệ mẫu nhiễm, tăng khả năng sống và sinh trưởng của mẫu cấy in vitro. Mục tiêu của các chương trình cải thiện giống là thu nhận được một lượng đáng kể tăng thu di truyền càng nhanh càng tốt, đồng thời duy trì được một vốn di truyền phong phú để đảm bảo tăng thu trong tương lai. Để nhận được những tăng thu như vậy phải dựa trên các phương pháp chọn lọc nhằm chọn ra những cá thể đáp ứng tốt nhất những yêu cầu của nhà chọn giống để dùng như những cây bố mẹ trong các chương trình chọn giống và sản xuất hạt. Sau khi đã chọn được loài và xuất xứ đáp ứng mục tiêu kinh tế và phù hợp với mỗi vùng thì chọn lọc cây trội là phần then chốt của bất kỳ một chương trình nào về cải thiện giống cây rừng. Có cây trội được chọn lọc cẩn thận, được khảo nghiệm hậu thế để đánh giá từ đó xây dựng các vườn giống để cung cấp giống thì năng suất rừng mới từng bước được nâng cao, đáp ứng yêu cầu ngày càng tăng của sản xuất xã hội. Cây trội là nền tảng của một chương trình chọn giống [8].
16 Chọn cây trội là phương pháp lợi dụng biến dị cá thể tự nhiên trong quần thể để nâng cao sản lượng đời sau so với giống đại trà. Tăng thu di truyền khi chọn lọc cá thể có thể đạt 25 - 50%, mức độ biến động giữa các cá thể trong quần thể càng lớn thì tăng thu di truyền đạt được càng cao. Các cây trội đã chọn có thể được dùng để lấy giống phát triển trực tiếp vào sản xuất. Còn nếu biết phối hợp với các phương pháp chọn giống khác như lai giống, gây đột biến… sẽ mang hiệu quả cao hơn. Bước 2: Nuôi cấy khởi động Là giai đoạn khử trùng mẫu cấy in vitro. Trong giai đoạn này cần đảm bảo các yêu cầu như tỉ lệ nhiễm thấp, tỉ lệ sống cao, mô tồn tại và sinh trưởng tốt. Khi lấy mẫu cần chọn đúng loại mô, đúng giai đoạn phát triển của cây. Quan trọng nhất là đỉnh chồi ngọn, đỉnh chồi nách và sau đó là hoa và cuối cùng là đoạn thân, mảnh lá chồi ngọn, chồi nách được sử dụng để nhân nhanh một số cây như măng tây, dứa khoai tây, thuốc lá, hoa cúc… Bước 3: Nhân nhanh Là giai đoạn kích thích mô nuôi cấy phát sinh hình thái và tăng nhanh số lượng thông qua các con đường: hoạt hoá chồi nách, tạo chồi bất định, tạo phôi vô tính. Vấn đề đặt ra là cần xác định được môi trường và điều kiện ngoại cảnh thích hợp để có hiệu quả cao nhất. Theo nguyên tắc chung, môi trường có nhiều cytokinin sẽ kích thích tạo chồi. Chế độ nuôi cấy thường là 25 - 270C và 12 - 16h chiếu sáng/ngày, cường độ chiếu sáng 2000 - 4000 lux. Tuy nhiên đối với mỗi loại đối tượng nuôi cấy đòi hỏi có chế độ nuôi cấy khác nhau. Bước 4: Tạo cây hoàn chỉnh Để tạo rễ cho chồi, người ta chuyển chồi từ môi trường nhân nhanh sang môi trường tạo rễ. Môi trường tạo rễ thường được bổ sung một lượng nhỏ auxin. Một số chồi có thể phát sinh rễ ngay sau khi chuyển từ môi trường
17 không chứa chất kích thích sinh trưởng. Sau đó cây được ra ngoài vườn ươm phát triển tốt thì cây phải đảm bảo một số yêu cầu: + Cây đảm bảo về các yêu cầu chiều cao, rễ, lá… + Giá thể phải tơi xốp, sạch sẽ, thoát nước tốt + Phải điều chỉnh độ ẩm, sự chiếu sáng của vườn ươm cũng như có chế độ dinh dưỡng thích hợp [22]. 1.3. Thành tựu về nuôi cấy in vitro 1.3.1. Thành tựu chung về nuôi cấy mô, tế bào thực vật trong và ngoài nước Nhân giống cây trồng bằng phương pháp nuôi cấy mô, tế bào thực vật đã và đang có nhiều ứng dụng trong thực tiễn sản xuất và trong nghiên cứu phát triển khoa học công nghệ trên thế giới và Việt Nam. * Ngoài nước Hiện nay nuôi cấy in vitro đã và đang được ứng dụng rộng rãi trong sản xuất thương mại cây lâm nghiệp ở nhiều nước trên thế giới, hàng trăm loài cây lá rộng và hàng chục loài cây lá kim đã được nuôi cấy mô thành công. Cho tới năm 1991, Thái Lan đã nhân giống in vitro thành công cho 55 loài trong tổng số 67 loài tre - trúc thử nghiệm. Công nghệ này cho phép nhân nhanh loài Dendrocalamus asper với số lượng khoảng 1 triệu cây mỗi năm đáp ứng được nhu cầu cây con phục vụ cho trồng rừng. Số lượng các loài Bạch đàn đã được nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy in vitro ngày càng tăng: đến năm 1987 đã có trên 20 loài Bạch đàn khác nhau được nuôi cấy thành công. Trung Quốc là nước thành công trong trong việc tạo cây in vitro cho các loài cây thân gỗ. Đến nay đã có hơn 100 loài cây thân gỗ được nuôi cấy như: Dương, Bạch đàn, Tếch, Bao đồng… Nhiều loài cây lá rộng Châu Âu đã được thử nghiệm nhân giống thành công bằng phương pháp nuôi cấy mô như: Acer, Beluta, Fagus, Quercus,
18 Carpinus… Nuôi cấy in vitro cũng là một biện pháp nhân giống được áp dụng nhiều ở các loài cây lá kim nhằm phục vụ cho các chương trình trồng rừng dòng vô tính…Có tới 30 loài trong số các loài cây lá kim được nghiên cứu nuôi cấy mô đã đạt được những thành công bước đầu, trong đó phải kể đến các loài Bách tán (Araucaria), Liễu sam (Cryptomeria japonica), Bách xanh [10]...Một số loài Thông đã được nuôi cấy thành công đó là Pinus nigra, P. pinaster của các tác giả như: Shakya và cộng sự (1989) [42], Thorpe và Harry (1991) [47], Okamura và Kondo (1995) [39]. Shakya và cộng sự (1989) đã thành công trong nghiên cứu nhân giống P. wallichiana bằng kỹ thuật nuôi cấy phôi có định hướng. Phôi tách ra được nuôi cấy trên môi trường Aiken - Christie (LP - 1984) bổ sung BAP ở các nồng độ từ 0 - 88µM trong 10; 14; 21 ngày. Kết quả đạt ít nhất 40 chồi/phôi trong một chu kỳ cấy chuyển 4 tháng [42] Thorpe và Harry (1991) đã nghiên cứu nuôi cấy thông Pinus canariensis với nguồn vật liệu sử dụng chủ yếu từ lá mầm của cây con mới nảy mầm vô trùng, tác giả đã sử dụng hai loại môi trường nuôi cấy chính là môi trường SH (1972) và môi trường MCM (1983) có bổ sung 5 - 10 µM BAP. Kết quả nghiên cứu đã xác định được môi trường MCM với nồng độ BAP tối ưu trong giai đoạn tái sinh chồi là 10 µM, xác định được tổ hợp phytohormon là BAP/2iP (tỉ lệ 1:1) là 5/5 µM cho kết quả tái sinh chồi tốt hơn môi trường chỉ có BAP, xác định được giá thể ra rễ là hỗn hợp vô trùng than bùn/vermiculate (tỉ lệ 1:1) chứa ¼ khoáng MCM, xử lý chồi ra rễ bằng IBA 1µM trong 4 giờ. Kết quả đã đưa cây invitro vào giá thể trong bầu PVC ở điều kiện nhà kính [47]. Năm 1995, Okamura và Kondo công bố “Hướng dẫn nuôi cấy mô cây thông” giới thiệu tạo cây con thông Pinus thunbergi trong ống nghiệm từ nuôi cấy phôi và lá mầm. Trong hướng dẫn này dùng môi trường GD (1972) và