Luận văn Thạc sĩ Khoa học lâm nghiệp: Nghiên cứu sự khác biệt về di truyền ở mức độ phân tử giữa các giống bạch đàn lai sinh trưởng nhanh và chậm làm cơ sở cho chọn giống sớm

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:100

Thêm vào BST

Báo xấu

16
lượt xem 3
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Bài nghiên cứu này được thực hiện nhằm xác định được khác biệt về di truyền ở mức độ phân tử giữa các giống bạch đàn lai sinh trưởng nhanh và sinh trưởng chậm làm cơ sở cho chọn giống sớm. Để hiểu rõ hơn mời các bạn cùng tham khảo nội dung chi tiết của luận văn này.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Khoa học lâm nghiệp: Nghiên cứu sự khác biệt về di truyền ở mức độ phân tử giữa các giống bạch đàn lai sinh trưởng nhanh và chậm làm cơ sở cho chọn giống sớm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT TRƯỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP NGUYỄN VIỆT TÙNG NGHIÊN CỨU SỰ KHÁC BIỆT VỀ DI TRUYỀN Ở MỨC ĐỘ PHÂN TỬ GIỮA CÁC GIỐNG BẠCH ĐÀN LAI SINH TRƯỞNG NHANH VÀ CHẬM LÀM CƠ SỞ CHO CHỌN GIỐNG SỚM CHUYÊN NGÀNH: LÂM HỌC MÃ SỐ: 60.62.02.01 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC LÂM NGHIỆP NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. NGUYỄN VIỆT CƯỜNG TS. NGUYỄN VĂN VIỆT Hà Nội, 2015
i CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập – Tự do – Hạnh phúc LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan, đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và có kế thừa số liệu sinh trưởng và sử dụng số liệu của hai đề tài nghiên cứu khoa học: “ Nghiên cứu lai tạo giống một số loài bạch đàn, keo, tràm, thông” và “Nghiên cứu chọn giống bạch đàn lai bằng chỉ thị phân tử”. Nếu nội dung nghiên cứu của tôi trùng lặp với bất kỳ công trình nghiên cứu nào đã công bố, tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm và tuân thủ kết luận đánh giá luận văn của Hội đồng khoa học. Hà Nội, ngày tháng năm 2015 Người cam đoan Nguyễn Việt Tùng
ii LỜI CẢM ƠN Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Việt Cường – Bộ môn Lai Giống – Viện nghiên cứu Giống và Công nghệ Sinh học Lâm nghiệp đã tận tình hướng dẫn tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình làm việc, học tập và hoàn thành luận văn. Trong quá trình học tập và thực hiện luận văn tôi đã nhận được rất nhiều hướng dẫn, giúp đỡ từ phía các thầy cô giáo, đồng nghiệp, bạn bè trong và ngoài cơ quan, nhà trường. Nhân đây, tôi xin gửi lời cảm ơn tới các cô, chú, các anh, chị và các bạn đồng nghiệp trong bộ môn Lai Giống và Viện nghiên cứu Giống và Công nghệ Sinh học Lâm nghiệp, TS. Nguyễn Văn Việt – Viện Công nghệ Sinh học Lâm nghiệp – Trường Đại học Lâm nghiệp đã giúp đỡ tôi trong suốt thời gian làm việc và học tập. Cuối cùng, tôi xin gửi lời biết ơn sâu sắc tới gia đình và bạn bè luôn hết lòng ủng hộ, động viên tôi trong những năm qua. Luận văn này là một phần của đề tài “Nghiên cứu chọn giống bạch đàn lai bằng chỉ thị phân tử” và có kế thừa số liệu nghiên cứu của đề tài “Nghiên cứu lai tạo giống một số loài bạch đàn, keo, tràm, thông”. Hà Nội, ngày tháng năm 2015 Học viên Nguyễn Việt Tùng
iii MỤC LỤC Trang Trang phu ̣ bià Lời cam đoan ...................................................................................................... i Lời cảm ơn ........................................................................................................ ii Mu ̣c lu ̣c ............................................................................................................. iii Danh mu ̣c các ký hiêu, ̣ các chữ viế t tắ t............................................................. v Danh mu ̣c các bảng .......................................................................................... vi Danh mu ̣c các hình ......................................................................................... vii ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................... 1 Chương 1. TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU ....................................... 3 1.1. Những nghiên cứu về tuyển chọn giống bạch đàn năng suất cao. ......... 3 1.1.1. Các nghiên cứu ở nước ngoài.......................................................... 3 1.1.2. Các nghiên cứu ở trong nước. ......................................................... 5 1.2. Cơ sở khoa học và ứng dụng của kỹ thuật phân tử trong chọn giống cây trồng .............................................................................................................. 7 1.3. Nghiên cứu, phát triển chỉ thị phân tử trong chọn giống cây lâm nghiệp ..................................................................................................................... 12 1.3.1. Các nghiên cứu ở nước ngoài........................................................ 13 1.3.2. Các nghiên cứu ở Việt Nam. ......................................................... 18 Chương 2. MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.1.Mục tiêu nghiên cứu.............................................................................. 25 2.2.Đối tượng và phạm vi, địa điểm nghiên cứu......................................... 25 2.3.Nội dung nghiên cứu. ............................................................................ 25 2.4.Phương pháp nghiên cứu....................................................................... 26 2.4.1.Tách chiết ADN tổng số................................................................. 26 2.4.2.Điện di ADN tổng số và sản phẩm PCR. ....................................... 27
iv 2.4.3.Phương pháp kiểm tra chất lượn nồng độ ADN bằng máy quang phổ. ......................................................................................................... 31 2.4.4.Phương pháp PCR. ......................................................................... 32 2.4.5.Phương pháp khảo nghiệm giống, thu thập và phân tích số liệu. .. 34 Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ............................ 36 3.1.Đánh giá sinh trưởng các giống bạch đàn lai được lựa chọn. ............... 36 3.2.Xác định chỉ thị SSR đa hình. ............................................................... 46 3.2.1.Tách chiết ADN tổng số................................................................. 46 3.2.2.Sàng lọc chỉ thị SSR đa hình .......................................................... 49 3.3.Phân tích sự khác biệt ở mức độ phân tử giữa các giống bạch đàn lai. 52 3.3.1.Điện di sản phẩm PCR với chỉ thị đa hình và ghi nhận số liệu. .... 52 3.3.2.Sự khác biệt ở mức độ phân tử giữa các giống bạch đàn lai sinh trưởng nhanh, sinh trưởng chậm. ............................................................ 57 3.4.Phân tích sự khác biệt về di truyền giữa các giống bạch đàn lai. ......... 63 3.4.1.Quan hệ di truyền giữa 10 tổ hợp bạch đàn lai .............................. 63 3.4.2.Quan hệ di truyền giữa các dòng bạch đàn lai ............................... 66 KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ ................................................................. 71 DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ............................................... 73 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC
v DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ADN Acid Deoxyribonucleic AFLP Amplified fragment length polymorphism APS Amonium Persulfate ARN Axit Ribonucleic Bp Base pair cM Centi Morgan CTAB Cetyltrimethyl Amonium Bromide CTPT Chỉ thị phân tử CU Dòng bạch đàn lai E. camaldunensis x E. urophylla dNTPs Deoxynucleotide triphosphate EDTA Ethylenediaminetetra Acetic Acid ISSR Inter-Simple sequence repeat Kb Kilo base MAS Marker Assisted Selection NST Nhiễm sắc thể Nu Nucleotide PCR polymerase chain reaction. PU Dòng bạch đàn lai giữa E. pellita và E. urophylla QTL Quantitative trait locus RAPD Random Amplified Polymosphic DNA RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism RNase Ribonuclease SDS Sodium Dodecyl Sulphate SNP Single nucleotide polymorphism SSR Simple sequence repeats TBE Tris-Boric Acid-EDTA TE Tris-EDTA UC Dòng bạch đàn lai giữa E. urophylla và E. camaldunensis UE Dòng bạch đàn lai E. urophylla và E. exserta UP Dòng bạch đàn lai giữa E. urophylla và E. pellita
vi DANH MỤC CÁC BẢNG TT Tên bảng Trang 2.1 Thành phần phản ứng PCR - SSR 33 2.2 Chương trình chạy phản ứng PCR và chu kỳ nhiệt 33 Sinh trưởng bạch đàn lai tại Minh Đức – Bình Phước ở tuổi 3.1 37 4 Sinh trưởng bạch đàn lai tại Minh Đức – Bình Phước ở tuổi 3.2 38 7 3.3 Sinh trưởng bạch đàn lai tại Tân Lập – Bình Phước ở tuổi 6 40 Sinh trưởng bạch đàn lai tại Tân Lập – Bình Phước ở tuổi 3.4 40 12 3.5 Sinh trưởng bạch đàn lai tại Tam Thanh – Phú Thọ ở tuổi 5 41 Sinh trưởng bạch đàn lai tại Bầu Bàng – Bình Dương ở tuổi 3.6 7,5 43 3.7 Sinh trưởng bạch đàn lai tại Kinh Đứng – Cà Mau ở tuổi 7 44 3.8 Xếp nhóm sinh trưởng các dòng bạch đàn lai nghiên cứu 45 Kết quả đo độ hấp thụ bước sóng 260nm, 280nm và nồng 3.9 48 độ ADN tổng số 14 mẫu bạch đàn lai 3.10 Danh mục chỉ thị SSR đa hình 51 Số liệu điện di chỉ thị EMBRA223, EMBRA225 trên gel 3.11 53 polyacrylamide 3.12 Số liệu thống kê thông tin đa hình của 36 chỉ thị 55 3.13 Số liệu điện di chỉ thị EMBRA206 trên gel polyacrylamide 59 3.14 Số liệu điện di chỉ thị EMBRA263 trên gel polyacrylamide 61 3.15 Số liệu điện di chỉ thị EMBRA229 trên gel polyacrylamide 62 3.16 Khoảng cách di truyền giữa 10 tổ hợp bạch đàn lai 63 3.17 Khoảng cách di truyền giữa 14 dòng bạch đàn lai 66 Khoảng cách di truyền nhóm bạch đàn lai sinh trưởng 3.18 68 nhanh Khoảng cách di truyền nhóm bạch đàn lai sinh trưởng 3.19 69 chậm
vii DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ TT Tên hình vẽ Trang 3.1 Mẫu lá bảo quản 46 3.2 Kết quả tách ADN tổng số trên gel agarose 1% 47 Kết quả tách ADN tổng số mẫu lá bạch đàn lai sau 1 năm 3.3 47 bảo quản trên gel agarose 1% 3.4 Kiểm tra sản phẩm PCR trên gel agarose 1% 50 Điện di sản phẩm PCR tìm chỉ thị đa hình trên gel 3.5 51 polyacrylamide 4,5% Kết quả điện di sản phẩm PCR của EMBRA223, 3.6 EMBRA225 trên gel polyacrylamide với 14 mẫu bạch 53 đàn lai Kết quả điện di sản phẩm PCR của EMBRA116 trên gel 3.7 54 polyacrylamide với 14 mẫu bạch đàn lai Kết quả điện di sản phẩm PCR của EMBRA102, 3.8 EMBRA153 trên gel polyacrylamide với 14 mẫu bạch 54 đàn lai Kết quả điện di sản phẩm PCR của EMBRA206 trên gel 3.9 59 polyacrylamide với 14 mẫu bạch đàn lai Kết quả điện di sản phẩm PCR của EMBRA229 trên gel 3.10 61 polyacrylamide với 14 mẫu bạch đàn lai 3.11 Biểu đồ quan hệ di truyền giữa 10 tổ hợp bạch đàn lai 65 3.12 Biểu đồ quan hệ di truyền giữa 14 dòng bạch đàn lai 67 Biểu đồ quan hệ di truyền nhóm bạch đàn lai sinh trưởng 3.13 68 nhanh Biểu đồ quan hệ di truyền nhóm bạch đàn lai sinh trưởng 3.14 70 chậm
1 ĐẶT VẤN ĐỀ Bạch đàn là nhóm loài có khả năng thích nghi với nhiều vùng sinh thái nên bạch đàn là một trong số những loài cây dẫn đầu trong trồng rừng sản suất trên thế giới ở sáu châu lục và trên 100 quốc gia với tổng diện tích đạt 20,07 triệu ha nhưng khoảng 90-95% giống bạch đàn trồng sản xuất trên thế giới thuộc chín loài trong phân chi Symphyomyrtus (Brooker, 2000) và giống lai giữa chúng (Harwood, 2011) [32], [42], [43]. Gỗ bạch đàn được sử dụng cho ngành xây dựng, đóng đồ nội thất, nguyên liệu chế biến ván ép, ván dăm và ngành công nghiệp giấy cũng như sản phẩm sinh khối cho ngành năng lượng. Bạch đàn lai là tên gọi chung cho sản phẩm lai tạo giữa hai hay nhiều loài bạch đàn khác nhau. Bạch đàn lai đang được quan tâm với những ưu điểm vượt trội về năng suất, chất lượng và tính chống chịu với điều kiện bất lợi so với giống cây bố mẹ. Cho đến nay, bạch đàn lai là lựa chọn ưu tiên trong trồng rừng sản xuất ở Việt Nam cũng như các quốc gia có nền lâm nghiệp phát triển trên thế giới: Brazil, Úc, Ấn Độ, Trung Quốc... Bằng phương pháp chọn tạo giống truyền thống, từ giai đoạn năm 1990 đến nay các nhà khoa học Việt Nam đã lai tạo thành công nhiều giống bạch đàn lai được công nhận là giống quốc gia và giống tiến bộ kỹ thuật. Nhờ sự phát triển và tính ứng dụng cao của các kỹ thuật sinh học phân tử, nhiều hướng nghiên cứu mới trong chọn tạo giống cây trồng lâm nghiệp đã được triển khai trong những năm gần đây. Kỹ thuật sinh học phân tử là công cụ hữu hiệu, trợ giúp đắc lực cho chọn giống cây trồng nhằm khắc phục những trở ngại trong công tác chọn giống truyền thống. Đặc biệt, sự phát triển nhanh chóng về số lượng các chỉ thị phân tử đã giải phóng các nhà chọn giống khỏi một khối lượng công việc đồ sộ khi phải chọn lọc, phát hiện số lượng nhỏ những cá thể quan tâm trong vô số các cá thể khác nhờ việc xác định sự
2 có mặt hay vắng mặt của những chỉ thị phân tử liên kết với các allele đặc hiệu mà không cần đánh giá kiểu hình [8]. Ở Việt Nam, thời gian để một giống lai nhân tạo được công nhận bằng phương pháp chọn giống truyền thống phải mất ít nhất từ 6 – 7 năm cùng với quy mô khảo nghiệm lớn tại nhiều lập địa khác nhau. Trong khi đó, dựa trên thành quả của những nghiên cứu đạt được từ chọn giống truyền thống và kết hợp việc sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử có thể tiết kiệm thời gian chọn giống mới và quy mô khảo nghiệm giống. Đây là hướng đi mới đang được nhiều nhà khoa học quan tâm và nghiên cứu tìm ra giống mới sớm đưa vào sản xuất. Từ các cơ sở trên, luận văn “Nghiên cứu sự khác biệt về di truyền ở mức độ phân tử giữa các giống bạch đàn lai sinh trưởng nhanh và chậm làm cơ sở cho chọn giống sớm” được đề xuất và thực hiện. Đây là nghiên cứu cần thiết làm cơ sở xác định sự khác biệt di truyền cho một số giống bạch đàn lai bằng kỹ thuật Simple sequence repeats (SSR).
3 Chương 1 TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Những nghiên cứu về tuyển chọn giống bạch đàn năng suất cao. 1.1.1 Các nghiên cứu ở nước ngoài. Nghiên cứu chọn giống bạch đàn là một khâu quan trọng trong chiến lược cải thiện giống nhóm loài bạch đàn. Mặc dù, nhiều loài bạch đàn có biên độ sinh thái rộng nhưng khi được trồng trên nhiều quốc gia khác nhau thì bạch đàn có sự phân hóa mạnh về sinh trưởng. Các chương trình khảo nghiệm bạch đàn được chú trọng ở một số quốc gia như Công Gô (1970 - 1981) với trên 100 xuất xứ của loài E. urophylla. Tại Pakistan, Hafeez và cộng sự (1972) đã khảo nghiệm 22 xuất xứ của loài E. camaldulensis với nguồn hạt giống được nhập từ Úc, qua khảo nghiệm tác giả đã chọn ra được 6 xuất xứ thích hợp và nhập nội hạt giống để trồng trên quy mô lớn. Tại Nam Phi, từ năm 1973 đến năm 1980, Darrow đã tiến hành 9 khảo nghiệm phối hợp 26 xuất xứ E. camaldulensis và 23 xuất xứ của E. tereticornis, E. grandis. Kết quả cho thấy, ở những vùng ẩm thì E. grandis cho năng suất cao nhất, sau đó đến E. tereticornis. Còn ở những vùng khô hạn và có sương giá thì E. camaldulensis lại cho năng suất cao hơn [31]. Hiện nay, việc tạo ra giống bạch đàn lai có ưu thế từ các phương pháp lai giống đang được các nhà chọn giống quan tâm. Tại Brazil, chương trình cải thiện giống bạch đàn dựa trên phép lai đôi và lai ba cũng đã được thực hiện. Sinh trưởng về thể tích ở tuổi 7 của cá thể lai ba E. urophylla x (E. camaldulensis x E. grandis) vượt trội các cây lai tốt nhất của các tổ hợp lai đôi E. grandis x E. urophylla, E. grandis x E. camaldulensis, E. urophylla x E. camaldulensis và E. urophylla x E. grandis [23].
4 Năm 1975, Viện nghiên cứu lâm nghiệp Quảng Tây (Trung Quốc) đã lai giữa E. saligna với E. exserta tạo ra được một số tổ hợp lai có khả năng vượt trội hơn loài E. exserta tới 82% về thể tích thân cây, trong đó tổ hợp lai nghịch E. exserta x E. saligna có sinh trưởng nhanh hơn tổ hợp lai thuận E. saligna x E. exserta. Hiện các giống lai được trồng chủ yếu ở các vùng ven biển vì chúng có khả năng chịu gió bão tốt đồng thời sinh trưởng nhanh [46]. Chew T.K. (1980) đã khảo nghiệm 10 loài tại 3 địa điểm khác nhau trên bán đảo Malaysia. Sau 10 năm trồng, tác giả nhận thấy sinh trưởng tốt nhất là loài E. camaldulensis (2 xuất xứ Bắc Úc) và E. degluta; các loài triển vọng khác là E. brassiana, E. urophylla và E. tereticornis [29]. Rao D.V. (1984) tiến hành khảo nghiệm nhiều xuất xứ khác nhau của E. camaldulensis, E.tereticornis tại các vùng Pradesh, Maharastra và Haryana của Ấn Độ. Qua điều tra sinh trưởng cho thấy có 10 xuất xứ E. camaldulensis và 5 xuất xứ E. tereticornis sinh trưởng tốt [44]. Ngoài ra, từ những năm 1980 - 1990 có nhiều tác giả nghiên cứu về chọn loài và xuất xứ bạch đàn ở nhiều nước khác nhau như: Agpaoa A.C (1986) khảo nghiệm loài và xuất xứ bạch đàn tại Philippine. Watanabe H. (1987) tiến hành khảo nghiệm các xuất xứ của loài E.camaldulensis tại Thái Lan. Sun và Dickinson (1997) thí nghiệm tuyển chọn 28 loài trên đất mặn và đất không mặn tại miền Đông Bắc nhiệt đới khô ở Úc [21], [47], [53]. Từ năm 1989, Viện lâm nghiệp nhiệt đới của Trung Quốc cũng tạo ra 204 cây lai từ các cặp bố mẹ giữa E. urophylla với các loài E. tereticornis, E. camaldulensis, E. exserta, E. grandis, E. saligna và E. pellita. Trong đó một số cá thể cây lai từ các tổ hợp E.urophylla x E. tereticornis và E. urophylla x E. camaldulensis đã có ưu thế lai rõ rệt về sinh trưởng so với bố mẹ của chúng, cây lai có thể tích vượt bố mẹ với các trị số tương ứng là 120,7% và 89,4% [46].
5 Ở Brazil, số liệu theo dõi sinh trưởng trong một số lô thí nghiệm 6 – 8 tuổi của rừng trồng bạch đàn cho năng suất tăng trưởng 70 – 90 m3/ha/năm, một số giống lai trong công thức thí nghiệm cho năng suất trên 100 m3/ha/năm (Eldrige, 1993) [33]. Tại rừng thí nghiệm 5,5 tuổi của dòng lai E. Grandis x E. urophylla có năng suất bình quân 70 m3/ha/năm. Ngoài việc nâng cao năng suất về sinh khối thì tính trạng khối lượng riêng của gỗ bạch đàn tăng từ 480 lên 490 kg/m3, năng suất bột giấy từ 47% lên 49%, hàm lượng vỏ giảm từ 18% xuống còn 12% [48]. Các tổ hợp lai thuận nghịch giữa E. urophylla x E. grandis cũng đã được tạo ra ở Trung Quốc, Brazil và ở Indonesia. Hiện các giống này đang được trồng phổ biến tại Trung Quốc, năng suất các giống này cao gấp 1,5 lần các giống E. urophylla thuần [24], [45], [52]. Thông thường ưu thế lai thể hiện rõ hơn trong những điều kiện môi trường sống bất lợi và chúng có phạm vi thích ứng rộng hơn mức bình thường. Nghiên cứu của Verryn (2000) cho thấy những tổ hợp lai có khả năng chống chịu với điều kiện môi trường bất lợi tốt là E. grandis x E. camaldulensis, E. grandis x E. tereticornis, E. grandis x E. urophylla [50]. Nghiên cứu ưu thế lai về năng suất được thực hiện trên các tổ hợp E. grandis x E. urophylla, E. pellita x E. urophylla, kết quả cho thấy chúng là những tổ hợp lai có ưu thế lai vượt hơn các loài thuần và là giống sản xuất ở Brazil và Congo [24]. Ngoài ra, ưu thế lai về sinh trưởng và tính chịu lạnh được tìm thấy ở tổ hợp lai E. grandis x E. nitens, còn ưu thế lai về sinh trưởng và chống chịu bệnh loét thân thể hiện ở tổ hợp lai E. grandis x E. urophylla [50]. 1.1.2 Các nghiên cứu ở trong nước. Bạch đàn được du nhập vào nước ta từ những năm 1930, ban đầu các loài bạch đàn chủ yếu được lựa chọn để làm nguyên liệu giấy nhưng với
6 những ưu điểm cùng tính đa dụng và những đòi hỏi của thị trường gỗ thì đến nay bạch đàn đã trở thành loài cây trồng kinh tế trên khắp cả nước. Từ năm 1991, Trung tâm nghiên cứu giống cây rừng đã tiến hành chọn lọc cây trội và ghép một số cây E. urophylla (U), E.camaldulensis (C) và E. exserta (E). Trong các năm 1996 – 2000, Trung tâm đã nghiên cứu và tiến hành lai giống thuận nghịch cho ba loài nói trên bằng phương pháp thụ phấn có kiểm soát và tạo ra nhiều tổ hợp lai UC, CU, UE, EU, CE, EC và UU. Qua khảo nghiệm đã chọn lọc được 31 cây trội thuộc 8 tổ hợp lai đều có sinh trưởng nhanh hơn các loài bố mẹ [9], [39], [40]. Dựa trên kết quả nghiên cứu các giai đoạn trước đã chứng tỏ một số loài bạch đàn có triển vọng trong trồng rừng là E. urophylla cho các tỉnh miền Bắc, E. camaldulensis và E. tereticornis chủ yếu cho các tỉnh miền Trung và miền Nam, các loài bạch đàn có triển vọng này đã được xây dựng rừng giống và vườn giống tại nhiều vùng sinh thái phù hợp sinh trưởng phát triển của mỗi loài [10], [15]. Nguyễn Hoàng Nghĩa (2005) thực hiện đề tài nghiên cứu chọn giống bạch đàn theo hướng sinh trưởng và kháng bệnh. Kết quả cho thấy 3 loài bạch đàn là E. camaldulensis, E. brassiana và E. tereticornis có nhiều xuất xứ sinh trưởng khá, có khả năng kháng bệnh hại cao, đề tài chọn được một số dòng có sinh trưởng nhanh và kháng bệnh cao. Qua nghiên cứu và kế thừa ở các giai đoạn trước đề tài đã có được nhiều kết quả: Tuyển chọn được 8 dòng bạch đàn có chỉ số bệnh thấp, sinh trưởng nhanh từ khu khảo nghiệm 50 dòng ở Sông Mây, trong đó 2 dòng SM16 và SM23 đã được công nhận là giống tiến bộ kỹ thuật. Hai dòng này sinh trưởng nhanh đạt năng suất trên 25 m3/ha/năm và chống chịu tốt với bệnh hại lá tại Bình Dương và Bình Phước [12]. Trong khuôn khổ dự án Sida – SAREC về nghiên cứu cải thiện giống cây rừng, Trung tâm nghiên cứu giống cây rừng đã thực hiện trên đối tượng
7 nghiên cứu là E. urophylla và E. pellita (P). Kết quả trong giai đoạn 2005 – 2009 đã tạo ra trên 60 tổ hợp lai UP và PU và một số khảo nghiệm giống lai tại Hà Nội, Nghệ An, Quảng Trị và Quảng Bình. Đánh giá sinh trưởng ở 30 tháng tuổi cho thấy tổ hợp lai giữa hai loài này có triển vọng cho trồng rừng ở miền Bắc và Bắc Trung bộ nhưng trên lập địa cho thấy sự khác biệt rất lớn về sinh trưởng của các tổ hợp lai và điều này khẳng định có sự ảnh hưởng rất lớn giữa kiểu gene và môi trường. Tại Ba Vì – Hà Nội có ba tổ hợp lai triển vọng U70P28, U87P22, U87P8; và tại Đông Hà – Quảng Trị là 2 tổ hợp U87P22, U70P48. So với giống đối chứng U6 và PN14 thì những tổ hợp lai này có sinh trưởng tốt hơn rõ rệt với độ vượt trung bình về thể tích từ 20 – 50% [11]. Nguyễn Việt Cường (2005- 2009) nghiên cứu lai tạo giống một số loài bạch đàn, keo, tràm thông đã chọn được 19 dòng bạch đàn lai CU89, UE35, UE52, GU94, UE34, UE46, UE69, UC80, UE27, UE30, UE73, UU9, UE24, UE3, UE85, UE23, UC2, UU80 có sinh trưởng nhanh hơn đối chứng U6, GU8, PN2 và PN14 ở giai đoạn từ tuổi 2 đến tuổi 6. Trong 19 dòng bạch đàn lai đã có UE24, UC80 được công nhận là giống quốc gia và UE3, UE23, UE27, UE33, UC1, UC2, CU91, UE73 là giống tiến bộ kỹ thuật [4]. Nhìn chung, các công trình nghiên cứu trên đều cho thấy bạch đàn lai giữa các loài E. urophylla, E.camaldulensis, E. exserta, E. grandis, E. pellita... thích nghi tốt với điều kiện hoàn cảnh gây trồng khác nhau, có năng suất cao đã mang lại giá trị kinh tế trong trồng rừng sản xuất tại Việt Nam và nhiều quốc gia trên thế giới. 1.2 Cơ sở khoa học và ứng dụng của kỹ thuật phân tử trong chọn giống cây trồng. Ngoài các phương pháp chọn giống truyền thông thì những tính trạng quan tâm cũng có thể được chọn lọc gián tiếp thông qua các chỉ thị. Khi chỉ thị được xác định liên kết với tính trạng, chỉ thị đó cho biết sự có mặt hay
8 vắng mặt của gene hoặc tính trạng số lượng (Quantitative trait locus - QTL) quan tâm và không ảnh hưởng đến kiểu hình. Chỉ thị chia thành hai loại: chỉ thị hình thái và chỉ thị phân tử (CTPT). Chỉ thị hình thái biểu hiện như kiểu hình ở giai đoạn trưởng thành, các sản phẩm tương tác giữa gene và môi trường, kiểu hình của chỉ thị hình thái phụ thuộc vào giai đoạn phát triển của thực vật tại thời điểm thí nghiệm. Trong khi đó, CTPT được xác định ở cấp độ dưới mức tế bào, có thể được kiểm tra trong giai đoạn cây con nhờ các kỹ thuật phân tử cần thiết. Hai dạng chỉ thị mang lại những ứng dụng hiệu quả cho Marker assisted selection (MAS): (1) loại chỉ thị được định vị ngay trên phạm vi gene/QTL quan tâm tại vị trí 0 cM, đây là trường hợp lý tưởng nhất cho MAS, nhưng rất khó tìm kiếm loại chỉ thị này; (2) nhóm chỉ thị có khuynh hướng di truyền cùng gene/QTL quan tâm. Mối liên kết chỉ thị - gene được nhận biết khi gene và chỉ thị có khoảng cách vật lý gần nhau, chọn lọc dựa trên loại chỉ thị này gọi là dựa trên liên kết không cân bằng (Linkage disequilibrium – LD) [8]. CTPT là những đặc tính sinh học được xác định bằng dạng hình allele hoặc locus gene và có thể được truyền từ thế hệ này sang thế hệ khác, do đó chúng có thể được sử dụng như thiết bị dò để theo dõi cá thể, mô, tế bào, nhân, nhiễm sắc thể (NST) hoặc gene. CTPT là đoạn ADN biểu thị các biến dị, có thể được sử dụng để xác định đa hình giữa các kiểu gene hoặc các allele khác nhau của cùng một gene, các đoạn ADN này có mối liên kết tại một vị trí nhất định trong hệ gene và được xác định bằng công nghệ phân tử. CTPT là tiểu vùng của trình tự ADN biểu hiện tính đa hình, dựa vào việc mất đoạn, thêm đoạn hoặc thay thế đoạn giữa các cá thể khác nhau. CTPT được phát triển thành nhiều hệ thống dựa trên phương pháp và các kỹ thuật phát hiện đa hình khác nhau: Restriction fragment length polymorphism (RFLP), Amplified fragment length polymorphism (AFLP),
9 Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD), simple sequence repeat (SSR), Single-nucleotide polymorphism (SNP)... [8]. Về nguyên tắc, một CTPT lý tưởng phải đạt các yêu cầu sau: Bản chất cho đa hình cao, di truyền đồng trội, xuất hiện nhiều trong genome, dễ tiếp cận, phân tích nhanh và dễ dàng. Tuy nhiên, gần như không thể tìm thấy một CTPT nào có thể thỏa mãn tất cả những điều kiện trên. Tùy thuộc vào những nghiên cứu mà người ta sử dụng một hệ thống chỉ thị nhằm thỏa mãn một số điều kiện [1]. Bên cạnh đó chỉ thị phân tử ADN có những ưu điểm vượt trội so với chỉ thị hình thái ở một số đặc tính: - Đo lường trực tiếp các vật liệu di truyền; - Có nhiều chỉ thị trong quần thể; - Đo lường không chi phối ảnh hưởng của môi trường và ảnh hưởng có tính chất phát triển. Chỉ thị phân tử được chia làm ba loại chính: - Chỉ thị dựa trên cơ sở lai ADN: RFLP - Chỉ thị dựa trên nguyên tắc nhân bội ADN bằng PCR: RAPD, AFLP, STS (Sequence Tagged Site), RGA (Resistance Gene Analog), SNPs. - Chỉ thị dựa trên cơ sở những chuỗi có trình tự lặp lại. Nhóm chỉ thị này thực ra cũng dựa trên cơ sở nhân bội ADN nhưng do chúng có bản chất là chuỗi lặp lại nên có thể xếp vào một nhóm riêng: Minisatellite, SSR. Trong những năm gần đây việc nghiên cứu hệ gene sinh vật sử dụng các chỉ thị phân tử được phát triển nhanh chóng. Chỉ thị phân tử cho phép xác định được các chỉ tiêu trực tiếp của kiểu gene thông qua việc xác định các trình tự nhất định của các gene hay các trình tự đặc hiệu liên kết chặt với các gene mang các tính trạng mong muốn. Bằng việc sử dụng các chỉ tiêu phân tích trực tiếp kiểu gene, khắc phục ảnh hưởng của các yếu tố môi trường, theo dõi và phát hiện được các gene mong muốn, sự biến đổi của chúng qua các thế hệ khi chưa có sự biểu hiện ra kiểu hình.
10 Trên rất nhiều loại cây trồng hiện nay người ta đã thiết lập bản đồ chi tiết về các chỉ thị ADN liên kết với nhiều gene quy định các tính trạng nông sinh học khác nhau, trên cơ sở đó đã tiến hành chọn lọc gián tiếp dựa trên các chỉ thị phân tử này. Nhờ vào những ưu điểm của chỉ thị phân tử: - Tìm và phát hiện những cá thể có chứa một gene nhất định nào đó trong quần thể đang phân ly, trên cơ sở tìm sự có mặt của một mẫu ADN đánh dấu liên kết chặt với gene đó chứ không phải dựa vào kiểu hình của nó. - Đánh giá từng cá thể trong quần thể ở bất kì giai đoạn sinh trưởng nào: tế bào, mô hay toàn bộ cơ thể, trong bất kì điều kiện môi trường đánh giá nào, cùng một lúc đánh giá được nhiều tính trạng khác nhau trên một cá thể sinh vật. - Loại trừ được ảnh hưởng của mối tương tác giữa các allele khác nhau của một locus hoặc giữa các locus khác nhau lên sự biểu hiện tính trạng. - Tăng hiệu quả và độ chính xác của chọn lọc đặc biệt đối với những tính trạng khó biểu hiện ra kiểu hình. - Số lượng các chỉ thị phân tử là cực kỳ lớn, giúp cho nhà chọn giống phân biệt được sự sai khác rất nhỏ giữa hai cá thể sinh vật có họ hàng gần nhau, thậm chí khác nhau chỉ do đột biến nhỏ hoặc do tái tổ hợp, phân biệt được giữa các allele, các chủng sinh lý gây bệnh. - Là công cụ hữu hiệu để khẳng định quyền tác giả đối với các loại giống cây trồng, vật nuôi, phát hiện các loại bệnh di truyền trong y tế, phát hiện tội phạm... Cơ sở di truyền của các tính trạng tăng trưởng đã được nghiên cứu rộng rãi trong cây rừng. Nhiều nghiên cứu QTL đã nhấn mạnh sự hiện diện của cả hai vùng gene ổn định và không ổn định, đóng vai trò sản xuất sinh khối ở mỗi cấp tuổi cây rừng và nền tảng di truyền nhưng kết quả vẫn còn hạn chế về sự tương tác giữa QTL và môi trường. Mục tiêu chính trong các nghiên cứu
11 này là phân tích cấu trúc di truyền với quỹ đạo tăng trưởng và nhấn mạnh vào sự tương tác kiểu gene với môi trường bằng cách đo đường kính, chiều cao tại các thời điểm rồi kết hợp mức tăng trưởng giữa các thời điểm để tìm tính tương quan với các giá trị môi trường thay đổi [35], hay có thể hiểu là mức độ liên kết của chỉ thị và các gene/QTL kiểm soát tính trạng số lượng [8]. Năng suất là một tính trạng số lượng phức tạp, về cơ bản nó là tổng hợp của nhiều tính trạng khác nhau. Năng suất có hệ số di truyền thấp, ảnh hưởng lớn bởi các yếu tố môi trường. Sự khác biệt về năng suất không phải do sự phân li của một hoặc hai gene mà là do sự phân li của rất nhiều gene, với ảnh hưởng của mỗi gene là nhỏ. Tính trạng số lượng không phân li thành các nhóm cụ thể do đó ta không thể đơn giản chỉ sử dụng các nguyên lí di truyền Mendel để nghiên cứu. Thay vào đó, giải pháp cho nghiên cứu các tính trạng này là xác định vị trí các locus của tính trạng số lượng dựa trên sự liên kết với marker phân tử (QTL mapping). Ở thực vật, có hai phương pháp chính trong QTL mapping: - Phương pháp1: Sử dụng các quần thể tạo ra từ các phép lai được kiểm soát (ví dụ như quần thể F2, quần thể lai trở lại...) phù hợp cho các loài có vòng đời ngắn, dễ lai tạo và tạo nhiều hạt ở thế hệ sau, đồng thời có phương thức tính toán đơn giản hơn. - Phương pháp 2: Sử dụng các quần thể tự nhiên, giao phấn tự do không kiểm soát (phương pháp này còn được gọi là lập bản đồ kết hợp - association mapping). Có lợi thế là không phải tạo ra quần thể phân li, phù hợp cho các loài giao phấn, vòng đời dài và có thể phân tích được nhiều allele cùng một lúc [6].
12 1.3 Nghiên cứu, phát triển chỉ thị phân tử trong chọn giống cây lâm nghiệp. Chỉ thị phân tử có thể được sử dụng để nghiên cứu mô hình của di truyền, biến dị di truyền, hiện tượng tiến hóa và chọn lọc, các mối liên kết allele - allele và các liên kết allele - kiểu hình. Ứng dụng chỉ thị phân tử phụ thuộc vào tính chất vật lý của chỉ thị và vị trí của hệ gene, các chi phí liên quan, dễ sử dụng, và mức độ công suất cần thiết. Chỉ thị phân tử đã được áp dụng thành công trong khoa học thực vật đối với việc lập bản đồ di truyền và vật lý của hệ gene, xác định các gene kiểm soát quá trình khác nhau và kiểu hình (liên kết tính trạng), đa dạng di truyền và phân tích tiến hóa, chỉ thị còn hỗ trợ quá trình sinh sản nâng cao chất lượng giống cây trồng. Trước đây, vị trí của một CTPT thường không rõ và không cần thiết cho mục đích của sự đa dạng, phân tích tiến hóa và các ứng dụng về giống. Với những tiến bộ trong công nghệ giải mã bộ gene, CTPT với sự hiểu biết về vị trí gene và môi trường đang trở nên phổ biến hơn và được áp dụng cho phạm vi ngày càng rộng và thông lượng cao của mục tiêu. Đánh dấu chuỗi dựa trên ADN vốn đã có thể nắm bắt một lượng lớn các biến thể ở độ phân giải đơn giản, làm cho chúng đặc biệt hữu ích cho việc phát hiện các dấu hiệu hoàn hảo (đa hình ADN là nguyên nhân của liên kết các tính trạng quan tâm) và phát hiện, phân tích của các allele tham gia [37]. Nghiên cứu và phát triển nguồn giống cây bạch đàn đã tăng gấp bốn lần năng suất trồng trước đây, với chỉ tiêu hiện tại của 40 m3/ha/năm (ABRAF, 2013) và khả năng lên đến 100 m3/ha/năm với quản lý chuyên sâu (Evans và Turnbull, 2004) [19], [34]. Hiệu quả trong chiến lược chọn giống và dòng vô tính đã được triển khai nhằm phát triển rừng trồng sản xuất. Các nỗ lực trong chọn giống nhờ kỹ thuật sinh học phân tử và phân tích di truyền học phân tử đang được tiến hành mạnh mẽ ở bạch đàn trong sản xuất và bảo tồn. Mỗi loại chỉ thị phân tử khác nhau được