Luận văn Thạc sĩ Khoa học Lâm nghiệp: Nghiên cứu tạo cây con Mây nếp (Calamus Tetradactylus Hance) bằng phương pháp nuôi cấy in vitro

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:81

Thêm vào BST

Báo xấu

17
lượt xem 4
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Nội dung chính của đề tài là nghiên cứu kỹ thuật tạo mẫu sạch in vitro từ hạt và chồi măng cây mây nếp; Nghiên cứu kỹ thuật tạo cụm chồi mây nếp trong điều kiện nuôi cấy in vitro; Nghiên cứu kỹ thuật kích thích tăng trưởng chồi trong điều kiện nuôi cấy in vitro. Mời các bạn cùng tham khảo!

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Khoa học Lâm nghiệp: Nghiên cứu tạo cây con Mây nếp (Calamus Tetradactylus Hance) bằng phương pháp nuôi cấy in vitro

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT TRƯỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP NGUYỄN THỊ MAI DƯƠNG NGHIÊN CỨU TẠO CÂY CON MÂY NẾP (CALAMUS TETRADACTYLUS HANCE) BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY IN VITRO LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC LÂM NGHIỆP HÀ NỘI, 2010
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT TRƯỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP NGUYỄN THỊ MAI DƯƠNG NGHIÊN CỨU TẠO CÂY CON MÂY NẾP (CALAMUS TETRADACTYLUS HANCE) BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY IN VITRO Chuyên ngành: Lâm học Mã số: 60.62.60 LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC LÂM NGHIỆP Người hướng dẫn khoa học: TS. HOÀNG THANH LỘC HÀ NỘI, 2010
1 ĐẶT VẤN ĐỀ Ở nước ta, lâm sản ngoài gỗ có vai trò đặc biệt quan trọng đối với phát triển kinh tế - xã hội của đất nước. Mây là một trong những loài cây lâm sản ngoài gỗ có giá trị kinh tế cao. Nghề gây trồng, chế biến và kinh doanh các sản phẩm từ mây, đã tạo ra nhiều việc làm, tăng thu nhập, cải thiện đời sống cho người dân. Trong những năm gần đây, việc khai thác mây tự nhiên diễn ra quá mức, bất hợp lý, làm cho khu phân bố, cũng như trữ lượng mây còn không nhiều. Nguồn mây nguyên liệu tự nhiên không còn đủ đáp ứng cho các cơ sở sản xuất để tạo các sản phẩm phục vụ cho nhu cầu sử dụng trong nước và xuất khẩu. Vì vậy hàng năm chúng ta phải nhập khẩu một lượng lớn mây nguyên liệu từ bên ngoài, chủ yếu từ Lào và Trung Quốc. Hiện nay, nhiều tỉnh trong cả nước đang có các chương trình mở rộng diện tích trồng mây nguyên liệu. Để nâng cao năng suất, giống tốt có vai trò cực kỳ quan trọng. Giống mây nếp (C. tetradactylus Hance) đang được đánh giá là giống cho năng suất và giá trị kinh tế cao ở Việt Nam, được nhiều địa phương gây trồng. Với diện tích gây trồng mây ngày càng được mở rộng, nên thị trường đang có nhu cầu rất lớn về cây giống chất lượng cao. Trồng rừng nguyên liệu từ cây con thực sinh thường có hiện tượng phân li hữu tính, nên có sinh trưởng và phát triển, cũng như có số lượng và chất lượng các sản phẩm chuyên dụng không đồng đều. Điều này đã ảnh hưởng không nhỏ tới việc gây trồng, chăm sóc, khai thác và chế biến. Việc áp dụng kỹ thuật tạo cây con bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào - phương pháp nhân giống sinh dưỡng tiên tiến nhằm chủ động tạo ra số lượng lớn cây giống có phẩm chất di truyền tốt và đồng đều, trong thời gian ngắn thực sự đang là việc làm cấp bách và đầy ý nghĩa. Với ý nghĩa như vậy, tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu tạo cây con mây nếp (Calamus tetradactylus Hance) bằng phương pháp nuôi cấy in vitro".
2 Chương 1. TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1. Đại cương về nuôi cấy mô – tế bào 1.1.1. Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô – tế bào thực vật Tính toàn năng cùng với sự phân hóa và phản phân hóa của tế bào là cơ sở lý luận của kỹ thuật nuôi cấy mô – tế bào. 1.1.1.1.Tính toàn năng (Totipotence) của tế bào Haberlandt (1902) là người đầu tiên đề xuất phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật để chứng minh tính toàn năng của tế bào. Theo ông, mỗi tế bào của bất kỳ cơ thể sinh vật nào đều mang lượng thông tin di truyền cần thiết và đủ của cả sinh vật đó, vì vậy khi gặp điều kiện thích hợp mỗi tế bào đều có thể phát triển thành cơ thể hoàn chỉnh [2], [12]. Tính toàn năng của tế bào mà Haberlandt nêu ra chính là cơ sở lý luận của phương pháp nuôi cấy mô – tế bào thực vật. Đến nay con người đã hoàn toàn chứng minh được khả năng tái sinh thành một cơ thể thực vật hoàn chỉnh từ một tế bào riêng rẽ. 1.1.1.2. Sự phân hóa và phản phân hóa tế bào Cơ thể thực vật trưởng thành là một chỉnh thể thống nhất bao gồm nhiều cơ quan chức năng khác nhau, trong đó có nhiều loại tế bào khác nhau thực hiện các chức năng cụ thể khác nhau. Tuy nhiên tất cả các loại tế bào đó đều bắt nguồn từ tế bào phôi sinh. Quá trình phân hóa tế bào có thể biểu thị: Tế bào phôi sinh Tế bào giãn Tế bào phân hóa chức năng Tuy nhiên, khi tế bào đã phân hóa thành mô chức năng chúng không hoàn toàn mất khả năng phân chia của mình. Trong trường hợp cần thiết, điều kiện thích hợp, chúng lại có thể trở về dạng tế bào phôi sinh và lại phân chia mạnh mẽ. Quá trình đó gọi là sự phản phân hóa tế bào, ngược lại với sự phân hóa tế bào.
3 Về bản chất thì quá trình phân hóa và phản phân hóa là một quá trình hoạt hóa phân hóa gen. Tại một thời điểm nào đó trong quá trình phát triển của cá thể, có một số gen được hoạt hóa (mà vốn trước nay bị ức chế) để cho ra tính trạng mới, một số gen khác lại bị đình chỉ hoạt động. Điều này xảy ra theo một chương trình đã được mã hóa trong cấu trúc phân tử ADN của mỗi tế bào. Mặt khác, khi tế bào nằm trong một khối mô của cơ thể thường bị ức chế bởi các tế bào xung quanh. Khi tách riêng rẽ tế bào, gặp điều kiện thuận lợi thì các gen được hoạt hóa, quá trình phân hóa sẽ được xảy ra theo một chương trình đã định sẵn. 1.1.2. Lịch sử phát triển nuôi cấy mô – tế bào thực vật 1.1.2.1. Trên thế giới - Giai đoạn khởi xướng (1898 - 1930) Haberlandt (1902) – nhà sinh lý thực vật học người Đức là người đầu tiên đề xuất phương pháp nuôi cấy mô – tế bào thực vật để chứng minh tính toàn năng của tế bào. Theo ông, mỗi tế bào của bất kỳ cơ thể sinh vật nào đều mang lượng thông tin di truyền cần thiết và đủ của cả sinh vật đó, vì vậy khi gặp điều kiện thích hợp mỗi tế bào đều có thể phát triển thành cơ thể hoàn chỉnh [12]. Tuy nhiên ông đã không thành công trong thí nghiệm nuôi cấy tế bào khí khổng. - Giai đoạn nghiên cứu sinh lý (1930 - 1950) Giai đoạn này bắt đầu năm 1934 với công trình của White (Mỹ). Ông đã nuôi cấy thành công rễ cà chua (Lycopersicum esculanum) trên môi trưởng lỏng chứa muối khoáng, glucose và dịch chiết nấm men. Năm 1935, Thimann đã phát hiện ra Auxin (IAA) trong mô thực vật. Nhiều nhà nghiên cứu đã sử dụng IAA cùng các Vitamin bổ sung vào môi trường nuôi cấy và thu được kết quả tốt. Cũng trong thời gian này, Gautheret (Pháp) đã nghiên cứu nuôi cấy
4 mô tượng tầng một số cây thân gỗ. Trong những năm 1940, nhiều chất điều hòa sinh trưởng thuộc nhóm Auxin (NAA, 2,4D) được tổng hợp thành công và được nhiều nhà nghiên cứu sử dụng trong nuôi cấy mô cùng với nước dừa. Kết quả nghiên cứu cho thấy các chất này có tác dụng kích thích tạo mô sẹo, thúc đẩy tế bào phân chia rõ rệt [2]. - Giai đoạn nghiên cứu phát sinh hình thái (1950 - 1960) Năm 1954 – 1955, Skoog và Miller (Mỹ) trong khi nuôi cấy mô lõi cây thuốc lá đã xác định được vai trò của Kinetin trong sự kích thích phát triển của mô. Năm 1956, Skoog và Miller đã tìm hiểu ảnh hưởng của tỷ lệ Auxin/Cytokinin trong môi trường nuôi cấy đến sự hình thành cơ quan và tạo được chồi từ mô cây thuốc lá nuôi cấy. Năm 1956, Nickell đã nuôi thành công tế bào đơn của đậu (Phaseolus vulgaris) trong dịch lỏng. Năm 1960, Bergman đã tái sinh tế bào đơn thuốc lá trong môi trường lỏng (còn gọi là kỹ thuật gieo tế bào) [2], [14]. - Giai đoạn triển khai nuôi cấy mô vào công nghệ sinh học thực vật (từ 1960 đến nay) Năm 1960, Cooking (Anh) đã dùng enzym Cellulase để phân hủy vỏ cellulose của tế bào thực vật và thu được các tế bào không vỏ, còn gọi là tế bào trần (protoplast). Nitsh (1967), Nakata và Tanaka (1968) tạo được cây thuốc lá đơn bội bằng cách nuôi cấy bao phấn. Nakata và Tanaka (1970 - 1971) cho các protoplast thuốc lá tái tạo vỏ Cellulose, tế bào mới phân chia tạo nên quần lạc tế bào trong môi trường lỏng và sau đó tạo được cây hoàn chỉnh. Năm 1977, Melchers dung hợp protoplast giữa khoai tây và cà chua thành công tạo ra cây lai khoai tây – cà chua “Pomate”. Từ năm 1965, Ledoux cho rằng có thể gây ra biến dị di truyền ở tế bào, thậm chí ở hạt giống bằng cách cho chúng hấp thụ ADN ngoại lai, ADN
5 ngoại lai sau khi vào trong tế bào sẽ gắn với ADN nội bào. ADN ngoại lai vào trong tế bào thực vật, đặc biệt là trong tế bào trần, chúng không bị các nuclease của tế bào chủ phân hủy. Từ năm 1980, hàng loạt nghiên cứu trong lĩnh vực công nghệ sinh học (công nghệ gen) đã được công bố. Ngày nay nuôi cấy mô – tế bào không những là cơ sở quan trọng của công nghệ sinh học hiện đại, là công cụ quan trọng trong chọn tạo và nhân giống hiện đại mà còn đóng góp những cơ sở lý luận mới cho sinh học hiện đại. 1.1.2.2. Lịch sử phát triển của nuôi cấy mô – tế bào thực vật ở Việt Nam Nuôi cấy mô – tế bào thực vật được phát triển ở Việt Nam ngay sau khi chiến tranh kết thúc (1975). Phòng thí nghiệm nuôi cấy mô – tế bào đầu tiên được xây dựng tại Viện Sinh vật học, viện Khoa học Việt Nam (KHVN) do PGS.TSKH. Lê Thị Muội đứng đầu. Phòng đã nghiên cứu các phương pháp nuôi cấy cơ bản trong điều kiện Việt Nam như nuôi cấy bao phấn, nuôi cấy mô sẹo và protoplast. Thành công đầu tiên về nuôi cấy bao phấn lúa và thuốc lá đã được công bố vào năm 1978 (Lê Thị Muội và cs, 1978; Lê Thị Xuân và cs.,1978). Tiếp đó là thành công về nuôi cấy protoplast ở thuốc lá và khoai tây (Lê Thị Muội và Nguyễn Đức Thành, 1978; Nguyễn Đức Thành và Lê Thị Muội, 1980, 1981). Trong cùng thời gian, tại phân viện KHVN ở thành phố Hồ Chí Minh, Đại học Nông nghiệp I Hà Nội, viện Khoa học kỹ thuật Nông nghiệp Việt Nam... các phòng thí nghiệm nuôi cấy mô – tế bào được thành lập và chủ yếu tập trung vào vi nhân giống khoai tây. Đến nay, nước ta đã có rất nhiều phòng thí nghiệm nuôi cấy mô – tế bào ở các viện nghiên cứu (viện Di truyền Nông nghiệp, viện Rau quả Trung ương, ...); các trường đại học (Đại học Nông nghiệp I, Đại học Lâm nghiệp, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh,...); một số tỉnh và cơ sở sản xuất
6 cây giống nông – lâm nghiệp (Yên Bái, Hưng Yên, Bình Định, Đà Lạt, Quảng Ninh, Hòa Bình, Phú Thọ,...) Đối tượng cây giống sản xuất bằng phương pháp nuôi cấy mô – tế bào thực vật cũng được mở rộng như: bạch đàn, keo, dó trầm, lan, cúc,... 1.1.3.Thành tựu nuôi cấy mô – tế bào thực vật Kỹ thuật nuôi cấy mô – tế bào thực vật đã thành công với hàng loạt các cây trồng như: cây ăn quả, cây lương thực, cây công nghiệp, cây thuốc, hoa... và các loại cây quý hiếm có giá trị cao. Ở nước ta, các hướng nghiên cứu ứng dụng phương pháp nuôi cấy mô – tế bào thực vật được phát triển mạnh từ những năm 1980 và đã đạt được những kết quả đáng khích lệ trong lĩnh vực nhân giống in vitro: nhân giống khoai tây, dứa, chuối, mía; một số loài hoa như: phong lan, đồng tiền, cúc, cẩm chướng; một số cây lâm nghiệp như: bạch đàn, keo...; các cây dược liệu như: thông đỏ, thanh hao [12]. Với cây công nghiệp, chúng ta đã ứng dụng thành công phương pháp nuôi cấy in vitro, góp phần giải quyết nhu cầu nguyên liệu đối với một số cây trồng trọng điểm như: dứa Cayen, mía...theo phương pháp nhân cụm chồi của Mapes (1974). Với cây lương thực, kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng (meristem) tạo được cây khoai tây sạch virus, lập được ngân hàng giống khoai tây hay nuôi cấy bao phấn lúa tạo cây đơn bội [2], [12], [15]. Một số kết quả bước đầu đã được ghi nhận trong lĩnh vực chọn dòng tế bào như chọn dòng kháng bệnh, chọn dòng chịu muối, chịu mất nước. Nuôi cấy các cây dược liệu quý để bảo tồn nguồn gen và tạo các dòng tế bào có hàm lượng các chất sinh học quan trọng cao cũng đã và đang được phát triển. Nuôi cấy mô – tế bào còn được ứng dụng để nhân các cây chuyển gen nhằm tạo ra nhiều cây trồng chuyển gen với những đặc tính mong muốn như: tính kháng virus, kháng vi khuẩn, kháng nấm, kháng côn trùng, kháng thuốc
7 diệt cỏ, kháng kim loại nặng và chống băng giá, chống hạn... đã thành công trên nhiều đối tượng như lúa, bông... [2], [12]. Đến nay, nuôi cấy mô – tế bào thực vật trở thành một công cụ không thể thiếu của công nghệ sinh học hiện đại nhất là trong lĩnh vực ứng dụng công nghệ ADN tái tổ hợp thực vật, công nghệ tạo giống và nhân nhanh giống hiện đại. 1.2. Nhân giống vô tính in vitro 1.2.1. Khái niệm nhân giống vô tính in vitro - Nhân giống in vitro hay vi nhân giống (micropropagation) là hệ thống sử dụng sự phát triển nhân tạo và nhân các điểm sinh trưởng tồn tại hoặc mô phân sinh trong cây [12]. - Nói cách khác, nhân giống in vitro hay vi nhân giống (micropropagation) là sự tăng bội hoặc tái sinh sản vật liệu thực vật được thu nhỏ trong ống nghiệm dưới điều kiện môi trường vô trùng và được điều khiển. 1.2.2. Yêu cầu thực tiễn Hiện nay, các ngành sản xuất nông lâm nghiệp đã và đang được quan tâm trên nhiều quốc gia. Mong muốn tạo ra nhiều sản phẩm có năng suất, chất lượng cao, sạch bệnh... phục vụ nhu cầu của con người. Đáp ứng những nhu cầu trên thì vấn đề đẩy mạnh công tác nhân giống in vitro càng được quan tâm với những mục tiêu sau: - Duy trì và nhân nhanh các kiểu gen quý làm vật liệu cho công tác nhân giống - Nhân nhanh và duy trì các cá thể đầu dòng tốt để cung cấp hạt giống các loại cây trồng khác nhau như cây lương thực, cây cảnh, cây dược liệu, các loài hoa... - Nhân nhanh ở điều kiện vô trùng cách ly tái nhiễm kết hợp với làm sạch virus - Bảo quản các tập đoàn giống, nhân giống vô tính các loài cây giao phấn trong ngân hàng gen [2].
8 1.2.3. Một số phương thức nhân giống vô tính in vitro Phương pháp nhân giống in vitro đã bổ sung cho các kỹ thuật nhân giống cổ điển như: chiết cành, ghép, giâm hom... Nhân giống in vitro hay vi nhân giống trong ống nghiệm là một trong bốn lĩnh vực ứng dụng chính của công nghệ tế bào thực vật và mang lại hiệu quả kinh tế lớn. Có 3 phương thức để tạo cây in vitro: 1.2.3.1. Hoạt hóa chồi nách Hoạt hóa chồi nách bằng cách phá vỡ hiện tượng ưu thế ngọn khi nuôi cấy các đỉnh chồi hoặc đoạn thân mang mắt ngủ. Theo phương pháp này thì sự hoạt hóa chồi nách diễn ra theo 2 cách: - Cây phát triển trực tiếp từ chồi đỉnh hoặc chồi nách (xảy ra khi nuôi cấy loài cây hai lá mầm như: khoai tây, hoa cúc, cây thuốc lá...) - Tạo cụm chồi từ đỉnh hoặc chồi nách (xảy ra với cây một lá mầm như: cây lúa, cây mía...) 1.2.3.2. Phương pháp tạo chồi bất định Chồi bất định là chồi được hình thành từ các cơ quan, các bộ phận khác của cây, không phải là phôi. Như: chồi hình thành từ mô sẹo (callus). Tạo chồi bất định sử dụng các bộ phận của cây như: đoạn thân, mô lá, giẻ hành. Trong quá trình này cần thực hiện quá trình phản phân hóa và tái sinh tế bào để bắt tế bào sôma hình thành chồi trực tiếp hoặc gián tiếp thông qua giai đoạn phát triển mô sẹo. 1.2.3.3. Phương pháp tạo phôi vô tính Trong quá trình nuôi cấy in vitro, phôi có thể hình thành từ các tế bào sôma gọi là phôi vô tính. Các phôi vô tính có thể tái sinh thành cây hoàn chỉnh hoặc có thể được sử dụng làm nguyên liệu để sản xuất hạt giống nhân tạo. Tương tự như tạo chồi bất định, để tạo phôi vô tính cần thực hiện quá trình phản phân hóa và tái sinh tế bào để tách các tế bào sôma, hình thành
9 phôi trực tiếp hoặc gián tiếp thông qua giai đoạn phát triển mô sẹo. Sự hình thành phôi trải qua 2 bước chính sau: - Sự phân hóa các tế bào có khả năng phát sinh phôi. Trong quá trình này cần môi trường giàu Auxin vì Auxin giúp cho việc cảm ứng để tạo các tế bào phôi, đồng thời Auxin giúp kích thích quá trình phát triển số lượng tế bào thông qua việc liên tiếp phân chia tế bào. Các tế bào có khả năng phát sinh phôi là các tế bào nhỏ, nhân lớn, nhiều hạch nhân, không có không bào, tế bào chất đậm đặc, giàu protein, ARN thông tin. - Sự phát triển của phôi mới hình thành. Môi trường nuôi cấy trong giai đoạn này phải nghèo hoặc không có Auxin, với nồng độ Auxin cao kích thích quá trình hình thành phôi nhưng ức chế quá trình phân hóa và phát triển tiếp theo của phôi. Như vậy, nồng độ chất điều hòa sinh trưởng hợp lý là điều kiện quyết định cho các phản hồi thích hợp, nếu nồng độ thấp có thể gây sốc cho phản ứng và nồng độ cao có thể gây ức chế hoặc gây độc [13]. 1.2.4. Các giai đoạn chính trong quá trình nhân giống in vitro Theo Georger (1993) quá trình nhân giống vô tính in vitro bao gồm các bước sau: Bước 1: Chọn lọc và chuẩn bị cây mẹ Trước khi tiến hành nhân giống in vitro cần chọn lọc cẩn thận cây mẹ (cây cho nguồn mẫu nuôi cấy). Các cây này phải sạch bệnh, đặc biệt là bệnh virut và ở giai đoạn sinh trưởng mạnh. Việc trồng các cây mẹ trong điều kiện thích hợp với chế độ chăm sóc và phòng trừ bệnh hiệu quả trước khi lấy mẫu sẽ giảm tỷ lệ mẫu nhiễm, tăng khả năng sống và sinh trưởng của mẫu cấy in vitro Bước 2: Nuôi cấy khởi động Là giai đoạn khử trùng đưa mẫu vào nuôi cấy in vitro. Giai đoạn này cần đảm bảo các yêu cầu sau: tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, mô tồn tại và sinh trưởng tốt.
10 Khi lấy mẫu cần chọn đúng loại mô, đúng giai đoạn phát triển của cây. Quan trọng nhất là đỉnh chồi, đỉnh chồi nách và sau đó là đỉnh chồi hoa và cuối cùng là đoạn thân, mảnh lá... chồi ngọn, chồi nách được dùng để nhân nhanh các cây: măng tây, dứa, khoai tây, thuốc lá, hoa cúc... ở suplơ dùng hoa tự non, ở bầu bí các mảnh lá mầm là nguyên liệu nuôi cấy thích hợp để nhân nhanh in vitro. Chồi non nảy mầm từ hạt cũng có thể dùng làm vật liệu nuôi cấy Bước 3: Nhân nhanh Là giai đoạn kích thích mô nuôi cấy phát sinh hình thái và tăng số lượng thông qua các con đường: hoạt hóa chồi nách, tạo chồi bất định và tạo phôi vô tính. Vấn đề là xác định được môi trường nuôi cấy và điều kiện ngoại cảnh thích hợp để hiệu quả đạt cao nhất. Theo nguyên tắc chung môi trường có nhiều cytokinin sẽ kích thích tạo chồi. Chế độ nuôi cấy thường là 25 - 270C và 16 giờ chiếu sáng/ngày, cường độ ánh sáng từ 2000 - 4000 lux. Tuy nhiên đối với mỗi loại đối tượng nuôi cấy sẽ có chế độ nuôi cấy khác nhau: nhân nhanh sup lơ cần chu kì chiếu sáng 9h/ngày, nhân nhanh phong lan Phalenopsis ở giai đoạn đầu cần che tối... Bước 4: Tạo cây in vitro hoàn chỉnh Để tạo rễ cho chồi, người ta chuyển chồi từ môi trường nhân nhanh sang môi trường tạo rễ. Môi trường tạo rễ thường bổ sung một lượng nhỏ auxin. Một số chồi có thể phát sinh rễ ngay sau khi chuyển từ môi trường nhân nhanh giàu cytokinin sang môi trường không có chất điều hòa sinh trưởng. Bước 5: Đưa cây ra vườn ươm Để đưa cây từ ống nghiệm ra vườn ươm với tỉ lệ sống cao, cây sinh trưởng tốt cần đảm bảo một số yêu cầu sau: - Cây trong ống nghiệm phải đạt những tiêu chuẩn hình thái nhất định (số lá, chiều dài rễ, độ cao của thân)
11 - Các giá thể thích hợp cho cây in vitro: giá thể sạch, tơi xốp, thoát nước. - Phải chủ động điều chỉnh được ẩm độ, sự chiếu sáng của vườn ươm cũng như có chế độ dinh dưỡng phù hợp. 1.2.5. Các nhân tố ảnh hưởng tới quá trình nhân giống 1.2.5.1. Thành phần môi trường dinh dưỡng Vào thời kì Haberlandt tiến hành các thí nghiệm nuôi cấy tế bào phân lập những hiểu biết về nhu cầu dinh dưỡng khoáng của mô và tế bào thực vật còn rất hạn chế, đặc biệt là vai trò của các chất điều hòa sinh trưởng hầu như chưa được khám phá. Chính vì vậy mà Haberlandt đã không thành công. Đến nay có hàng trăm loại môi trường dinh dưỡng nhân tạo đã được xây dựng và thử nghiệm có kết quả. Hầu hết các loại môi trường đều gồm những nhóm chất chính sau: Các loại muối khoáng, nguồn các bon, vitamin, các chất điều hoà sinh trưởng, các nhóm chất bổ sung, chất độn. - Các loại muối khoáng Các nguyên tố khoáng dùng trong môi trường dinh dưỡng nuôi cấy mô và tế bào thực vật được chia thành hai nhóm: đa lượng và vi lượng + Các nguyên tố khoáng đa lượng Bao gồm các nguyên tố khoáng được sử dụng ở nồng độ trên 30ppm (tức là trên 30mg/l). Những nguyên tố đó là N, S, P, K, Mg, Ca. Riêng Na và Cl cũng được sử dụng trong một vài môi trường nhưng vẫn chưa rõ tác dụng của chúng. - Nito (N): được sử dụng ở hai dạng NO3- và NH4+ riêng rẽ hoặc phối hợp với nhau. Hầu hết các thực vật đều có khả năng khử nitrat thành amonium thông qua hệ thống nitrat reductase (NR). Amonium được tế bào thực vật đồng hóa trực tiếp để sinh ra tổng hợp các chất hữu cơ như amoni acid. Điều đáng lưu ý là nếu chỉ dùng amonium thì sinh trưởng của tế bào giảm, thậm chí ngừng hoàn toàn. Nguyên nhân chính là do quá trình trao đổi
12 ion của tế bào xảy ra lệch dẫn đến tình trạng thay đổi pH của môi trường. Cụ thể: khi chỉ dùng nitrat độ pH của môi trường giảm dần do tế bào hấp thu NO3- hoặc NH4+ và thải ra ngoài môi trường loại ion có giá trị tương đương. Khi pH giảm thì quá trình trao đổi Fe của tế bào kém đi, kết quả là tế bào sinh trưởng chậm lại. Vì vậy hầu hết các loại môi trường đều dùng nitrat và amonium dạng phối hợp nhưng tùy theo đặc tính hấp thu nitơ của loài cây đó mà phối hợp theo tỉ lệ thích hợp - Lưu huỳnh (S): Chủ yếu và tốt nhất là muối SO42-. Các dạng ion khác như SO32- hoặc SO22- thường kém tác dụng thậm chí còn độc. - Phospho (P): Mô và tế bào thực vật nuôi cấy có nhu cầu về phospho rất cao. P là một trong những thành phần cấu trúc của phân tử acid nucleic. Ngoài ra khi phospho ở dạng H2PO4- và HPO42- còn có tác dụng như một hệ thống đệm làm ổn định pH của môi trường trong quá trình nuôi cấy. + Các nguyên tố vi lượng Là các nguyên tố được sử dụng ở nồng độ thấp hơn 30ppm. Đó là Fe, B, Mn, Mo, Cu, Zn, Ni, Co. - Sắt (Fe): thiếu sắt tế bào mất khả năng phân chia. Thí nghiệm với sắt đánh dấu đồng vị phóng xạ 59Fe cho thấy Fe được dự trữ trong nhân rất nhiều. Thiếu Fe làm giảm hàm lượng RNA và giảm sinh tổng hợp protein, nhưng làm tăng hàm lượng DNA và amino acid tự do. Kết quả là giảm phân bào. Fe thường tạo phức hợp với các thành phần khác khi pH thay đổi, phức hợp này thường mất khả năng giải phóng Fe cho các nhu cầu trao đổi chất trong tế bào. Tốt nhất nên sử dụng Fe ở dạng chelat với citrat hoặc với EDTA (Etylen Diamin Tetraacetic Acid). Từ các phức chất này Fe được giải phóng ra trong phạm vi rộng - Mangan (Mn): thiếu Mn cũng làm hàm lượng acid tự do và DNA tăng dần, nhưng lượng RNA và sinh tổng hợp protein giảm dẫn đến kém phân bào.
13 - Bo (B): thiếu Bo trong môi trường gây nên biểu hiện như thừa auxin vì thực tế B làm cho các chất ức chế auxin oxydase trong tế bào giảm. Mô nuôi cấy có biểu hiện mô sẹo hóa mạnh nhưng thường là mô xốp mọng nước kém tái sinh - Molipden (Mo): là ion đóng vai trò là co - factor trong hệ thống nitrat reductase, như vậy Mo tác động trực tiếp lên quá trình trao đổi đạm trong tế bào thực vật [2], [12]. - Nguồn các bon Mô tế bào thực vật nuôi cấy in vitro sống chủ yếu theo phương thức chủ yếu là dị dưỡng, mặc dù trong nhiều trường hợp chúng có thể sống bán dị dưỡng nhờ điều kiện tự nhiên ánh sáng nhân tạo và lục lạp có khả năng quang hợp. Vì vậy việc đưa vào môi trường nuôi cấy nguồn các bon hữu cơ là điều bắt buộc. Nguồn các bon thông dụng nhất đã được kiểm chứng là saccarose. Nồng độ thích hợp phổ biến là 2 - 3%, song cũng phụ thuộc vào mục đích nuôi cấy mà thay đổi, có khi xuống tới 0,2% (chọn dòng) và tăng lên 12% (nhằm cảm ứng stress nước). Tiếp đến là glucose và maltose cũng hay được đưa vào môi trường nuôi cấy (glucose cho nuôi cấy protoplast và maltose cho nuôi cấy bao phấn lúa). Các loại đường khác như fructose, raffinose, lactose, galactose... cũng đã được thử nghiệm, nhưng tỏ ra kém hiệu quả và chỉ được dùng trong những trường hợp đặc biệt. Các dạng polysaccaride như tinh bột, pectine, dextrine cũng có thể dùng cho nuôi cấy. Tuy nhiên những loại tế bào được nuôi cấy trên môi trường chỉ có chứa một trong các polysaccharide trên khả năng thủy phân thông qua các enzyme như amylase. Có những chủng tế bào nuôi cấy giải phóng ra môi trường chứa nhiều tinh bột khá nhiều amylase. Chuyển chúng lên môi trường chỉ chứa saccarose, lượng amylase thải ra giảm ngay, nguyên
14 nhân chính là do các promoter của gen amylase chịu tác động khống chế của sacarose. - Vitamin Mặc dù các loại mô và tế bào nuôi cấy in vitro đều có khả năng tự tổng hợp hầu hết các loại vitamin, nhưng thường không đủ về lượng, do đó phải bổ sung thêm từ bên ngoài, đặc biệt là các vitamin thuộc nhóm B. + Vitamin B1 (Thiamin.HCl hoặc aneurin): là chất bổ sung rất cần cho môi trường nuôi cấy. Khi khử trùng bằng cách hấp ở nhiệt độ cao, B 1 bị nhiệt phân thành pirimidin và thiazol là hai cấu tử của B1. Vì vậy không nhất thiết phải khử trùng bằng phương thức khác như lọc. + Vitamin B6 (Pyridoxin, ademin) là tiền chất của pyrodoxanphosphat – cofactor của các nhóm enzym như enzym cacboxydase và transaminase. Khi hấp ở nhiệt độ cao phản ứng xảy ra: pyridoxin + phosphat→ pyridoxanphosphat - Các chất điều hòa sinh trưởng Trong môi trường nuôi cấy mô và tế bào thực vật, thành phần phụ gia quan trọng nhất quyết định kết quả nuôi cấy là các chất điều hòa sinh trưởng, những chất điều hòa sinh trưởng đó thuộc các nhóm sau: + Auxin Được gọi là hoocmon sinh trưởng do Went và Thimann (1937) phát hiện, chủ yếu kích thích sinh trưởng của tế bào, cũng như làm tăng phân bào. Có 4 loại auxin thường được sử dụng trong nuôi cấy mô là: - Indolyacetic acid (IAA) tồn tại trong tự nhiên - Naphthylacetic acid (NAA) - 2,4-Dichlophenoxyacetic acid (2,4-D) - Indolylbutyric acid (IBA) Riêng IAA là auxin tự nhiên còn lại là auxin nhân tạo. Thường thì các auxin nhân tạo có hoạt tính mạnh hơn auxin tự nhiên do đặc điểm phân tử của
15 chúng nên các enzym oxi hóa auxin (auxinoxidase) không có tác dụng. Kinh nghiệm sử dụng auxin trong nuôi cấy mô: lúc đầu sử dụng ở nồng độ cao sau thấp hơn để tránh tình trạng mô bị say và nhiễm độc + Cytokinin Là hoocmon phân bào lần đầu tiên được Skoog (khoảng 1950) phát hiện trong môi trường thí nghiệm chiết xuất acid nucleic bị sơ suất. Đó là những cấu tử của acid nucleic bị phân hủy thành. Các loại cytokinin chính đang được sử dụng trong nuôi cấy mô là: - Kinetin là sản phẩm được phát hiện đầu tiên, có cấu trúc phân tử là: 6 - (2 - furfuryl) - aminopurin. Kinentin được phân lập từ chế phẩm DNA cũ hoặc nucleic acid mới sau khi hấp ở nhiệt độ cao hay đun sôi. Trong cơ thể sống có thể không có Kinetin tồn tại. Sản phẩm này kích thích sự phát sinh chồi của cây thuốc lá nuôi cấy, nhưng nếu phối hợp xử lí cùng auxin ở tỷ lệ nồng độ thích hợp sẽ kích thích quá trình phân chia tế bào (do đó có tên là Kinetin). Kinetin thực chất là một dẫn xuất của bazơ hữu cơ adenin, như vậy có thể coi đây là một chất nhân tạo. Trong tự nhiên có tồn tại một hoocmon phân bào không? Letham là người đầu tiên đã phân lập tinh chế và cho kết tinh thành công hoocmon phân bào tự nhiên đó là nội nhũ đang ở dạng sữa của hạt ngô. Hợp chất cytokinin tự nhiên đó được gọi là zeatin (zea = ngô) - Zeatin cũng là một dẫn xuất của adenin. Công thức hóa học của zeatin là: 6-(4-hydroxy-3-methylbut-2-enyl) aminopurin. Trong thực tiễn nuôi cấy, người ta chỉ dùng zeatin trong những trường hợp đặc biệt vì nó quá đắt, mà thường sử dụng kinetin hoặc một số sản phẩm nhân tạo. Đó là: 6- benzylaminopurin BAP (6-benzylaminopurin): Hoạt lực của BAP cao hơn nhiều so với kinetin và bản thân BAP bền vững hơn zeatin ở nhiệt độ cao. + Gibberellic acid
16 Được phát hiện vào những năm 1930. Lịch sử phát hiện nhóm hoocmon này bắt đầu từ 1895 khi người Nhật nói về bệnh lúa von. 1926 phát hiện được bệnh là do loài nấm Gibberlla fujikuroi gây ra. Đến những năm 1930 thì mới phân lập và tinh chế được hoạt chất được gọi là gibberelli. Mãi sau chiến tranh thế giới thứ hai, năm 1950 người Anh và người Mĩ mới biết đến thành công này của Nhật. Tới nay đã phát hiện được trên 60 chất thuộc nhóm gibberellin acid. Loại gibberellin acid thông dụng nhất trong nuôi cấy mô là GA3. Trong đời sống thực vật, gibberellin đóng vai trò đối với nhiều quá trình sinh lý như: - Sinh lý ngủ nghỉ của hạt và chồi - Phát triển của hoa - Kích thích tăng trưởng chiều cao Nhưng trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật tác động của gibberellin acid chưa thật rõ ràng. Nhiều tác giả có sử dụng và coi đó là thành phần không thể thiếu của một loại môi trường chuyên dụng nào đó. + Abscisic acid (ABA) ABA thuộc nhóm các chất ức chế sinh trưởng. Abscisic acid có tác dụng tăng cường khả năng chống chịu của tế bào thực vật với điều kiện ngoại cảnh bất lợi, vì vậy ABA được đưa vào môi trường tái sinh cây và mang lại hiệu quả nhất định. + Etylen Etylen có biểu hiện tác động hai chiều, nó kìm hãm hình thành chồi ở giai đoạn sớm nhưng lại kích thích chồi phát triển ở giai đoạn muộn. Trong một số trường hợp etylen kích thích sự hình thành rễ nhưng một số trường hợp khác nó lại kìm hãm quá trình này [2], [12].
17 - Các hỗn hợp chất tự nhiên Các nhà sáng lập của ngành nuôi cấy mô thường sử dụng môi trường rất đơn giản gồm muối khoáng và đường. Ngày nay người ta khẳng định rằng loại môi trường đơn giản như vậy không đủ để cho tế bào sinh trưởng bình thường. Vì vậy thành phần môi trường ngày càng phong phú, đầy đủ và phức tạp hơn, người ta đã sử dụng một số hỗn hợp dinh dưỡng tự nhiên sau: + Nước dừa Từ năm 1941 được sử dụng để nuôi phôi của Datura và năm 1949 nuôi mô của Daucus. Kết quả phân tích thành phần của nước dừa từ non đến già của Tulecke và cs (1961) cho thấy trong nước dừa có: - Amino acid tự do: đạt nồng độ 190,5 ppm đến 685 ppm trong nước dừa tùy theo tuổi của quả tính từ non đến già. Khi hấp ở nhiệt độ cao chỉ còn 70 ppm - Amino acid dạng liên kết có trong protein và peptid - Acid hữu cơ - Đường - RNA và DNA Ngoài ra nước dừa còn chứa các hợp chất quan trọng đối với tế bào nuôi phân lập như: myo-inositon, các chất có hoạt tính auxin, các cytokinin dạng glycoside + Dịch chiết mầm lúa mỳ (mạch nha): Thành phần hóa học chưa được phân tích kĩ, chủ yếu chứa một số đường, vitamin và một số chất có hoạt tính điều khiển sinh trưởng + Dịch chiết nấm men (Yeast Extract: YE): Với dịch nấm men, White (1934) lần đầu tiên thành công rễ cà chua trong ống nghiệm kéo dài vô thời hạn. Thành phần hóa học của dịch nấm men ít được chú ý phân tích. Chủ yếu chứa: đường, nucleic acid, amino acid,
18 vitamin, auxin, khoáng. Tác dụng của YE với rễ rất tốt nhưng với mô sẹo không rõ ràng. + Dịch thủy phân casein: Được sử dụng rộng rãi trong kỹ thuâ ̣t vi sinh vật, ở nuôi cấy mô tế bào thực vật chủ yếu được sử dụng làm nguồn bổ sung acid amin + Hỗn hợp amino acid nhân tạo Dựa trên những kết quả phân tích các hỗn hợp chất tự nhiên trên, nhiều tác giả đã đề ra các công thức pha chế hỗn hợp acid amin nhân tạo để bổ sung vào môi trường dinh dưỡng Kết quả sử dụng các hợp chất này rất khác nhau, có thể yêu cầu acid amin của từng tế bào khác nhau. Trong môi trường lỏng để nuôi mô sẹo và môi trường tái sinh cây từ mô sẹo, prolin là một thành phần quan trọng. - Chất độn (thạch) Là loại polysaccharid thu được từ một số loài tảo (chủ yếu là tảo hồng Rhodophyta), trong đó có rau câu mọc ở vùng đầm phá Việt Nam. Được sử dụng làm chất đệm cho môi trường rắn lại. Ở 800C thạch ngậm nước chuyển sang trạng thái sol và 400C trở về trạng thái gel. Khả năng ngậm nước của thạch là 7 - 12g thạch/1lít nước. Ngoài ra độ pH của môi trường dinh dưỡng ảnh hưởng trực tiếp tới quá trình thu nhận các chất dinh dưỡng từ môi trường vào tế bào. Vì vậy đối với mỗi loại môi trường nhất định và đối với loại môi trường cụ thể của các loài cây phải chỉnh độ pH của môi trường về mức độ ổn định ban đầu. Đối với mô sẹo của nhiều loài cây, pH ban đầu là 5,6 - 6,0 sau 4 tuần nuôi cấy đạt 6,0 - 6,5 Đặc biệt khi dùng các loại phụ gia có tính kiềm hoặc tính axit cao như axit amin, vitamin thì nhất định phải dùng NaOH để làm tăng hoặc HCl loãng để làm giảm pH môi trường về 5,5 - 6,5 [2], [12].