Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Lựa chọn các điều kiện lên men xốp tối ưu và nghiên cứu đặc tính xylanase từ các chủng vi khuẩn ưa nhiệt

Chia sẻ: Na Na | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:99

Thêm vào BST

Báo xấu

105
lượt xem 12
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận văn nhằm mục tiêu khảo sát và tuyển chọn những chủng vi khuẩn và xạ khuẩn bền nhiệt có hoạt độ enzyme xylanase cao; nghiên cứu đặc điểm sinh học và phân loại các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn nghiên cứu; lựa chọn các điều kiện lên men xốp tối ưu cho các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn nghiên cứu; nghiên cứu đặc tính và tinh sạch enzyme của các chủng nghiên cứu.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Lựa chọn các điều kiện lên men xốp tối ưu và nghiên cứu đặc tính xylanase từ các chủng vi khuẩn ưa nhiệt

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYỄN THỊ NHIÊN LỰA CHỌN CÁC ĐIỀU KIỆN LÊN MEN XỐP TỐI ƯU VÀ NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH XYLANASE TỪ VI KHUẨN ƯA NHIỆT LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC Hà Nội - 2012
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYỄN THỊ NHIÊN LỰA CHỌN CÁC ĐIỀU KIỆN LÊN MEN XỐP TỐI ƯU VÀ NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH XYLANASE TỪ VI KHUẨN ƯA NHIỆT Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60 42 40 LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TS. ĐÀO THỊ LƯƠNG Hà Nội - 2012 1
LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới cô giáo TS. Đào Thị Lương đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn này. Tôi xin chân thành cám ơn Nghiên cứu sinh Trịnh Thành Trung và Nghiên cứu sinh Trần Thị Lệ Quyên đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu vừa qua. Xin chân thành cảm ơn TS. Dương Văn Hợp và các cán bộ của Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học - Đại học Quốc gia Hà Nội đã tạo điều kiện cho tôi được học tập và nghiên cứu để hoàn thành luận văn này. Xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo và các cán bộ của Bộ môn Vi sinh vật học thuộc Khoa Sinh học, Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc Gia Hà Nội. Xin cảm ơn Phòng Sau Đại học Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc Gia Hà Nội đã tạo nhiều điều kiện cho tôi hoàn thành luận văn này. Tôi xin cảm ơn các thầy cô, bạn bè đồng nghiệp đã động viên và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian làm luận văn. Và lời cảm ơn sâu sắc nhất tôi xin dành cho gia đình và những người thân yêu của tôi đã luôn ủng hộ, động viên tôi trong suốt thời gian qua. Hà Nội, ngày 3 tháng 4 năm 2012 Tác giả Nguyễn Thị Nhiên 2
MỤC LỤC BẢNG Bảng Tên bảng Trang 1.1. Thành phần chất khô trong thực vật …………………………………. 13 1.2. Các họ thuộc glyoside hy drolase (GHs) có hoạt động trên xylan (Collin & cộng sự, 2005)……..…………………………………………………. 18 1.3. Một số nhóm vi sinh vật được dùng trong lên men xốp (Raimbault, 1998) …………………………………………………………………….. 28 3.1. Hoạt tính xylanase của 26 chủng vi sinh vật nghiên cứu………………. 55 3.2. Khả năng chịu nhiệt của các chủng vi sinh vật…………………………. 56 3.3. Ảnh hưởng của các loại dịch chiết đến hiệu quả thu hồi enzyme xylanase ..................................................................................................... 73 3.4. Kết quả tủa enzyme xylanase của chủng 118 và B2H2 bằng các dung môi hữu cơ ........................................................................................................ 73 3
MỤC LỤC HÌNH Hình Tên hình Trang 1.1. Cấu trúc hóa học của xylan …......……………………………………….. 14 1.2. Cấu trúc xylan trong cây gỗ. ……………………………….....…………. 16 1.3. Cấu trúc không gian xylanase của Bacillus subtilis……..….....…………. 19 1.4. Các enzyme cần thiết phân cắt hoàn toàn xylan………….....…………… 20 1.5. Sự thủy phân thành tế bào thực vật bằng enzyme. ………………....…… 24 3.1. Vị trí phân loại của chủng B2H2 với các loài có quan hệ họ hàng gần ...... 57 3.2. Hình thái khuẩn lạc và tế bào chủng B2H2………..........................……… 58 3.3. Vị trí phân loại của chủng XK-118 với các loài có quan hệ họ hàng gần 59 3.4. Hình thái khuẩn lạc và cuống sinh bào tử chủng 118…………...…….... 60 3.5. Môi trường thích hợp cho sự sinh trưởng và tổng hợp enzyme của 2 chủng B2H2 và 118 ...…………………………………………………….. 61 3.6. Nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trưởng và tổng hợp enzyme của 2 chủng B2H2 và 118………………………………………………………………. 62 3.7. pH thích hợp cho sự sinh trưởng và tổng hợp enzyme chủng B2H2 và 118………………………………………………………………………... 63 3.8. Thời gian thích hợp cho giống khởi động của chủng B2H2 và 118…...…. 65 3.9. Cơ chất thích hợp cho quá trình tổng hợp xylanase của 2 chủng B2H2 và 118……………………………………………………………………….. 66 3.10. Ảnh hưởng của độ ẩm đến khả năng tổng hợp enzyme xylanase của 2 chủng B2H2 và 118 ………………………………………………………. 67 3.11. Thời gian nuôi cấy thích hợp cho khả năng tổng hợp xylanase của 2 chủng B2H2 và 118 ...…………………………………………………….. 68 3.12. Tỷ lệ giống cấy thích hợp cho khả năng sinh xylanase của chủng B2H2 và 118 …………………………………………………………………………………… 69 3.13. Nguồn nitơ bổ sung thích hợp cho khả năng tổng hợp xylanase của chủng B2H2 và chủng 118 ........................................................................... 70 3.14. Mức độ ảnh hưởng của cao thịt đến khả năng tổng hợp xylanase của chủng B2H2 ...……………………………………………………….......... 71 4
3.15. Mức độ ảnh hưởng của urea đến khả năng tổng hợp xylanase của chủng 118……………………...………………………………………………… 72 3.16. Nguồn cacbon bổ sung thích hợp cho khả năng tổng hợp xylanase của 2 chủng B2H2 và chủng 18 ............................................................................. 73 3.17. Lựa chọn hỗn hợp khoáng thích hợp cho khả năng sinh tổng hợp xylanase của chủng B2H2 và chủng 118 ..................................................... 74 3.18. Sắc ký trao đổi ion DEAE sepharose mẫu enzyme tủa aceton của chủng 118 ……………………………………………...………………………... 76 3.19. Sắc ký trao đổi ion sử dụng dịch enzyme của các phân đoạn có hoạt độ xylanase cao ở bước rửa cột....................................................................... 77 3.20. Điện di đồ trên gel hoạt độ mẫu enzyme thô có ME (1) và không có ME (2); mẫu enzyme tủa aceton có ME (3) và không có ME (4) ..................... 78 3.21. Điện di trên gel hoạt tính mẫu enzyme tủa aceton...................................... 79 3.22. Hoạt độ xylanase chủng 118 thu hồi được khi tủa trong muối ammonisunfat từ 30 đến 90% .................................................................... 80 3.23. Điện di trên gel SDS-PAGE và điện di trên gel hoạt độ mẫu enzyme tủa aceton và mẫu enzyme tủa ammonisunfat từ 30 đến 90% ......................... 80 3.24. Sắc ký trao đổi ion dịch enzyme tủa ammonisunfat 50% ......................... 81 3.25: Kết quả sắc ký trao đổi ion mẫu enzyme tủa ammonisunfat 80% ............ 82 3.26. Điện di SDS-PAGE mẫu enzyme tủa ammonisunfat 80%, E1 và E2 ........ 83 3.27. Dải pH thích hợp cho hoạt động của xylanase từ 118 .............................. 83 3.28. Nhiệt độ phản ứng tối ưu của enzyme xylanase từ chủng 118 .................. 84 3.29. Ảnh hưởng của các ion kim loại đến hoạt động của enzyme xylanase từ 118 .............................................................................................................. 85 3.30. Khả năng chịu nhiệt của các enzyme xylanase từ chủng 118 ở 600C ........ 86 3.31. Khả năng bền nhiệt của hai loại xylanase tinh sạch từ chủng 118 .....….... 86 3.32. Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ xylanase của chủng B2H2 ........................ 87 3.33. Nhiệt độ thích hợp cho phản ứng enzyme xylanase từ chủng B2H2 .......... 88 3.34. Khả năng chịu nhiệt của enyme xylanase từ chủng B2H2 ..……………… 88 3.35. Ảnh hưởng của các ion kim loại đến hoạt độ xylanase .............................. 89 5
MỤC LỤC MỞ ĐẦU .............................................................................................................. 11 1. Lý do lựa chọn đề tài .............................................................................................. 11 2. Nhiệm vụ và mục đích nghiên cứu......................................................................... 12 3. Những đóng góp mới của đề tài ............................................................................. 12 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................. 13 1.1. XYLAN ................................................................................................................ 13 1.1.1. Xylan .................................................................................................... 13 1.1.2. Cấu trúc của xylan ............................................................................... 14 1.2.3. Tính chất của xylan.............................................................................. 15 1.2. ENZYME PHÂN GIẢI XYLAN - XYLANASE ............................................ 16 1.2.1. Nguồn gốc xylanase ............................................................................. 16 1.2.2. Phân loại xylanase ............................................................................... 17 1.2.3. Cấu trúc ................................................................................................ 18 1.2.4. Đặc tính của xylanase .......................................................................... 19 1.2.5. Ảnh hưởng của một số yếu tố đến hoạt động của enzyme xylanase .... 21 1.2.5.1. Ảnh hưởng của một số ion kim loại ................................................. 21 1.2.5.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ .................................................................. 22 1.2.5.3. Ảnh hưởng của pH .......................................................................... 22 1.2.5.4. Ảnh hưởng của dung môi hữu cơ và các chất tẩy rửa ..................... 23 1.2.6. Ứng dụng của xylanase ........................................................................ 23 1.2.6.1. Ứng dụng của xylanase trong công nghiệp thực phẩm .................... 23 1.2.6.2. Trong công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy .................................. 24 1.2.6.3. Ứng dụng của xylanase trong sản xuất nguyên liệu sinh học ........... 24 1.2.6.4. Ứng dụng trong công nghiệp vải sợi ............................................... 25 1.2.6.5. Ứng dụng trong nông nghiệp .......................................................... 25 1.2.6.6. Ứng dụng của xylanase trong xử lý môi trường ............................... 25 1.2.7. Vi sinh vật sinh xylanase ...................................................................... 26 1.3. LÊN MEN XỐP ................................................................................................... 26 1.3.1. Khái niệm lên men xốp......................................................................... 26 1.3.2. Ưu điểm của kỹ thuật lên men xốp....................................................... 27 1.4. TINH SẠCH ENZYME XYLANASE ................................................................ 30 1.4.1. Tủa enzyme bằng muối ammonisunfat ................................................ 31 1.4.2. Tủa enzyme bằng dung môi hữu cơ ..................................................... 32 6
1.4.3. Sắc ký ................................................................................................... 33 1.4.3.1. Sắc ký lọc gel.................................................................................. 33 1.4.3.2. Sắc ký trao đổi ion .......................................................................... 34 1.4.3.3. Sắc ký ái lực ................................................................................... 35 1.4.3.4. Sắc ký tương tác kỵ nước ................................................................ 36 1.4.3.5. Các kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao - HPLC ............................. 36 1.4.4. Điện di .................................................................................................. 37 1.4.4.1. Điện di trên gel agarose ................................................................. 38 1.4.4.2. Điện di trên gel polyacrylamide...................................................... 38 CHƯƠNG 2 - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............ 40 2.1 CHỦNG VI SINH VẬT, MÔI TRƯỜNG VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU ........ 40 2.1.1. Chủng vi sinh vật ................................................................................. 40 2.1.2. Môi trường nghiên cứu ........................................................................ 40 2.1.2.1. Môi trường nhân giống (g/l)............................................................ 40 2.1.2.2. Môi trường nuôi dịch thể................................................................. 40 2.1.2.3. Môi trường kiểm tra hoạt độ enzyme ............................................... 41 2.1.2.4. Môi trường nuôi xốp ....................................................................... 41 2.1.3. Thiết bị nghiên cứu .............................................................................. 41 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................................................................... 41 2.2.1. Phương pháp xác định hoạt tính xylanase........................................... 41 2.2.1.1. Phương pháp định tính (khuếch tán trên thạch) .............................. 41 2.2.1.2. Phương pháp định lượng................................................................. 42 2.2.2. Tuyển chọn chủng................................................................................ 44 2.2.3. Phương pháp xác định khả năng sinh trưởng ..................................... 44 2.2.4. Phương pháp phân loại........................................................................ 44 2.2.4.1. Phương pháp phân loại vi khuẩn dựa vào đọc trình tự ADN ........... 44 2.2.4.2. Quan sát hình thái........................................................................... 48 2.2.5 Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy thích hợp cho khả năng tổng hợp xylanase ở các chủng vi sinh vật nghiên cứu ................................................ 49 2.2.5.1. Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy giống thích hợp cho khả năng tổng hợp xylanase ở các chủng nghiên cứu .......................................................... 49 2.2.5.2. Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy xốp thích hợp cho khả năng tổng hợp xylanase ở các chủng nghiên cứu................................................................. 49 2.2.6. Thu hồi enzyme .................................................................................... 51 7
2.2.6.1.Chiết enzyme .................................................................................... 51 2.2.6.2. Thu hồi enzyme bằng các dung môi hữu cơ ..................................... 51 2.2.7. Tinh sạch xylanase của chủng 118 ...................................................... 52 2.2.7.1. Tủa enzyme trong dung môi hữu cơ................................................ 52 2.2.7.2. Tủa enzyme trong muối ammonisunfat ........................................... 52 2.2.7.3. Sắc ký trao đổi ion .......................................................................... 52 2.2.8. Điện di .................................................................................................. 53 2.2.8.1. Điện di trên gel SDS-PAGE ............................................................ 53 2.2.8.2. Điện di trên gel hoạt tính ................................................................ 53 2.2.9. Nghiên cứu đặc tính enzyme ................................................................ 54 2.2.9.1. pH thích hợp cho hoạt động của enzyme ........................................ 54 2.2.9.2.Nhiệt độ thích hợp cho hoạt động của enzyme .................................. 54 2.2.9.3. Khả năng bền nhiệt của enzyme ...................................................... 54 2.2.9.4. Ảnh hưởng của các ion kim loại đến hoạt độ enzyme ..................... 54 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ....................................................... 54 3.1. KẾT QUẢ TUYỂN CHỌN ................................................................................. 54 3.1.1. Lựa chọn các chủng có hoạt độ xylanase cao ...................................... 54 3.1.2. Lựa chọn các chủng vi sinh vật bền nhiệt có hoạt tính xylanase cao .. 55 3.2. PHÂN LOẠI .................................................................................................... 56 3.2.1. Chủng B2H 2.......................................................................................... 56 3.2.1.1. Phân tích trình tự ADNr 16S .......................................................... 56 3.2.1.2. Đặc điểm hình thái .......................................................................... 57 3.2.2. Chủng 118 ............................................................................................ 58 3.2.1.2. Phân tích trình tự ADNr 16S .......................................................... 58 3.2.1.3. Đặc điểm hình thái ......................................................................... 59 3.3. NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY ........................................................... 60 3.3.1. Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy giống .................................................. 60 3.3.1.1. Môi trường thích hợp cho sự sinh trưởng ....................................... 60 3.3.1.2. Nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trưởng ............................................ 62 3.3.1.3. pH thích hợp cho sự sinh trưởng..................................................... 63 3.3.1.4. Thời gian thích hợp cho giống khởi động........................................ 64 3.3.2. Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy xốp ...................................................... 65 3.3.2.1. Lựa chọn cơ chất ............................................................................ 65 3.3.2.2. Lựa chọn độ ẩm thích hợp ............................................................... 65 8
3.3.2.4. Lựa chọn tỷ lệ giống cấy thích hợp.................................................. 68 3.3.2.5. Lựa chọn nguồn nitơ bổ sung .......................................................... 68 3.3.2.6. Lựa chọn nguồn cacbon bổ sung ..................................................... 71 3.3.2.7. Lựa chọn loại khoáng thích hợp ...................................................... 72 3.4. THU HỒI ENZYME ........................................................................................... 72 3.4.1. Điều kiện thích hợp cho chiết enzyme .................................................. 72 3.4.2. Thu hồi enzyme bằng các dung môi hữu cơ......................................... 73 3.5. TINH SẠCH ENZYME ...................................................................................... 74 3.5.1. Tinh sạch enzyme xylanase chủng 118 theo phương pháp sắc ký trao đổi ion .......................................................................................................... 74 3.5.2. Tinh sạch xylanase của chủng 118 bằng phương pháp tủa trong muối ammonisunfat bão hòa kết hợp với sắc ký trao đổi ion sepharose DEAE. .... 77 3.6.1. Đặc tính enzyme xylanase từ chủng 118 .............................................. 81 3.6.1.1. pH thích hợp ................................................................................... 81 3.6.1.2. Nhiệt độ thích hợp ........................................................................... 82 3.6.1.3. Ảnh hưởng của các ion kim loại ...................................................... 83 3.6.1.4. Khả năng chịu nhiệt của enzyme ..................................................... 84 3.6.2. Đặc tính xylanase từ B2H2 ................................................................... 86 3.6.2.1. pH thích hợp ................................................................................... 86 3.5.2.2. Nhiệt độ .......................................................................................... 87 3.5.2.3. Bền nhiệt ......................................................................................... 88 3.5.2.4. Ảnh hưởng của ion kim loại ............................................................ 88 KẾT LUẬN .......................................................................................................... 90 KIẾN NGHỊ ......................................................................................................... 91 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 92 TIẾNG VIỆT ............................................................................................................... 92 TIẾNG ANH ............................................................................................................... 92 PHỤ LỤC............................................................................................................. 96 9
BẢNG CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN HPLC : High Performance Liquid Chromatography (sắc ký lỏng hiệu năng cao) ADN : Acid Deoxyribose Nucleic (acid deoxyribonucleic) ADNr : Acid Deoxyribose Nucleic ribosome (acid deoxyribonucleic ribosome) ARN : Acid Ribose Nucleic (acid ribonucleic) bp : base pair (cặp base) C : các bon CMC : Carboxymethyl cellulose Da : Dalton DEAE : Diethylaminoethyl DNS : Dinitro-salicylic acid dNTP : Deoxyribonucleotide triphosphate EtBr : Ethidium Bromide G : gram GH : Glycoside Hydrolase kb : Kilo-base kDa : Kilo-Dalton mA : mini Ampe PCR : Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi polymerase) SDS : Sodium Dodecyl Sulfate SDS-PAGE : Sodium Dodecyl Sulfate- Polyacrylamide Gel Electrophoresis TAE : Tris - Acetate - Ethylendiamin tetracetic acid TE : Tris - Ethylendiamin tetracetic acid TEMED : Tetramethylethylenediamine U : Unit (đơn vị) v/p : Vòng /phút VPG : Vòng phân giải XK : Xạ khuẩn YG : Yeast Glucose (môi trường YG) 10
MỞ ĐẦU 1. Lý do lựa chọn đề tài Trong nhiều năm gần đây, nhu cầu sử dụng enzyme có nguồn gốc từ vi sinh vật ngày càng tăng, đặc biệt là enzyme xylanase. Xylanase được sử dụng trong nhiều ngành sản xuất trên toàn thế giới [26, 15]. Một trong những ứng dụng quan trọng của xylanase là được dùng để bổ sung vào thức ăn chăn nuôi. Sự có mặt của xylanase trong thức ăn chăn nuôi có tác dụng thúc đẩy quá trình tiêu hóa, cải thiện hệ vi sinh vật đường ruột của động vật [11, 6]. Ngoài ra, xylanase còn được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác như: phân hủy rác thải; tẩy trắng trong công nghiệp sản xuất giấy, sản xuất nhiên liệu sinh học,… [33, 30]. Xét ở quy mô công nghiệp, sản xuất enzyme là một lĩnh vực đang ngày càng phát triển của công nghệ sinh học nói chung và công nghệ thực phẩm nói riêng. Nhu cầu sử dụng enzyme có nguồn gốc từ vi sinh vật ngày càng tăng cao, đặc biệt là enzyme xylanase được sử dụng trong nhiều ngành sản xuất trên toàn thế giới [14]. Trong sinh giới, động vật và thực vật không có khả năng tự sinh xylanase, do đó vai trò thủy phân xylan phụ thuộc chủ yếu vào nguồn vi sinh vật, đặc biệt quan trọng là các nhóm vi khuẩn, xạ khuẩn và nấm. Trước đây, việc nghiên cứu xylanase chủ yếu được tiến hành trên đối tượng nấm sợi. Tuy nhiên, gần đây cùng với sự phát mẽ của khoa học công nghệ, ngày càng nhiều chủng vi sinh vật có khả năng sinh xylanase được phát hiện và nghiên cứu sâu. Đồng thời, các lĩnh vực liên quan đến enzyme xylanase và ứng dụng của loại enzyme này ở vi khuẩn và xạ khuẩn được các nhà khoa học ngày càng quan tâm hơn. Lên men xốp được đánh giá là con đường tốt nhất để sản xuất enzyme và các sản phẩm bền nhiệt khác. Lên men xốp ngày càng được sử dụng rộng rãi trong sản xuất cũng như trong nghiên cứu vì những ứng dụng mang tính thực tiễn và kinh tế của nó. Lên men xốp được dùng trong công nghiệp chế biến và sản xuất thực phẩm chủ yếu là lĩnh vực sản xuất các loại hương liệu, sản xuất enzyme (a-amylase, fructosyl transferase, lipase, pectinase, xylanase), các acid hữu cơ (acid lactic, acid citric) và các loại kẹo cao su [8]. Trước đây, trong sản xuất enzyme người ta thường sử dụng kỹ thuật lên men dịch thể. Tuy nhiên, khi tiến hành so sánh hiệu quả của các loại hình lên men, người ta thấy hàm lượng enzyme vi sinh vật có thể sinh ra trong lên men xốp cao hơn 11
nhiều lần so với trong lên men dịch thể khi sử dụng cùng một chủng vi sinh vật trong cùng điều kiện lên men [14]. Để góp phần bổ sung các số liệu cần thiết về việc ứng dụng kỹ thuật lên men xốp trong công nghiệp sản xuất enzyme chúng tôi thực hiện đề tài: “Lựa chọn các điều kiện lên men xốp tối ưu và nghiên cứu đặc tính xylanase từ các chủng vi khuẩn ưa nhiệt”. 2. Nhiệm vụ và mục đích nghiên cứu - Khảo sát và tuyển chọn những chủng vi khuẩn và xạ khuẩn bền nhiệt có hoạt độ enzyme xylanase cao. - Nghiên cứu đặc điểm sinh học và phân loại các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn nghiên cứu. - Lựa chọn các điều kiện lên men xốp tối ưu cho các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn nghiên cứu. - Nghiên cứu đặc tính và tinh sạch enzyme của các chủng nghiên cứu. 3. Những đóng góp mới của đề tài Đề tài chúng tôi thực hiện có kế thừa các công trình nghiên cứu đã công bố gần đây về mặt phương pháp nghiên cứu, tuy nhiên kết quả của nó hoàn toàn mới và độc lập. Do đó đề tài sẽ góp phần đóng góp thêm số liệu vào cơ sở dữ liệu về quá trình sản xuất enzyme xylanase bằng kỹ thuật lên men xốp. 12
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. XYLAN 1.1.1. Xylan Xylan là thành phần chính của hemicellulose thực vật, là polysaccharide phổ biến thứ hai trong tự nhiên chỉ sau cellulose và được tìm thấy trong thành tế bào thực vật [27]. Xylan còn tham gia vào cấu trúc và giúp lignocellulose bền hơn. Bảng 1.1: Thành phần chất khô trong thực vật [2] Nguồn gốc Cellulose (%) Hemicellulose (%) Lignin (%) Thân gỗ cứng 40-55 24-40 18-25 Thân gỗ mềm 45-50 25-35 25-35 Vỏ lạc 25-30 25-30 30-40 Lõi ngô 45 35 15 Giấy 85-99 0 0-15 Vỏ trấu 32.1 24 18 Vỏ trấu của lúa mì 30 50 15 Rác đã phân loại 60 20 20 Lá cây 15-20 80-85 0 Hạt bông 80-95 5-20 0 Giấy báo 40-55 25-40 18-30 Giấy thải từ bột giấy hóa học 60-70 10-20 5-10 Chất rắn nước thải ban đầu 8-15 - 24-29 Chất thải của lợn 6 28 - Phân bón gia súc 1.6-4.7 1.4-3.3 2.7-5.7 Cỏ ở bờ biển Bermuda 25 35.7 6.4 Cỏ mềm 45 31.4 12.0 Các loại cỏ (trị số trung bình cho 25-40 25-50 10-30 các loại) Bã thô 33.4 30 18.9 Thực vật trên cạn có xylan là chuỗi D-xylosyl được nối với nhau bằng liên kết β-1,4, tảo biển tổng hợp xylan với một cấu trúc hóa học khác đó là các monomer D-xylose nối với nhau bằng liên kết β-1,3. Ở một vài lớp Chlorophycaea và Rhodophycaea không có sự hiện diện của cellulose, xylan tạo nên vật liệu hình sợi trong suốt. Thông thường, xylan chiếm khoảng 15-30% trọng lượng chất khô trong cây hạt kín và khoảng 7-15% trọng lượng chất khô của cây hạt trần. Đặc biệt trong cây lá rộng, xylan chiếm tới 35% tổng trọng lượng chất khô của thực vật [21]. 13
1.1.2. Cấu trúc của xylan Xylan là một polysaccharide không đồng nhất, bao gồm các gốc D-xylose liên kết với nhau bằng liên kết β-1,4-xylanosidic (β-1,4- D-xylopyranosyl) giữa đường xylopyranose với acetyl, arabinosyl và glucuronysyl [22]. (a) (b) Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của xylan [35] (a) Cấu trúc một monomere; (b) Cấu trúc trong tự nhiên Do tính không đồng nhất của xylan, sự thủy phân của nó phải cần đến một hệ thống enzyme phức tạp. Enzyme này thường bao gồm hai loại: enzyme không phân nhánh (β-1,4-endoxylanse, ferulic acid esterases) và enzyme phân nhánh (α- arabinofuranosidase, α-glucuronidase, esterase xylan acetyl và esterase axit phenolic) (Hình 1). Tất cả các enzyme này tác động tương hỗ để chuyển hóa xylan thành cấu tử đường của nó. Hệ thống đa enzyme thủy phân xylan khá phổ biến ở vi khuẩn và nấm. Các xylan khác loại chứa các nhóm thể khác nhau trong mạch chuỗi chính và chuỗi bên. Sự phân giải polysaccharide phức tạp cần có hoạt động hỗ trợ giữa các thành phần khác nhau của hệ thống enzyme thủy phân xylan. Trong đó, endo-β-1,4-xylanase là enzyme quan trọng nhất vì nó khởi đầu cho quá trình phân giải xylan thành các xylooligosaccharide ngắn. 14
Khác với cellulose, xylan có mạch polymere ngắn hơn, chỉ bao gồm khoảng 150- 200 gốc xylose [20]. Các sợi xylan liên kết với nhau nhờ các phân tử acid diferulic và bao quanh các vi sợi cellulose. Cùng với lignin, xylan còn có tác dụng bảo vệ các vi sợi cellulose [31]. Cấu trúc hóa học của xylan phụ thuộc vào nguồn gốc cũng như vị trí trong tế bào của chúng. Ví dụ, trong gỗ của cây lá rộng, xylan bao gồm 89,3% xylose, 1% arabinose, 1% glucose, và 8,3% anhydrouronic acid. Thông thường tỷ lệ giữa arabinose: 4-O-methyl-glucuronic acid: xylose trong xylan của cây gỗ mềm là 1,3:2:10. Arabinose, acetylate thường tạo nhánh tại C thứ 3 của đường xylose, glucosyluronic, hoặc 4-O-methyl-glucuronic acid tạo nhánh tại C thứ 2 [16]. Xylan của thực vật trên cạn xuất hiện trên rất nhiều vị trí của vách tế bào của các mô bị lignin hóa, chúng cũng được tìm thấy trên một số loại thực vật khác như rêu, dương xỉ (Aspinal, 1959; Joseleau, 1980). Chúng thường tạo thành vách thứ cấp của những mô có chức năng cấu trúc, nhưng cũng hiện diện trong vách sơ cấp của những vách sơ cấp của một số tế bào đang tăng trưởng, vách sơ cấp của hạt giống và trong một số loài thực vật có chức năng dự trữ (Joseleau và Barnoud, 1974; Mc Neil & cộng sự, 1979; Shaw & cộng sự, 1966). Ở vị trí phía trong của vách tế bào, xylan liên kết với những thành phần cấu trúc khác, đặc biệt là với vi sợi cellulose, với những polymere không phải cellulose khác, trong hầu hết các trường hợp là với lignin. Xylan liên kết với lignin bằng liên kết hydrogen và với acid phenon bằng liên kết hóa trị [35]. 1.2.3. Tính chất của xylan Xylan không mùi, không vị. Nhiệt độ hòa tan của xylan phụ thuộc vào nguồn gốc. Xylan có nguồn gốc từ gỗ cứng có nhiệt độ hòa tan là 150 - 200oC; còn đối với gỗ mềm, nhiệt độ hòa tan của nó là 70-130oC. Trong gỗ cứng, cấu trúc của xylan có chứa các nhóm acetyl, còn trong gỗ mềm nó không chứa nhóm acetyl. Do đó, xylan trong gỗ cứng tan trong nước tốt hơn [16]. 15
(a) (b) Hình 1.2. Cấu trúc xylan trong cây gỗ (a) gỗ mềm; (b) gỗ cứng 1.2. ENZYME PHÂN GIẢI XYLAN - XYLANASE Xylanase được dùng để chỉ một phức hệ các enzyme cần thiết cho quá trình phân hủy hoàn toàn cơ chất xylan, một polysaccharide không đồng nhất. Trong tự nhiên, một số vi sinh vật sử dụng các nguồn năng lượng tự sinh ra các loại xylanase khác nhau. Các loại enzyme này ngoài chức năng phân hủy thành tế bào thực vật còn kết hợp với các enzyme thủy phân khác tham gia vào quá trình tách dòng. 1.2.1. Nguồn gốc xylanase Xylanase được sinh tổng hợp bởi nấm, vi khuẩn, xạ khuẩn và động vật nguyên sinh. Trong các loài vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp xylanase, nấm, vi khuẩn và xạ khuẩn là các nhóm quan trọng nhất, đặc biệt là nấm sợi. Các nhóm vi sinh vật có khả năng sinh xylanase phân bố khá rộng rãi và tham gia tích cực vào các chu trình tuần hoàn vật chất, nhất là các quá trình phân giải chất hữu cơ để hình thành chất mùn [31]. 16
Các loại xylanase được sinh ra bởi vi khuẩn và nấm sợi ưa kiềm có khả năng chịu nhiệt tốt hơn và do đó chúng được ứng dụng rộng rãi và cho hiệu quả cao hơn trong công nghiệp [22]. 1.2.2. Phân loại xylanase Xylanase được nghiên cứu rộng khắp toàn cầu trong suốt hơn hai thập kỷ vừa qua do chúng có những ưu điểm vượt trội được ứng dụng trong công nghiệp, chẳng hạn như trong công nghiệp thực phẩm, sản xuất thức ăn chăn nuôi, công nghiệp sản xuất bột giấy và làm giấy. Xylanase thuộc nhóm các enzyme thủy phân liên kết glycoside (glycoside hydrolase, GH), thủy phân xylan. Glycoside hydrolase là một nhóm enzyme phân bố rộng rãi, thủy phân các liên kết glycoside trong chuỗi polysaccharide hoặc oligosaccharide. Do cấu trúc phức tạp của các carbonhydrate trong tự nhiên, nên các enzyme đặc hiệu cơ chất khác nhau cũng tồn tại số lượng lớn song song với nó. GH từ các nguồn khác nhau được phân loại thành các họ khác nhau dựa vào trình tự axit amin tương đồng. Nguyên tắc cơ bản là từ trình tự axit amin bậc một có thể thấy được mối liên kết trực tiếp giữa cấu trúc bậc này và sự cuộn gấp của các enzyme đối với các thành viên trong một hệ nhất định [7]. Trước đây, các nhà khoa học cho rằng xylanase khác với hệ enzyme glycoside hydrolase (GHs), nhưng gần đây, người ta nghiên cứu được rằng xylanase có các đặc điểm thuộc hệ enzyme GH5, GH7, GH8, GH10, GH11 và GH43 [19]. Nhưng đa phần xylanase thuộc nhóm GH10 và GH11 [21]. Xylanase thuộc hệ GH10 có khối lượng phân tử nhỏ nhất là 30 kDa và thuộc nhóm acid xylanase. Còn xylanase thuộc hệ GH11 có khối lượng phân tử lớn nhất là 30 kDa và thuộc nhóm alkaline xylanase [37]. Dựa vào sự tương đồng trình tự acid amin và các kết quả phân tích về cấu trúc không gian, xylanase chủ yếu được xếp vào họ 10 và 11 của hệ enzyme thủy phân glycoside (Collin & cộng sự, 2005; Jeya & cộng sự, 2009; Sibtain & cộng sự, 2009). Xylanase cả hai họ 10 và 11 đều thủy phân xylan bằng cơ chế thay thế hai lần liên quan đến hai acid glutamic (Sinnot, 1990). Hai phân tử acid này nằm tại trung tâm hoạt động của enzyme và quyết định một phần đến sự hình thành cấu trúc của xylanase. Một phân tử acid hoạt động như một chất xúc tác bằng cách thêm proton vào cơ chất, trong khi phân tử acid thứ hai có ái lực mạnh với nhân, có vai trò mở đầu cho phản ứng phân cắt và trong sự hình thành enzyme α-glycosyl (Collin & cộng sự, 2005) [12]. 17
Bảng 1.2. Các họ thuộc glyoside hydrolase (GHs) có hoạt động trên xylan (Collin & cộng sự, 2005) Số thành viên Họ glycoside thủy phân Cơ chế xúc Nhóm acid/base Nucleophilchase hydrolase xylan Nếp gấp tác chính chính 5 8 (β/α)8 Giữ nguyên Glutamate Glutamate 7 1 β-Jelly roll Giữ nguyên Glutamate Glutamate 8 4 (α/α)6 Đảo ngược Glutamate Aspartate 10 127 (β/α)8 Giữ nguyên Glutamate Glutamate 11 173 β-Jelly roll Giữ nguyên Glutamate Glutamate 5-Blade β- 43 1 propeller Đảo ngược Glutamate Aspartate Các thành viên họ xylanase 10 có cấu trúc α/β gấp cuộn 8 lần và trọng lượng phân tử xấp xỉ 48 kDa, pI thấp, và thủy phân các liên kết glycoside với sự giữ được hình thể nguyên vẹn, trong khi đó, họ xylanase 11 có cấu trúc mạch β gập hình bánh sandwich gần giống với cấu trúc bàn tay phải và có khối lượng phân tử nhỏ hơn, vào khoảng 20 kDa, pI cao và thủy phân các liên kết glycoside với cơ chế xúc tác đổi chỗ hai lần (Hakylinen & cộng sự, 2003; Zhou & cộng sự, 2009). Xylanase thuộc hệ GH10 thuộc nhóm acid xylanase. Xylanase thuộc hệ GH11 thuộc nhóm alkaline xylanase [36]. 1.2.3. Cấu trúc Cấu trúc bậc ba của phân tử xylanase được xác định bằng cách sử dụng mô hình Insight II Molecular. Theo đó, cấu trúc xylanase bao gồm một miền đơn có chứa 2 vùng cấu trúc β và một miền có chuỗi xoắn α, các cấu trúc này chỉ có ở xylanase hệ GH11. Cấu trúc chung của phân tử xylanase được ví như “bàn tay phải” với các ngón tay ở phía dưới và ngón cái nằm phía trên. Trung tâm hoạt động là ngón tay cái, lòng bàn tay và ngón tay. 18
Hình 1.3. Cấu trúc không gian xylanase của Bacillus subtilis [18] Xylanase được báo cáo lần đầu tiên vào năm 1955. Đó là enzyme thủy phân xylan, phá vỡ liên kết β-1,4-xylanosidic của xylan thành nhiều xylo-oligosaccharide có độ dài khác nhau. 1.2.4. Đặc tính của xylanase Trong trung tâm hoạt động của xylanase, axit amin quyết định sự hoạt động của enzyme là axit glutamic [2]. Sự thủy phân xylan đòi hỏi sự hỗ trợ hoạt động của các thành phần trong hệ thống enzyme xylanolytic. 19