Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu biến đổi số lượng bản sao ADN ti thể ở bệnh nhân ung thư vú

Chia sẻ: Na Na | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:70

Thêm vào BST

Báo xấu

46
lượt xem 3
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Phương pháp HPLC là phương pháp định lượng cơ bản kinh điển trong phân tích hóa sinh học. Phương pháp này có độ nhạy cao, có khả năng ứng dụng rộng rãi, cho phép phân tích với lượng mẫu nhỏ. Với sự pháp triển của khoa học hiện đại, nhiều phần mềm đã được ra đời phục vụ mục đích bán định lượng dựa trên phân tích hình ảnh các băng điện di như phần mềm ImageJ – NIH US, đây là phương pháp đơn giản, ít tốn kém, tiện dụng, cho kết quả nhanh và có thể áp dụng rộng rãi. Trên cơ sở đó, tác giả đã ứng dụng phương pháp HPLC và phân tích hình ảnh bằng phần mềm ImageJ để thực hiện đề tài “Nghiên cứu biến đổi số lượng bản sao ADN ti thể ở bệnh nhân ung thư vú”

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu biến đổi số lượng bản sao ADN ti thể ở bệnh nhân ung thư vú

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN -- Nguyễn Hồng Nhung NGHIÊN CỨU BIẾN ĐỔI SỐ LƯỢNG BẢN SAO ADN TI THỂ Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ VÚ LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội-2015
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN -- Nguyễn Hồng Nhung NGHIÊN CỨU BIẾN ĐỔI SỐ LƯỢNG BẢN SAO ADN TI THỂ Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ VÚ Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Trịnh Hồng Thái TS. Đỗ Minh Hà Hà Nội-2015
LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên em xin chân thành bày tỏ lòng cảm ơn và kính trọng sâu sắc đối với thầy, PGS. TS. Trịnh Hồng Thái, người đã tận tình hướng dẫn em trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận văn này. Thầy đã mở ra cho em những vấn đề khoa học rất lý thú, hướng em vào nghiên cứu các lĩnh vực hết sức thiết thực và vô cùng bổ ích, đồng thời tạo điều kiện thuận lợi cho em học tập và nghiên cứu. Em đã học hỏi được rất nhiều ở Thầy phong cách làm việc, cũng như phương pháp nghiên cứu khoa học. Em cũng xin trân trọng cảm ơn đến TS. Đỗ Minh Hà và thầy giáo, cô giáo trong khoa Sinh học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên, đặc biệt là các thầy cô giáo trong bộ môn Sinh lý Thực vật và Hóa sinh học đã tận tình giảng dạy dìu dắt tôi trong suốt thời gian học tập tại trường. Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các anh chị đã tận tình giúp đỡ và chỉ bảo tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận văn tại Phòng Proteomics và Sinh học Cấu trúc thuộc Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzyme và Protein, các bạn học viên cao học và các em sinh viên làm việc tại phòng, những người đã làm cùng tôi, luôn ở bên tôi lúc thất bại hay những lúc thành công. Trong quá trình thực hiện đề tài, tôi đã nhận được sự giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi của PTNTĐ Công nghệ Enzym và Protein, Trường Đại học KHTN, sự giúp đỡ của các cán bộ nhân viên thuộc khoa Tế bào và Giải phẫu bệnh, bệnh viện K, Hà Nội trong việc cung cấp mẫu nghiên cứu. Tôi xin chân thành cảm ơn. Luận văn được thực hiện trong phạm vi nội dung và kinh phí củađề tài cấp nhà nước (mã số KC.04.10/11-15). Tôi xin chân thành cảm ơn. Con xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Bố, Mẹ người đã vất vả nuôi con khôn lớn và dạy con những bài học làm người đầu tiên, con cảm ơn ông bà, cô chú…những người thân của con, những người luôn dành tình cảm và những lời động viên con. Và cuối cùng tôi xin cảm ơn các bạn bè của tôi, những người luôn ủng hộ và giúp đỡ tôi. Hà Nội, tháng 8 năm 2015 Học viên Nguyễn Hồng Nhung
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ADN Acid Deoxyribonucleic APS Ammonium persulfate ARN Acid Ribonucleic ATP Adenosine Triphosphate AcN Acetonitrile Bp Base pair (cặp bazơ) cs cộng sự EDTA Ethylenediaminetetraacetic Acid EtBr Ethidium Bromide HCC Ung thư biểu mô tế bào gan (Hepatocellular carcinoma) HPLC Sắc kí lỏng hiệu năng cao (High-performance liquid chromatography) MT/mt Mitochondria (ti thể) mtADN ADN ti thể (mitochondrial DNA) nADN ADN nhân (nuclear DNA) PCR Phản ứng chuỗi trùng hợp (polymerase chain reaction) Smac/DIABLO Chất hoạt hóa caspase thứ hai từ ti thể/ chất ức chế trực tiếp của protein gắn trong quá trình apoptosis trong điều kiện pI thấp. (Second mitochondria-derived activator of caspase/direct inhibitor of apoptosis-binding protein with low pI) TEA Triethylamine TEAA Triethylammonium acetate tARN ARN vận chuyển (transfer RNA) rARN ARN ribosome (RNA ribosome)
DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1 Các hóa chất chính sử dụng cho nghiên cứu Bảng 2 Thành phần hóa chất chạy HPLC Bảng 3 Thành phần phản ứng PCR Bảng 4 Thành phần phản ứng PCR thể tích 15 µl Bảng 5 Công thức đổ gel polyacrylamide 10% bản 7cm Số liệu phân tích HPLC với các mẫu có tỉ số hàm lượng ADN chuẩn Bảng 6 400bp/100bp khác nhau Số liệu phân tích HPLC với các mẫu có tỉ số lượng mt/ACTB khác Bảng 7 nhau Biến đổi tỉ số mt/ACTB trong các loại mẫu ở bệnh nhân ung thư vú Bảng 8 và bệnh nhân u xơ vú Biến đổi tỉ số mt/ACTB và đặc điểm bệnh học ở bệnh nhân ung thư Bảng 9 vú Biến đổi tỉ số mt/ACTB trong các loại mẫu ở bệnh nhân ung thư vú Bảng 10 và bệnh nhân u xơ vú bằng phương pháp ImageJ Biến đổi tỉ số mt/ACTB và đặc điểm bệnh học ở bệnh nhân ung thư Bảng 11 vú phân tích bằng phương pháp ImageJ
DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1 Phân bố gen trên ADN ti thể Hình 2 Sơ đồ quy trình thí nghiệm Hình 3 Chương trình chạy HPLC Hình 4 Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR nhân đoạn gen mt và ACTB Hình ảnh điện di ADN tổng số tách chiết từ mô vú của bệnh nhân Hình 5 ung thư vú (điện di trên gel agarose 0,8% và nhuộm ethidium bromide) Kết quả phân tích HPLC với ADN chuẩn 100_200bp và Hình 6 200_400bp Hình ảnh điện di sản phẩm PCR đoạn mt và ACTB trên gel Hình 7 agarose 1,7% Hình ảnh điện di sản phẩm PCR đa mồi ở các chu kì khác nhau Hình 8 trên gel polyacrylamide 10%, nhuộm bạc Hình ảnh điện di sản phẩm PCR đa mồi mt_ACTB ở 28 chu kì của Hình 9 các mẫu khác nhau Hình ảnh khuẩn lạc sau khi plasmid được biến nạp vào tế bào Hình 10 E.coli DH5α. Hình 11 Hình ảnh điện di sau khi tách plasmid Hình 12 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR plasmid mt và ACTB Hình 13 Kết quả giải trình tự plasmid có chứa đoạn mt Hình 14 Kết quả giải trình tự plasmid có chứa đoạn ACTB Hình ảnh phân tích HPLC và Biểu đồ đường chuẩn tỉ số hàm Hình 15 lượng ADN chuẩn 400bp/100bp Hình 16 Hình ảnh phân tích HPLC và biểu đồ đường chuẩn tỉ số mt/ACTB. Hình 17 Biểu đồ biến đổi tỉ số mt/ACTB ở các loại mẫu Biểu đồ biến đổi tỉ số mt/ACTB theo nhóm tuổi ở bệnh nhân ung Hình 18 thư vú. Hình 19 Biểu đồ biến đổi tỉ số mt/ACTB theo kích thước khối u ở bệnh
nhân ung thư vú Hình 20 Hình ảnh bản gel khi phân tích bằng phầm mềm ImageJ Biểu đồ biến đổi tỉ số mt/ACTB theo loại mẫu phân tích bằng Hình 21 phương pháp ImageJ
MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 Chương 1 - TỔNG QUAN 3 1.1. TỔNG QUAN VỀ TI THỂ 3 1.1.1. Cấu trúc và chức năng của ti thể 3 1.1.2. Những biến đổi ti thể và bệnh ung thư 6 1.2. TỔNG QUAN VỀ UNG THƯ VÚ 11 1.2.1. Phân loại ung thư vú 11 1.2.2. Các giai đoạn của ung thư vú 12 1.2.3 Các yếu tố nguy cơ 14 1.3. NGHIÊN CỨU BIẾN ĐỔI SỐ LƯỢNG BẢN SAO ADN TI THỂ Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ VÚ 15 1.4. CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG ADN TI THỂ 16 Chương 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1. ĐỐI TƯỢNG 19 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu 19 2.1.2. Hóa chất 19 2.1.3. Dụng cụ 20 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.2.1. Tách chiết ADN tổng số 21 2.2.2. Thiết kế các cặp mồi cho phản ứng PCR đa mồi phục vụ mục đích định lượng: 22 2.2.3. Định lượng ADN bằng HPLC và phần mềm ImageJ 26 2.2.4. Tính toán thống kê 28 Chương 3 – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29 3.1. TÁCH CHIẾT ADN TỔNG SỐ TỪ MÔ 29 3.2. THIẾT KẾ CÁC CẶP PRIMER CHO PHẢN ỨNG PCR ĐA MỒI 30
3.3. KẾT QUẢ ĐỊNH LƯỢNG SỐ BẢN SAO ADN TI THỂ 35 KẾT LUẬN 51 KIẾN NGHỊ 52 PHỤ LỤC 58
MỞ ĐẦU Ti thể là bào quan quan trọng trong tế bào nhân chuẩn có vai trò chính tạo ra năng lượng thông qua hô hấp hiếu khí, là nơi hình thành và đích đến của các gốc oxy tự do (ROS) tác nhân gây ung thư. Mỗi tế bào có nhiều bản sao của ti thể, có thể tới hàng trăm bản sao, tuy nhiên số lượng ADN ti thể (mtADN) tương đối ổn định trong các tế bào trong điều kiện sinh lý. Những thay đổi trong mtADN về cấu trúc, hay số lượng bản sao mtADN có thể đóng vai trò trực tiếp là tác nhân gây ung thư. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh sự thay đổi số lượng bản sao mtADN có liên quan đến hình thành và tiến triển của nhiều loại ung thư như ung thư hạch bạch huyết (Non-Hodgkin lymphoma), ung thư phổi, ung thư dạ dày, ung thư thận, ung thư tuyến tụy, ung thư đại trực tràng và ung thư vú,... Ung thư vú là bệnh ung thư phổ biến nhất ở phụ nữ trên toàn thế giới, hiện nay tỷ lệ mắc ung thư vú cũng tăng lên nhanh chóng, đặc biệt ở các nước Châu Á như Việt Nam. Mặc dù đã có nhiều phương pháp chẩn đoán, tầm soát ung thư giúp phát hiện sớm như chụp nhũ ảnh và nhiều phương pháp điều trị hiện đại đã giúp giảm đáng kể tỉ lệ mắc bệnh và tử vong do ung thư vú, tuy nhiên, ung thư vú vẫn là loại ung thư gây tử vong hàng đầu ở nữ giới. Phương pháp HPLC là phương pháp định lượng cơ bản kinh điển trong phân tích hóa sinh học. Phương pháp này có độ nhạy cao, có khả năng ứng dụng rộng rãi, cho phép phân tích với lượng mẫu nhỏ. Với sự pháp triển của khoa học hiện đại, nhiều phần mềm đã được ra đời phục vụ mục đích bán định lượng dựa trên phân tích hình ảnh các băng điện di như phần mềm ImageJ – NIH US, đây là phương pháp đơn giản, ít tốn kém, tiện dụng, cho kết quả nhanh và có thể áp dụng rộng rãi. Trên cơ sở đó, chúng tôi đã ứng dụng phương pháp HPLC và phân tích hình ảnh bằng phần mềm ImageJ để thực hiện đề tài “Nghiên cứu biến đổi số lượng bản sao ADN ti thể ở bệnh nhân ung thư vú” Đề tài được thực hiện tại phòng Proteomics và Sinh học Cấu trúc thuộc Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzyme và Protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội. Kinh phí thực hiện từ đề tài cấp nhà 1
nước, mã số KC.04.10/11-15 “Nghiên cứu phát hiện các bệnh đột biến gen ti thể ở người Việt Nam bằng các kỹ thuật sinh học phân tử”. 2
Chương 1 - TỔNG QUAN 1.1. TỔNG QUAN VỀ TI THỂ Ti thể là bào quan chuyển hóa năng lượng của tế bào nhân chuẩn, trong đó năng lượng từ thức ăn được bộ máy chuyển hóa của cơ thể và tế bào chuyển đổi thành ATP thông qua nhiều quá trình phức tạp mà mắt xích cuối là quá trình phosphoryl oxi hóa diễn ra ở trong ti thể. Ti thể có lớp màng kép, màng ngoài phân tách các ti thể với bào tương. Màng bên trong được gấp cuộn để tạo thành các nếp gấp hướng vào tâm, bên trong có chứa chất nền. Phức hệ 5 enzyme của hệ thống phosphoryl oxi hóa được gắn vào trong màng trong ti thể. Ti thể chứa bộ gen của riêng mình, được gọi là ADN ti thể (mtADN) và phân chia độc lập với ADN nhân. Trong tế bào động vật có vú, mỗi tế bào thường chứa nhiều bản sao giống hệt nhau của mtADN [7]. Ti thể được cho là có nguồn gốc từ vi khuẩn hiếu khí bị cộng sinh vào tế bào nhân chuẩn (thuyết nội cộng sinh). Trong quá trình tiến hóa để trở thành nhà máy năng lượng của tế bào nhân chuẩn, các vi khuẩn cộng sinh đã chuyển nhiều gen thiết yếu của mình vào các nhiễm sắc thể nhân. Tuy nhiên, ti thể vẫn mang các dấu ấn của các vi khuẩn tổ tiên. Ví dụ, ti thể sử dụng N-formylmethionyl-tARN (fMet-tARN) để kích hoạt quá trình tổng hợp protein [28]. 1.1.1. Cấu trúc và chức năng của ti thể 1.1.1.1. Cấu trúc của ti thể ADN ti thể người là phân tử vòng sợi kép có kích thước 16.569 bp. Các chuỗi của ADN mạch kép dựa trên thành phần nucleotide khác nhau được chia thành chuỗi nặng chứa nhiều Guannine và chuỗi nhẹ chứa nhiều Cytosine. Hầu hết các thông tin được mã hóa trên chuỗi nặng, với gen mã hóa cho 2 rARN, 14 tARN và 12 chuỗi polypeptide. Chuỗi nhẹ mã hóa cho 8 tARN và một chuỗi polypeptide (Hình 1). Tất cả 13 protein sản phẩm là thành phần của phức hợp enzyme trong hệ thống phosphoryl oxy hóa: 7 chuỗi polypeptide, từ ND1 đến ND6 và ND4L là các tiểu đơn vị của phức hợp I (NADH dehydrogenase- ubiquinone reductase); 1 chuỗi cytochrome b là tiểu đơn vị của phức hợp III (ubiquinol-cytochrome c reductase); 3 3
chuỗi: CO I, CO II và CO III là tiểu đơn vị xúc tác của phức hợp IV (cytochrome c oxidase); ATPase 6 và 8 là tiểu đơn vị của phức hợp V (ATP synthetase) [2]. Hình 1- Phân bố gen trên ADN ti thể mtADN được sắp xếp rất tiết kiệm, các gen không có intron, các trình tự mã hóa tiếp giáp với nhau hoặc cách nhau bởi một vài nucleotide. Các phân tử rRNA và tARN đều rất nhỏ. Một số gen mã hóa cho protein còn nằm gối lên nhau (ở người, ATPase 6 và 8 gối nhau 46 nucleotide, ND4 và tiểu đơn vị ND4L gối nhau 7 nucleotide), trong một số trường hợp một phần của bộ ba kết thúc không mã hóa trong mtADN mà được tạo ra sau phiên mã bởi quá trình thêm đuôi poly A của mARN tương ứng. Ngoài ra còn có thay đổi trong việc sử dụng các bộ ba so với ARN nhân. Ví dụ, UGA mã hóa cho tryptophan chứ không phải bộ ba kết thúc, AUA, AUC và AUU được sử dụng như bộ 3 mở đầu, AGA và AGG không mã hóa cho arginine mà là bộ 3 kết thúc [20]. 4
1.1.1.2. Chức năng chính của ti thể Năng lượng và quá trình trao đổi chất Chức năng quan trọng nhất và đặc trưng nhất của ti thể là sản xuất adenosine triphosphate (ATP) thông qua quá trình phosphoryl oxy hóa, được thực hiện bởi một loạt các phức hợp protein, được gọi chung là chuỗi hô hấp, được mã hóa bởi cả nADN và mtADN. Chuỗi hô hấp hoàn chỉnh chứa ít nhất 87 polypeptide, 13 trong số đó là mã hóa bởi mtADN. Do đó, phần lớn các tiểu phần của chuỗi hô hấp mã hóa trong nhân và được đưa vào ti thể sau khi được dịch mã trong nhân và đưa ra bào tương. Phosphoryl oxy hóa là một quá trình sinh hóa độc đáo được tạo ra từ sự phối hợp chặt chẽ của các protein sản phẩm từ hai bộ gen riêng biệt (nhân và ti thể). Tuy nhiên, quá trình này không phải là cách duy nhất để tạo ra năng lượng cho tế bào. Đường phân cũng có thể tạo ra ATP và cung cấp cơ chế thay thế khi quá trình phosphoryl oxy hóa trở nên kém hiệu quả do chuỗi hô hấp có khiếm khuyết. Khi các electron được vận chuyển thông qua chuỗi hô hấp trong quá trình hô hấp của ti thể, một số electron có thể trốn khỏi hoặc rò rỉ từ các phức hợp vận chuyển electron và phản ứng với oxy phân tử hình thành các gốc superoxide (O*2-). Dòng chảy electron này xảy ra chủ yếu tại khu phức hợp I và III [27]. Do vậy một đột biến mtADN nhất định có thể gây ra sự thay đổi các thành phần vận chuyển điện tử và tạo ra các gốc superoxide, sau đó chuyển đổi thành các dạng gốc oxy hóa tự do (ROS). Các đột biến mtADN và sự gia tăng quá trình oxy hóa đã được quan sát thấy trong các loại tế bào ung thư khác nhau ở nhiều nghiên cứu độc lập [9]. Tuy nhiên, liên hệ trực tiếp giữa đột biến mtADN và sự gia tăng hình thành ROS trong các tế bào ung thư vẫn chưa được chứng minh bằng thực nghiệm. Ti thể đóng vai trò điều tiết các cơ chế trung gian quan trọng trong quá trình chuyển hóa carbohydrate, axid amin và axid béo. Chu trình acid tricarboxylic trong chất nền của ti thể là một ví dụ điển hình của một con đường sinh hóa đòi hỏi nhiều cơ chế trung gian quan trọng [13]. Một phần chính của chu trình urê cũng xảy ra trong ti thể, nơi xảy ra quá trình xử lý các axid amin trung gian có chứa nitơ. Axit béo được chia nhỏ thành các đơn vị hai carbon bởi một loạt các β-oxy hóa và tiếp tục xử lý để acetyl CoA trong chất nền của ti thể. Như vậy, chức năng chính của ti thể là tạo 5
ATP qua quá trình phosphoryl oxy hóa không phải là thiết yếu, ti thể lại không thể thiếu để các tế bào nhân chuẩn tham gia vào các quá trình trao đổi chất quan trọng khác, điều này giải thích tại sao trong một số tế bào có mất đoạn mtADN, lượng ti thể vẫn được duy trì mà không có các đoạn mtADN mã hóa các protein trong chuỗi hô hấp [12]. Apoptosis và sự tồn tại của tế bào Ti thể đóng một vai trò quan trọng trong quá trình apoptosis, một quá trình sinh học cơ bản của các tế bào chết theo chương trình có kiểm soát. Một số nDNA mã hóa protein tham gia quá trình apoptosis bao gồm cytochrome c, yếu tố cảm ứng apoptosis (AIF), endonuclease G, và Smac/DIABLO được dự trữ trong ti thể. Khi những yếu tố protein này được giải phóng khỏi ti thể, chúng sẽ tạo ra một loạt phản ứng các sinh hóa để kích hoạt những tín hiệu của thác apoptois. Đặc điểm nổi bật của sự khơi mào apoptosis là sự hoạt hóa caspase (một họ protease) bởi cytochrome c và apaf-1 với sự có mặt của ATP hoặc dATP [17]. Quá trình chuyển AIF từ ti thể tới nhân để gây apoptosis độc lập với caspase [26]. Quá trình apoptosis đóng vai trò quan trọng trong việc phát triển bệnh ung thư và đáp trả lại tín hiệu của các tác nhân chống ung thư. Tuy nhiên, vai trò chính xác của đột biến mtDNA trong phản ứng chết theo chương trình của tế bào để đáp trả lại tín hiệu của các tác nhân chống ung thư vẫn chưa được xác định. 1.1.2. Những biến đổi ti thể và bệnh ung thư Khiếm khuyết chức năng ti thể từ lâu đã được cho là đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển và tiến triển của ung thư. Hơn 70 năm trước, Warburg tiên phong nghiên cứu sự biến đổi trong quá trình hô hấp của ti thể với bệnh ung thư và đề xuất cơ chế để giải thích ảnh hưởng của ti thể trong quá trình gây ung thư. Ông đưa ra giả thuyết rằng một sự kiện then chốt trong ung thư liên quan đến sự phát triển tổn thương của bộ máy hô hấp, dẫn đến tăng sản xuất ATP trong quá trình đường phân [34]. Cuối cùng, các tế bào ác tính sẽ đáp ứng nhu cầu năng lượng bằng cách sản xuất một phần lớn ATP thông qua quá trình đường phân chứ không phải thông qua sự phosphoryl oxy hóa. Do hiệu suất của quá trình đường phân thấp, điều này có thể giải 6
thích phần nào các tế bào ác tính có nhu cầu tiêu thụ glucose lớn để đáp ứng nhu cầu năng lượng. Điều này trái ngược với các tế bào bình thường, ưu tiên sử dụng quá trình phosphoryl oxy hóa tạo ATP với hiệu quả cao. Sự khác biệt về trao đổi năng lương giữa các tế bào bình thường và ung thư là một cơ sở sinh hóa để phát triển chiến lược điều trị để tiêu diệt tế bào ung thư có chọn lọc. Kể từ khi ấn phẩm đầu tiên của Warburg ra đời hơn nửa thế kỷ trước, đến nay nhiều khiếm khuyết của ti thể liên quan đến ung thư đã được xác định và mô tả. Những khiếm khuyết này bao gồm các thay đổi trong biểu hiện và hoạt động của các tiểu đơn vị trong chuỗi hô hấp và các enzym đường phân và đột biến mtADN [10]. Hầu hết các protein ti thể được mã hóa bởi ADN nhân (nADN) và đưa vào ti thể. Mặc dù các quá trình nhân bản của mtADN là không đồng bộ với quá trình nhân bản nADN, số lượng tổng thể của ti thể trong mỗi tế bào vẫn tương đối ổn định trong các loại tế bào cụ thể trong quá trình tăng sinh, cho thấy rằng quá trình tạo ti thể quyết định phần lớn bởi các tín hiệu ngoài ti thể. Sự sinh tổng hợp của ti thể có thể tiếp tục ngay cả khi mất mtADN. Như vậy, việc nhân bản ti thể không cần sự có mặt của mtADN và không chịu ảnh hưởng của các đột biến trong mtADN, dẫn đến việc duy trì các khiếm khuyết của ti thể [5]. 1.1.2.1. Đột biến gen ti thể và bệnh ung thư Hầu hết các tế bào của động vật có vú có chứa hàng chục, hàng trăm ti thể, mỗi ti thể lại có chứa 2-10 bản sao mtADN [25]. Trong một cá thể, tất cả các bản sao mtADN thường giống hệt nhau (homoplasmy), nhưng đột biến có thể phát sinh, duy trì và được khuếch đại, do đó các bản sao đột biến khác nhau cùng tồn tại với kiểu mtADN ban đầu (heteroplasmy). Khi tế bào phân chia, bộ gen ti thể được phân bố ngẫu nhiên cho các tế bào con và do đó, mặc dù chỉ bắt đầu từ một trường hợp heteroplasmy nhất định, nhưng kết quả có thể tồn tại mức độ khác nhau của heteroplasmy và thậm chí có thể homoplasmy mtADN trong dòng tế bào khác nhau [14]. Bộ gen ti thể được đi truyền theo dòng mẹ; một vài ti thể từ tinh trùng có thể xâm nhập vào trứng trong quá trình thụ tinh sẽ bị loại bỏ bởi cơ chế phụ thuộc ubiquitin. Trong quá trình tạo trứng, chỉ có số lượng nhỏ phân tử mtADN được 7
khuếch đại và truyền tới thế hệ sau con [18]. Hiện tượng này giải thích tại sao một đột biến có thể trở thành dạng homoplasmy sau một hoặc một vài thế hệ. Tỷ lệ biến đổi của mtADN nhanh hơn rất nhiều so với bộ gen nhân. Một trong những nguyên nhân là mtADN không được bảo vệ bởi protein (histone), thêm vào đó ti thể là nhà máy năng lượng của tế bào, nơi xảy ra các quá trình photphoryl oxi hóa và nhiều quá trình sinh hóa khác, các quá trình này tạo ra các gốc oxy hóa tự do ROS nên mtADN rất dễ bị tổn thương. Mặt khác, ti thể lại không có các cơ chế sửa chữa ADN như nhân, theo một số công bố mtADN đột biến đột biến cao hơn nADN 10- 100 lần [22]. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh các đột biến và thay đổi trong mtADN đóng một vai trò quan trọng trong một số bệnh như bệnh thần kinh thị giác di truyền Leber, bệnh tiểu đường di truyền theo dòng mẹ, hội chứng Leigh [8]. Bên cạnh các bệnh của ti thể là đột biến dòng mầm, các đột biến soma mtADN cũng được tìm thấy ở nhiều bệnh khác nhau, đặc biệt là ung thư. Với vai trò quan trọng của ti thể trong quá trình chuyển hóa ATP, trong tạo ra các gốc oxy hóa tự do và trong việc điều hòa quá trình apoptosis, đột biến ở mtADN có khả năng ảnh hưởng đến năng lượng tế bào, gây ra tổn thương ADN trung gian qua ROS và làm thay đổi phản ứng của tế bào cảm ứng apoptosis với các tác nhân chống ung thư. Ngày càng có nhiều nghiên cứu chứng minh ảnh hưởng của đột biến mtADN đối với sự phát triển, di truyền và tiến triển của nhiều bệnh ung thư khác nhau. Hơn nữa, tần suất đột biến mtADN cao trong ung thư và sự xuất hiện của chúng trong giai đoạn sớm của bệnh có thể là chỉ thị để phát hiện sớm bệnh ung thư [19]. Ung thư đại trực tràng: Trong một nghiên cứu đã tiến hành trên mô thường và mô u của 10 bệnh nhân ung thư đại trực tràng đã phát hiện 7 trong số 10 bệnh nhân có đột biến soma mtADN. Các đột biến được tìm thấy trên các gen 12S rRNA, 16S rRNA, ND1, ND4L, ND5, Cytochrome b, COXI, COXIIvà COXIII [23]. Phần lớn các đột biến là đột biến điểm soma ở vùng D-Loop không mã hóa trong đó A  T và G  C và các đột biến mất đoạn được phát hiện bằng cách kết hợp 2 phương pháp phân tích sợi đôi tương đồng heteroduplex và phương pháp biến tính sợi đơn (SSCP) [1]. Một số nghiên cứu khác đã cho thấy mức độ biểu hiện tăng của mARN mã hóa 8
ND2 ở các mô u so với các mô lành ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng, mARN của ND1 và rARN mã hóa cho tiểu đơn vị 16S tăng trong mẫu u của bệnh nhân polip tuyến gia đình so với mô lành ruột kết [6]. Ung thư buồng trứng: Liu và cs đã phân tích mtADN từ mô bình thường và mô u được lấy từ 10 bệnh nhân ung thư buồng trứng. Giải trình tự hoàn chỉnh mtADN của cặp mô và so sánh phân tích, đã xác định được các đột biến soma với tỉ lệ cao (60%). Hầu hết các đột biến được xác định là T  C hoặc G  A. Các đột biến soma chủ yếu trên 4 khu vực của mtADN: D-loop, 12S rRNA, 16S rRNA và cytochrome b [16]. Ung thư vú: Nhiều nghiên cứu toàn diện về đột biến mtADN ở ung thư vú đã được công bố gần đây. Trong một nghiên cứu của Tan và cs, đã sử dụng kết hợp phương pháp điện di và giải trình tự ADN trực tiếp để đưa ra trình tự hoàn chỉnh bộ gen ti thể có đột biến ở 19 bệnh nhân, trên mẫu u và mẫu mô thường và đã xác định được ở mtADN của 14 bệnh nhân có đột biến soma (74%). Phần lớn các đột biến nằm trong vùng D-loop (81,5%). Tuy nhiên, đột biến cũng được phát hiện trên gen 16S rRNA, ND2 và ATPase [29]. Trong một nghiên cứu khác sử dụng phương pháp sinh thiết khối u nguyên phát của 18 bệnh nhân, đột biến soma được phát hiện trong phần lớn các bệnh nhân (61%) và hầu hết các đột biến xác định là ở vùng D-loop, còn lại đột biến đã được tìm thấy trên các vùng gen ND1, ND4, ND5 và cytochrome b [21]. Các nghiên cứu trước đó cũng cho thấy tồn tại đột biến điểm và mất đoạn mtDNA ở bệnh nhân ung thư vú. Đột biến mất đoạn phổ biến nhất 4977 bp được tìm thấy trong mô u ác tính và mô vú lành của các bệnh nhân có các bất thường vú [4]. Ngoài đột biến ở mtADN, biểu hiện cao của mARN cytochrome c oxidase II cũng được phát hiện trong mô u ở một số bệnh nhân so với mô bình thường [24]. 1.1.2.2 Biến đổi số lượng bản sao gen ti thể và bệnh ung thư Như đã nêu ở trên, mỗi tế bào chứa hàng trăm, ngàn ti thể, trong mỗi ti thể lại chứa 2-10 bản sao mtADN, tuy nhiên số lượng bản sao mtADN tương đối ổn định trong diều kiện sinh lí. Nhiều nghiên cứu ở bệnh nhân ung thư nguyên phát đã chỉ ra rằng thay đổi số lượng bản sao mtADN là một yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của ti thể và có liên 9
quan đến sự hình thành và phát triển ở nhiều loại ung thư. Biến đổi số lượng bản sao mtADN liên quan đến bệnh ung thư đã được nghiên cứu rộng rãi bằng nhiều phương pháp tiếp cận. Năm 2004, Yin và cs đã nghiên cứu biến đổi số lượng bản sao mtADN và ti thể ở bệnh nhân ung thư biểu mô gan (HCC). Ở bệnh nhân HCC số lượng bản sao mtADN giảm ở mô u so với mô lành tương ứng. Biểu hiện thụ thể kích hoạt peroxisome proliferator γ coactivator-1 bị ức chế mạnh ở bệnh nhân, trong khi các biểu hiện của các protein liên kết với mtADN sợi đơn lại tăng, cho thấy hoạt động chức năng sinh học của ti thể bất thường ở bệnh nhân HCC. Đáng chú ý là 22% bệnh nhân HCC mang một đột biến soma trong vùng D-loop của mtADN. Vùng gan lành của bệnh nhân HCC có tiền sử uống rượu trong nhiều năm có số lượng bản sao mtADN giảm và mức độ mất đoạn 4977 bp cao hơn so với bệnh nhân không uống rượu. Kết quả cho thấy số lượng bản sao mtADN giảm, suy giảm chức năng ti thể và đột biến soma trong mtADN là những sự kiện quan trọng trong quá trình sinh ung thư HCC [38]. Bên cạnh đó trong một nghiên cứu năm 2006 của Yamada và cs ở 31 bệnh nhân HCC đã chứng minh rằng hàm lượng mtADN thấp có liên quan mật thiết với kích thước khối u và xơ gan. Bệnh nhân HCC có hàm lượng mtADN thấp hơn thường có tiên lượng xấu hơn và thời gian sống ngắn hơn [36]. Đối với bệnh nhân ung thư phổi NSCLC, tìm ra mối liên hệ giữa giảm số lượng bản sao mtADN được gắn liền với sự phát triển của khối u. Tương tự, sự giảm hàm lượng mtADN phổ biến hơn ở các bệnh nhân ung thư dạ dày [33] Một số nghiên cứu khác cho thấy số lượng bản sao mtADN trong mô ung thư cao hơn so với các mô lân cận. Năm 2006, Wang và cs cho thấy ở ung thư buồng trứng, số lượng bản sao mtADN thấp ở giai đoạn đầu và cao hơn nhiều giai đoạn sau, cho thấy mối tương quan giữa việc tăng số lượng bản sao mtADN tới tiến triển của bệnh nhân ung thư buồng trứng [31]. Trong báo cáo năm 2008 của Lin và cs, việc giảm số lượng bản sao mtADN trong các mô ung thư có thể làm giảm tổn thương của quá trình oxy hóa mtADN, thúc đẩy quá trình phát triển và tạo điều kiện cho tế bào ung thư trở thành bất tử. Mẫu ung thư phổi không phải tế bào nhỏ (NSCLC) đã được thu thập từ 29 bệnh 10
nhân ở giai đoạn III sau khi hóa trị hỗ trợ trị liệu và phẫu thuật cắt bỏ. Số lượng bản sao mtADN tương đối và các tổn thương oxy hóa mtADN của mỗi mô ung thư được xác định bằng phương pháp PCR định lượng. Kết quả cho thấy số lượng bản sao mtADN ít và quá trình ôxy hoá mtADN mức độ thấp có tương quan với sự tiến triển của khối u. Hơn nữa, số lượng bản sao mtADN và tổn thương của quá trình oxy hóa mtADN thấp hơn ở những bện nhân NSCLC sau khi hóa trị. Phát hiện này cho thấy sự suy giảm hàm lượng mtADN có thể dẫn đến giảm mật độ của ti thể trong tế bào ung thư, dẫn đến giảm sản xuất ROS nội sinh và giảm ROS gây tổn thương ADN để tế bào ung thư trở thành bất tử [15]. 1.2. TỔNG QUAN VỀ UNG THƯ VÚ Ung thư vú là loại ung thư phổ biến thứ hai trên thế giới và là bệnh ung thư thường gặp nhất ở phụ nữ với ước tính 1,67 triệu trường hợp ung thư mới được chẩn đoán vào năm 2012 (25% của tất cả các trường hợp mắc bệnh ung thư). Nó là loại ung thư phổ biến nhất ở phụ nữ cả ở các nước kém phát triển (883.000 trường hợp) và các nước phát triển (794.000). Tỉ lệ mắc bệnh rất khác nhau giữa các khu vực trên thế giới, dao động từ 27 trên 100.000 ở khu vực Trung Phi và Đông Nam Á và 96 ở khu vực Tây Âu. Ung thư vú rất hiếm gặp ở nam giới nhưng lại rất phổ biến ở phụ nữ. Tỷ lệ mới mắc ung thư vú ở nam ít hơn 100 lần so với nữ [40]. Theo hồ sơ từ tổ chức Globocan về tình hình ung thư thế giới, ung thư vú là nguyên nhân tử vong đứng thứ năm do ung thư nói chung (522.000 trường hợp tử vong) và là loại ung thư hàng đầu gây tử vong ở phụ nữ ở khu vực kém phát triển (324.000 người chết, 14,3% trên tổng số) và thứ hai ở khu vực phát triển hơn (198.000 người chết, 15,4%) sau ung thư phổi [44]. 1.2.1. Phân loại ung thư vú Có nhiều loại ung thư vú phát sinh từ các dạng tế bào khác nhau, nhưng phổ biến nhất là hai loại: Ung thư biểu mô ống và ung thư biểu mô tuyến, được dặt tên theo dạng tế bào mà chúng bắt nguồn [41]. 11