Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu các đặc tính sinh học và tiềm năng ứng dụng của chủng vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum SP 1901 phân lập tại rừng Quốc gia Hoàng Liên

Chia sẻ: Na Na | Ngày: | Loại File: DOCX | Số trang:71

Thêm vào BST

Báo xấu

108
lượt xem 18
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu chính của luận văn: Tuyển chọn các chủng vi khuẩn thuộc nhóm B. subtilis phân lập tại rừng Quốc gia Hoàng Liên; sử dụng kỹ thuật phân tích trình tự đa gen để phân loại chính xác các chủng vi khuẩn nghiên cứu đến cấp độ loài và dưới loài.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu các đặc tính sinh học và tiềm năng ứng dụng của chủng vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum SP 1901 phân lập tại rừng Quốc gia Hoàng Liên

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Phan Lạc Dũng NGHIÊN CỨU CÁC ĐẶC TÍNH SINH HỌC VÀ TIỀM NĂNG ỨNG DỤNG CỦA CHỦNG VI KHUẨN BACILLUS AMYLOLIQUEFACIENS SUBSP. PLANTARUM SP 1901 PHÂN LẬP TẠI RỪNG QUỐC GIA HOÀNG LIÊN LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội Năm 2013
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Phan Lạc Dũng NGHIÊN CỨU CÁC ĐẶC TÍNH SINH HỌC VÀ TIỀM NĂNG ỨNG DỤNG CỦA CHỦNG VI KHUẨN BACILLUS AMYLOLIQUEFACIENS SUBSP. PLANTARUM SP 1901 PHÂN LẬP TẠI RỪNG QUỐC GIA HOÀNG LIÊN Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60 42 40 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TS. TRỊNH THÀNH TRUNG
Hà Nội Năm 2013 LỜI CẢM ƠN Trước tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Trịnh Thành Trung, người đã dẫn dắt, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn cao học này. Tôi xin chân thành cảm ơn các cán bộ, anh chị đang làm việc tại Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học Đại học Quốc gia Hà Nội đã giúp đỡ tôi trong quá trình hoàn thành luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trong Bộ môn Vi sinh vật học nói riêng và Khoa Sinh học nói chung đã dạy dỗ tôi trong quá trình học tập. Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè đã luôn động viên, giúp đỡ, hỗ trợ để tôi có thể hoàn thành luận văn này. Hà Nội, tháng 5 năm 2013 Học viên Phan Lạc Dũng
MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1. Khả năng sinh trưởng của chủng SP 1901 ở các nhiệt độ khác nhau. 33 Bảng 3.2. Khả năng đồng hoá các loại đường…………………………………. 34 Bảng 3.3. Khả năng lên men các loại đường…………………………………... 35 Bảng 3.4. Khả năng sinh enzyme ngoại bào theo phương pháp sử dụng kit API ZYM………………………………….…………………………………… 37 Bảng 3.5. Tỷ lệ giữa hoạt độ xylanase (U/ml) và nồng độ protein (mg/ml) của chủng SP 1901…………………………………. ……………………………… 40 Bảng 3.6. Hoạt độ của xylanase sau các bước tinh sạch……………………… 46
DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của xylan và các vị trí tấn công của hệ thống enzyme xylanolytic………………………………….………………………… 8 Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của amylose và amylopectin……………………. 11 Hình 1.3. Phản ứng thủy phân liên kết peptide của chuỗi polypeptide……… 13 Hình 2.1. Đồ thị đường chuẩn theo thang BSA………………………………. 21 Hình 2.2. Đồ thị đường chuẩn theo thang xylose…………………………….. 22 Hình 2.3. Đồ thị đường chuẩn theo thang glucose……………………………. 23 Hình 2.4. Đồ thị đường chuẩn theo thang L 24
tyrosine………………………… Hình 3.1. Cây phát sinh chủng loại của 37 chủng vi khuẩn Bacillus phân lập tại rừng Quốc gia Hoàng Liên và 9 loài thuộc nhóm vi khuẩn B. subtilis dựa trên phân tích trình tự 16S rDNA…………………………………. ………….. 28 Hình 3.2. Cây phát sinh chủng loại của các loài vi khuẩn thuộc nhóm B. subtilis………………………………….…………………………………….. 30 Hình 3.3. Hình thái khuẩn lạc chủng SP 1901 (a), hình thái tế bào khi nhuộm gram (b) và soi nổi (c) …………………………………. ……………………. 31 Hình 3.4. pH sinh trưởng tối ưu (a). Khả năng chịu muối NaCl (b). Khả năng chịu dịch dạ dày (c). Khả năng chịu muối mật (d) …………………………… 31 Hình 3.5. Khả năng sinh chất kích thích sinh trưởng IAA của chủng SP 1901 sau 24, 48 và 72 giờ…………………………………. ……………………… 32 Hình 3.6. Khả năng sinh IAA làm cho dung dịch chuyển từ màu vàng sang đỏ (a). Ảnh hưởng của chủng SP 1901 lên khả năng sinh trưởng của cây ngô sau 10 ngày trồng (b) …………………………………. ………………………… 32 Hình 3.7. Vòng phân giải cơ chất của các enzyme ngoại bào. Amylase (a). Cellulase (b). Phytase (c). Protease (d). Xylanase (e) ……………………… 36 Hình 3.8. Phản ứng thử nghiệm khả năng sinh enzyme trên thanh thử API ZYM………………………………….……………………………………… 37 Hình 3.9. Khả năng sinh kháng sinh của chủng SP 1901 theo phương pháp khuếch tán trên thạch. Đĩa thạch cấy sẵn vi khuẩn E. coli (a). Vi khuẩn Shigella sp. (b). Vi khuẩn S. aureus (c) ……………………………………… 38 Hình 3.10. Khả năng sinh trưởng trên các môi trường khác nhau (a, b) và hoạt độ xylanase ngoại bào (c, d) của chủng SP 1901 khi nuôi cấy trên 10 loại môi trường ở các giờ khác nhau…………………………………. ………………. 39 Hình 3.11. Hoạt độ xylanase (U/ml) và nồng độ protein (mg/ml) khi nuôi 39
cấy trên môi trường có bổ sung CMC và glucose và môi trường NA dịch thể tại các giờ khác nhau…………………………………. ………………………… Hình 3.12. Hoạt tính amylase và protease của chủng SP 1901 trên môi trường có bổ sung CMC và glucose và môi trường NA dịch thể…………………… 40 Hình 3.13. Hoạt độ xylanase và nồng độ protein ở các phân đoạn trong sắc ký trao đổi ion gel CM Sepharose…………………………………. …………… 41 Hình 3.14. Hoạt độ amylase và nồng độ protein ở các phân đoạn trong sắc ký trao đổi ion gel DEAE Sepharose…………………………………. ………… 42 Hình 3.15. Hoạt độ protease và nồng độ protein ở các phân đoạn trong sắc ký trao đổi ion gel CM Sepharose…………………………………. …………… 42 Hình 3.16. Hoạt độ xylanase ở các phân đoạn trong sắc ký lọc gel………… 43 Hình 3.17. Hoạt độ amylase ở các phân đoạn trong sắc ký lọc gel………… 44 Hình 3.18. Hoạt độ protease ở các phân đoạn trong sắc ký lọc gel………… 44 Hình 3.19. Điện di SDSPAGE 2 mẫu xyl 29 và xyl 36…………………… 45 Hình 3.20. Nhiệt độ hoạt động tối ưu của xyl 29, xyl 36, amylase và protease từ chủng SP 1901…………………………………………………………… 46 Hình 3.21. Khả năng bền nhiệt của xyl 29, xyl 36, amylase và protease từ chủng SP 1901……………………………………………………………… 47 Hình 3.22. pH hoạt động tối ưu của xyl 29, xyl 36, amylase và protease từ chủng SP 1901……………………………………………………………… 48 Hình 3.23. Khả năng bền axít của xyl 29, xyl 36, amylase và protease từ chủng SP 1901……………………………………………………………… 49 Hình 3.24. Khả năng bền ion kim loại và hóa chất của xyl 29, xyl 36, amylase và protease từ chủng SP 1901………………………………………………… 50
Hình 3.25. Bản chạy sắc ký lớp mỏng để phân tích sản phẩm thủy phân từ cơ chất xylan bởi xylanase của chủng SP 1901…………………………………… 52 CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT BSA Bovine serum albumin CMC Carboxymethyl cellulose DNA Deoxyribonucleic axít DNS Dinitrosalicylic IAA Indole3acetic axít PAGE Polyacrylamide gel electrophoresis PCR Polymerase chain reaction RNA Ribonucleic axít SDS Sodium dodecyl sulfate
ĐẶT VẤN ĐỀ Ngày nay, việc ứng dụng vi sinh vật vào trong đời sống và sản xuất đã trở nên rất phổ biến. Con người đã và đang khai thác triệt để nguồn tài nguyên vi sinh vật trong nhiều lĩnh vực khác nhau. Trong y học, nhờ có vi sinh vật mà con người đã tổng hợp thành công nhiều loại chế phẩm như vacxin, kháng sinh, hormone, vitamin giúp phòng ngừa và điều trị nhiều loại bệnh cho con người. Trong nông nghiệp, nhiều chế phẩm sinh học có nguồn gốc từ vi sinh vật đã được sản xuất để diệt trừ sâu bệnh hại cây và làm phân bón vi sinh. Trong công nghiệp thực phẩm, con người đã ứng dụng vi sinh vật để sản xuất ra các loại protein, enzyme, chế phẩm probiotic và các loại thực phẩm lên men truyền thống. Ngoài ra, vi sinh vật còn được ứng dụng vào trong xử lý rác thải hữu cơ và nước thải trong sản xuất công nghiệp. Với khả năng chuyển hóa mạnh mẽ và sinh sản nhanh chóng, vi sinh vật đóng một vai trò to lớn trong hệ sinh thái tự nhiên và trong các hoạt động cải thiện chất lượng cuộc sống của con người. Bacillus là một trong những vi sinh vật đầu tiên được phát hiện và mô tả trong giai đoạn đầu của tiến trình phát triển ngành vi sinh vật học ở cuối thế kỷ 19. Đây là một chi lớn với gần 200 loài vi khuẩn hiếu khí, hình que và có khả năng sinh nội bào tử. Chúng phân bố rộng rãi trong các hệ sinh thái tự nhiên, từ trên cạn đến dưới nước, từ nước ngọt đến nước mặn và từ ven bờ đến đáy các Đại Dương. Ngoài các loài vi khuẩn gây bệnh cho con người như B. anthracis và B. cereus, nhiều loài vi khuẩn thuộc chi Bacillus đặc biệt là nhóm B. subtilis có tính ứng dụng cao trong nhiều lĩnh vực như y dược học, nông nghiệp, công nghiệp thực phẩm và xử lý môi trường. Do đó, các loài thuộc chi Bacillus đã và đang ngày càng trở thành những vi sinh vật quan trọng hàng đầu về mặt ứng dụng. Nhằm góp phần tìm hiểu thêm kiến thức về chi Bacillus nói chung và ứng dụng của các loài thuộc nhóm B. subtilis nói riêng, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu các đặc tính sinh học và tiềm năng ứng dụng của chủng vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum SP 1901 phân lập tại rừng Quốc gia Hoàng Liên” với 4 mục tiêu chính sau: (i) Tuyển chọn các chủng vi khuẩn thuộc nhóm B. subtilis phân lập tại rừng Quốc gia Hoàng Liên. 9
(ii) Sử dụng kỹ thuật phân tích trình tự đa gen để phân loại chính xác các chủng vi khuẩn nghiên cứu đến cấp độ loài và dưới loài. (iii) Tìm hiểu các đặc tính sinh học quý của chủng vi khuẩn được lựa chọn. (iv) Tách chiết, tinh sạch và đánh giá sơ bộ đặc tính các enzyme ngoại của chủng vi khuẩn nghiên cứu. 10
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. VI KHUẨN BACILLUS AMYLOLIQUEFACIENS 1.1.1. Tổng quan về Bacillus amyloliquefaciens Bacillus amyloliquefaciens là một loài vi khuẩn thuộc nhóm Bacillus subtilis [45]. B. subtilis được Christion Erenberg phát hiện lần đầu tiên vào năm 1835, tên của loài vi khuẩn này lúc bấy giờ là “Vibrio subtilis”. Năm 1872, nhà sinh học người Đức Ferdinand Cohn đã đặt tên cho loài vi khuẩn này là Bacillus subtilis. Trong thế chiến thứ hai, tổ chức y học Nazi (Đức) đã dùng B. subtilis để phòng bệnh lị cho các binh lính chiến đấu ở Bắc Phi. Từ đó đến nay, B. subtilis đã được nghiên cứu và sử dụng rộng rãi trên Thế giới. Thuật ngữ “Subtilis therapy” (điều trị bằng subtilis) ra đời từ đó và B. subtilis ngày càng được sử dụng rộng rãi để phòng ngừa và điều trị các loại bệnh về rối loạn đường tiêu hóa, các chứng viêm ruột, viêm đại tràng và tiêu chảy. Hiện nay, B. subtilis đã được chứng minh có tiềm năng to lớn trong nhiều lĩnh như chăn nuôi, công nghiệp, xử lý môi trường [8]. Vi khuẩn B. subtilis có mặt ở hầu hết các loại môi trường tự nhiên. Phần lớn cư trú trong đất, rơm rạ và cỏ khô nên được gọi là “trực khuẩn cỏ khô”. Ngoài ra, chúng còn có mặt trong các nguyên liệu sản xuất như bột mì (trong bột mì B. subtilis chiếm 7579% vi khuẩn tạo bào tử), bột gạo và trong các thực phẩm như mắm, tương và chao [12]. B. subtilis có vai trò to lớn trong việc giữ ổn định hệ vi sinh vật đường ruột bằng cơ chế cạnh tranh sinh tồn và khả năng gây ức chế các vi khuẩn gây bệnh khác do tác dụng của những sản phẩm ngoại bào của nó . Công trình nghiên cứu của Work và cộng sự năm 1959 đã cho thấy B. subtilis có hệ thống enzyme tương đối hoàn chỉnh, có khả năng thủy phân carbohydrate và protein. Ngoài ra, B. subtilis còn có khả năng tổng hợp một số chất kháng sinh như bacitracin, 11
bacilysin, bacillomicin, bacillopectin, mycobacillin, subtilin và prolimicin. Những chất này có tác dụng ức chế sinh trưởng hoặc tiêu diệt một số vi sinh vật khác. Chúng tác dụng lên cả vi khuẩn gram âm, gram dương và nấm gây bệnh [9]. Nhóm B. subtilis gồm ít nhất 9 loài vi khuẩn là B. amyloliquefaciens, B. atrophaeus, B. axarquiensis, B. malacitensis, B. mojavensis, B. sonorensis, B. tequilensis, B. vallismortis và B. velezensis. Kết quả phân tích trình tự đoạn gen 16S rRNA cho thấy mức độ tương đồng giữa chúng rất cao (> 99%). Bên cạnh đó, phương pháp phân loại truyền thống dựa trên hình dạng khuẩn lạc, hình thái tế bào và bào tử cũng như các đặc điểm sinh hóa không có khả năng phân tách các loài này. Vì vậy, 9 loài vi khuẩn trên thường được gọi theo một thuật ngữ chung là nhóm vi khuẩn B. subtilis [45]. Gần đây, bên cạnh việc phân tích trình tự gen 16S rRNA các nhà khoa học đã sử dụng phương pháp phân tích trình tự đa gen trong việc phân loại vi khuẩn đến cấp độ loài và dưới loài [25]. Đặc biệt trong nhóm B. subtilis, bằng phương pháp phân tích trình tự đa gen và xây dựng cây phát sinh chủng loại, nhiều loài trong nhóm này đã được phân tách thành các loài phụ như B. subtilis được phân thành B. subtilis subsp. subtilis, B. subtilis subsp. spizizenii và B. subtilis subsp. inaquosorum; B. amyloliquefaciens được phân thành B. amyloliquefaciens subsp. amyloliquefaciens và B. amyloliquefaciens subsp. plantarum [42]. Phân loại các loài trong nhóm B. subtilis nói chung và B. amyloliquefaciens nói riêng đòi hỏi phải có sự tổ hợp của nhiều phương pháp phân loại hiện đại. Hiện nay ở Việt Nam hầu như chưa có bất cứ một nghiên cứu nào công bố chính xác một loài vi khuẩn phân lập trong hệ sinh thái tự nhiên đến cấp độ dưới loài dựa trên việc phân tích trình tự đa gen. 1.1.2. Lịch sử phát hiện B. amyloliquefaciens được Fukomoto phát hiện vào năm 1943 nhờ khả năng sinh αamylase và protease. Tại thời điểm đó, loài vi khuẩn này chưa được xếp loại trong bảng Danh pháp Vi khuẩn. Cho đến năm 1975, theo điều 24a và 28a trong Bộ luật Quốc tế về Danh pháp Vi khuẩn thì cái tên B. amyloliquefaciens mới được công bố [43]. Thời gian đầu, loài vi khuẩn này được xem là dòng khác của B. subtilis hay loài phụ B. subtilis subsp. amyoliquefaciens. B. amyloliquefaciens mang rất nhiều 12
đặc điểm tương đồng với các loài B. subtilis, B. licheniformis và B. pumilus. Bằng các phương pháp phân loại thông thường rất khó để phân biệt giữa chúng. Đến năm 1987, B. amyloliquefaciens mới được tách ra thành một loài riêng dựa vào kết quả lai DNA lần lượt là 23, 15 và 5% so với các loài B. subtilis, B. licheniformis và B. pumilus [43]. Từ đó đến nay, nhiều chủng B. amyloliquefaciens phân lập từ các hệ sinh thái khác nhau ở các vùng địa lý khác nhau đã được công bố. Năm 2010, Borriss và cộng sự đã chứng minh sự khác biệt về chỉ số lai DNA, chỉ số so sánh hệ gen bằng kỹ thuật microarray, tính tương đồng của toàn bộ hệ genome và phổ các chất hoạt tính lipopeptide và polypeptide giữa một nhóm B. amyloliquefaciens DSM7 không có khả năng và một nhóm B. amyloliquefaciens FZB42 có khả năng sống nội cộng sinh rễ cây thực vật. Dựa vào kết quả thu được, Borriss đã đề xuất tách B. amyloliquefaciens thành 2 nhóm loài phụ là B. amyloliquefaciens subsp. plantarum (có khả năng sống nội cộng sinh rễ cây thực vật) và B. amyloliquefaciens subsp. amyloliquefaciens (không có khả năng sống nội cộng sinh rễ cây thực vật) [23]. 1.1.3. Phân loại Theo phân loại của Bergey (1974) [24], B. amyloliquefaciens thuộc: Giới: Bacteria Ngành : Firmicutes Lớp: Bacilli Bộ: Bacillales Họ: Bacillaceae Chi: Bacillus Nhóm: Bacillus subtilis Loài: Bacillus amyloliquefaciens 1.1.4. Đặc điểm sinh học và phân bố trong tự nhiên B. amyloliquefaciens thường có mặt trong các mẫu đất tự nhiên. Đây là loài vi khuẩn hiếu khí, hình que, Gram dương, sinh nội bào tử, có khả năng di 13
động và kích thước tế bào 3,04,0 × 0,71,5 µm. Đặc biệt, có một số chủng vi khuẩn B. amyloliquefaciens có khả năng sống nội cộng sinh rễ cây thực vật [23]. 1.2. ỨNG DỤNG CỦA BACILLUS AMYLOLIQUEFACIENS 1.2.1. Sản xuất enzyme công nghiệp Loài vi khuẩn này được biết đến từ rất sớm nhờ khả năng sản sinh các loại enzyme ngoại bào đa dạng. Từ những năm 1943, B. amyloliquefaciens đã được sử dụng để sản xuất 2 loại enzyme công nghiệp là αamylase và protease [43]. Enzyme từ B. amyloliquefaciens như amylase, xylanase, cellulase, protease và lipase có nhiều đặc tính quý như khả năng hoạt động tốt trong dải pH rộng và khả năng bền nhiệt. Do đó, enzyme từ B. amyloliquefaciens đã được ứng dụng nhiều trong công nghiệp chế biến thực phẩm, công nghiệp dệt may, công nghiệp giấy và công nghiệp sản xuất chất tẩy rửa [21]. Bên cạnh đó, nhóm B. amyloliquefaciens sống nội cộng sinh rễ cây thực vật có khả năng sinh phytase đã được công bố và gen mã hóa phytase của chúng đã được biểu hiện thành công trên chủng B. subtilis MU331 [31]. Phytase là enzyme phân giải phytate khó tan trong các loại rau, củ và quả thành myoinositol và các dạng phosphate hòa tan dễ hấp thụ trong hệ tiêu hóa động vật. Vì vậy, phytase đã được bổ sung vào thức ăn chăn nuôi nhằm nâng cao hiệu quả sử dụng thức ăn cho nhóm động vật dạ dầy đơn và làm giảm nguy cơ ô nhiễm môi trường do hàm lượng phosphate dư thừa thải ra môi trường nước [29]. 1.2.2. Sản xuất chất kháng sinh Các loài thuộc nhóm B. subtilis đã được biết đến nhờ khả năng sinh các chất kháng sinh kháng vi khuẩn và nấm gây bệnh hoặc sản sinh các sản phẩm trao đổi bậc hai khác như chất kháng virus, chất kháng ung thư và chất ức chế miễn dịch [47]. Chất kháng sinh từ Bacillus có bản chất là các peptide được tổng hợp qua ribosome (còn gọi là bacteriocin hoặc lantibiotics). Lantibiotics có phổ kháng khuẩn hẹp và thường ứng dụng trong bảo quản thực phẩm. Nhiều chất kháng sinh có bản chất peptide tổng hợp không qua ribosome cũng đã được công bố từ loài B. amyloliquefaciens như bacylicin, lipopeptide (surfactin, fengycin, iturin và bacillomycin) và polyketide (difficidin, bacillaene và macrolactin) [18] [38]. Bacylicin là chất dipeptide được tạo nên từ Lanaline và một amino axít hiếm Lanticapsin. Bacylicin có khả năng ức chế vi khuẩn Erwinia amylovora gây 14
bệnh cháy lá trên táo và lê. Surfactin hoạt động như chất tẩy rửa trên màng tế bào. Chất này có tính kháng khuẩn, kháng virus và kháng viêm. Iturin, fengycin và bacillomycin là các lipopeptide vòng có tính kháng nấm gây bệnh cây. Nghiên cứu gần đây cho thấy, một số chất peptide giống iturin từ B. amyloliquefaciens có khả năng diệt Paenibacillus larvae gây bệnh trên ong mật [22]. Difficin là chất kháng sinh phổ rộng, chất này ức chế quá trình tổng hợp protein và có khả năng ức chế Erwinia amylovora. Bacillaene cũng là một chất ức chế tổng hợp protein ở tế bào prokaryotes. Macrolactin là một chất kháng khuẩn Gram dương. 1.2.3. Sản xuất phân bón vi sinh Một số chủng B. amyloliquefaciens sống nội cộng sinh trên rễ cây thực vật có khả năng sinh chất kích thích sinh trưởng Indole3acetic axít (IAA). Chất này sẽ tác động tích cực đến những quá trình sinh lý của thực vật như quang hướng động, địa hướng động, ưu thế chồi ngọn và sự tượng rễ. Yao và cộng sự (2012) đã thử nghiệm bổ sung chế phẩm chứa vi khuẩn B. amyloliquefaciens FZB24 lên cây bông. Kết quả cho thấy, sản lượng bông thu hoạch được tăng 30% so với đối chứng bổ sung đạm NPK [56]. Trong nghiên cứu Idris và cộng sự (2007), tác giả đã thử khả năng sinh chất kích thích sinh trưởng indole3acetic axít của chủng vi khuẩn B. amyloliquefaciens FZB42 lên bèo tấm. Kết quả cho thấy, trọng lượng tươi của bèo tấm khi thu hoạch có sự gia tăng đáng kể so với đối chứng. Loài vi khuẩn B. amyloliquefaciens đã được chứng minh có tiềm năng ứng dụng trong sản xuất phân bón vi sinh nhờ khả năng sinh các chất kháng nấm và chất kích thích sinh trưởng thực vật [31]. 1.2.4. Sản xuất chế phẩm probiotics B. amyloliquefaciens là những vi sinh vật an toàn (Generally recognized as safe; GRAS) và có thể dùng như probiotics để bổ sung vào thức ăn hoăc n ̣ ươć uông nh ́ ằm cân băng hê vi sinh đ ̀ ̣ ường ruôt, qua đo ngăn ng ̣ ́ ừa va phong chông cac ̀ ̀ ́ ́ ̣ ̉ bênh tiêu chay th ương găp. Ngoai ra, vi sinh v ̀ ̣ ̀ ật trong probiotics con tăng c ̀ ường ̉ kha năng chuy ển hóa lactose, điêu hoa hê thông miên dich va tăng c ̀ ̀ ̣ ́ ̃ ̣ ̀ ường sức khoẻ con ngươi [48] [49]. Nhi ̀ ều bằng chứng cho thấy B. amyloliquefaciens đã được sử dụng trong chế phẩm probiotics [53]. 1.3. MỘT SỐ ENZYME CÔNG NGHIỆP QUAN TRỌNG 15
1.3.1. Xylanase 1.3.1.1. Cấu trúc xylan Xylan là thành phần chính của hemicellulose và là polysaccharide phổ biến thứ hai trong tự nhiên chỉ sau cellulose. Chúng được tìm thấy trong thành tế bào thực vật [50]. Xylan là một polysaccharide không đồng nhất, bao gồm các gốc Dxylose liên kết với nhau bằng liên kết β1,4xylanosidic giữa đường xylopyranose với acetyl, arabinosyl và glucuronisyl [39]. Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của xylan và các vị trí tấn công của hệ thống enzyme xylanolytic [34]. Thực vật trên cạn có xylan là chuỗi Dxylosyl được nối với nhau bằng liên kết β1,4, trong khi tảo biển tổng hợp xylan với một cấu trúc hóa học khác gồm các monomer Dxylose nối với nhau bằng liên kết β1,3. Thông thường, xylan chiếm khoảng 1530% trọng lượng khô của cây hạt kín và khoảng 715% của cây hạt trần. Đặc biệt trong cây lá rộng, xylan chiếm tới 35% tổng trọng lượng khô của chúng [35]. Do xylan có cấu trúc không đồng nhất, để thủy phân cấu trúc này cần phải có hệ thống enzyme xylanolytic. Tất cả các enzyme trong hệ thống này tác động tương hỗ với nhau để phân giải xylan thành các phân tử đường [34]. 1.3.1.2. Nguồn sản sinh xylanase 16
Xylanase được sinh tổng hợp bởi nấm, vi khuẩn, xạ khuẩn và động vật nguyên sinh. Trong các loài vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp xylanase, nấm, vi khuẩn và xạ khuẩn là các nhóm quan trọng nhất [57]. Các loại xylanase được sinh ra bởi vi khuẩn và nấm sợi ưa kiềm có khả năng chịu nhiệt tốt hơn và do đó chúng được ứng dụng rộng rãi và cho hiệu quả cao hơn trong công nghiệp [39]. 1.3.1.3. Đặc tính hoạt động của xylanase Axít glutamic là axít amin quyết định sự hoạt động của xylanase [10]. Sự thủy phân xylan đòi hỏi sự hỗ trợ hoạt động của các thành phần trong hệ thống enzyme xylanolytic (hình 1.1.). Vai trò của các enzyme chính trong hệ thống enzyme xylanolytic cụ thể như sau: β 1,4endoxylanase và ferulic axít esterase Enzyme β1,4endoxylanase và ferulic axít esterase là hai enzyme có vai trò chủ đạo trong quá trình thủy phân mạch chính của xylan. Trong đó, β 1,4endo xylanase tấn công vào liên kết xylosidic của mạch chính còn ferulic axít esterase tấn công các liên kết xylosyl còn lại và giải phóng ra các xylooligosaccharide. Hai enzyme này là thành phần chính của hệ enzyme xylanolytic do các vi sinh vật sinh ra, chẳng hạn như các loài thuộc Trichoderma, Aspergillus, Schizophyllum, Bacillus, Clostridium và Streptomyces [55]. Ferulic axít esterase là enzyme ngoại bào exoglycosidase thủy phân các oligosaccharide ngắn và xylobiose thành đường xylose [57]. Trong số các cơ chất, xylobiose thường là cơ chất tốt nhất [ 39]. Hầu hết các ferulic axít esterase được nghiên cứu cho đến nay đều bị ức chế ngược bởi xylose, một sản phẩm thủy phân của chúng. α LArabinofuranosidase αLArabinofuranosidase có khả năng thủy phân cả hai liên kết 1,3 và 1,5 αLarabinofuranosyl trong arabinoxylan giải phóng arabinose. Khi giải phóng 17
arabinose, mạch chính xylan không bị thủy phân và không tạo ra xylooligosaccharide [55]. α DGlucuronidase αDGlucuronidase phân giải liên kết α1,2 giữa axít glucuronic và gốc xylose trong phân tử glucuronoxylan. Tính đặc hiệu của αglucuronidase là khác nhau phụ thuộc vào nguồn gốc của enzyme [39]. Acetyl xylan esterase Acetyl xylan esterase là enzyme có thể cắt đứt liên kết giữa các nhóm acetyl với 2 hoặc 3 vị trí của gốc xylose và góp phần đóng vai trò thủy phân xylan trong tự nhiên [34]. Enzyme này thường được sinh ra từ một số loài vi khuẩn và nấm. 1.3.1.4. Ứng dụng của enzyme xylanase Xylanase được ứng dụng trong sản xuất nước hoa quả và làm trong rượu. Hơn nữa, xylanase còn có thể hoạt động trong điều kiện nhiệt độ cao (khoảng 6070oC) nên có thể ngăn chặn được sự nhiễm vi sinh vật khi chế biến nước hoa quả ở nhiệt độ cao [27]. Xylanase còn được ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm như trong công nghệ sản xuất bánh nướng, hỗ trợ quá trình đường hóa lignocellulose (một polysaccharide khó phân hủy trong thành tế bào thực vật). Xylanase còn được sử dụng để loại lignin khỏi bột giấy. Trong công nghiệp sản xuất giấy và vải sợi, xylanase tham gia vào quá trình tách xylan và lignin để thu cellulose một cách nhanh chóng và dễ dàng. Xylanase giúp tẩy màu và làm mềm sợi lanh và sợi gai [11]. Xylan là chất xơ khó phân hủy trong thực vật và là chất khó tiêu trong thức ăn chăn nuôi. Vì thế việc bổ sung xylanase vào khẩu phần ăn của gia súc và gia cầm sẽ giúp chúng dễ tiêu hóa và dễ hấp thụ thức ăn, đồng thời góp phần làm giảm ô nhiễm môi trường. 1.3.2. α amylase 1.3.2.1. Cấu tạo tinh bột và glycogen 18
Cơ chất tác dụng của amylase và tinh bột và glycogen. Tinh bột là nhóm carbohydrate ở thực vật. Chúng có chủ yếu ở trong các loại củ và hạt như khoai lang, khoai tây, sắn, củ mì và các loại hạt ngũ cốc. Tinh bột từ mọi nguồn khác nhau đều có cấu tạo từ 2030% amylose và 7080% amylopectin. Amylose được cấu tạo từ 2001.000 phân tử Dglucose nối với nhau bởi liên kết α1,4glucoside tạo thành một mạch dài không phân nhánh. Amylopectin được cấu tạo từ 6006.000 phân tử Dglucose nối với nhau bởi liên kết α1,4 glucoside và α1,6glucoside tạo thành mạch có nhiều nhánh. Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của amylose và amylopectin [14]. 19
Glycogen được ví như tinh bột của động vật. Glycogen có cấu tạo giống với tinh bột nhưng mức độ phân nhánh mạnh hơn. Cấu tạo của chúng gồm các phân tử glucose nối với nhau bằng liên kết α1,4glucoside. Ở các vị trí phân nhánh glucose nối với nhau băng liên kết α1,4glucoside. Glycogen có ở động vật và người, chúng tập trung chủ yếu ở gan. 1.3.2.2. Nguồn sản sinh αamylase Amylase là hệ enzyme rất phổ biến ở nhiều sinh vật. Vi khuẩn và nấm sợi là những nhóm sinh amylase chính. Amylase của vi khuẩn có ưu điểm chịu nhiệt tốt hơn của nấm sợi, chúng có thể hoạt động ở nhiệt độ 8595oC [34]. Các enzyme này thuộc nhóm enzyme thủy phân. Có 6 loại amylase được xếp vào 2 nhóm: endoamylase và exoamylase. Endoamylase gồm αamylase và nhóm enzyme khử nhánh. Exoamylasse gồm có βamylase và glucoamylase. 1.3.2.3. Đặc tính hoạt động của αamylase Đây là một enzyme kim loại, nếu không có sự hiện diện của ion canxi trong phân tử enzyme thì chúng sẽ không hoạt động được. αamylase có khả năng phân cắt các liên kết α1,4glucoside nằm ở phía bên trong phân tử cơ chất một cách ngẫu nhiên không theo một trật tự nào cả. αamylase không chỉ thủy phân hồ tinh bột mà chúng còn có khả năng thủy phân cả hạt tinh bột nguyên thủy. Quá trình thủy phân tinh bột bở αamylase là quá trình xảy ra qua nhiều giai đoạn: dextrin hóa  đường hóa  phân cắt polyglucose tạo polyglucose collagen  sản phẩm thủy phân gồm maltotetrose, maltotriose và maltose. Ở giai đoạn đầu (giai đoạn dextrin hóa): chỉ một số phân tử cơ chất bị thủy phân tạo thành một lượng lớn dextrin phân tử thấp (αdextrin), độ nhớt của hồ tinh bột giảm nhanh (các amylose và amylopectin đều bị dịch hóa nhanh). Sang giai đoạn 2 (giai đoạn đường hóa): các dextrin phân tử thấp tạo thành bị thủy phân tiếp tục tạo ra các tetratrimaltose không cho màu với iodine. Các chất này bị thủy phân rất chậm bởi αamylase cho tới disaccharide và monosaccharide. Dưới tác dụng của αamylase, amylose bị phân giải khá nhanh thành oligosaccharide gồm 67 gốc glucose. 20