intTypePromotion=3

Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu đa dạng di truyền phân đoạn S7 của các chủng virus gây bệnh lúa lùn sọc đen

Chia sẻ: Na Na | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:79

0
37
lượt xem
9
download

Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu đa dạng di truyền phân đoạn S7 của các chủng virus gây bệnh lúa lùn sọc đen

Mô tả tài liệu
  Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận văn với những mục tiêu chính như sau: Phân lập và giải trình tự phân đoạn S7 của vius SRBSDV trên các mẫu lúa nhiễm bệnh thu thập tại 5 vùng sinh thái trồng lúa của Việt Nam; phân tích tính đa dạng di truyền và so sánh mức độ tiến hóa của các chủng SRBSDV ở Việt Nam với các chủng SRBSDV khác trên thế giới.

Chủ đề:
Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu đa dạng di truyền phân đoạn S7 của các chủng virus gây bệnh lúa lùn sọc đen

  1. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------- Lại Phƣơng Liên NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN PHÂN ĐOẠN S7 CỦA CÁC CHỦNG VIRUS GÂY BỆNH LÚA LÙN SỌC ĐEN LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – Năm 2013
  2. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------- Lại Phƣơng Liên NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN PHÂN ĐOẠN S7 CỦA CÁC CHỦNG VIRUS GÂY BỆNH LÚA LÙN SỌC ĐEN Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60420121 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. Phạm Xuân Hội PGS.TS. Nguyễn Thị Hồng Vân Hà Nội – Năm 2013
  3. LỜI CẢM ƠN Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới PGS.TS. Phạm Xuân Hội và PGS.TS. Nguyễn Thị Hồng Vân đã tận tình chỉ bảo, hƣớng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu để hoàn thành luận văn này. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới ThS. Nguyễn Duy Phƣơng, CN. Nguyễn Hoàng Quang cùng các cán bộ, anh chị em trong Bộ môn Bệnh học Phân tử Thực vật, Viện Di truyền Nông nghiệp đã nhiệt tình hƣớng dẫn và giúp đỡ tôi rất nhiều trong thời gian thực tập tại Bộ môn. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới toàn thể các thầy cô giáo trong bộ môn Di truyền học, khoa Sinh học , trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã tạo điều kiện cho tôi đƣợc học tập và nghiên cứu trong một môi trƣờng học tập khoa học, giúp cho tôi có những kiến thức bổ ích trong suốt 2 năm học. Cuối cùng tôi cũng xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến gia đình và bạn bè,những ngƣời luôn đứng sau giúp đỡ và tạo điều kiện để tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp. Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 10 tháng 12 năm 2013 Học viên thực hiện Lại Phƣơng Liên i
  4. DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT BVTV Bảo vệ thực vật bp Base pair (Cặp bazơ) cDNA complementary (DNA bổ sung) ddNTP Dideoxyribonucleoside triphosphate DNA Axit deoxy ribonucleic dNTP Deoxynucleotidetriphosphates dsRNA Double stranded RNA (ARN sợi đôi) FDV Fiji disease virus (Virus bệnh Fiji) EDTA Axit Ethylenediaminetetra acetic ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay (xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme) EtBr Ethidium Bromide IRRI International Rice Research Institute (Viện nghiên cứu lúa quốc tế) Kb Kilobase LB Môi trƣờng Luria Bertani LSĐPN Lùn sọc đen phƣơng Nam MRCV Mal de Río Cuarto virus (Virus Mal de Rio Cuarto) MRDV Maize rough dwarf virus (Virus lùn ngô) NLRV Nilaparvata lugens virus (Virus nilaparvata lugens) NN&PTNT Nông nghiệp và phát triển nông thôn OD Optical Density (mật độ quang học) ORF Open reading frame (Khung đọc mở) OSDV Oat Sterile-Dwarf Virus (Virus lùn yến mạch) PCR Polymerase chain reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp) RBSDV Rice black streaked dwarf virus (Virus lùn sọc đen) RGSV Rice grassy stunt virus (Virus lúa cỏ) RNA Axit ribonucleic RRSV Rice ragged stunt virus (Virus lùn xoắn lá) ii
  5. RSV Rice stripe virus (Virus lúa sọc) RT-PCR Reverse transcription polymerase chain reaction (phản ứng chuỗi trùng hợp phiên mã ngƣợc) RTSV Rice tungro spherical virus (Virus Tungro hình cầu) RTBV Rice tungro bacilliform virus (Virus Tungro dạng thẳng) RDV Rice dwarf virus (Virus bệnh lúa lùn) RGDV Rice gall dwarf virus (Virus vết u lùn lúa) SRBSDV Southern rice black-streaked dwarf virus (Virus lùn sọc đen phƣơng Nam) TAE Tris base – Acetic - EDTA iii
  6. DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1 Các cặp oligo nucleotide sử dụng trong nghiên cứu. 22 Bảng 2 Các biểu hiện của bệnh lùn sọc đen trên lúa 35 Bảng 3 Kết quả sàng lọc mẫu bệnh bằng phƣơng pháp Sandwich-ELISA và 40 RT-PCR một bƣớc Bảng 4 Trình tự các mồi đặc hiệu đƣợc thiết kế phục vụ cho phản ứng 42 RT-PCR Bảng 5 So sánh mức đồng nhất trình tự phân đoạn S7 phân lập của các 54 mẫu Việt Nam và Trung Quốc iv
  7. DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1 Cây lúa bị nhiễm bệnh lùn sọc đen phƣơng Nam 8 Hình 2 Rầy lƣng trắng Sogatella furcifera truyền virus SRBSDV 9 Hình 3 Cấu trúc phân tử các Fijivirus 11 Hình 4 Tổ chức bộ gen của các Fijivirus 11 Hình 5 Cấu trúc hình đa diện kiểu icosahedral T=13 12 Hình 6 Ảnh điện di 10 phân đoạn RNA sợi đôi của virus SRBSDV 14 trên gel polyacrylamide 12,5%. Hình 7 Sự xuất hiện của protein P7-1 trong tế bào vector truyền bệnh 16 (rầy Sogatella furcifera) dƣới kính hiển vi điện tử Hình 8 Xét nghiệm virus SRBSDV bằng phƣơng pháp DOT-ELISA 17 Hình 9 Vector nhân dòng pGEM-T và một số vị trí cắt của các 32 enzyme cắt giới hạn trên vector pGEM-T Hình 10 Triệu chứng một số mẫu lúa thu thập tại các tỉnh Việt Nam 37 Hình 11 Một số kết quả kiểm tra ELISA với các mẫu thu thập ở các tỉnh 38 Việt Nam Hình 12 Một phần kết quả điện di kiểm tra sản phẩm RT-PCR một 39 bƣớc của các mẫu lúa Hình 13 Hình ảnh điện di genome của SRBSDV phân lập từ 12 mẫu 40 lúa Hình 14 Kết quả điện di phân đoạn S7 phân lập đƣợc của SRBSDV 42 trên gel agarose 1% (chủng Thái Bình-2) Hình 15 Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi đặc hiệu của phân 43 đoạn S7 Hình 16 Kết quả điện di sản phẩm DNA tinh sạch bằng bộ kit 45 GenJETTM Gel Extraction trên gel agarose 1% Hình 17 Sơ đồ minh họa quá trình dòng hóa S7 vào vector pGEM-T 46 Hình 18 Kết quả biến nạp sản phẩm phản ứng gắn vào E.coli chủng 46 v
  8. DH5α Hình 19 Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm plasmid tinh sạch trên gel 47 agarose 1% Hình 20 Kết quả điện di sản phẩm PCR từ plasmid tinh sạch Sử dụng 48 cặp mồi S7-Fw/S7-Rv Hình 21 Kết quả điện di sản phẩm PCR từ plasmid tinh sạch sử dụng 49 cặp mồi T7-Fw/SP6-Rv Hình 22 Kết quả điện di sản phẩm cắt giới hạn vector tái tổ hợp 50 pGEM-T/S7 bằng enzyme EcoRI Hình 23 Một phần kết quả giải trình tự phân đoạn S7 của virus 50 SRBSDV (mẫu Nghệ An) Hình 24 Trình tự amino acid suy diễn của 2 khung đọc mở nằm trên 51 phân đoạn S7 (mẫu Nghệ An) Hình 25 Một phần kết quả so sánh trình tự nucleotide phân đoạn S7 53 của các mẫu SRBSDV thu đƣợc tại Việt Nam và trên thế giới Hình 26 Một phần kết quả so sánh trình tự amino acid phân đoạn S7 53 của các mẫu SRBSDV thu đƣợc tại Việt Nam và trên thế giới Hình 27 Hai cây phả hệ dựa trên toàn bộ trình tự S7 (A) và trình tự 55 gen P7-1 (B) vi
  9. MỤC LỤC MỞ ĐẦU .................................................................................................................................... 1 CHƢƠNG I - TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................................... 3 1.1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CÁC VIRUS HẠI LÚA Ở VIỆT NAM............................3 1.1.1. Các virus gây bệnh trên lúa...............................................................................................3 1.1.2. Tình hình nghiên cứu virus hại lúa ở Việt Nam...............................................................3 1.2. BỆNH LÙN SỌC ĐEN PHƢƠNG NAM VÀ VIRUS SRBSDV.......................................5 1.2.1. Giới thiệu chung về bệnh lùn sọc đen phƣơng Nam.........................................................5 1.2.1.1. Nguồn gốc phát sinh bệnh lùn sọc đen phƣơng Nam....................................................5 1.2.1.2. Diễn biến bệnh lúa lùn sọc đen tại Việt Nam................................................................6 1.2.2. Đặc điểm bệnh học của bệnh lùn sọc đen phƣơng Nam..................................................7 1.2.2.1.Dấu hiệu nhận biết..........................................................................................................7 1.2.2.2. Vector truyền bệnh ........................................................................................................8 1.2.3. Đặc điểm sinh học của virus SRBSDV..........................................................................10 1.2.3.1. Phân loại.....................................................................................................................10 1.2.3.2. Đặc điểm hình thái của SRBSDV................................................................................12 1.2.3.3. Đặc điểm di truyền của virus SRBSDV......................................................................12 1.2.3.4. Đặc điểm phân đoạn S7 và khả năng tiến hóa của SRBSDV......................................14 1.2.3.5. Chuẩn đoán virus SRBSDV.........................................................................................16 1.2.4. Tình hình nghiên cứu bệnh lùn sọc đen phƣơng Nam và virus SRBSDV ở Việt Nam...........................................................................................................................................17 1.2.4.1. Các nghiên cứu xác định virus SRBSDV ..........................................................17 1.2.4.2. Các nghiên cứu về quy trình chẩn đoán virus SRBSDV.............................................19 CHƢƠNG II - VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..........................................21 2.1. VẬT LIỆU.........................................................................................................................21 2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu.....................................................................................................21 2.1.2. Hóa chất..........................................................................................................................21 2.1.3. Thiết bị............................................................................................................................22 vii
  10. 2.2. PHƢƠNG PHÁP..............................................................................................................22 2.2.1. Thu mẫu.........................................................................................................................22 2.2.2. Xét nghiệm mẫu............................................................................................................22 2.2.2.1. Phƣơng thức ELISA gắn đặc hiệu - "Sandwich ELISA".............................................23 2.2.2.2. RT-PCR một bƣớc.......................................................................................................25 2.2.2.3. Điện di DNA trên gel agarose 1%.............................................................................26 2.2.3. Tinh sạch dsRNA của SRBSDV bằng cột CF-11..........................................................26 2.2.4. Tổng hợp cDNA từ dsRNA...........................................................................................28 2.2.4.1 Thiết kế cặp mồi...........................................................................................................28 2.2.4.2. Tổng hợp cDNA sợi 1..................................................................................................28 2.2.4.3. Tổng hợp cDNA sợi đôi bằng kĩ thuật PCR...............................................................29 2.2.4.4. Tinh sạch sản phẩm PCR từ gel agarose bằng bộ kit Fermentas...............................30 2.2.5. Nhân dòng sản phẩm PCR bằng bộ kit pGEM®-T Easy Cloning.................................31 2.2.5.1. Phản ứng gắn sản phẩm PCR vào vector pGEM-T.....................................................31 2.2.5.2. Biến nạp DNA vào tế bảo khả biến E.colichủng DH5α..............................................32 2.2.6. Tinh sạch plasmid từ vi khuẩn E.coli bằng bộ kit GenJETTM Plasmid Miniprep...........33 2.2.7. Cắt enzyme giới hạn.......................................................................................................33 2.2.8. Giải trình tự nucleotide đoạn gen đã nhân dòng.............................................................34 2.2.9. Phân tích đa dạng di truyền phân đoạn S7......................................................................35 CHƢƠNG III – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.......................................................................36 3.1. Thu thập và bảo quản mẫu................................................................................................36 3.2. Kết quả sàng lọc mẫu bệnh bằng phƣơng pháp Sandwich-ELISA và RT-PCR một bƣớc......38 3.2.1. Kết quả xét nghiệm mẫu bệnh sử dụng phƣơng pháp Sandwich- ELISA............................38 3.2.2. Sàng lọc mẫu bệnh bằng phƣơng pháp RT-PCR 1 bƣớc....................................................39 3.3. Phân lập hệ gen của các mẫu SRBSDV............................................................................39 3.4. Phân lập phân đoạn S7 của SRBSDV thu thập từ mẫu lúa bệnh......................................41 3.5. Nhân bản phân đoạn S7 bằng phƣơng pháp RT-PCR.......................................................43 3.5.1. Thiết kế đoạn mồi đặc hiệu cho phản ứng RT-PCR phục vụ nhân bản phân đoạn S7 ..43 3.5.2. Nhân bản phân đoạn S7 bằng phƣơng pháp RT-PCR....................................................43 viii
  11. 3.6. Tinh sạch sản phẩm PCR phân đoạn S7 của virus SRBSDV............................................44 3.7. Nhân dòng phân đoạn S7 vào vector PGEM-T.................................................................45 3.7.1. Tạo plasmid tái tổ hợp PGEM-T/S7 biến nạp vào tế bào E.coli chủng DH5α...............45 3.7.2. Kiểm tra sự có mặt phân đoạn S7 trong plasmid tái tổ hơ ̣p............................................47 3.7.2.1. Kiểm tra sự có mặt phân đoạn S7 trong plasmid tái tổ hơ ̣p bằng phản ứng PCR. ..... 47 3.7.2.2. Kiểm tra sự có mặt phân đoạn S7 trong plasmid tái tổ hơ ̣p bằng cách xử lí với enzyme cắt giới hạn EcoRI .................................................................................................................... 49 3.8. Giải trình tự phân đoạn S7 của SRBSDV.........................................................................50 3.9. Phân tích đa dạng di truyền phân đoạn S7 của các mẫu SRBSDV...................................52 3.9.1. So sánh trình tự phân đoạn S7 của các mẫu SRBSDV Việt Nam với các mẫu SRBSDV trên thế giới...............................................................................................................................52 3.9.2. Phân tích đặc điểm di truyền..........................................................................................55 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.................................................................................................. 57 Kết luận .................................................................................................................................... 57 Kiến nghị..................................................................................................................................57 TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................................ 57 PHỤ LỤC 1 .............................................................................................................................. 62 PHỤ LỤC 2 .............................................................................................................................. 68 ix
  12. LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP Lại Phương Liên – K20 Di truyền học MỞ ĐẦU Lúa (Oryza sativa L.) là cây lƣơng thực quan trọng nhất ở Việt Nam, đồng thời cũng là nguồn lƣơng thực chính cho một nửa dân số thế giới. Là nƣớc xuất khẩu gạo đứng thứ 2 trên thế giới, lúa gạo là nguồn thu ngoại tệ lớn nhất của nền nông nghiệp xuất khẩu Việt Nam và cũng là nguồn thức ăn chính của 90 triệu dân số trong nƣớc. Tuy nhiên, sản xuất lúa gạo của Việt Nam đang phải đối mặt với nhiều thách thức nhƣ (1) điều kiện bất lợi của môi trƣờng do ảnh hƣởng của hiện tƣợng biến đổi khí hậu toàn câu và (2) dịch bệnh do việc canh tác quá phụ thuộc vào thuốc hóa học dẫn đến mất cân bằng sinh thái. Trong điều kiện thích hợp, các tác nhân gây bệnh trên lúa có thể phát triển rất mạnh, làm giảm năng suất tới trên 85%, thậm chí mất trắng. Đây là một trong những nguyên nhân chính làm giảm năng suất, dẫn đến sản lƣợng nông nghiệp không ổn định và gây tình trạng mất an ninh lƣơng thực. Trong số các tác nhân gây bệnh trên lúa, virus là mầm bệnh nguy hiểm nhất do khả năng phát tán rất rộng, đồng thời rất khó kiểm soát. Ở Việt Nam, virus gây ra một số bệnh rất nguy hiểm, ảnh hƣởng nghiêm trọng tới sản lƣợng lúa nhƣ bệnh vàng lùn, bệnh lùn xoắn lá, bệnh lùn sọc đen...Trong các năm từ 2009 đến 2010, dịch bệnh lúa lùn sọc đen lần đầu tiên bùng phát và gây hại tại 28 tỉnh miền Bắc và Trung với tổng diện tích nhiễm bệnh lên tới cả trăm ngàn ha, gây thiệt hại lớn cho sản suất Nông nghiệp. Mặc dù, nguyên nhân gây bệnh bƣớc đầu đã đƣợc xác định là virus gây bệnh lúa lùn sọc đen (SRBSDV) và dịch bệnh đến nay đã tạm thời lắng xuống nhƣng diễn biến gây bệnh vẫn tồn tại trong sản suất lúa. Đặc biệt, virus SRBSDV là chủng vius mới xuất hiện nên tất cả các nghiên cứu nhƣ: (1) nguyên nhân gây bệnh, (2) đặc trƣng sinh học, (3) dịch tễ bệnh và (4) phòng chống bệnh cần phải đƣợc nghiên cứu. Thực tế các nghiên cứu hiện tại vẫn đang tập trung vào việc hoàn thiện quy trình chẩn đoán, sau đó áp dụng các biện pháp canh tác nhƣ nhổ bỏ cây bệnh, diệt trung gian truyền bệnh, trồng giống lúa kháng rầy, luân canh...; chƣa có các nghiên cứu chuyên sâu về bản chất hệ gene, mức độ đa dạng di truyền, mức độ đột biến, nguy cơ phát sinh chủng mới. Vì nguy cơ phát dịch trở lại của loại virus này vẫn tiềm ẩn. 1
  13. LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP Lại Phương Liên – K20 Di truyền học Hệ gen của SRBSDV có chiều dài 29.124 bp, gồm 10 phân đoạn RNA sợi đôi, có kích thƣớc từ 1 đến 4,5 kb và đƣợc đặt tên theo thứ tự từ S1 đến S10 dựa vào kích thƣớc phân đoạn RNA sợi đôi. Phân đoạn S7 có chiều dài 2176 bp, chứa hai ORF có chiều dài 1073 và 930 nucleotide. Trong đó, ORF 7-1 chứa gen 7-1 quy định protein P7-1 liên quan đến tính tƣơng tác đặc hiệu với vector trung gian truyền bệnh là rầy lƣng trắng (Sogatella furcifera), do đó có vai trò quan trọng trong nghiên cứu tính đa dạng di truyền và sự tiến hóa của virus. Dựa vào thực tế trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “ Nghiên cứu đa dạng di truyền phân đoạn S7 của các chủng virus gây bệnh lúa lùn sọc đen” với những mục tiêu chính nhƣ sau: - Phân lập và giải trình tự phân đoạn S7 của vius SRBSDV trên các mẫu lúa nhiễm bệnh thu thập tại 5 vùng sinh thái trồng lúa của Việt Nam. - Phân tích tính đa dạng di truyền và so sánh mức độ tiến hóa của các chủng SRBSDV ở Việt Nam với các chủng SRBSDV khác trên thế giới. 2
  14. LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP Lại Phương Liên – K20 Di truyền học CHƢƠNG I - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CÁC VIRUS HẠI LÚA Ở VIỆT NAM 1.1.1. Các virus gây bệnh trên lúa Virus là một trong những tác nhân gây bệnh nguy hiểm nhất và là nguyên nhân chính làm sản lƣợng nông nghiệp không ổn định, gây ra tình trạng mất an ninh lƣơng thực. Đặc biệt trong bối cảnh thay đổi khí hậu toàn cầu, cân bằng sinh thái bị phá vỡ do việc canh tác quá phụ thuộc vào thuốc hóa học đã làm cho diễn biến phát sinh dịch và mức độ gây hại của các bệnh virus càng trở nên nguy hiểm và phức tạp hơn lúc nào hết. Trong sản xuất nông nghiệp tổng cộng có 16 loại virus gây hại cho lúa (phụ lục 1) và khoảng hơn 1000 loài virus gây hại cho thực vật và các loại cây nông nghiệp nhƣ cây ngô, đậu tƣơng…Trong số các virus hại lúa ngoài Rice hoja blanca virus (một Ternuivirus, phân bố tại Nam Mỹ), Rice giallume virus (một Luteovirus, phân bố tại châu Âu), Rice stripe necrosis virus (một Furovirus, phân bố tại châu Phi) thì 13 virus còn lại đều phát hiện thấy tại các nƣớc trồng lúa châu Á. Tuy nhiên có 5 bệnh virus gây hại nghiệm trọng và phổ biến nhất là: bệnh vàng lùn (bệnh lúa cỏ), bệnh lúa lùn xoắn lá, bệnh Tungro, bệnh lúa sần lùn, bệnh vàng lá tạm thời.[17,24,26,23,34] 1.1.2. Tình hình nghiên cứu virus hại lúa ở Việt Nam Việt Nam hiện có 12/16 loại vius gây hại trên lúa, các bệnh do vius gây ra thành các đợt dịch thƣờng nối tiếp nhau ở các vùng trồng lúa khác nhau trên cả nƣớc. Tuy nhiên, cho đến nay mới ghi nhận 5 loại bệnh virus gây thành dịch, bao gồm bệnh vàng lá di động, bệnh tungro, bệnh lúa cỏ, bệnh lúa lùn xoắn, bệnh lùn sọc đen phƣơng Nam [15]. Hiện nay, virus gây bệnh vàng lụi lúa (Rice yellow stunt virus – RYSV) đang gây hại tại Bắc giang và đang có nguy cơ thành dịch [14]. Các nghiên cứu về virus ở Việt Nam hiện mới tập trung ở khâu phát hiện sau đó áp dụng các biện pháp canh tác nhƣ nhổ bỏ cây bệnh, diệt môi giới truyền bệnh, trồng giống kháng rầy, luân canh… Một số cơ quan nghiên cứu nhƣ Viện Bảo vệ Thực vật và Trƣờng đại học Nông nghiệp Hà Nội đã hoàn thiện quy trình chẩn đoán dựa trên kháng 3
  15. LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP Lại Phương Liên – K20 Di truyền học huyết thanh, RT-PCR và đã sản xuất đƣợc kháng huyết thanh cho virus vàng lùn và lùn xoăn lá, đã thiết kế các cặp mồi đặc hiệu cho phản ứng PCR phát hiện RGSV, RRSV, RBSDV, RSV, RTSV, SRBSDV [8, 13]. Các nghiên cứu về quan hệ giữa virus vàng lùn và lùn xoăn lá với rầy nâu, các loại rầy (rầy nâu, rầy nâu nhỏ và rầy lƣng trắng) và biện pháp phòng trừ môi giới truyền bệnh và bệnh virus hại lúa cũng đã đƣợc nghiên cứu khá đầy đủ và bài bản tại Viện Bảo vệ thực vật [7]. Các nghiên cứu về virus hại lúa tại Viện Di truyền Nông Nghiệp và Viện Công nghệ Sinh học lại tập trung vào các nghiên cứu phân tử nhƣ giải trình tự gen, tạo giống chống chịu virus bằng Công nghệ gen. Hiện Viện Di truyền Nông Nghiệp đã đăng ký 14 trình tự gen của virus vàng lùn và lùn xoăn lá lúa ở ngân hàng gen NCBI, đã xác định đƣợc các gen quan trọng và các đoạn trình tự bảo thủ của các gen virus (không trùng lặp với trình tự gen của cây chủ), đã thiết kế các vector RNAi mang gen có khả năng làm bất hoạt virus và đã nhận đƣợc một số cây chuyển gen [5, 11]. Gần đây, trong một hợp tác nghiên cứu với Trung tâm nghiên cứu Nông nghiệp quốc gia Nhật Bản, Viện Di truyền Nông Nghiệp đã sản suất đƣợc 7 bộ kit chẩn đoán 7 virus lúa dựa trên kháng huyết thanh bao gồm: RGSV, RRSV, RBSDV, RSV, RTSV, RTBV, RDV và RGDV với số lƣợng đủ cho nghiên cứu, hợp tác và chẩn đoán [5]. Các tiến bộ trong nghiên cứu virus hại lúa ở Việt Nam trong thời gian qua là đáng ghi nhận nhƣng vẫn chƣa thể đáp ứng đƣợc với diễn biến phức tạp của dịch virus hiện nay. Vì vậy, chiến lƣợc nghiên cứu bệnh virus hại lúa trong giai đoạn hiện nay cần phải có sự kết hợp hài hòa giữa nghiên cứu đối ứng và nghiên cứu dài hạn. Nghiên cứu đối ứng tập trung vào khâu chỉ đạo sản suất và phát hiện nhanh tác nhân gây bệnh từ đó xây dựng các biện pháp phòng trừ hiệu quả, trong khi nghiên cứu dài hạn tập trung vào khâu xác định bản chất hệ gen, mức độ đa dạng di truyền, tính độc và mức độ đột biến để xác định danh tính tác nhân gây bệnh, hoàn thiện các quy trình chẩn đoán chính xác, nguy cơ phát sinh chủng mới và tiến tới các biện pháp phòng trừ hiệu quả tác nhân gây bệnh dựa trên công nghệ gen. 4
  16. LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP Lại Phương Liên – K20 Di truyền học 1.2. BỆNH LÙN SỌC ĐEN PHƢƠNG NAM VÀ VIRUS SRBSDV 1.2.1. Giới thiệu chung về bệnh lùn sọc đen phƣơng Nam 1.2.1.1. Nguồn gốc phát sinh bệnh lùn sọc đen phương Nam. Từ năm 2001, một bệnh lúa lùn mới đã xuất hiện trên lúa (Oryza sativa) tại một số vùng thuộc tỉnh Quảng Đông và Hải Nam, phía Nam Trung Quốc. Cây lúa nhiễm bệnh thấp lùn, lá xanh đậm, ở mặt sau lá và các đốt thân xuất hiện các nốt sần nhỏ. Ban đầu, virus gây bệnh chỉ đƣợc coi nhƣ là một biến chủng của virus lùn sọc đen. Mãi tới gần đây, dựa vào các kết quả nghiên cứu về môi giới truyền bệnh, cấu trúc và bản chất hệ gen virus, các nhà khoa học Trung Quốc đã kết luận nguyên nhân gây bệnh là do 1 chủng virus mới với tên gọi virus lúa lùn sọc đen phƣơng Nam. Nhóm virus mới có môi giới truyền bệnh riêng biệt là rầy lƣng trắng – một đặc điểm quan trọng và khá đặc trƣng cho các thành viên trong nhóm Fijivirus. Hình dạng, kích thƣớc và cấu trúc đặc trƣng của các tiểu thể virus dƣới kính hiển vi điện tử có những đặc điểm rất đặc trƣng. Toàn bộ trình tự gen của 2 biến chủng (Quảng Đông và Hải Nam) đã đƣợc xác định. Các tính chất đặc trƣng ở mức phân tử cho thấy trình tự gen cũng nhƣ trình tự axit amin của 2 biến chủng này có độ tƣơng đồng cao hơn hẳn so với sự sai khác giữa các biến chủng của các thành viên khác trong nhóm Fijivirus và nằm trong khoảng sai khác khi so sánh giữa các chủng với nhau. Mặt khác, những khác biệt này lại gần gũi hơn với Rice black streaked dwarf virus (RBSDV), Maize rough dwarf virus (MRDV) và Mal de Rio Cuarto virus (MRCV) – các thành viên trong phân nhóm Fijivirus-2 của nhóm Fijivirus, so với các thành viên thuộc các phân nhóm khác. Do đó, có thể nói chính xác hơn rằng SRBSDV là 1 thành viên mới thuộc nhân nhóm 2 – cùng với RBSDV, MRCV, MRDV, trong nhóm Fijivius, họ Reoviridae. Việc đặt tên là lùn sọc đen phƣơng Nam là do nhóm virus này có sự tƣơng đồng về triệu chứng bệnh trên cây nhiễm, song virus lùn sọc đen tập trung chủ yếu ở phía Bắc Bán cầu trong khi virus SRBSDV mới chỉ ghi nhận ở các tỉnh phía Nam Trung Quốc [25,24,18]. Ngoài lúa và ngô, virus SRBSDV cũng đƣợc xác định có thể nhiễm tƣ̣ nhiên trên 3 loài cỏ dại là cỏ 5
  17. LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP Lại Phương Liên – K20 Di truyền học lồ ng vƣ̣c (Echinochloa crusgalli), cỏ đuôi voi (Pennisetum flaccidum) và Juncellus serotinus có mặt trong hoặc xung quanh ruộng lúa nhiễm bệnh [7,42,22]. 1.2.1.2. Diễn biến bệnh lúa lùn sọc đen tại Việt Nam Vào cuối tháng 8/2009, tại Nghệ An, mô ̣t bê ̣nh la ̣ (bê ̣nh lùn lu ̣i ) đã xuấ t hiê ̣n trên diê ̣n rô ̣ng trên lú a mùa với tổ ng diê ̣n tích nhiễm bê ̣nh lên tới 5.506 ha, trong đó gần 3.510 ha bị mất trắng. Cây bê ̣nh bi ̣lùn ma ̣nh , lá xanh đậm , nhiề u lá bi ̣xoắ n vă ̣n , sau biế n vàng, trỗ không thoát . Triê ̣u chƣ́ng cây bê ̣nh khá giố ng với bê ̣nh lùn xoắ n lá tại miền Nam . Tấ t cả các giố ng gieo trồ ng ta ̣i Nghê ̣ An (TH3-3, Nhị ƣu 838, Bio404, Bắc thơm số 7, Khang dân 18 và Hƣơng thơm ) đều bị nhiễm bệnh [9]. Cho tới giƣ̃a tháng 9, mô ̣t số điạ phƣơng ta ̣i miề n Bắ c nhƣ Nam Đinh ̣ , Thái Bì nh cũng thông báo dịch bệnh tƣơng tự [2]. Báo cáo tại cuộc họp do bô ̣ Nông Nghi ệp và Phát Triển Nông Thôn (NN&PTNT) chủ trì ngày 23/9 cho biết từ ngày 16-19/9, Cục Bảo Vệ Thực Vật (BVTV) đã kiểm tra và lấy mẫu tại một số tỉnh ở miền Bắc. Cục đã phát hiện 5 tỉnh có diện tích lúa nhiễm bệnh gồ m Ngh ệ An, Thanh Hóa, Nam Định, Thái Bình và Ninh Bình với trên 13 nghìn ha lúa nhiễm bệnh, trong đó hơn 8 nghìn ha bị bệnh rất nặng, có khả năng mất trắng [3]. Để làm rõ nguyên nhân gây bê ̣nh t ại Nghệ An, đặc biệt khi bệnh đang đƣợc liên tu ̣c báo cáo xuấ t hiê ̣n ta ̣i nhiề u tin ̉ h miề n Bắ c , ngày 4/9/2009, Bộ NN &PTNT đã tổ chƣ́c hô ̣i thảo khẩ n cấ p về nguyên nhân gây bê ̣nh ta ̣i Nghê ̣ An do đích thân Bô ̣ trƣởng Cao Đƣ́c Phát chủ trì với sƣ̣ tham gia của các chuyên gia đầ u ngành cả nƣớc và Tiến sĩ Rogelio , chuyên gia về bê ̣nh virus lúa của Viê ̣n nghiên c ứu lúa quố c tế (IRRI). Dƣ̣a chủ yế u vào triê ̣u chƣ́ng quan sát bê ̣nh trên thƣ̣c điạ và ý kiế n chuyên gia , hô ̣i nghi ̣ kế t luâ ̣n bê ̣nh lúa lùn lu ̣i ta ̣i Nghê ̣ An là do 2 virus gây bê ̣nh vàng lùn / lùn xoắn lá giố ng nhƣ ở miề n Nam với vector truyề n bê ̣nh là rầ y nâu . Các kế t quảxét nghi ệm ELISA trên các mẫu rầ y nâu thu thâ ̣p đƣơ ̣c thƣ̉ nghiê ̣m ta ̣i IRRI và Trung tâm BVTV phía Nam, Bô ̣ NN &PTNT và Cục BVTV v ẫn kế t luâ ̣n nguyên nhân gây bê ̣nh lúa lùn lụi ở miền Bắc là do 2 virus vàng lùn và lùn xoắn lá và do rầ y nâu lan truyề n [4]. 6
  18. LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP Lại Phương Liên – K20 Di truyền học Trong tháng 9, 10 năm 2009, các hoạt động nghiên cứu nhằm xác đin h tác nhân gây bê ̣nh đã đƣơ ̣c thƣ̣c hiê ̣n tić h cƣ̣c ta ̣i các cơ quan nhƣ Viê ̣n BVTV , Cục BVTV , Trƣờng ĐHNN Hà Nô ̣i và Viê ̣n Nghiên c ứu lúa quố c tế (IRRI). Kết quả nghiên cứu đã xác định tác nhân gây bê ̣nh lùn l ụi lúa tại Nghệ An và các tỉnh phía bắc trong vụ mùa 2009 là do SRBSDV [9]. Ngay sau khi tác nhân gây bệnh đƣợc xác định, Bộ NN&PTNT đã thành lập ban chỉ đạo phòng chống dịch lùn sọc đen do thứ trƣởng Bùi Bá Bổng làm trƣởng ban chỉ đạo. Trong vụ mùa 2010, cũng theo thông báo của Cục BVTV, tính đến tháng 10, bệnh lùn sọc đen cũng vẫn phát sinh gây hại tại 28 tỉnh/thành tổng diện tích bị nhiễm tính từ đầu vụ là 24.000 ha, trong đó diện tích phải nhổ tỉa là 9.000 ha và phải tiêu hủy là 1.700 ha. Các tỉnh có xuất hiện bệnh lùn sọc đen bao gồm: + Bắc Bộ (19 tỉnh): Bắc Kạn, Lào Cai, Yên Bái, Lai Châu, Lạng Sơn, Sơn La, Bắc Giang, Hải Dƣơng, Điện Biên, Thái Bình, Ninh Bình, Bắc Ninh; Hải Phòng, Hòa Bình, Nam Định, Quảng Ninh, Hƣng Yên, Cao Bằng và Hà Nam. + Bắc Trung Bộ (6 tỉnh): Nghệ An, Thừa Thiên Huế, Quảng Bình, Quảng Trị, Hà Tĩnh và Thanh Hóa. + Duyên Hải Nam Trung Bộ (3 tỉnh): Quảng Nam, Quảng Ngãi và Đà Nẵng. Đến năm 2013, bệnh lùn sọc đen đã tạm thời lắng xuống, chỉ còn rải rác ở một vài tỉnh thành. Tuy nhiên, bệnh vẫn chƣa đƣợc phòng trị hoàn toàn, có nhiều khả năng tái bùng phát thành dịch. 1.2.2. Đặc điểm bệnh học của bệnh lùn sọc đen phƣơng Nam 1.2.2.1.Dấu hiệu nhận biết Biểu hiện bệnh của cây lúa nhiễm virus SRBSDV rất giống với biểu hiện của bệnh lùn sọc đen do virus RBSDV gây ra. Triệu chứng chung của lúa nhiễm bệnh bao gồm: cây lúa tƣơng đối thấp lùn, lá xanh đậm, lá bị xoăn ở đầu lá hoặc toàn bộ lá, rách mép lá và đặc biệt có những u sáp màu trắng đến đen chạy dọc các đƣờng gân ở mặt sau lá, bẹ lá hoặc các đốt thân. Các u sáp này đƣợc hình thành do sự phát triển vƣợt trội 7
  19. LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP Lại Phương Liên – K20 Di truyền học cả về số lƣợng và kích thƣớc của mô mạch dẫn nhựa. Khi cây còn non gân chính trên bẹ lá cũng bị sƣng phồng. Từ giai đoạn làm đòng và khi có lóng, cây bị bệnh thƣờng nảy chồi trên đốt thân và mọc nhiều rễ bất định. Trên bẹ và lóng thân xuất hiện nhiều u sáp và sọc đen (rất dễ nhận thấy u sáp khi dùng tay vuốt nhẹ thân). Cây lúa bị bệnh nặng không trổ bông đƣợc hoặc trổ bông không thoát, hạt thƣờng bị đen [11] (Hình 1). Hình 1: Cây lúa bị nhiễm bệnh lùn sọc đen phƣơng Nam[11] 1.2.2.2. Vector truyền bệnh Vector chính truyền bệnh lùn sọc đen phƣơng nam là rầy lƣng trắng (Sogatella furcifera). Cả rầy non và rầy trƣởng thành đều có khả năng truyền bệnh. Rầy lƣng trắng sau khi đã chích hút nhựa cây bị bệnh mang virus có thể truyền virus gây bệnh đến khi chết. Một nghiên cứu về phƣơng thức lan truyền bệnh lùn sọc đen phƣơng nam ở lúa đã đƣợc tiến hành nhằm đánh giá khả năng lan truyề n virus SRBSDV qua vector đã đƣợc thực hiện trên 3 loài rầy là rầy lƣng trắ ng (Sogatella furcifera), rầ y nâu (Nilaparavata lugenes) và rầy nâu nhỏ (Laodelphax striatellus). Kế t quả cho thấ y cả rầ y lƣng trắ ng và rầ y nâu nhỏ đề u có khả năng truyề n SRBSDV tƣ̀ lúa sang lúa với hiê ̣u quả truyề n rấ t cao (100 % cây nhiễm bê ̣nh với chỉ 3 – 4 rầ y/cây). Tuy nhiên, chỉ 8
  20. LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP Lại Phương Liên – K20 Di truyền học có rầy lƣng trắng (Hình 2) mới có khả năng truyề n SRBSDV tƣ̀ lúa sang ngô . Nghiên cƣ́u này cũng cho thấ y rầ y nâu không thể truyề n đƣơ ̣c SRBSDV [36,38,39]. Rầy cánh dài Rầy cánh ngắn Hình 2: Rầy lƣng trắng Sogatella furcifera truyền virus SRBSDV[11] Rầy lƣng trắng gây hại cùng với rầy nâu nhỏ, nhƣng trong cùng một lứa thì rầy lƣng trắng phát sinh rộ sớm hơn. Rầy lƣng trắng thƣờng có mật độ cao, gây hại nặng vào giai đoạn lúa làm đòng. Cũng nhƣ rầy nâu, rầy lƣng trắng thích hợp với điều kiện khí hậu ấm nóng, ẩm độ cao, mƣa nắng xen kẽ. Ở vùng Đồng bằng sông Hồng, một năm có 6-7 lứa rầy, quan trọng nhất là lứa rầy vào tháng 4 (vụ xuân) và cuối tháng 8 đầu tháng 9 (vụ mùa). Vụ xuân thƣờng gây hại nặng hơn vụ mùa. Rầy lƣng trắng hại nặng trên các giống lúa nhiễm rầy, lúa lai; nếu thâm canh cao, bón nhiều đạm, ruộng lúa cấy dày, rậm rạp là điều kiện cho rầy lƣng trắng phát sinh, phát triển. Rầy lƣng trắng phân bố rộng rãi trên khắp các vùng trồng lúa của Việt Nam và trên thế giới, có khả năng du nhập và di chuyển rất cao [7]. Một nghiên cứu về đặc tính lây truyền SRBSDV của rầy lƣng trắng Sogatella furcifera đã đƣợc các nhà khoa học Trung Quốc thực hiện nhằm xác định các giai đoạn phát triển của bệnh cũng nhƣ tìm phƣơng pháp kiểm soát bệnh hiệu quả nhất. Bằng phƣơng pháp RT-PCR, các nhà khoa học đã xác định đƣợc sự có mặt của virus SRBSDV trong tất cả các giai đoạn phát triển khác nhau của S. furcifera, bao gồm cả giai đoạn ấu trùng, rầy cánh dài và rầy cánh ngắn S. furcifera khi đã nhiễm virus SRBSDV sẽ có khả năng truyền virus cho cây lúa trong suốt vòng đời còn lại. Tuy nhiên, virus SRBSDV không truyền qua giai đoạn trứng. Mỗi cá thể rầy S. furcifera mang virus SRBSDV trung bình có thể lây nhiễm cho 48-50 cây lúa, tối đa là 87-90 cây lúa. Thời gian tối thiểu và tối đa để rầy nâu lƣng trắng truyền virus cho cây lúa non 9

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

 

Đồng bộ tài khoản