Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu định lượng Paraquat trong mẫu huyết tương người bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

Chia sẻ: Na Na | Ngày: | Loại File: DOCX | Số trang:65

Thêm vào BST

Báo xấu

119
lượt xem 26
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận văn được thực hiện với hai mục tiêu: Nghiên cứu xây dựng quy trình chiết tách Paraquat trong huyết tương người và phân tích bằng HPLC để định lượng paraquat; xác định giá trị sử dụng của phương pháp và áp dụng định lượng paraquat trong huyết tương bệnh nhân ngộ độc paraquat tại Trung tâm chống độc bệnh viện Bạch Mai, Hà Nội.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu định lượng Paraquat trong mẫu huyết tương người bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ======= VŨ ANH PHƯƠNG NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG PARAQUAT TRONG MẪU HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Chuyên ngành: Hóa phân tích Mã số: 60440118 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. TẠ THỊ THẢO 2. TS. HÀ TRẦN HƯNG HÀ NỘI 2015 LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên cho tôi gửi lời cảm ơn sâu sắc tới PGS.TS Tạ Thị Thảo và TS. Hà Trần Hưng đã tận tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài và viết luận văn. Tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới ban lãnh đạo và toàn thể nhân viên Trung tâm Chống Độc – Bệnh viện Bạch Mai đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi được học tập và nghiên cứu. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy cô giáo giảng dạy tại khoa Hoá, đặc biệt là các thầy cô trong bộ môn Hoá Phân tích, đã cho tôi những kiến thức quý giá trong quá trình học tập và thực hiện đề tài này. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn các anh chị, bạn bè của tập thể lớp cao học hoá K24, đặc biệt là những người bạn trong nhóm hoá phân tích K24 đã giúp đỡ, chia sẻ những khó khăn trong suốt quá trình tôi học tập và thực hiện đề tài này. Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và bạn bè đã luôn động viên, chia sẻ mọi khó khăn cùng tôi. Hà Nội, ngày 01 tháng 10 năm 2015 Học viên Vũ Anh Phương
MỤC LỤC
DANH SACH BANG BIÊU ́ ̉ ̉
DANH SACH HINH ́ ̀ Chương 1. DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Tên viết tắt Tên tiếng anh Tên Tiếng việt % RSD % Relative standard deviation % Độ lệch chuẩn tương đối % Độ lệch chuẩn tái lặp % RSDR % Reproducibility standard deviation tương đối ACN Acetonitrile Acetonitril AS Asymmetry factor Hệ số đối xứng pic ATP Adenosin Triphophate Adenosin Triphophat BN Patient Bệnh nhân DAD diodearray detector detector mảng diode DQ Diquat Diquat EPQ Ethylparaquat Ethylparaquat Gas chromatography Mass GC MS Sắc ký khí khối phổ spectroscopy HP Hemoperfusion Lọc máu hấp phụ High performance liquid HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao Chromatography Liquid Chromatography Mass LC MS Sắc ký lỏng khối phổ Spectroscopy LOD Limit of Detection Giới hạn phát hiện LOQ Limit of Quantification Giới hạn định lượng MeOH Methanol Methanol ppm Parts per million Phần triệu PQ Paraquat Paraquat R Relative coefficient Hệ số tương quan ROC Receiver operating characteristics Đường cong ROC RPHPLC Reverse phaseHPLC Sắc ký lỏng pha đảo SD Standard deviation Độ lệch chuẩn Chỉ số độ nặng của ngộ độc SIPP Severity Index of Paraquat Poisoning Paraquat TCA Trichloroacetic acid Acid Tricloacetic tR Retention time Thời gian lưu UVVIS UltravioletVisible Tử ngoại và khả kiến
ĐẶT VẤN ĐỀ ́ ́ ̉ paraquaternary bipyridyl) la môt thuôc diêt co Paraquat (viêt tăt cua ̀ ̣ ́ ̣ ̉ gia thành re, ́ ̉ hiệu quả ̣ ̉ ̣ ́ , ít ảnh hưởng tới môi trường do đó hiện đang được sử dụng rộng rãi ở diêt co dai nhanh chong Việt Nam với nhiều tên thương mại khác nhau. Tuy nhiên, paraquat (PQ) lại la môt chât hoa hoc ̀ ̣ ́ ́ ̣ ̣ ới ngươi. Li vô cung đôc v ̀ ̀ ều tử vong của PQ ước tính là khoảng 10 ml dung dịch 20%. Tai nhi ̣ ều nước phát triển, PQ đa bi câm s ̃ ̣ ́ ử dung nh ̣ ưng ở Viêt Nam viêc thi ̣ ̣ ếu các chính sách và biện pháp quan̉ ́ ử dung hoa chât nay nên trong nh ly s ̣ ́ ́ ̀ ững năm vừa qua co rât nhiêu tr ́ ́ ̀ ương h ̀ ợp ngô đôc ̣ ̣ PQ đên c ́ ấp cứu [1]. Trên thế giới, nhiêu ca t ̀ ử vong do ngộ đôc PQ đa đ ̣ ̃ ược bao cao [10][19][27]. T ́ ́ ại Trung tâm Chống độc bệnh viện Bạch Mai, trong những năm gần đây, số lượng bệnh nhân ngộ độc PQ không ngừng gia tăng và trở thành một vấn nạn vô cùng nghiêm trọng, vượt ngưỡng 300 ca trong năm 2013 và năm 2014 lên tới 391 ca. Ti lê t ̉ ̣ ử vong do ngô đôc PQ rât cao, th ̣ ̣ ́ ường khoảng 7080% theo nhiêù nghiên cứu cua cac tac gia n ̉ ́ ́ ̉ ươc ngoai [29][32]. Tai Trung tâm ch ́ ̀ ̣ ống độc (TTCĐ) bênh viên Bach ̣ ̣ ̣ ̉ ̣ ử vong năm 2007 la 72,5% [ Mai, ti lê t ̀ 4], năm 2011 là 72,9% [2], nghiên cứu tai bênh viên Ch ̣ ̣ ̣ ợ Râỹ thành phố Hồ Chí Minh la 85%. ̀ Trong chẩn đoán và điều trị ngộ độc cấp PQ, xét nghiệm định lượng PQ trong huyết tương đóng vai trò đặc biệt quan trọng, giúp xác định mức độ nặng của ngộ độc, tiên lượng bệnh nhân cũng như đánh giá hiệu quả của các biện pháp điều trị, đặc biệt là lọc máu hấp phụ. Tỷ lệ tử vong do ngộ độc cấp PQ rất cao vì thiếu các biện pháp điều trị hiệu quả. Gần đây, các nghiên cứu của nhiều tác giả nước ngoài và một số tác giả Việt Nam cho thấy các kĩ thuật lọc máu mới, nhất là lọc máu hấp phụ bằng cột than hoạt hoặc cột resin nhằm tăng cường đào thải PQ cho kết quả khả quan, cứu sống một số không nhỏ bệnh nhân ngộ độc cấp PQ. Xét nghiệm định lượng nồng độ PQ huyết tương cung cấp công cụ quan trọng để đánh giá hiệu quả của các biện pháp điều trị tăng thải trừ này. Tuy nhiên, cho đến nay tại Việt Nam việc xét nghiệm PQ chỉ dừng ở mức độ định tính trong nước tiểu bằng phương pháp so màu để xác định bệnh nhân ngộ độc PQ mà chưa có cơ sở xét nghiệm nào có thể thực hiện việc định lượng nồng độ PQ máu với kết quả đáng tin cậy. Điều này dẫn đến một khoảng trống lớn trong chẩn đoán, tiên lượng cũng như đánh giá hiệu quả của các biện pháp lọc máu làm cho việc điều trị ngộ độc PQ tại Trung tâm Chống độc và các khoa hồi sức cấp cứu trên cả nước gặp rất nhiều khó khăn. Để định lượng PQ trong huyết tương trên thế giới đã áp dụng các phương pháp sắc ký khí khối phổ (GCMS), điện di mao quản (CE), sắc ký lỏng khối phổ (LCMS)... Tại Trung tâm chống độc bệnh viện Bạch Mai hiện đang sử dụng máy sắc ký lỏng hiệu năng cao để xét
nghiệm độc chất nhưng cũng chưa có quy trình chuẩn định lượng PQ huyết tương. Vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu định lượng Paraquat trong mẫu huyết tương người bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao” với hai mục tiêu: 1. Nghiên cứu xây dựng quy trình chiết tách Paraquat trong huyết tương người và phân tích bằng HPLC để định lượng paraquat. 2. Xác định giá trị sử dụng của phương pháp và áp dụng định lượng paraquat trong huyết tương bệnh nhân ngộ độc paraquat tại Trung tâm chống độc bệnh viện Bạch Mai, Hà Nội.
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Tông quan vê paraquat ̉ ̀ 1.1.1. Công thức paraquat Paraquat là từ viết tắt của paraquaternary bipyridyl, tên khoa học là 1,1'dimethyl4,4' bipyridilium là thuốc diệt cỏ phổ biến nh ất hi ện nay do đặc tính diệt cỏ nhanh và triệt để. PQ thuộc nhóm hợp chất amonium bậc 4 bipyridylium, đượ c tổng hợp đầu tiên vào năm 1882, ứng dụng trong nông nghiệp làm thuốc trừ cỏ từ những năm 1950 [42]. PQ có khối lượng phân tử tương đối 186,2 có công thức hóa học như hình 1.1: Hình 1.: Công thức hóa học của paraquat 1.1.2. Tính chất lý, hóa học của paraquat PQ thường có màu trắng hơi vàng, không mùi, tỷ trọng ở 20oC là 1,240 1,260, điểm chảy 175 180oC, điểm sôi khoảng 300oC và pH của dung dịch PQ trong nước 6,5 7,5. PQ thường ở dạng dimethylsulphate hoặc dichloride. Dạng dichloride tinh thể trắng, dạng dimethylsulphate chảy rữa. PQ ổn định trong dung dịch môi trường acid hoặc trung tính và không ổn định trong môi trường kiềm. PQ tan tốt trong nước (độ tan 700 g/l ở 20oC), ít tan trong cồn và hầu như không tan trong các dung môi hữu cơ khác. PQ bị phân hủy dưới ánh sáng UV, bị bất hoạt bởi các tác nhân hoạt động bề mặt anionic và bởi đất sét, bị mất hoạt tính nhanh khi tiếp xúc với đất. PQ không bay hơi. Dung dịch PQ đặc ăn mòn thép, tấm thiếc, sắt mạ kẽm và nhôm [43]. PQ được sản xuất bởi nhiều công ty khác nhau vơi cac tên th ́ ́ ương mai và hàm l ̣ ượng khác nhau, nói chung thường đều ở dạng dung dịch màu xanh. Một số tên gọi thường gặp của PQ như: Gramoxone, Gfaxone, Hegaxone, Tungmaxone, Owen... [42]. Do độc tính gây tử vong rất cao nên hầu hết các nước phát triển đều đã cấm sử dụng PQ như là một loại hóa chất bảo vệ thực vật (Mỹ và các nước Châu Âu). Một số nước như Nhật Bản chỉ cho phép lưu hành PQ dạng dung dịch với hàm lượng thấp 4,5% sẽ giúp giảm thiểu
nguy cơ nếu bị ngộ độc. Thực tế hiện nay trên thế giới vẫn có gần 130 nước cho phép sử dụng PQ trong đó có Việt Nam [42]. Hiện ở Việt Nam thuốc từ cỏ PQ được lưu hành dạng dung dịch 20% do đó nguy cơ ngộ độc cấp tính rất lớn. Một điều đáng nói là công ty sản xuất PQ lớn nhất trên thế giới hiện nay là Syngenta hay còn gọi là Zeneca đặt nhà máy tại Trung Quốc và Anh. Trên đất nước họ đã cấm hoàn toàn PQ, hoạt động kinh doanh chủ yếu xuất khẩu sang các nước thứ ba [39]. 1.1.3. Cơ chế gây độc của paraquat Cơ chế gấy độc của PQ được mô tả theo sơ đồ sau [37]: Hình 1.. Cơ chế gây độc của paraquat [15] Trong giai đoạn đầu của chu trình này, ion PQ2+ cùng với NADPH trải qua một phản ứng tạo ra ion paraquat bị khử (PQ+) và NADP+. PQ+ phản ứng hầu như ngay lập tức với oxy tái tạo lại PQ2+ và gốc superoxid. Có sẵn NADPH và oxy, chu trình oxy hoá khử của PQ xảy ra liên tục, với việc NADPH liên tục bị mất đi và không ngừng tạo ra gốc superoxid. Gốc tự do superoxid sau đó phản ứng với bản thân nó để tạo ra peroxid hydro (H 2O2), và với H2O2 cùng Fe để tạo thành gốc tự do hydroxyl [18] [31]. Cạn kiệt NADPH dẫn tới chết tế bào. Chu trình oxy hoá khử tạo thành gốc tự do hydroxyl dẫn tới nhiều cơ chế làm tổn thương tế bào: phản ứng với lipid trên màng tế bào (peroxide hoá lipid), DNA và các protein tối cần thiết cho tế bào sống sót cũng bị các gốc tự do hydroxyl phá hủy [12] [39] [40]. Hậu quả lên tế bào do việc hình thành các gốc tự do (superoxid và các gốc tự do khác) là đối tượng của rất nhiều nghiên cứu. Các thử nghiệm điều trị nhằm vào việc thay đổi các gốc tự do bằng các chất như desferioxamin, superoxid dismutase, αtocopherol và vitamin C cùng với bài
niệu cưỡng bức. Tuy nhiên, cho đến hiện nay không có chất nào trong số này được khuyến cáo dùng. Mặc dù chi tiết đầy đủ về độc chất học của các gốc tự do do PQ sinh ra vẫn chưa được biết nhưng những gì người ta đã biết về cơ sở để ngộ độc là sự tương tác giữa PQ, NADPH và oxy. Sau đó, ở mức độ tế bào, oxy là yếu tố tối cần thiết cho việc hình thành bệnh lý do PQ. Đây là cơ sở cho việc hạn chế cung cấp oxy trong việc điều trị ban đầu bệnh nhân ngộ độc PQ. PQ có tính ăn mòn và gây tổn thương giống như kiềm khi tiếp xúc với da, mắt và các niêm mạc. Các cơ quan đích chủ yếu trong ngộ độc toàn thân PQ là đường tiêu hoá, thận và phổi. Dạ dày, ruột bị tổn thương nặng nề do tác dụng ăn mòn trực tiếp khi bệnh nhân uống PQ có chủ ý với nồng độ cao. Thận là cơ quan đào thải PQ và DQ và có nồng độ bipyridyl cao hơn so với các cơ quan khác. Riêng ở phổi, PQ vào các phế bào týp I và II không phụ thuộc bậc thang nồng độ mà theo cơ chế vận chuyển tích cực phụ thuộc ATP. Do vậy PQ gây tổn thương hầu hết tất cả các cơ quan trong cơ thể vì đều có liên quan đến chuyển hóa và hô hấp tế bào, tuy nhiên tại các vị trí hấp phụ nhiều PQ hoặc liên quan đến thải trừ PQ thì tổn thương đến sớm hơn, nặng hơn và cũng là nguyên nhân hàng đầu gây tử vong như tổn thương phổi gây suy hô hấp, suy thận, viêm gan, loét niêm mạc đường tiêu hóa và biến chứng nhiễm trùng [6][13][37]. Viêc tiêp xuc v ̣ ́ ́ ơi ĺ ượng PQ it h ́ ơn se lam châm nguy c ̃ ̀ ̣ ơ tử vong do xơ phôi tiên triên va suy thân [33]. Môt sô nghiên c ̉ ́ ̉ ̀ ̣ ̣ ́ ứu gân đây còn cho thây ph ̀ ́ ơi nhiêm PQ co ̃ ́ liên quan với hôi ch ̣ ưng Parkinson [21][23]. ́ ̣ ̣ ́ ̉ Trong ngô đôc câp PQ, co thê tiên l ́ ượng bênh d ̣ ựa trên nông đô PQ trong huyêt t ̀ ̣ ́ ương. Môṭ ̣ ́ ương vượt qua 2 µg/ml thi hâu hêt t sô bao cao cho thây nông đô PQ huyêt t ́ ́ ́ ́ ̀ ̀ ̀ ́ ử vong, tuy nhiên môṭ ̀ ương h vai tr ̀ ợp bênh nhân vân hôi phuc khi nông đô trong mau cao h ̣ ̃ ̀ ̣ ̀ ̣ ́ ơn 2 µg/ml [7][10][22]. 1.1.4. Dược động học paraquat 1.1.4.1. Hấp thu Ở đường tiêu hoá PQ được hấp thu rất nhanh nhưng ít (510%). Hấp thu chủ yếu ở ruột non. Khi dạ dày ruột bị tổn thương lan rộng, số lượng chất độc được hấp thu sẽ tăng lên. PQ không gắn với protein huyết tương. Nồng độ đỉnh của PQ trong huyết tương đạt được trong vòng 2 giờ sau uống [6] [37]. Tiếp xúc qua da, hấp thu vào cơ thể nói chung chỉ xảy ra khi tiếp xúc kéo dài hoặc da bị tổn thương. Tiếp xúc với PQ qua đường hô hấp không làm cho lượng PQ được hấp thu đến mức đủ để gây nhiễm độc. Bởi vì kích thước các hạt chứa PQ lớn (hầu hết trên 100 m) làm cho PQ không đi sâu được xuống đường hô hấp để hấp thu [11]. Mắt tiếp xúc với PQ sẽ bị tổn thương, nhưng không đủ để gây nhiễm độc toàn thân.
1.1.4.2. Phân bố Sau khi uông, PQ phân b ́ ố nhanh chóng nhất tới tât ca cac c ́ ̉ ́ ơ quan chinh nh ́ ư phổi, thận, gan và cơ, đăc biêt la phôi, PQ se bi kh ̣ ̣ ̀ ̉ ̃ ̣ ử thanh dang gôc t ̀ ̣ ́ ự do hoat tinh cao [8][22]. Th ̣ ́ ể tích phân bố của PQ là 1,2 1,6 l/kg. PQ đạt được nồng độ cao và tồn tại lâu hơn trong phổi, nồng độ trong phổi có thể cao hơn so với nồng độ huyết tương gấp 50 lần. Sau uống 57 giờ, nồng độ PQ trong tổ chức phổi đạt cao nhất. Tuy nhiên, lượng PQ huyết tương cũng cần đạt đến một ngưỡng tới hạn để cho quá trình hấp thu ở phổi diễn ra [11]. PQ qua được nhau thai. Trong một nghiên cứu, nồng độ PQ trong dịch ối và máu dây rốn, bào thai cao hơn nồng độ trong máu mẹ 46 lần [11]. Không có bào thai nào sống sót. Tuy nhiên nếu mẹ ngộ độc PQ còn sống thì đến lần có thai sau không nguy hiểm đến bào thai. 1.1.4.3. Chuyển hoá, thải trừ PQ được đào thải hầu như hoàn toàn qua thận nhờ cả quá trình lọc của cầu thận và quá trình bài tiết tích cực của ống thận. Trong vòng 1224 giờ sau uống, trên 90% PQ được đào thải dưới dạng không đổi qua thận, nếu chức năng thận bình thường [11].Tuy nhiên có thể xét nghiệm thấy PQ trong nước tiểu vài ngày sau do có sự tái phân bố PQ từ các cơ quan. Thời gian bán thải của PQ có thể kéo dài 12120 giờ hoặc lâu hơn khi có suy thận. Ngoai ra PQ con đao thai ̀ ̀ ̀ ̉ qua phân dươi dang không đôi [8][22]. ́ ̣ ̉ 1.1.5. Tiên lượng bệnh nhân dựa vào nồng độ paraquat trong huyết tương. Tiên lượng bệnh nhân uống PQ có thể dựa vào nồng độ PQ huyết tương theo thời gian. Nồng độ PQ phải đo trước khi điều trị vì các biện pháp điều trị có thể làm giảm nồng độ PQ (dùng than hoạt, lọc máu hấp phụ…). Proudfoot và cộng sự [29] lần đầu tiên trình bày biểu đồ tiên lượng khả năng sống từ kết quả định lượng nồng độ PQ huyết tương tại nhiều thời điểm khác nhau trên 79 bệnh nhân. Những BN sống có nồng độ dưới 2,0; 0,6; 0,3; 0,16 và 0,1 mg/ l tương ứng ở 4, 6, 10, 16, và 24 giờ sau uống PQ . Schermann và cộng sự [35] mở rộng đường cong tiên lượng BN này lên đến ngày thứ 7 sau nhiễm độc, và nghiên cứu này cho thấy những BN nồng độ PQ huyết tương trên 10 mg/l (định lượng trong vòng 8 giờ), thường chết vì sốc tim trong 24h, trong khi những BN có nồng độ thấp hơn (nhưng vẫn trên đường tiên lượng), chết vì xơ phổi và suy hô hấp muộn hơn 24 giờ sau uống. Suzuki và cộng sự (1991) [36] đã kết hợp dữ liệu của Proudfoot (1979), Bismuth (1982), Scherrmann (1987), Sawada (1988) và thêm một nhóm 78 BN, kết luận rằng đồ thị tiên lượng chính xác 101 trong 102 trường hợp tử vong và 61 trong 63 BN sống được đánh giá trong vòng 24 h sau uống PQ. Mặc dù đồ thị khá chính xác, giúp xác định mức độ nặng và tiên lượng tử vong nếu định lượng được PQ ngay lập tức, đồ thị này cũng
đôi khi tiên đoán sai. Nguyên nhân do ước tính thời gian từ khi uống PQ dễ sai, đặc biệt trong vài giờ đầu tiên nồng độ PQ huyết tương giảm nhanh sai số về thời gian thậm chí 0,5 đến 1h có thể thay đổi hoàn toàn mối quan hệ nồng độ và tiên lượng. Ngoài ra, nồng độ PQ trong huyết tương có thể không hoàn toàn chính xác vì được phân tích bằng một số phương pháp khác nhau và các nghiên cứu thường không trình bày rõ nồng độ của ion hay là muối PQ, và thực tế có thể có khác biệt giữa các bệnh nhân về mức độ nhạy cảm với tác dụng độc của PQ, tuy khác biệt này chưa được nghiên cứu. Hình 1.: Biểu đồ liên quan giữa nồng độ Paraquat huyết tương (µg/ml), thời gian sau uống, và khả năng sống. Năm 1988 Sawada và cộng sự [34] báo cáo chỉ số tiên lượng ngộ độc PQ dựa trên nghiên cứu nồng độ PQ huyết thanh ở 30 bệnh nhân, 20 tử vong và 10 BN sống. Chỉ số độ nặng của ngộ độc PQ (SIPP: severity index of PQ poisoning) tính bằng thời gian từ khi uống (giờ) cho đến khi bắt đầu điều trị nhân với nồng độ PQ huyết thanh (µg/ml) khi vào viện. SIPP = [nồng độ PQ huyết thanh (µg/ml)] × [thời gian từ uống đến bắt đầu điều trị (h)] Khi điểm SIPP ít hơn 10, bệnh nhân có thể sống sót; điểm 50 phân biệt tử vong muộn do suy hô hấp (10 < SIPP 50). Mặc dù đây là nghiên cứu quan trọng, Sawada xét nghiệm định lượ ng dùng huyết thanh không phải huyết tươ ng. Suzuki và cộng sự (1991) đã so sánh SIPP với đồ thị tiên lượ ng sống trên 167 BN nhập viện trong vòng 24 h sau uống PQ. Các kết cục của BN dự đoán theo đồ thị của Proudfoot đã sai ở 1 trường hợp tử vong và 2 BN sống; trong khi đó, SIPP sai ở 1 BN sống và 10 trườ ng hợp tử vong. Những khác biệt này có ý nghĩa thống kê, và tác giả kết luận rằng dựa trên
nồng độ PQ trong 24 h đầu sau uống, đồ thị của Proudfoot tiên lượ ng chính xác hơn SIPP [36]. 1.2. Các phương pháp xác định paraquat trong huyết tương 1.2.1. Phương pháp quang phô ̉ Rai M.K và cộng sự [30] định lượng PQ sử dụng NaBH4 để khử PQ trong môi trường kiềm tạo ra dung dịch màu xanh hấp thụ cực đại ở bước sóng 600nm trong khi Kato K. và cộng sự [20] lại dùng Tetrabromophenolphthalein Ethyl Ester (TBPE) phản ứng với PQ để tạo ra dung dịch hữu cơ PQTBPE màu xanh da trời, có thể chiết được bằng dichloromethane. Changbin Li và cộng sự [24] đã định lượng PQ trong huyết tương dựa bằng đo quang phổ của dẫn xuất khi phản ứng với Na2S2O4 10% và NaOH 5M. Ưu điểm của phương pháp khử PQ bằng NaBH4 là độ nhạy cao, với các điều kiện khử PQ là nhiệt độ 3540°C, pH 1011 thì màu có độ ổn định lên đến 12h và không cần đệm để ổn định màu, khoảng nồng độ 0,05 0,5 µg/ml tuân theo định luật Lambert – Beer, trong khi giới hạn phát hiện là 0,03 µg/ml. Trong khi đó, phương pháp sử dụng TBPE thì mẫu được phép để tối đa trong 20 phút. Cả 2 phương pháp này đều đề cập đến DQ, trong khi Rai M.K [30] loại bỏ DQ thì Kato K. [20] lại định lượng đồng thời cả PQ và DQ. Phương pháp định lượng PQ bằng NaBH4 đã loại được sự ảnh hưởng của các thuốc trừ sâu thông thường và các ion kim loại khác. DQ, có cấu trúc gần giống PQ, sẽ gây ảnh hưởng khi định lượng PQ. Tuy nhiên DQ, nếu có, sẽ bị loại khi thêm NaOH 0,2 N, trong khi PQ không bị mất đi. Các ion kim loại như Fe3+ và Al3+, có thể ảnh hưởng do làm kết tủa hydroxide, sẽ bị loại đi khi thêm 1 ml Natri EDTA 5% trước khi thêm dung dịch NaOH [30]. Còn theo Kato K [20], DQ cũng có thể chiết được với TBPE trong dichloromethane cũng giống như PQ nhưng PQTBPE có quang phổ hấp thụ hơi khác với DQTBPE. Đo độ hấp phụ của PQ ở bước sóng 603 nm & DQ ở bước sóng 608 nm với dãy nồng độ (4,5 45,0)×107 M. Giới hạn phát hiện 4,77.107 M. Phương pháp định lượng PQ bằng NaBH 4 đã được ứng dụng để định lượng PQ trong mẫu bệnh phẩm bệnh nhân như máu, nước tiểu, sữa mẹ cũng như các mẫu thực phẩm và các mẫu trong môi trường. Với phương pháp đo quang phổ thông thường, không phát hiện được PQ tại bước sóng 257 nm. Nên Changbin Li và cộng sự [24] đã định lượng nồng độ PQ trong huyết tương dựa trên việc đo quang phổ dẫn xuất thứ 2 (tuân theo định luật Lambert Beer với r = 0,996). Dung dịch nước chuẩn PQ 10 μg/ml được quét bước sóng từ 200 đến 300 nm, với mẫu trắng là nước cất. Huyết tương sạch và các dung dịch huyết tương chuẩn PQ 50 và 10 μg/ml được thêm TCA 20% (tỉ lệ 6:1, v/v). Lắc xoáy, ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút. Lấy dịch trong phần trên đi đo quét
bước sóng từ 200 đến 300 nm. Sau khi xử lý mẫu như trên, dịch trong phần trên được chuyển vào ống Eppendorf mới, bảo quản tránh ánh sáng. Trước khi đo, 400 μl mẫu được lắc trộn nhẹ nhàng và hoàn toàn với 100 μl hỗn hợp đồng thể tích Na2S2O4 10% và NaOH 5M. Làm tương tự với mẫu huyết tương trắng đối chiếu và đo độ hấp thụ quang trong khoảng bước sóng từ 300 đến 500 nm (khoảng bước sóng Δλ = 0,5 nm). Từ đó dẫn xuất thứ 2 này có thể được tính toán theo công thức Δ2Abs/(Δλ)2 (khoảng bước sóng dẫn xuất Δλ=4 nm) [24]. 1.2.2. Phương pháp sắc ký khí khối phổ Phương pháp GCMS là phương pháp đơn giản có độ nhạy và độ tin cậy cao, từ lâu đã được sử dụng để định lượng PQ trong dịch sinh học. L. Gao [16] và Almeida R. M. [5] cùng sử dụng phương pháp GCMS để định lượng PQ. Trong cả hai nghiên cứu, các tác giả đã sử dụng hệ thống chọn lọc ion (selected ion monitoring – SIM) để nhận biết PQ, đồng thời cũng thêm EPQ làm chất nội chuẩn, khí He được dùng như là khí mang để đưa chất phân tích vào cột. Dung dịch mẫu phân tích đều được khử bằng NaBH4 trước khi đem phân tích trên hệ sắc ký khí. Tuy nhiên mỗi tác giả lại nghiên cứu các quy trình phân tích khác nhau. Tác giả L. Gao và cộng sự [16] lại sử dụng cột mao quản (10 m 0,18 mm, độ dày màng 0,25 µm). Nhiệt độ của bơm tiêm, interface và nguồn ion lần lượt là 280, 280, 200 oC. Khí mang được bơm đẳng dòng với tốc độ là 1,01 ml/phút. Mẫu được đưa vào bằng chế độ tiêm chia dòng (10:1) và nhiệt độ giải hấp phụ lúc đầu là 70 oC trong 1 phút và tăng đến 295oC với tốc độ 25oC/phút. Nhiệt độ 295oC được duy trì trong 10 phút. Trong đó các mảnh ion 196 và 224 được dùng để định lượng PQ & EPQ. Độ thu hồi của mẫu máu và nước tiểu lần lượt là 94,00 99,85% và 95,00 100,34%, khoảng tuyến tính 0,1 50 µg/m l. Giới hạn phát hiện (S/N = 3) là 0,01 µg/ml đối với cả máu và nước tiểu. Phương pháp này đã được áp dụng để phân tích các mẫu sinh học thu được từ các nạn nhân chết do uống PQ. Trong khi đó, Almeida R. M. và cộng sự [5] sử dụng trên hệ máy sắc ký GCMS (Gas chromatograph model 6890 và Mass selective detector MSD model 5972) với cột mao quản fused silica HP5MS (30 m × 0,25 mm, độ dày màng phim 0,1 µm) và chế độ đẳng dòng với tốc độ 0,6 ml/phút. Nhiệt độ của bơm và interface (bộ phận ghép nối giữa GC và MS) là 270 oC. Bơm hoạt động ở chế độ chia dòng. Nhiệt độ cột duy trì 80oC trong 1 phút, tăng nhiệt 10oC/phút đến 200oC và 20oC/phút đến 270oC và duy trì 270oC trong 4 phút. Số khối của các mảnh ion được chọn cho các hợp chất là: m/z 108, 135, 190 (DQ); m/z 134, 148, 192 (PQ) và m/z 148, 162, 220 (EPQ), trong đó các mảnh ion 192 và 162 được dùng để định lượng PQ & EPQ.
1.2.3. Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ Hai tác giả ZhaohongWang và Proenca P. đều định lượng PQ trong mẫu sinh học bằng sắc ký lỏng ion hóa tia điện khối phổ [28] [41]. ZhaohongWang sử dụng hệ thống Waters UPLC với. Tiêm mẫu 5 μl với cột ACQUITY BEH HILIC (50 mm × 2,1 mm × 1.7 μm) ở 30oC. Còn Proenca P. sử dùng hệ thống sắc ký LC Water 2695 Alliance System và cột silica HILIC (150 × 2,1 mm × 5 µm). Nhiệt độ cột duy trì 35oC. Bơm mẫu 10 µl. Detector mảng photodiode Water 996 hoạt động từ bước sóng 210400 nm với độ phân giải 1,2 nm. Độ hấp thụ UV được đo ở 258 nm. Cả hai tác giả đều sử dụng pha động là ammonium formate và acetonitrile. Trong khi ZhaohongWang dùng ammonium formate 250 mM (điều chỉnh đến pH 3,7 bằng acid formic) và acetonitrile. Và chạy pha động theo chế độ gradient với tốc độ dòng 0,3 ml/phút. Ngay sau khi tiêm mẫu, % acetonitrile giảm từ 60% đến 20% trong 0,5 phút, sau đó tăng tới 60% ở 1,5 phút và duy trì 60% ở 1,5 phút tiếp. Tổng thời gian chạy là 3 phút. Thì tác giả Proenca P. dùng pha động gồm acetonitrile và đệm ammonium formate (200 mM) pH 3,6 với chế độ đẳng dòng (30:70, v/v) và tốc độ 300 µl/phút. Các tác giả trên đều sử dụng nguồn ion hóa tia điện dương để ion hóa PQ và chuẩn nội nhưng có khác nhau về điều kiện khối phổ. Tác giả ZhaohongWang sử dụng bộ phân tích phổ khối ACQUITY BSM_SM_Quattro Premier XE MS. Tối ưu hóa điều kiện MSMS bằng cách tiêm dòng PQ và ethyl viologen trong acetonitrile/dung dịch ammonium formate 250 mM (40:60, v/v) với tốc độ khí cone là 50 l/h và tốc độ dòng khí làm khô là 651 l/h ở 350 oC. Điện áp mao quản là 3,5 kV và điện áp cone là 20 V, điện áp extractor là 4,0 V và điện áp thấu kính RzFl à 0,5 V. Định lượng bằng kỹ thuật quét ion (multireaction monitoring, MRM), bắt các mảnh ion ban đầu có m/z 186 và các ion sản phẩm có m/z 155 và 171 đối với PQ; mảnh ion ban đầu có m/z 214 và các ion sản phẩm có m/z 158 và 185 đối với chuẩn nội ethyl viologen [41]. Còn với tác giả Proenca P [28] phát hiện phổ (MS) được thực hiện trên máy khối phổ tư ́ cực Water ZQ 2000. Thiết lập các điều kiện: nguồn nhiệt 120 oC; nhiệt độ làm khô 400oC; tốc độ dòng khí cone (N2) 0 l/h và tốc độ dòng khí làm khô (N2) 600 l/h. Điện thế capillary 3,5 kV; điện thế cone 40 V; extractor 4 V; năng lượng ion 0,5 V; Quét phổ từ m/z 130500, thời gian quét 0,5 s và thời gian trễ (interscan) 0,1s. Đường chuẩn độ PQ trong máu tuyến tính từ 0,0102,0 µg/ml trong máu (y=0,0142x+0,1497 với r2=0,9994) và tuyến tính từ 0,02510,0 µg/ml trong nước tiểu (y = 0,0141x + 1,347 với r2 = 0,9994). Giới hạn phát hiện của PQ trong máu và nước tiểu lần lượt là 0,004 µg/ml và 0,007 µg/ml (LOD, S/N = 3) và giới hạn định lượng ( LOD, S/N = 10) là 0,0012
µg/ml trong máu và 0,024 µg/ml trong nước tiểu. Nghiên cứu cũng chứng minh mẫu máu trắng không có pic nào trùng thời gian lưu với PQ và chất chuẩn nội 1.2.4. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao Có rất nhều tác giả đã sử dụng phương pháp HPLC để định lượng PQ trong dịch sinh học [7][17][26]. Arys K. và cộng sự [7] sử dụng hệ thống HPLC. Gồm b ơm model 126 và tiêm mẫu type 210A với vòng tiêm mẫu 50 µl. Bước sóng hoạt động là 230 nm. Cột phân tích Aluspher 100 RPselect B (125 mm × 4,0 mm, kích thướ c hạt 5 µm) với cột bảo vệ 100 RPselect B (4 mm × 4,0 mm, kích thướ c hạt 5 µm). Pha động là hỗn hợp dung dịch NaOH 0,0125 M trong nướ c (dung dịch A) và dung dịch NaOH 0,0125 M trong methanol (dung d ịch B), t ốc độ dòng 1 ml/phút. Chạy pha động chế độ gradient, dung dịch A từ 90% đến 10% trong thời gian 15 phút. Sau khi chạy xong, chạy l ại điều kiện ban đầu trong 5 phút trướ c khi chuyển sang chạy mẫu mới. Giới hạn phát hiện PQ của phương pháp trong máu và nướ c tiểu lần lượ t là 63 và 32 µg/l. Paixão P. [26] định lượng PQ trong huyết thanh và huyết tương người được làm đơn giản và nhanh bằng phương pháp HPLC sử dụng 1,19diethyl4,49 bipyridyldiylium (diethyl paraquat) làm nội chuẩn. Hệ thống HPLC gồm bơm mẫu model 1100, ổn định nhiệt, detector UVVIS. Vòng bơm mẫu 50 µl, cột NovaPar C18 (150×4,6 mm, 5µm). Tiền cột C18 (100×4,6 mm, 10µm). PQ và chất nội chuẩn được rửa giải ở 25 oC với tốc độ dòng 0,8 ml/phút và bước sóng hấp thụ 258 nm. Pha động gồm acid 1 octanesulphonic 3,0 mM; acid orthophosphoric 0,1 M trong 900 ml nước khử khoáng điều chỉnh pH đến 3,0 bằng diethylamine. Acetonitrile nồng độ 10% (v/v). Kết quả: Thời gian lưu của PQ và chuẩn nội là 6,5 và 9,5 phút. Giới hạn phát hiện (LOD) 0,1 µg/ml, giới hạn định lượng (LOQ) 0,4 µg/ml trong huyết tương và huyết thanh. Độ đúng trong ngày không vượt quá 3,5%; 3,2% đối với huyết tương, huyết thanh. Độ đúng trong khác ngày không vượt quá 4,7%; 3,1% đối với huyết tương, huyết thanh. Độ thu hồi trong huyết tương và huyết thanh lần lượt là 98,9% và 98,7%. Shuuji Hara [17] định lượng đồng thời PQ và DQ trong huyết tương bằng phương pháp HPLC. Hệ sử dụng bơm L7120 (Hitachi, Tokyo, Nhật), van bơm mẫu (20 µl) Rheodyne 7125. PQ, DQ, IS được tách trên cột pha đảo Capcell PaK C18 UG120 (1504,6 mm, cỡ hạt 5µm, của Shiseido Co., Tokyo, Nhật) bằng dung dịch rửa giải của methanol và 200 mM axit phosphoric với diethyl amine 0,1M và sodium 1heptane sulphonate 12 mM (1:4, v/v). Tốc độ dòng của pha
động 0,5 ml/phút và nhiệt độ cột trong khoảng từ 1520oC. Dịch rửa từ cột HPLC được trộn với dung dịch kiềm của Sodium hydrosulfite bằng thiết bị trộn. Tốc độ dòng 0,4 ml/phút. Hỗn hợp được dẫn vào sợi dây (1 m x 0,5 mm) và được làm ấm trong bể nước SB9 (EYELA, Tokyo, Nhật) ở nhiệt độ 20oC và đo ở bước sóng 391 nm bằng detector UV Hitachi L 7405. Độ cao của pic được dùng để định lượng bằng máy CR6A Chromatopak (Shimadzu, Kyoto, Nhật). Giới hạn phát hiện của PQ và DQ là 50 và 100 ng (0,19 và 0,29 nmol) trên ml huyết tương. Định lượng PQ trong huyết tương sử dụng sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo cặp ion đã được Brunetto M.R. thực hiện trên hệ thống sắc ký được sử dụng có 2 bơm, 1 bơm 2 nòng để chuyển pha động vào cột phân tích và bơm Knauer Model 64 để chuyển pha động vào cột chiết. Van tiêm (V1) 6 cửa có các vòng mẫu 20, 100 hoặc 200 µl để đưa mẫu vào cột chiết. Sử dụng các cột 25 4 mm được lấp đầy các hạt LiChrospher RP18 ADS (kích thước hạt 25 µm) và cột VARIAN ODS C18 (25 cm × 4,6 mm, hạt 5 µm) lần lượt là cột chiết và cột phân tích. Cột chiết và cột phân tích được gắn với van xoay 6 cửa Rheodyne được điều khiển bằng bơm 2 nòng. Sử dụng detector UVDAD PerkinElmer LC 235 ở bước sóng 258 nm với flowcell 12 µm để phát hiện các tín hiệu. Các pha động: Pha động để chiết (Pha động 1): chứa natri octane sulfonate (SOS) 10mM và acid orthophosphoric 0,05 M được pha bằng nước cất 2 lần, và lọc màng 0,45 µm. Điều chỉnh pH đến 2,8 bằng TEA và thêm 2propanol nồng độ 3% (v/v). Pha động để phân tích (Pha động 2): methanol 40 % và SOS 10 mM trong acid orthophosphoric 0,05 M. Điều chỉnh đến pH 2,8 bằng TEA. Các dung dịch và pha động được lọc màng 0,45 µm và loại khí trong bể siêu âm trước khi sử dụng. Giới hạn phát hiện, tỉ lệ tín hiệu (Signal) / Nhiễu đường nền (Noise) với S/N > 3, là 0,005 µg/ml PQ với thể tích tiêm mẫu 200 µg [9]. Chen Lu và cộng sự [25] đã sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao để xác định PQ trong huyết thanh người. Trong thí nghiệm này, các mẫu huyết thanh đã được kết tủa protein lần lượt 30% acid perchloric, acetonitrile và dichlormethane, thu được 50 ml dung dịch. Pha động acetonitrileđệm (10:90), dung dịch đệm chứa natri heptanesulfonate 0,02 M và acid phosphoric 0,26 M, điều chỉnh pH đến 2,0 bằng triethylamine. Tốc độ dòng 1,2 ml/phút, bước sóng phát hiện 256 nm, nhiệt độ cột 40oC. Đường chuẩn tuyến tính với nồng độ PQ huyết thanh từ 0,1 40 mg/l (r = 0,9999). Giới hạn phát hiện là 0,1 mg/l (S/N = 3). Độ lêch chuân (RSD) c ̣ ̉ ủa các mẫu chưng ́
nồng độ thấp, trung bình và cao là trong vòng 3,061% 6,149%, độ lêch chuân gi ̣ ̉ ữa các lô 0,705% ̣ ̀ ̉ 2,796%, và đô thu hôi cua ph ương phap x ́ ử ly mâu 96,79 % 100,07%, và đô thu h ́ ̃ ̣ ồi phương pháp là 91,66% 108,49%. Phương pháp này là đơn giản, nhạy cảm, chính xác, nhanh chóng và cũng chỉ ra rằng có thể được sử dụng trong chẩn đoán lâm sàng. ̣ ̀ ương phap khac cung đa đ * Ngoai ra, môt vai ph ̀ ́ ́ ̃ ̃ ược nghiên cứu đê đinh l ̉ ̣ ượng PQ trong ́ ư: miên dich phong xa [14], điên di mao quan [38]… mau nh ̃ ̣ ́ ̣ ̣ ̉ 1.3. Các phương pháp xử lý mẫu huyết tương phân tích Paraquat Một trong những yếu tố quyết định đến hiệu quả của phương pháp định lượng đó là phương pháp xử lý mẫu. Có rất nhiều nghiên cứu sử dụng kỹ thuật chiết pha rắn để xử lý mẫu sinh học trong phân tích PQ [5][16][20][28][41]. Một số tác giả dùng đệm phosphate để thêm vào mẫu thử trước khi cho qua cột chiết pha rắn [5][16][41]. Cột chiết pha rắn C18 thường được dùng để chiết PQ & DQ trong mẫu thử [20]. Dung dịch mẫu đã loại protein được chỉnh pH đến 11 bằng NaOH. Cột được hoạt hóa bằng 5 ml nước, 5 ml methanol và 20 ml nước trước khi bơm mẫu vào cột. 3 ml nước cất được bơm qua cột để loại bỏ hoàn toàn các hợp chất khác trong máu. Sau đó, 3 ml acid hydrochloric 0,2 M và 1 ml × 3 nước khử khoáng được cho qua cột để rửa giải PQ & DQ. Với dịch thu được thêm 3 m l dung dịch NaOH 0.2 M. Mẫu này được mang đi đo quang [20]. Changbin Li [5] cũng dùng cột C18 để chiết PQ, cột được rửa với 2 m l methanol và 2 ml đệm phosphate (pH 8,0). Dung dịch mẫu được đưa qua cột rồi rửa với 2 m l nước khử khoáng. Cuối cùng, rửa giải với 2 ml methanol và dịch rửa giải được bay hơi ở nhiệt độ phòng dưới dòng khí nitrogen. Hòa tan cắn trong 100 µl methanol và bơm 1 µl vào hệ thống GCMS. Zhaohong Wang [41] xử lý 1,0 ml máu, thêm 3 ml đệm phosphate 0,1M (pH 7) và dung dịch chuẩn nội 100 ng/ml. Ly tâm 8000 vòng/phút trong 10 phút. Các cột Waters Oasis WCX 3 m l được cho chạy qua lần lượt 3 ml methanol, 3 ml nước khử khoáng và 1 ml đệm phosphate 0,1 M (pH 7). Sau khi cho mẫu chạy qua cột, rửa cột với 3 m l đệm phosphate 0,1 M (pH 7), 3 ml nước khử khoáng và 3 ml methanol. Sấy khô chân không cột trong 10 phút. Chất phân tích được rửa giải bằng 2 ml dung dịch acid formic 2% trong acetonitrile 80%. Bay hơi dịch rửa giải bằng dòng khí nitrogen ở 45oC. Hòa tan cắn bằng 50 μl pha động (dung dịch acetonitrile và ammonium formate 250 mM tỉ lệ 1:1). Proenca P [28] xử ly mâu băng cach lây 1 m ́ ̃ ̀ ́ ́ l máu hoặc 1 ml nước tiểu thêm 50 µl chuẩn nội (10 µg/ml) và 2 ml acetonitrile. Lắc, ly tâm 2500 vòng/phút trong 10 phút. Cột chiết pha rắn (Oasis, 3 cc) được rửa với lần lượt 1 m l methanol và 1 ml nước khử khoáng. Đưa mẫu qua cột
chiết pha rắn. Rửa cột với 1 ml đệm phosphate pH 7,1 ml nước khử khoáng và 1 ml methanol. Sau khi làm khô 10 phút trong chân không, rửa giải cột với 1,5 m l acetonitrile/water/TFA (84:14:2, v/v/v). Dịch rửa giải được bay hơi đến cắn dưới dòng khí nitrogen ở 40 oC. Cắn được hòa tan trong 100 µl methanol và bơm 10 µl vào hệ thống LCESIMS. Kyoko KATO, P. Paixão đều dùng acid perchloric để loại protein [20][26]. Tuy nhiên, một số công trình khác sử dụng acid trichloracetic để kết tủa protein trong mẫu huyết tương [7][17] [24][30] rất đơn giản và cho hiệu quả cao vì vậy có thể áp dụng rộng rãi ở các đơn vị xét nghiệm. Phương pháp này được Rai M.K. và cộng sự áp dụng để định lượng PQ trong máu, nước tiểu và sữa mẹ. Thêm 1 ml dung dịch EDTA 5% và 1ml acid trichloracetic 1% vào để loại sự ảnh hưởng của các ion kim loại và loại protein. Ly tâm 1850 vòng/phút trong 10 phút. Lấy phần dịch trong ở trên đem đo quang [30]. Huyết tương sạch và các dung dịch huyết tương chuẩn PQ 50 và 10 μg/ml được thêm TCA 20% (tỉ lệ 6:1). Lắc xoáy, li tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút. Lấy dịch trong phần trên đi đo quét bước sóng từ 200 đến 300 nm [24]. Arys K [7] xử ly mâu băng cach lây 1 m ́ ̃ ̀ ́ ́ l (hoặc 1 g) mẫu, thêm 50 µl chuẩn nội và thêm nước vừa đủ 4 ml. Tủa protein bằng acid trichloroacetic là bước làm sạch đầu tiên của các mẫu máu, gan, thận. Thêm 1,5 ml dung dịch acid trichloroacetic 25%, lắc 10 phút, ly tâm 400 vòng/phút trong 5 phút. Sau khi chuyển dịch trong ở trên sang ống nhựa sạch, phần tủa protein phía dướ i đượ c hòa tan lại bằng 2,5 ml dung dịch acid trichloroacetic 5%, l ắc 10 phút, ly tâm 1100 vòng/phút trong 5 phút, gộp phần dịch trong l ại, chuy ển sang ống silan hóa. Tuy nhiên ở một số trườ ng hợp đã đượ c chứng minh cần thêm bướ c ly tâm nữa (2200 vòng/phút trong 10 phút) để thu đượ c phần dịch sạch hoàn toàn. Đối với nướ c tiểu và dịch dạ dày, bướ c loại protein có thể bỏ qua và làm ngay bước tiếp theo là khử PQ bằng natri borohydride. Điều chỉnh pH của dung dịch đến pH lớn hơn 10 bằng 1 m l NaOH 1M (đối với nước tiểu và dịch dạ dày) hoặc 1 ml NaOH 5M (đối với các mẫu khác). Sau đó, thêm 250 mg bột NaBH 4 và lắc ở 60 oC trong 25 phút. Sau khi làm mát ở nhiệt độ phòng, chiết dung dịch v ới 8 m l diethyl ether bằng máy trong 15 phút. Sau khi ly tâm (1100 vòng/phút trong 10 phút), chuyển lớp hữu cơ phía trên sang ống silan hóa hình nón. Bay hơi dịch chiết đến khô bằng dòng khí nitrogen. Cắn đượ c hòa tan trong 60 µl pha động (dung dịch A : dung d ịch B là 50:50, v/v) và tiêm 50 µ l vào hệ thống HPLC.
Theo nghiên cứu của Shuuji Hara và cộng sự [17] chỉ cần lấy 200 µl huyết thanh trộn với 20 µl dung dịch nội chuẩn (10 µg/ml) và 120 µl TCA 10% và lắc xoáy trong 20 giây, ly tâm 1000 vòng/phút trong 5 phút. Sau đó, lấy 20 µl dịch nổi ở trên bơm vào máy. Tóm lại, tổng quan tài liệu tham khảo cho thấy việc định lượng PQ trong mẫu huyết tương chủ yếu được thực hiện bằng phương pháp HPLC. Trong đó mẫu huyết tương được loại bỏ protein bằng cách kết tủa với TCA và định lượng trên hệ HPLC cột tách C8 dung môi pha động theo thể tích (5:95) gồm ACN – Đệm photphat pH=2,5 gồm (natri heptanesulfonate; KCl; PEG ; triethylamine; MeOH).