Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu khả năng tăng sinh của tế bào gốc mỡ và ảnh hưởng của chúng đến tế bào da nuôi cấy định hướng trong điều trị vết thương

Chia sẻ: Na Na | Ngày: | Loại File: DOC | Số trang:84

Thêm vào BST

Báo xấu

75
lượt xem 8
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận văn gồm các mục tiêu sau: Đánh giá đặc điểm phân lập và sự tăng sinh của tế bào gốc mỡ trong điều kiện nuôi cấy invitro; đánh giá ảnh hưởng của tế bào gốc mỡ đến tế bào da nuôi cấy. Mời các bạn cùng tham khảo nội dung chi tiết.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu khả năng tăng sinh của tế bào gốc mỡ và ảnh hưởng của chúng đến tế bào da nuôi cấy định hướng trong điều trị vết thương

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ĐOÀN HOÀNG THU NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TĂNG SINH CỦA TẾ BÀO GỐC MỠ VÀ ẢNH HƯỞNG CỦA CHÚNG ĐẾN TẾ BÀO DA NUÔI CẤY ĐỊNH HƯỚNG TRONG ĐIỀU TRỊ VẾT THƯƠNG LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2014
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ĐOÀN HOÀNG THU NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TĂNG SINH CỦA TẾ BÀO GỐC MỠ VÀ ẢNH HƯỞNG CỦA CHÚNG ĐẾN TẾ BÀO DA NUÔI CẤY ĐỊNH HƯỚNG TRONG ĐIỀU TRỊ VẾT THƯƠNG Chuyên ngành : Sinh học thực nghiệm Mã số : 60420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC 1. TS. Đinh Văn Hân 2. PGS. TS. Ngô Giang Liên
Hà Nội 2014 LỜI CẢM ƠN Trước tiên, em xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc nhất tới Tiến sĩ Đinh Văn Hân và PGS. TS. Ngô Giang Liên – những người thầy đã tận tâm, nhiệt tình chỉ bảo, hướng dẫn cũng như động viên, cổ vũ tinh thần cho em trong suốt quá trình thực hiện đề tài luận văn thạc sĩ. Em xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc đến những thầy cô giáo đã giảng dạy em trong những năm qua, những kiến thức mà em nhận được trên giảng đường sẽ là hành trang giúp em vững bước trong tương lai. Em xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu, Phòng Sau đại học, Khoa Sinh học, Bộ môn Sinh học Tế bào Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành khóa học. Xin chân thành cảm ơn các cô chú, anh chị và các bạn đồng nghiệp tại Khoa Labo nghiên cứu ứng dụng trong điều trị Bỏng – Viện Bỏng Quốc Gia đã quan tâm, hỗ trợ, tạo điều kiện để em thực hiện đề tài. Cuối cùng, xin được gửi lời tri ân đến gia đình, bạn bè và tất cả những người thân yêu đã luôn động viên, khích lệ, giúp đỡ em trong quá trình học tập để em hoàn thành bản luận văn này! Hà Nội, ngày 16 tháng 08 năm 2014 Học viên Đoàn Hoàng Thu
MỤC LỤC
DANH MỤC BẢNG Bảng 1. Khả năng tạo dòng của tế bào mới tách ra từ mô mỡ (n=5)............. Error: Reference source not found Bảng 2. Khả năng tạo CFUF theo các thế hệ tế bào (n=5).......... Error: Reference source not found Bảng 3. Ảnh hưởng của tế bào gốc đến tăng sinh nguyên bào sợi Error: Reference source not found Bảng 4. Thời điểm nguyên bào sợi gia tăng số lượng khi có tấm tế bào gốc....... Error: Reference source not found Bảng 5. Tỷ lệ sống của nguyên bào sợi sau khi trypsin. Error: Reference source not found Bảng 6. Ảnh hưởng của tấm tế bào gốc đến tăng sinh tế bào sừng............... Error: Reference source not found Bảng 7. Ảnh hưởng của tấm tế bào gốc tới di cư tế bào sừng...... Error: Reference source not found
DANH MỤC HÌNH Hình 1. Sơ đồ sự tăng sinh của nguyên bào sợi trong các giai đoạn khác nhau của quá trình liền vết thương..................................... Error: Reference source not found Hình 2. Mô phỏng thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của tế bào gốc mô mỡ bằng phương pháp đồng nuôi cấy................................. Error: Reference source not found Hình 3. Tạo vết thương in vitro............................ Error: Reference source not found Hình 4. Tách mô mỡ bằng enzym collagenase...... Error: Reference source not found Hình 5. Đĩa tế bào sau 48h nuôi cấy. .................. Error: Reference source not found Hình 6. Tế bào sau 4 và 10 ngày nuôi cấy............ Error: Reference source not found Hình 7. Tế bào gốc mỡ trên kính hiển vi đảo ngược 50X(A) và 100X(B)........ Error: Reference source not found Hình 8. Hình thái tế bào gốc mỡ sau khi nhuộm Giemsa. (100X) .. . Error: Reference source not found Hình 9. Tế bào gốc mỡ tạo colony – ngày thứ 1 và 5. (50X) Error: Reference source not found Hình 10. Tế bào gốc mỡ tạo colony ở ngày thứ 10 và 20. (50X).... Error: Reference source not found Hình 11. Các đĩa colony sau khi nhuộm giemsa.... Error: Reference source not found Hình 12. Biểu đồ so sánh số lượng tế bào thu được giữa các thí nghiệm đồng nuôi cấy tấm tế bào gốc mô mỡ với nguyên bào sợi ở ngày thứ 2. Error: Reference source not found Hình 13. Tác động của tấm tế bào gốc mô mỡ lên sự tăng sinh của nguyên bào sợi (50X)................................................................ Error: Reference source not found Hình 14. Sự gia tăng số lượng nguyên bào sợi theo thời gian........ Error: Reference source not found Hình 15. So sánh số lượng tế bào thu được giữa các thí nghiệm đồng nuôi cấy tấm tế bào gốc với tế bào sừng........................... Error: Reference source not found
Hình 16. Tác động của tấm tế bào gốc mô mỡ lên sự tăng sinh của tế bào sừng Error: Reference source not found ............................................................................... Hình 17. Tế bào sừng độ che phủ đạt 100% , tế bào sừng hinh ovan và đa di ̀ ện ̣ moc day xêp khit nhau ngay tr ̀ ́ ́ ước khi tạo vết cạo để đồng nuôi cấy với tấm tế bào gốc mỡ và tấm nguyên bào sợi (50X)............ Error: Reference source not found Hình 18. Ảnh hưởng của tế bào gốc mỡ lên di cư và biệt hóa của tế bào sừng (50X). ..................................................................... Error: Reference source not found Hình 19. So sánh hình thái tế bào gốc mô mỡ…………………………….Error: Reference source not found DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT AB Antibiotic/Antimycotic Kháng sinh ADSCs AdiposeDerived Stem Cells Tế bào gốc mỡ DMEM Dubeco’s Modified Eagle Medium EGF Epidermal Growth Factor Yếu tố tăng trưởng biểu bì FBS Fetal Bovine Serum Huyết thanh bào thai bê FGF Fibroblasts Growth Factor Yếu tố tăng trưởng nguyên bào sợi HGF Hepatocyte Growth Factor IL Interleukin ITSX Insulin, Transferin, Selen X KGF Keratinocyte Growth Factor Yếu tố tăng trưởng tế bào sừng MCS Mesenchymal stem cells Tế bào gốc trung mô P Passage Cấy chuyển PBS Phosphat Buffer Saline Dung dịch đệm phosphat PDGF PleteletDerived Growth Factor TB Tế bào TGF Transforming Growth Factor VEGF Vessle Endothelial Growth Factor
ĐẶT VẤN ĐỀ Tế bào gốc là một trong những lĩnh vực sinh học lôi cuốn nhất hiện nay. Từ lâu, cấy ghép tế bào gốc đã được y học thế giới lựa chọn như là liệu pháp hữu hiệu để chữa khỏi một số căn bệnh mạn tính, hiểm nghèo liên quan đến máu, tủy, xương khớp…Trên thế giới, có một số nguồn tế bào gốc được đưa vào ứng dụng như tế bào gốc tủy xương và tế bào gốc máu cuống rốn, các tế bào gốc từ 2 nguồn này chủ yếu là tế bào gốc tạo máu nên được ứng dụng trong nghiên cứu và điều trị các bệnh về máu, còn các bệnh cần có sự tái tạo thuộc hệ thống trung mô thì ít được ứng dụng. Trong khi đó, các bệnh của trung mô lại rất thường gặp như các vết thương, vết loét, bệnh lý hệ mạch, não, tim…Một nguồn TB gốc khác đang được kỳ vọng nhiều chính là tế bào gốc phôi, mặc dù có tiềm năng lớn nhưng việc nghiên cứu và sử dụng còn rất khó khăn về công nghệ và đặc biệt là bị cản trở bởi vấn đề y đức (sử dụng tế bào gốc phôi đồng nghĩa với việc hủy đi một phôi vốn có thể trở thành một con người). Gần đây, nhiều nghiên cứu tập trung khai thác các tế bào gốc từ phần phụ của thai như bánh rau, dây rốn. Thành công về công nghệ đã có thể tách và nhân lên các tế bào gốc nhưng chỉ có những bệnh nhân có bảo quản dây rốn – bánh rau…khi sinh ra mới có hy vọng được dùng các nguồn tế bào gốc này. Hiện nay, chỉ có số lượng rất ít người được lưu giữ dây rốn hay bánh rau sau khi sinh ra, đồng thời chi phí cũng rất tốn kém và xác suất người lưu trữ mô lại có các bệnh cần được điều trị bằng các tế bào gốc này cũng không phải cao. Tế bào gốc mỡ là quần thể tế bào vạn năng, chúng có thể biệt hóa thành nhiều dòng khác nhau. Mô mỡ là loại mô có sẵn với số lượng lớn và dễ dàng thu hồi nên đây là nguồn tế bào đầy hứa hẹn cho y học tái tạo trong tương lai có thể sử dụng để ghép tự thân và đặc biệt là không gặp phải những vấn đề y đức. Đối với lĩnh vực nghiên cứu liền vết thương thấy rằng, tế bào
gốc mô mỡ là một trong những dạng tế bào quan trọng di cư đến vùng tổn thương để thực hiện nhiều khâu trong pha tăng sinh của quá trình liền vết thương. Tế bào gốc trung mô đã được nghiên cứu tách từ mô mỡ nhưng trong thành phần tế bào được tách còn nhiều dạng tế bào khác như bạch cầu, hồng cầu…Tỷ lệ tế bào gốc trung mô thay đổi nên khó xác định chính xác cần sử dụng bao nhiêu tế bào là cần thiết và bao nhiêu tế bào trong hỗn dịch tế bào mới tách là đủ để cho một lần ghép điều trị vết thương. Do đó, cần nghiên cứu xây dựng hoàn chỉnh quy trình tách và tinh lọc tế bào gốc trung mô. Nếu như các tế bào gốc trung mô tách ra lại có tác dụng kích thích tăng sinh hoặc di cư của 2 loại tế bào chủ yếu của da thì đó sẽ là cơ sở khoa học cần thiết cho việc tiếp tục các nghiên cứu ứng dụng tế bào gốc mô mỡ trên lâm sàng và định hướng cho các nghiên cứu chế tạo các chế phẩm sinh học phục vụ điều trị các tổn thương thuộc hệ thống trung mô đặc biệt là vết thương và vết bỏng. Ngày nay, nhu cầu điều trị vết thương bằng ghép tế bào gốc là rất lớn, cụ thể tại Mỹ với 260 triệu dân thì hàng năm có khoảng 6,5 triệu người mang các vết thương mạn tính. Hàng năm tại miền tây Châu Âu có khoảng 150.000 người cần được điều trị bằng da nhân tạo. Riêng tại Đức có khoảng 3 triệu người bị loét và chi phí lên tới hơn 1 tỷ Euro dành cho điều trị. Tại Việt Nam hàng năm ước tính khoảng 791.000 người gặp tai nạn về bỏng [8]. Tuy chưa có con số thống kê cụ thể nhưng chỉ tính riêng tại Viện Bỏng Quốc Gia, hàng năm có khoảng 5000 bệnh nhân bỏng điều trị thì nhu cầu về ghép da cũng đã chiếm khoảng 2500 bệnh nhân Xuất phát từ những cơ sở khoa học và tiềm năng ứng dụng của tế bào gốc mỡ, chúng tôi tiến hành nghiên cứu: “Nghiên cứu khả năng tăng sinh
của tế bào gốc mỡ và ảnh hưởng của chúng đến tế bào da nuôi cấy định hướng trong điều trị vết thương” nhằm mục tiêu sau: 1. Đánh giá đặc điểm phân lập và sự tăng sinh của tế bào gốc mỡ trong điều kiện nuôi cấy invitro 2. Đánh giá ảnh hưởng của tế bào gốc mỡ đến tế bào da nuôi cấy Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Các tế bào chủ yếu tham gia liền vết thương Diễn biến liền vết thương nói chung đều trải qua các giai đoạn đông máu, viêm, tăng sinh, tái lập mô và liền sẹo [3]. Tuy quá trình liền vết thương có nhiều cơ chế phức tạp nhưng kết quả cuối cùng là tái lập lại các mô tế bào đã bị tổn thương. Để duy trì chức năng bảo vệ cơ thể, con người cần có da. Thành phần tế bào da người chủ yếu bao gồm 2 loại là nguyên bào sợi (Fibroblasts) và tế bào sừng (Keratinocytes). Nguyên bào sợi là tế bào tạo ra lớp trung bì còn tế bào sừng tạo ra lớp biểu bì. Hai loại tế bào này có những chức năng khác nhau nhưng lại tương tác, kết hợp với nhau để tạo ra cấu trúc da hoàn chỉnh. Hai loại tế bào này cũng là những tế bào chủ yếu làm lành các tổn thương da. Khi da bị tổn thương, nguyên bào sợi là tế bào tổng hợp nên đệm gian bào, tiết các yếu tố tăng trưởng tạo điều kiện để tế bào sừng từ bờ mép vết thương tăng sinh che phủ bề mặt làm lành vết thương. Nguyên bào sợi (Fibroblasts) là tế bào quan trọng nhất trong giai đoạn tăng sinh, chúng tạo ra các thành phần đệm gian bào làm nền cho quá trình biểu mô hoá và cung cấp các sợi laminin, decorin, elastin, fibronectin để tế bào biểu mô bám và trượt trên đó giúp tăng nhanh quá trình biểu mô hoá che phủ
vết thương. Chúng tạo ra protein đệm mà trong đó collagen tạo nên sự bền vững và toàn vẹn của mô. Đồng thời nguyên bào sợi là nguồn cung cấp quan trọng một số yếu tố tăng trưởng (growth factors GF ) kích thích liền vết thương như TGFβ, PDGF, KGF...[44], [45], [67], [76]. Hơn nữa, nguyên bào sợi chuyển dạng thành myofibroblasts tạo nên sự co rút và liền vết thương nhanh hơn. Nguyên bào sợi còn tham gia vào giai đoạn sửa chữa sẹo diễn ra trong nhiều năm sau khi vết thương. Ngày thứ 2 sau khi bị thương bị bỏng, nguyên bào sợi xuất hiện ở vết thương do sự dịch chuyển từ mô liên kết bên cạnh. Sản xuất các siêu sợi actin của cơ trơn chuyển nguyên bào sợi thành myofibroblast, gây co kéo làm hẹp vết thương (12 mm/24 giờ). Tổng hợp men Metalloproteinase, collagenase gây thoái huỷ protein khoảng kẽ; men Stomalysin thoái huỷ protein màng nền. Điều hoà tổng hợp và thoá biến collagen thông qua FGF , TGF . Sắp xếp collagen theo cấu trúc mô. Trong khoảng thời gian từ 57 ngày, các nguyên bào sợi tăng sinh, và được kích thích tiết PDGF, TGFbeta để điều khiển quá trình tổng hợp và lắng đọng các thành phần đệm gian bào bao gồm: fibronectin, laminin, glycosaminoglycans (GAGs) và collagen. Nguyên bào sợi còn tham gia vào giai đoạn sửa chữa sẹo diễn ra trong nhiều năm sau khi vết thương đã liền. Tế bào sừng (Keratinocytes) tạo nên lớp biểu bì bảo vệ cơ thể. Biểu bì gồm nhiều lớp tế bào biểu mô lát tầng sừng hóa, thành phần chính là các tế bào sừng gồm nhiều lớp tế bào sắp xếp chặt chẽ với nhau [1]. Lớp mầm hay còn gọi là lớp đáy chứa các tế bào gốc biểu bì có khả năng tự tồn tại, tự tái sinh nhiều lần và nhanh trong suốt cuộc sống của con người. Giữa các tế bào sừng có các cầu nối gian bào làm kết nối chặt chẽ giữa chúng với nhau. Các tế bào lớp đáy có cấu trúc cầu nối khác với các lớp ở trên, chúng có thể dễ dàng bị xoá bỏ và cũng tự tái tạo lại để các tế bào sừng mới sinh ra di chuyển lên trên tạo ra các lớp tế bào biệt hoá ở phía trên. Trong các tế bào của lớp
mầm biểu bì thì chỉ có 10% là tế bào mầm biểu bì còn lại là các tế bào đang ở các giai đoạn gián phân. Bình thường sự phân chia tế bào sừng lớp mầm cân bằng với sự sừng hoá bong vảy của biểu bì nhưng khi da bị tổn thương thì chúng tăng cường phân chia để tạo ra nhiều tế bào biểu mô. Các tế bào biểu mô sẽ di cư vào trung tâm của vết thương ở dạng đơn lớp cho đến khi các tế bào tiếp xúc trực tiếp với nhau thì tốc độ phân chia chậm lại và biệt hoá thành các lớp gai, lớp hạt, lớp sừng ở phía trên để thực hiện chức năng bảo vệ của biểu bì. Trong quá trình di cư chúng cần đệm gian bào đủ chất lượng như trung bì, chúng cần có các sợi decorin, laminin…để bám vào và trượt dọc theo các sợi đó để di chuyển vào trung tâm vết thương. Trong trường hợp các vết thương mạn tính, cấu trúc đệm gian bào bị tổn thương không hồi phục, vết thương trở nên xơ sợi, các nguyên bào sợi nghèo nàn hoặc không thể thực hiện đầy đủ chức năng nên các tế bào biểu mô không thể phân chia hay di cư vào vết thương. Chính các mối tương tác chặt chẽ giữa hai loại tế bào trên mà trong điều trị cần chú ý tới các điều kiện để cả hai cùng tăng sinh, cùng biệt hoá, cùng thực hiện chức năng liền vết thương thì vết thương mới nhanh liền.
Hình 1. Sơ đồ sự tăng sinh của nguyên bào sợi trong các giai đoạn khác nhau của quá trình liền vết thương (Nguồn: Werner S et al (2003), Physiol. Re;83:835870), [79]. A. 1224 giờ sau bị thương, nguyên bào sợi quanh tổn thương được kích hoạt. B. Từ 37 ngày sau bị thương, nguyên bào sợi di cư vào vùng tổn thương, tăng sinh và tổng hợp đệm gian bào. C. Từ 12 tuần sau bị thương, mô hạt hình thành, nguyên bào sợi chuyển dạng thành myofibroblast gây co hẹp vết thương và tiết collagen. 1.2. Công nghệ mô – tế bào làm lành vết thương 1.2.1. Tổn thương da và nhu cầu chế tạo chế phẩm điều trị vết thương
Như chúng ta đã biết da là cơ quan lớn nhất của cơ thể và có vai trò là một cơ quan bảo vệ cơ thể trước các tác động với môi trường xung quanh. Da bảo vệ các cơ quan phía dưới da và bảo vệ cơ thể chống lại các mầm bệnh và vi sinh vật. Da trực tiếp tiếp xúc với các yếu tố độc hại tiềm tàng như vi khuẩn, nhiệt, các tác động cơ học và hóa học. Trong 25 năm qua, các cố gắng lớn đã tạo ra các vật liệu thay thế mang tính bắt chước da người [50]. Ở da công nghệ mô, các vật liệu tổng hợp hay sinh học được kết hợp với các tế bào nuôi cấy để tạo ra các mô có chức năng của da [74]. Các vật liệu thay thế da này được chế tạo dựa trên các tiến bộ về công nghệ mô và đã được ứng dụng trong lâm sàng, chúng thúc đẩy sự liền vết thương cấp và mạn tính và được sử dụng như một cơ quan phức hợp cho hệ thống thử nghiệm cơ bản hoặc các nghiên cứu về dược [59]. Một vấn đề chính trong việc tăng sinh tế bào là đáp ứng yêu cầu cần đạt đủ số lượng các tế bào cần thiết, trong khi vẫn đảm bảo được tính chất bình thường của tế bào và cả chức năng của chúng. Các tế bào này sau đó chỉ được sử dụng cho các mục đích hoặc là tạo vật liệu thay thế da phù hợp cho cấy ghép hoặc là cho các thử nghiệm in vitro [27], [66]. Có rất nhiều lý do gây nên tổn thương da bao gồm các hội chứng do gen, chấn thương cấp tính, vết thương mạn tính hoặc các can thiệp ngoại khoa. Một trong các lý do phổ biến nhất là tổn thương da do bỏng. Ngay khi da bị tổn thương, hàng loạt các vấn đề phức hợp bắt đầu diễn ra: các tế bào miễn dịch bị lôi kéo tới vùng thương tổn, mô đệm mới được sinh ra bởi nguyên bào sợi, tiếp theo là tái biểu mô hóa do tế bào sừng đảm nhiệm và cuối cùng là sự tái phân bố mạch của vết thương [54]. Quá trình liền vết thương phức tạp này được kích thích và kiểm soát bởi các cytokine và các yếu tố tăng trưởng khác nhau [25]. Kích thước vết thương là yếu tố chủ đạo cho biểu mô hóa. Tổn thương toàn bộ lớp da với kích thước lớn hơn 1 cm đường kính thì cần phải
ghép da để đề phòng tạo sẹo dẫn đến di chứng về chức năng hay thẩm mỹ [55]. Mảnh ghép hoàn hảo nên phải sẵn có, không gây đáp ứng miễn dịch, che phủ và bảo vệ nền vết thương, làm tăng nhanh liền vết thương, ít gây đau và ít tạo sẹo. Trong trường hợp tổn thương diện tích rộng các tế bào có chức năng liền vết thương của bệnh nhân không đủ khả năng làm lành tổn thương mà cần phải ghép da tự thân nhưng nguồn da tự thân cũng không phải vô hạn nên ghép da tự thân cũng chỉ cứu được những bệnh nhân bỏng sâu 50% diện tích cơ thể là chủ yếu. Trong lĩnh vực điều trị bỏng và chấn thương lớn, mặc dù đã có nhiều tiến bộ trong cứu chữa như cắt hoại tử ghép da ngay, tăng độ giãn rộng của da ghép [14], sử dụng da đồng loại hay các vật liệu thay thế da khác nhau [9], [10], [11], [12] nhưng các rối loạn về protein, thay đổi hệ thống miễn dịch... làm cho vết thương trở nên chậm lành hay rất khó lành [2], [7]. Ngoài ra chúng ta còn gặp các loại vết thương mạn tính rất khó lành như các vết loét do tiểu đường, loét do viêm tắc tĩnh mạch, loét điểm tỳ, loét xạ trị… mà không thể can thiệp bằng phẫu thuật ghép da nguy cơ thất bại rất cao do khả năng tiếp nhận mảnh ghép của vết thương rất kém và tình trạng bệnh nhân không cho phép phẫu thuật. Số lượng bệnh nhân này ngày càng tăng cao cùng sự phát triển kinh tế xã hội và tuổi thọ con người [10], [26]. Các vết thương này bị gián đoạn giai đoạn tăng sinh hoặc tế bào tham gia liền vết thương bị chuyển dạng [7], [9], [13], [23], [38]. Để khắc phục hạn chế này nhằm thay thế các tế bào đã tổn thương, công nghệ nuôi cấy tế bào da phát triển. Từ những năm trước, một số nhà nghiên cứu cho rằng điều trị vết thương vết bỏng trong tương lai sẽ trở nên đơn giản, nhanh chóng và dễ dàng che phủ tổn thương sau cắt hoại tử. Nhưng thực tế, điều đó còn rất xa vời.
Khái niệm này đã dẫn đến một số quan niệm sai trầm trọng dẫn đến việc đưa ra những hứa hẹn quá sớm về công nghệ mô da mà chậm được nhận ra trên thực tế lâm sàng. Khái niệm sai này là coi da như một mô giống như xương sụn và sẽ liên quan đơn giản tới nơi có thay đổi về công nghệ mô. Dù da không phải là một mô nhưng là một tổ chức hoàn toàn tổng hợp mang đến bởi sự kết hợp tế bào từ 3 nguồn gốc phôi gồm ngoại bì trung bì và ống thần kinh. Những thành công hiện đại về tạo ra những sản phẩm thay thế da đã trở nên bị hạn chế hơn so với mong đợi và bây giờ những sản phẩm da công nghệ mô đang được mô tả như vật liệu thay thế da giúp liền vết thương và sửa chữa, thay thế da tạm thời và thường hỗ trợ cho việc tái sinh. Quá trình liền vết thương, vết bỏng có nhiều cơ chế phức tạp nhưng kết quả cuối cùng là tái lập các mô tế bào đã bị tổn thương. Do đó, quan niệm mới trong điều trị các tổn thương ở bất cứ cơ quan nào trên cơ thể là các tế bào tổn thương phải được thay thế bằng các tế bào khỏe mạnh [4]. Cho đến ngày nay, người ta đã chế tạo được các tấm nguyên bào sợi, tấm tế bào sừng, thậm chí cả các tấm vật liệu chứa cả hai loại tế bào trên mà người ta gọi là các vật liệu tương đương da hoặc da nhân tạo…[57], [70]. Tuỳ theo nguồn gốc tế bào sừng trên tấm vật liệu là tự thân hay khác gen đồng loài (gọi tắt là đồng loài) mà người ta chế được vật liệu có tính chất vĩnh viễn (không thải ghép) hoặc tạm thời. Các tấm tế bào da nuôi cấy hoặc vật liệu tương đương da được ứng dụng trong điều trị bỏng, vết thương mạn tính trong thẩm mỹ và nghiên cứu thuốc…. So với ghép da tử thi, các vật liệu này có thuận lợi lớn là không phụ thuộc nguồn da người cho, việc sản xuất chúng gần như vô hạn và hầu như không có nguy cơ lây nhiễm bệnh do có thể kiểm soát trước được nguồn cho tế bào bằng các xét nghiệm tầm soát các bệnh lây truyền qua ghép mô/tế bào. Có hai thành phần chính của vật liệu tương đương da là thành phần khuôn và
thành phần tế bào. Thành phần khuôn hay được sử dụng là collagen, acid hyaluronic, polymer tổng hợp hoặc sinh tổng hợp. Thành phần tế bào bao gồm các tế bào da như nguyên bào sợi, tế bào sừng là hai tế bào chủ yếu, ngoài ra có thể có tế bào sắc tố… Đã có những sản phẩm thương mại sẵn có trên thị trường như Epicell, Integra, Transcyte, Apligraft, Dermagraft… 1.2.2. Một số loại tế bào và vật liệu điều trị vết thương từ nuôi cấy tế bào Trị liệu tế bào nói chung đã mang lại một số kết quả đáng kể trong lâm sàng, một số tế bào được nuôi cấy và ứng dụng phổ biến là: Tế bào sừng (Keratinocyte) Trong vài thập niên trở lại đây, cấy ghép tế bào sừng tự thân nuôi cấy đã được triển khai tại các trung tâm điều trị bỏng lớn ở Anh, Mỹ, Nhật... Việc cấy ghép tế bào sừng lên vết thương góp phần giải quyết sự thiếu hụt nguồn da lành. Thành công do ghép tế bào sừng nuôi cấy còn nhiều hạn chế, do khi đặt tế bào sừng nuôi cấy lên vết thương bỏng sâu, nền vết thương thiếu các yếu tố trung bì do chưa hoặc hình thành chậm màng đáy. Để khắc phục điều đó, người ta đã sử dụng cấy ghép kết hợp fibroblasts và tế bào sừng [40]. Ứng dụng tế bào sừng nuôi cấy, người ta đã chế tạo ra các tấm vật liệu thay thế biểu bì. Để sản xuất vật liệu thay thế biểu bì, một mẩu da sinh thiết khoảng 25cm 2 cần phải được lấy từ bệnh nhân. Công việc này có thể phải kết hợp với lần phẫu thuật cắt hoại tử của bệnh nhân bỏng. Rồi sau đó, biểu bì được tách khỏi lớp trung bì và các tế bào sừng đơn lẻ được phân lập nhờ enzyme và nuôi cấy cùng với nguyên bào sợi chuột đã bất hoạt khả năng phân chia. Môi trường nuôi cấy tăng sinh được sử dụng có chứa FBS và các chất cần thiết khác; tuy nhiên, cũng có thể làm tăng sinh các tế bào này trong điều kiện không có tế bào dị loại. Hiện nay, đã có các vật liệu thay thế biểu bì tự thân được thương mại hóa cho sử dụng trên lâm sàng như: Epicel, EpiDex, EpiBase, MySkin, Laserskin, BioseedS.
Đã có một số nghiên cứu thử nghiệm ghép tế bào biểu bì đồng loại như Celaderm [17], [42]; tuy nhiên, hiệu quả và tính an toàn của các sản phẩm này phải được khẳng định bằng nghiên cứu lâm sàng có đối chứng. Các sản phẩm đồng loại có lợi ích là giảm chi phí sản xuất so với chi phí sản xuất sản phẩm tự thân. Hơn bao giờ hết, sự thiếu sót của cả hai sản phẩm là chúng khó bám và do đó dễ dẫn đến việc tạo thành nốt phồng [80]. Nguyên bào sợi (Fibroblasts) là tế bào có nguồn gốc trung mô, chúng sản sinh ra collagen có vai trò quan trọng trong quá trình sửa chữa vết thương, phục hồi cấu trúc và chức năng của mô [5]. Ở mức độ phân tử, lớp trung bì rất quan trọng cho các tế bào biểu bì phát triển và trưởng thành chúng tiết ra các yếu tố như các sợi fibrin gắn kết, các yếu tố kết dính để gắn biểu bì vào trung bì. Vết bỏng sâu thiếu các thành phần trung bì hoặc lớp trung bì chưa hình thành hoặc hình thành chậm. Cần thiết phải tạo ra một lớp trung bì mới để tạo điều kiện cho da ghép tự thân hoặc tế bào sừng nuôi cấy che phủ lên vết thương cho kết quả tối ưu nhất [40]. Hiện nay, các nhà nghiên cứu đều cho rằng, vật liệu thay thế da lý tưởng nhất là phải thay thế được cả lớp trung bì và biểu bì. Sự tương tác giữa các yếu tố thuộc lớp biểu bì và trung bì sẽ kích thích sự trưởng thành của từng lớp. Boyce và Hansbrough đã tạo ra vật liệu thay thế da hỗn hợp (composite subtitues) g ồm nguyên bào sợi người nuôi cấy được cấy lên tấm màng collagenglycosaminoglycan sau đó cho tế bào sừng phát triển lên trên, vật liệu này đã được thử nghiệm thành công trên mô hình chuột, nhưng còn một số hạn chế khi thử nghiệm lâm sàng. Một xu hướng khác, đơn giản hơn và không đòi hỏi cao về công nghệ đó là sử dụng fibroblasts nuôi cấy đưa lên vết thương. Nguyên bào sợi sẽ tổng hợp các thành phần của trung bì, tạo điều kiện cho việc ghép da tự thân hoặc cấy ghép tế bào sừng thành công [33], [40], [70].
Để điều trị bỏng sâu, cả lớp biểu bì và lớp trung bì của da cần được thay thế, việc điều trị bằng tấm tế bào biểu bì đơn thuần sẽ dẫn đến chất lượng liền vết thương thấp. Tương phản với tấm biểu bì nuôi cấy, các cấu trúc trung bì từ công nghệ có thể dự phòng co kéo vết thương và tạo ra tính bền vững cơ học tốt hơn. Vật liệu tương đương trung bì và biểu bì phải được ghép kế tiếp nhau việc làm cho tuần hoàn hóa trung bì tốt sau khi loại bỏ nền vết thương là cần thiết trước khi ghép lớp biểu bì [35]. Một số vật liệu này là mảnh ghép đồng loại đã được xử lý bằng hóa chất, ví dụ Alloderm không có thành phần tế bào gây ra đáp ứng miễn dịch thải ghép [77]. Ngược lại, Dermagraft lại có các nguyên bào sợi từ da bao quy đầu của người được nuôi cấy trên lưới polyglactin có khả năng giáng hóa [72]. Trong các vật liệu này, các tế bào tiết protein đệm gian bào, hàng loạt các yếu tố tăng trưởng và cytokin vào trong vết thương cho đến khi chúng trải qua quá trình tự hủy bình thường sau vài tuần ghép. Purdue (1997) sử dụng tấm fibroblasts nuôi cấy là Dermagraft và so sánh với ghép da tử thi cho 66 bệnh nhân bỏng sâu được cắt hoại tử. Tác giả nhận thấy, tấm fibroblasts nuôi cấy có kết quả tốt tương đương với da tử thi trong việc hình thành mô hạt, kết quả về da ghép tự thân là tương đương, nhưng tấm fibroblasts dễ bóc khỏi mô hạt để ghép da tự thân nên không gây chảy máu như da tử thi. Tiếp tục theo dõi di chứng bỏng, tác giả nhận thấy vùng ghép fibroblasts có kết quả rất tốt về thẩm mỹ [61]. Hansbrough (1997) đã đánh giá khả năng của Dermagraft che phủ vết bỏng sau cắt hoại tử trên 10 vết thương có so sánh với da tử thi. Tác giả nhận thấy, khả năng bám dính, khả năng sống của Dermagraft là tương đương da tử thi, kết quả da ghép sống tương đương vùng ghép da tử thi. Không thấy có biểu hiện thải loại miễn dịch trong khi 4/10 vùng ghép da tử thi có biểu hiện thải loại lớp thượng bì [33].