intTypePromotion=1
zunia.vn Tuyển sinh 2024 dành cho Gen-Z zunia.vn zunia.vn
ADSENSE
 » 
 » 

Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu khả năng ức chế hoạt tính Aurora kinaza in vitro của Derrone phân lập từ cây Vông Nem Erythrina orientalis L. Murr

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:82

Thêm vào BST
Báo xấu
16
lượt xem 3
download
 
  Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Đề tài kiểm tra ảnh hƣởng của Derrone lên sự tăng trƣởng của một số dòng tế bào ung thƣ nuôi cấy đơn lớp 2D; nghiên cứu ảnh hƣởng của Derrone lên chu trình tế bào; bước đầu nghiên cứu tác động của Derrone lên hoạt tính của Aurora kinaza thông qua kiểm tra khả năng ức chế sự phosphoryl hóa histon H3 ở vị trí Serine 10 (H3PS10).

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu khả năng ức chế hoạt tính Aurora kinaza in vitro của Derrone phân lập từ cây Vông Nem Erythrina orientalis L. Murr

  1. Luận văn cao học ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------- NguyễnThịNhƣTrang NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG ỨC CHẾ HOẠT TÍNH AURORA KINAZA IN VITRO CỦA DERRONE PHÂN LẬP TỪ CÂY VÔNG NEM ERYTHRINA ORIENTALIS L. MURR LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HàNội - 2013 Nguyễn Thị Như Trang K20 - Sinh học thực nghiệm i
  2. Luận văn cao học ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------- NguyễnThịNhƣTrang NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG ỨC CHẾ HOẠT TÍNH AURORA KINAZA IN VITRO CỦA DERRONE PHÂN LẬP TỪ CÂY VÔNG NEM ERYTHRINA ORIENTALIS L. MURR Chuyênngành:Sinhhọcthựcnghiệm Mãsố: 60420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS HOÀNG THỊ MỸ NHUNG HàNội - 2013 Nguyễn Thị Như Trang K20 - Sinh học thực nghiệm ii
  3. Luận văn cao học MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG ..................................................................................................v DANH MỤC HÌNH MINH HỌA .......................................................................... vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT .............................................................................. ix MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1 Chƣơng 1 – TỔNG QUAN .......................................................................................3 1.1. NGUYÊN PHÂN ..........................................................................................3 1.1.1. Pha phân chia nhân (mitosis) ..............................................................3 1.1.2. Pha phân chia tế bào chất (cytokinesis) ..............................................4 1.1.3. Một số sự kiện quan trọng trong nguyên phân ....................................5 3.2. AURORA KINAZA VÀ VAI TRÒ TRONG UNG THƢ ..........................10 3.2.1. Aurora kinaza ....................................................................................10 3.2.2. Vai trò của Aurora kinaza trong sự hình thành ung thƣ ....................17 3.3. CÁC CHẤT SỬ DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU .....................................19 3.3.1. VX680 - chất ức chế Aurora kinaza ..................................................19 3.3.2. Paclitaxel (Taxol) ..............................................................................21 3.3.3. Chế phẩm Derrone.............................................................................22 Chƣơng 2 – ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .....................24 2.1. ĐỐI TƢỢNG ...............................................................................................24 Nguyễn Thị Như Trang K20 - Sinh học thực nghiệm iii
  4. Luận văn cao học 2.2. THIẾT BỊ, DỤNG CỤ VÀ HÓA CHẤT ....................................................25 2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...............................................................27 2.3.1. Hoạt hoá và nuôi cấy tế bào ..............................................................27 2.3.2. Đánh giá độc tính của chế phẩm Derrone bằng phƣơng pháp MTT .28 2.3.3. Thử độc tính của Derrone sử dụng phƣơng pháp xCELLigence ......31 2.3.4. Miễn dịch huỳnh quang .....................................................................33 2.3.5. Phƣơng pháp đếm tế bào dòng chảy Flow Cytometry ......................35 2.3.6. Phân tích kết quả, xử lý số liệu .........................................................37 Chƣơng 3 – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...........................................................38 3.1. KẾT QUẢ HOẠT HÓA VÀ NHÂN NUÔI TẾ BÀO ................................38 3.2. KẾT QUẢ THỬ ĐỘC TÍNH TRÊN CÁC DÒNG TẾ BÀO MCF-7, H1299, HELA VÀ HEK 293 ................................................................................38 3.2.1. Kết quả thử độc tính trên dòng MCF-7 bằng xCELLigence .............39 3.2.2. Kết quả thử độc tính trên dòng H1299 bằng xCELLigence ..............43 3.2.3. Kết quả thử độc tính trên dòng HeLa bằng xCELLigence ................46 3.2.4. Kết quả thử độc tính trên dòng HEK 293 bằng phƣơng pháp MTT .49 3.3. ĐÁNH GIÁ TÁC ĐỘNG CỦA DERRONE LÊN CHU TRÌNH TẾ BÀO 51 3.3.1. Đánh giá ảnh hƣởng của Derrone lên điểm kiểm soát thoi phân bào51 3.3.2. Ảnh hƣởng của Derrone lên chu trình tế bào ....................................54 3.4. ĐÁNH GIÁ TÁC ĐỘNG CỦA DERRONE LÊN SỰ BIỂU HIỆN H3PS10 …………………………………………………………………………….56 3.4.1. Đánh giá sự biểu hiện của H3PS10 dƣới ảnh hƣởng của Derrone bằng phƣơng pháp miễn dịch huỳnh quang ......................................................57 3.4.2. Định lƣợng ảnh hƣởng của Derrone lên H3PS10 bằng phƣơng pháp đếm tế bào dòng chảy........................................................................................60 3.5. THẢO LUẬN ..............................................................................................61 Nguyễn Thị Như Trang K20 - Sinh học thực nghiệm iv
  5. Luận văn cao học KẾT LUẬN ..............................................................................................................66 KIẾN NGHỊ .............................................................................................................67 TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................68 DANH MỤC BẢNG Bảng 1: Sự biểu hiện quá mức hay khuếch đại gen Aurora kinaza ở nhiều loại ung thƣ khác nhau ............................................................................................................18 Bảng 2: Các chất ức chế Aurora kinaza ....................................................................20 Bảng 3: Đặc điểm, nguồn gốc và điều kiện nuôi cấy của các dòng tế bào sử dụng trong nghiên cứu .......................................................................................................24 Bảng 4: Máy móc và thiết bị sử dụng .......................................................................25 Bảng 5: Dụng cụ và vật tƣ tiêu hao ...........................................................................26 Bảng 6: Hóa chất sử dụng trong đề tài ......................................................................26 Bảng 7: Tổng hợp giá trị IC50 và chỉ số tƣơng quan R2 của Derrone và VX-680 ....48 Bảng 8: Bảng thống kê tỷ lệ tế bào HeLa bám đĩa khi đƣợc ủ với VX-680 và chế phẩm Derrone ............................................................................................................54 Bảng 9: Thang chuẩn đánh giá độ độc của chất thông qua giá trị IC50.....................62 Nguyễn Thị Như Trang K20 - Sinh học thực nghiệm v
  6. Luận văn cao học DANH MỤC HÌNH MINH HỌA Hình 1: Mitosis và cytokinesis ....................................................................................4 Hình 2: Sự phosphoryl hóa H3 ở kỳ trung gian ..........................................................6 Hình 3: Chức năng và hoạt động của Aurora B và PP1 trong việc phosphoryl hóa H3 tại Ser10.................................................................................................................8 Hình 4: Cơ chế hoạt động của điểm kiểm soát phân bào ............................................9 Hình 5: Cấu trúc của Aurora kinaza A, B và C.........................................................12 Hình 6: Sự phân bố của Aurora A và B trong nguyên phân .....................................13 Hình 7: Aurora B điều hòa sự phân tách nhiễm sắc thể và kiểm soát thoi vô sắc ....16 Hình 8: Cây Thông đỏ (Taxus brevifolia) và công thức cấu tạo Paclitaxel ..............21 Hình 9: Cây vông nem Erythrina orientalis L. Murr và công thức cấu tạo Derrone ...................................................................................................................................22 Hình 10: Nguyên lý hoạt động và các bƣớc cơ bản của phƣơng pháp MTT ............29 Hình 11: Bố trí thí nghiệm trên đĩa nuôi cấy 96 giếng .............................................30 Hình 12: Các thành phần chính và nguyên tắc hoạt động của hệ thống xCELLigence ...................................................................................................................................31 Hình 13: Thành phần cấu tạo và hoạt động của hệ thống máy Flow Cytometry......35 Hình 14: Đồ thị biểu diễn trạng thái của MCF-7 dƣới tác dụng của Derrone theo thời gian.....................................................................................................................39 Hình 15: Phân tích tốc độ chết của tế bào MCF-7 sau khi CI đạt giá trị cực đại ở mẫu ủ Derrone ...........................................................................................................40 Hình 16: Đồ thị biểu diễn trạng thái của MCF-7 dƣới tác dụng của VX-680 theo thời gian.....................................................................................................................41 Hình 17: Đồ thị biểu diến giá trị IC50 của Derrone đối với dòng MCF-7 từ thời điểm 118 đến 148 giờ thí nghiệm ......................................................................................41 Hình 18: Đƣờng cong đáp ứng liều của MCF-7 dƣới sự tác động của Derrone ở 148 giờ..............................................................................................................................42 Hình 19: Đồ thị biểu diễn trạng thái của H1299 dƣới tác dụng của Derrone theo thời gian ............................................................................................................................43 Nguyễn Thị Như Trang K20 - Sinh học thực nghiệm vi
  7. Luận văn cao học Hình 20: Đồ thị biểu diễn trạng thái của H1299 dƣới tác dụng của VX-680 theo thời gian ............................................................................................................................43 Hình 21: Phân tích tốc độ chết của tế bào MCF-7 sau khi CI đạt giá trị cực đại ở mẫu ủ Derrone nồng độ 5 và 10 μg/ml .....................................................................45 Hình 22: Đồ thị biểu diến giá trị IC50 của Derrone đối với dòng H1299 từ thời điểm 53 đến 76 giờ thí nghiệm...........................................................................................45 Hình 23: Đồ thị biểu diễn đƣờng cong đáp ứng liều dòng H1299 dƣới tác động của Derrone tại thời điểm 76 giờ .....................................................................................46 Hình 24: Đồ thị biểu diễn trạng thái của HeLa dƣới tác dụng của Derrone theo thời gian ............................................................................................................................46 Hình 25: Đồ thị biểu diễn trạng thái của HeLa dƣới tác dụng của VX-680 theo thời gian ............................................................................................................................47 Hình 26: Đồ thị biểu diến giá trị IC50 của Derrone đối với dòng HeLa từ thời điểm 40 đến 78 giờ thí nghiệm...........................................................................................47 Hình 27: Đồ thị biểu diễn đƣờng cong đáp ứng liều dòng HeLa dƣới tác động của Derrone ở thời điểm 78 giờ .......................................................................................48 Hình 28: Hình ảnh tế bào sau 48 giờ ủ với chế phẩm Derrone và Taxol..................50 Hình 29: Đƣờng cong đáp ứng liều của HEK 293 với chất Derrone và Taxol .........51 Hình 30: Hình ảnh tế bào HeLa dƣới sự tác động của Taxol, VX-680 và Derrone .52 Hình 31: Hình ảnh tế bào MCF7 dƣới sự tác động của Taxol, VX-680 và Derrone 53 Hình 32: Biểu đồ thể hiện sự ảnh hƣởng của Derrone lên chu trình tế bào ở mẫu đối chứng và các mẫu ủ Derrone trong 8, 15 và 24 giờ ..................................................55 Hình 33: Biểu đồ thể hiện giá trị FSC của tế bào ở mẫu đối chứng và các mẫu ủ Derrone trong 8, 15 và 24 giờ ...................................................................................56 Hình 34: Sự biểu hiện H3PS10 tại các kỳ khác nhau trong quá trình phân chia của tế bào HeLa ở mẫu đối chứng sinh học.........................................................................57 Hình 35: So sánh biểu hiện của H3PS10 trên tế bào HeLa dƣới tác động của thuốc ...................................................................................................................................58 Hình 36: So sánh biểu hiện của H3PS10 và Aurora B trên tế bào MCF-7 dƣới tác động của VX-680, Derrone với đối chứng................................................................59 Nguyễn Thị Như Trang K20 - Sinh học thực nghiệm vii
  8. Luận văn cao học Hình 37: Biểu đồ thể hiện cƣờng độ tín hiệu H3PS10 của tế bào dƣới tác động của Derrone 15μg/ml so với đối chứng Taxol trên dòng tế bào HeLa ............................60 Hình 38: Dự đoán khả năng và vị trí liên kết của Derrone với Aurora B sử dụng phần mềm AutoDock Vina, so sánh với Luteolin và VX-680 ..................................63 Nguyễn Thị Như Trang K20 - Sinh học thực nghiệm viii
  9. Luận văn cao học DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Viết đầy đủ APC/C Anaphase-promoting Complex/Cylosome ATP Adenosine Triphosphate BSA Bovine serum albumin BTAK Breast Tumor Activated Kinaza Cdk Cyclin-dependent Kinaza CPC Chromosomal Passenger Complex – Phức hệ protein hành khách ĐCDM Đối chứng dung môi ĐCSH Đối chứng sinh học Der Derrone DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium DMSO Dimethyl Sulfoxide DNA Deoxyribonucleic Acid FBS Fetal Bovine Serum PFA Paraformaldehyde H3PS10 Histon H3 phosphoryl hóa tại Serine 10 HP1 Heterochromatin protein 1 IC50 Inhibitory Concentration 50% - Nồng độ ức chế tăng sinh 50% INCENP Inner Centromere Protein LSM Laser Scanning Microscope MAPK Mitogen – activated Protein Kinase MCAK Mitotic Centromere – associated kinesin MTT 3-[4,5-dimethylthiazol-2]-2,5 diphenyl tetrazolium bromide PBS Phosphate Buffered Saline PDB Protein Data Bank RPMI Roswell Park Memorial Institute Ser10 Serine 10 FSC Forward Scatter SSC Side Scatter Nguyễn Thị Như Trang K20 - Sinh học thực nghiệm ix
  10. Luận văn cao học MỞ ĐẦU Hóa trị là một phƣơng pháp truyền thống, mang tính chất toàn thânvà là một trong những phƣơng pháp đƣợc sử dụng đầu tiên trong điều trị ung thƣ. Những tiến bộ vƣợt bậc trong những thập niên vừa qua đã góp phần khẳng định và nâng cao vai trò của hóa trị ung thƣ. Các tiến bộ trong lĩnh vực sinh học ung thƣ đã và đang hoàn thiện phƣơng pháp điều trị này bằng việc tìm ra các thuốc mới có cơ chế tác động mang tính đặc hiệu hơn. Song song với đó, việc nghiên cứu chuyên sâu về bản chất, cơ chế phát sinh và xâm lấn của căn bệnh này cũng đang đƣợc quan tâm nghiên cứu. Trong quá trình đa giai đoạn hình thành khối u, tế bào ung thƣ thu nhận và biểu hiện nhiều đặc điểm, trong đó có sáu khả năng sinh học nổi bật tạo nên đặc tính phức tạp về mặt tổ chức của bệnh, bao gồm: duy trì tín hiệu tăng sinh; trốn tránh các yếu tố ức chế khối u; chống lại sự chết của tế bào; cho phép nhân lên gần nhƣ bất tử; cảm ứng hình thành mạch máu và hoạt hóa quá trình xâm lấn và di căn. Quá trình xảy ra xuyên suốt để tế bào bất thƣờng hình thành khối u trong cơ thể chính là sự tăng sinh không kiểm soát của tế bào, mà nguyên phân là giai đoạn thiết yếu. Vì vậy để ngăn chặn ung thƣ, nguyên phân trở thành một đích tác động đầy tiềm năng. Kết hợp những kiến thức và thành tựu khoa học đó, đã có rất nhiều hợp chất đƣợc thử nghiệm nghiên cứu tác dụng ức chế sự phát triển của tế bào ung thƣ nhắm đến các yếu tố khác nhau tham gia vào nguyên phân, trong đó các enzym kinaza điều khiển chu trình tế bào là mối quan tâm hàng đầu của các nhà khoa học trên thế giới trong những năm gần đây. Ở Việt Nam, đây vẫn đang là một hƣớng nghiên cứu mới, hứa hẹn những phát hiện mang tính đột phá. Vốn là một đất nƣớc đƣợc thiên nhiên ƣu đãi, nằm trong vùng nhiệt đới gió mùa, Việt Nam có một thảm thực vật vô cùng phong phú và đa dạng với hơn 12.000 loài thực vật bậc cao khác nhau. Từ nhiều thế kỷ nay, thực vật không chỉ là nguồn cung cấp dinh dƣỡng cho con ngƣời mà còn là những phƣơng thuốc chữa bệnh hết sức quý giá bao gồm thuốc chống ung thƣ nói riêng và các bệnh khác nói chung. Nguyễn Thị Như Trang K20 - Sinh học thực nghiệm 1
  11. Luận văn cao học Bởi vậy, nghiên cứu tìm ra các hợp chất từ nguồn dƣợc liệu thiên nhiên có khả năng chữa ung thƣ là một hƣớng nghiên cứu đƣợc nhiều nhà khoa học và thầy thuốc đầu tƣ tập trung nghiên cứu trong nhiều năm nay. Phát triển cùng xu hƣớng, và nhằm góp phần đẩy mạnh hơn nữa việc nghiên cứu các chế phẩm có tiềm năng chữa ung thƣ, đặc biệt là các chế phẩm có khả năng tác động lên các enzym kinaza trong chu trình tế bào, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu khả năng ức chế hoạt tính Aurora kinaza in vitro của Derrone phân lập từ cây Vông nem Erythrina orientalis L. Murr” với các nhiệm vụ chính nhƣ sau:  Kiểm tra ảnh hƣởng của Derrone lên sự tăng trƣởng của một số dòng tế bào ung thƣ nuôi cấy đơn lớp 2D.  Nghiên cứu ảnh hƣởng của Derrone lên chu trình tế bào.  Bƣớc đầu nghiên cứu tác động của Derrone lên hoạt tính của Aurora kinaza thông qua kiểm tra khả năng ức chế sự phosphoryl hóa histon H3 ở vị trí Serine 10 (H3PS10). Nguyễn Thị Như Trang K20 - Sinh học thực nghiệm 2
  12. Luận văn cao học Chƣơng 1 – TỔNG QUAN 1.1. NGUYÊN PHÂN Nguyên phân là giai đoạn quan trọng nhất trong chu trình tế bào. Mặc dù đây là giai đoạn chiếm thời gian ít nhất– chỉ khoảng 1 giờ ở tế bào đông vật có vú – tuy nhiên đó lại là giai đoạn có ảnh hƣởng nhiều nhất đến số phận của tế bào.Kết quả của quá trình này là đảm bảo từ một tế bào mẹ tạo ra hai tế bào con giống hệt nhau và giống hệt tế bào mẹ về vật chất di truyền. Ở tế bào soma điển hình, quá trình nguyên phân đƣợc chia làm hai pha chính là pha phân chia nhân (mitosis) và phân chia tế bào chất (cytokinesis). 1.1.1. Pha phân chia nhân (mitosis) Về cơ bản, pha phân chia nhân ở tất cả các sinh vật nhân chuẩn phải đảm bảo đƣợc sự phân chia chính xác các nhiễm sắc tử chị em về hai tế bào con. Những sự kiện chính của nguyên phân gồm có sự co đặc nhiễm sắc thể, hình thành thoi phân bào và sự liên kết của nhiễm sắc tử với các dây tơ vô sắc. Các nhiễm sắc tử chị em sau đó sẽ phân chia về hai cực của thoi vô sắc và hình thành hai nhân con[8]. Quá trình phân chia nhân thông thƣờng đƣợc chia làm bốn giai đoạn: kỳ đầu (prophase), kỳ giữa (metaphase), kỳ sau (anaphase) và kỳ cuối (telophase)(Hình 1). Kỳ đầu khởi đầu bằng sự co đặc của nhiễm sắc thể. Phân tử ADN mới đƣợc hình thành sau quá trình nhân đôi ở pha S vẫn còn đang tháo xoắn và quấn vào nhau, lúc này sẽ đƣợc gỡ rối và co đặc lại, hai nhiễm sắc tử chị em của cùng một nhiễm sắc thể sẽ dính nhau nhờ phức hệ protein sắp xếp quanh tâm động, tạo nên cấu trúc kinetochore, cũng là nơi gắn của sợi vô sắc trong kỳ đầu giữa. Ngoài ra ở giai đoạn này, những thay đổi của các phân tử trong tế bào chất giúp kích thích hình thành thoi phân bào.Trung thể (đã đƣợc nhân đôi ở kỳ trung gian) phân tách ra và di chuyển về phía đối diện tạo thành hai cực của thoi phân bào.Trong kỳ đầu còn xảy ra hiện tƣợng màng nhân biến mất, tuy nhiên hiện tƣợng này chỉ xảy ra ở tế bào động vật bậc cao. Một số cơ thể đơn bào nhƣ nấm men, quá trình nguyên phân xảy ra ở dạng kín khi màng nhân vẫn còn nguyên vẹn. Nguyễn Thị Như Trang K20 - Sinh học thực nghiệm 3
  13. Luận văn cao học Kết thúc kỳ đầu, tế bào bƣớc vào kỳ đầu giữa (prometaphase), là thời kỳ chuyển tiếp giữa kỳ đầu và kỳ giữa.Lúc này, các sợi vô sắc ở hai phía của của thoi phân bào đƣợc gắn với kinetochore tƣơng ứng ở hai phía của nhiễm sắc thể.Nhiễm sắc thể đang nằm lộn xộn trong tế bào đƣợc sắp xếp thành một hàng trên mặt phẳng xích đạo của thoi vô sắc ở kỳ giữa.Đây là giai đoạn hết sức quan trọng với sự tham gia của rất nhiều protein để đảm bảo sự sắp xếp và gắn chính xác của nhiễm sắc thể với thoi phân bào. Quá trình chuyển từ kỳ giữa sang kỳ sau đƣợc kích hoạt bởi sự phá vỡ liên kết giữa hai nhiễm sắc tử chị em, và sau đó là sự phân ly về hai cực thoi phân bào. Nguyên phân kết thúc vào kỳ cuối, khi màng nhân con hình thành tạo thành hai nhân tách biệt, nhiễm sắc thể tháo xoắn [8]. Hình 1: Mitosis và cytokinesis [8] 1.1.2. Pha phân chia tế bào chất (cytokinesis) Quá trình nguyên phân có đƣợc hoàn thành hay không hoàn toàn phụ thuộc vào quá trình phân chia tế bào chất, tạo hai tế bào con.Quá trình này thƣờng bắt đầu Nguyễn Thị Như Trang K20 - Sinh học thực nghiệm 4
  14. Luận văn cao học ở cuối kỳ sau và đƣợc thúc đẩy do sự bất hoạt Cdk1. Ở động vật và nấm men, tế bào chất đƣợc phân chia bằng việc hình thành phức hệ vòng có khả năng co rút gồm sợi actin và myosin II bao xung quanh. Rãnh phân cắt nằm ở đúng vị trí mặt phẳng xích đạo của thoi vô sắc, đƣợc hình thành do hệ vòng sợi actin – myosin co lại và chia đôi tế bào chất. Mối liên kết giữa hai tế bào sau đó đƣợc phá vỡ tạo hai tế bào con. Khác với tế bào động vật, tế bào thực vật phân chia bằng cách hình thành vách tế bào ở trung tâm của tế bào chất, từ từ lan ra cho đến khi chạm vào mặt ngoài của tế bào và cắt tế bào thành hai tế bào con. 1.1.3. Một số sự kiện quan trọng trong nguyên phân 1.1.3.1. Sự phosphoryl hóa histon H3 ở vị trí Serine 10 Quá trình đóng xoắn vàtháo xoắn nhiễm sắc thể trong nguyên phân là những sự kiện phức tạp với sự tham gia của nhiều loại protein điều khiển trong tế bào. Nhiễm sắc thể co ngắn cực đạiở kỳ giữa, sau đó tháo xoắn để thực hiện sao chép, sửa chữa, tái tổ hợp và phiên mã ở pha S. Để thực hiện đƣợc những hoạt động đó, các nhà khoa học đã nghiên cứu và tìm ra rằng chính protein histon, cụ thể là sự phosphoryl hóa histon H3, là yếu tố quan trọng nhất. Không chỉ vậy, sự phosphoryl hóa này còn là một dấu hiệu để nhận biết tế bào đang ở nguyên phân.Có bốn vị trí trên phân tử histon H3 đƣợc phosphoryl hóa là Thr3, Ser10, Thr11 và Ser28.Tuy nhiên trong nghiên cứu này, chúng tôi tập trung tìm hiểu về quá trình phosphoryl hóa H3 tại Ser10 (H3PS10), nhân tố đóng vai trò thiết yếu điều khiển quá trình đóng xoắn và mở xoắn nhiễm sắc thể. Quá trình H3PS10 xảy ra ở cả kỳ trung gian và trong nguyên phân, tuy nhiên mức độ và chức năng lại rất khác nhau.Ở kỳ trung gian, H3PS10 chủ yếu phụ thuộc vào sự cải biến sau dịch mã ở những axit amin xung quanh. Ví dụ nhƣ trên Hình 2, H3PS10 tăng khi Lys9 hoặc Lys14 đƣợc acetyl hóa và giảm khi Lys9 đƣợc dimethyl hóa. Trái ngƣợc với ở nguyên phân và giảm phân, H3PS10 xảy ra ở kỳ trung gian không ảnh hƣởng đến toàn bộ hệ gen mà chỉ liên quan đến những gen đơn lẻ và kích hoạt sao chép của gen đó. Nguyễn Thị Như Trang K20 - Sinh học thực nghiệm 5
  15. Luận văn cao học Hình 2: Sự phosphoryl hóa H3 ở kỳ trung gian[39] Sự phosphoryl hóa H3ở vị trí Ser10 trong kỳ trung gian cũng có liên quan đến sự đóng xoắn của nhiễm sắc thể ở nguyên phân, cùng với đó, sự mở xoắn đƣợc thực hiện bởi quá trình đề phosphoryl hóa. Vào cuối G2, sự phosphoryl hóa xảy ra ở vùng gần tâm động của nhiễm sắc thể, sau đó lan rộng ra toàn bộ nhiễm sắc thể và đƣợc hoàn thành ở kỳ đầu. Đến kỳ sau và kỳ cuối, H3 đƣợc giải phosphoryl hóa [39]. Đã có nhiều nghiên cứu tìm hiểu về vai trò thực sự của quá trình này, và liệu tế bào có thể bƣớc vào nguyên phân mà không có sự phosphoryl hóa H3 hay không? Van Hooser và cộng sự đã thực hiện vi tiêm một đoạn peptit mang trình tự Ser10 vào trong tế bào từ pha S để làm trung hòa các kinaza có khả năng phosphoryl hóa H3 trong pha G2/M. Kết quả thu đƣợc là tế bào bị bắt giữ ở G2/M mà không bƣớc vào nguyên phân[55]. Nghiên cứu này tuy không trực tiếp chứng minh đƣợc vai trò của H3PS10 trong pha chuyển G2 sang M, nhƣng có thể khẳng định vai trò thiết yếu của các kinaza. Đồng thời nghiên cứu cũng chứng minh rằng H3PS10 là cần thiết để khởi động quá trình đóng xoắn nhiễm sắc thể và duy trì cho đến kỳ giữa.Một số nghiên cứu khác ở cấp độ phân tử của Wei và cộng sự cũng có đồng quan điểm khi ông tiến hành gây đột biến thay thế vị trí Ser10 thành Alanin. Kết quả là có sự biến đổi bất thƣờng trong quá trình đóng xoắn và phân tách nhiễm sắc thể [56]. Quá trình phosphoryl hóa H3 tại Ser10 ở các loài khác nhau đƣợc điều hòa chặt chẽ bởi hoạt động của các enzymkinaza và phosphataza đặc hiệu để đảm bảo Nguyễn Thị Như Trang K20 - Sinh học thực nghiệm 6
  16. Luận văn cao học sự đóng xoắn và tháo xoắn nhiễm sắc thể trong nguyên phân đƣợc thực hiện một cách nhịp nhàng và chính xác. 2. Các kinaza tham gia phosphorylhóa H3 tại Ser10 trong nguyên phân Cho đến nay, đã có rất nhiều các nghiên cứu trên thế giới nhằm tìm ra các kinaza chịu trách nhiệm phosphoryl hóa H3 ở Ser10 trong nguyên phân.Ở nấm men Saccharomyces cerevisae chỉ có một loại kinaza duy nhất là Ipl1p thực hiện nhiệm vụ này, hay ở Schizosaccharomyces pombe là Ark1 (Aurora kinase 1)[20, 38]. Các cơ thể đa bào nhƣ ruồi giấm và giun tròn có hai loại Aurora kinaza A và B, trong khi ở động vật có vú, Aurora C cũng có khả năng phosphoryl hóa H3 Ser10 trong quá trình hình thành phôi[54]. Aurora A và B có khả năng phosphoryl hóa H3 Ser10 in vitro, tuy nhiên khi bất hoạt gen Aurora A không làm ảnh hƣởng đến quá trình này ở giun tròn và ruồi giấm. Vậy có thể Aurora A không liên quan trực tiếp đến H3PS10. Ở tế bào động vật có vú, các nhà khoa học đã quan sát thấy vị trí phân bố của Aurora B tƣơng đồng với sự biểu hiện H3PS10, và chứng minh đƣợc rằng Aurora B khả năng tác động trực tiếp lên quá trình phosphoryl hóa. Sự biểu hiện H3PS10 giảm mạnh khi ức chế Aurora B bằng Hesperadin hay ZM447439. Ngoài ra, sự biểu hiện quá mức của các kinaza ức chế Aurora B trong tế bào cũng làm giảm H3PS10, dẫn đến những biến đổi bất thƣờng trong quá trình đóng xoắn nhiễm sắc thể[15]. Sau Aurora B, MacCallum và cộng sự đã tìm ra một protein thuộc họ kinaza có khả năng phosphoryl hóa H3 tại Ser10 ở nấm sợi Aspergillus nidulans, đƣợc đặt tên là NIMA (never in mitosis). Sự định vị của NIMA trên nhiễm sắc thể ở giai đoạn đầu của nguyên phân tƣơng đồng với vị trí H3 đƣợc phosphoryl hóa, và sự bất hoạt NIMA làm tế bào không thể bƣớc vào nguyên phân [9].Ở tế bào động vật có vú cũng có một số protein có chức năng tƣơng tự NIMA đƣợc gọi là Neks (NIMA – related kinases), điển hình là Nercc1.Một kinaza khác là VRK1 (vacinia-related kinase 1) ở ngƣời cũng có vị trí phân bố trong nguyên phân tƣơng đồng với H3PS10 khi quan sát trên tế bào HeLa. Biểu hiện H3PS10 cũng giảm mạnh khi thực hiện loại bỏ gen VRK1 trong tế bào. Nguyễn Thị Như Trang K20 - Sinh học thực nghiệm 7
  17. Luận văn cao học 3. Quá trình đề phosphoryl hóa của H3 tại Ser10 Hình 3: Chức năng (A) và hoạt động (B) của Aurora B và PP1 trong việc phosphoryl hóa H3 tại Ser10[39] Hoạt động phosphoryl hóa H3 đƣợc cân bằng bởi quá trình đề phosphoryl hóa bởi các phosphataza đặc hiệu, cụ thể ở đây là PP1 (protein phosphatase 1).Trong quá trình nghiên cứu tìm ra Ipl1p trên nấm men, các nhà khoa học cũng chứng minh vai trò của Glc7p, là một PP1 có tác dụng đối lập với Ipl1p.Trong quá trình nguyên phân ở tế bào động vật có vú, cả Aurora B và PP1 đều có liên quan và tƣơng tác với nhiễm sắc thể, cụ thể là với H3 ở Ser10.PP1 không chỉ đề phosphoryl hóa Ser10 mà nó còn có khả năng đề phosphoryl hóa và làm bất hoạt chính Aurora B, thậm trí cả Aurora A ở điều kiện in vitro (Hình 3-A)[39].Vì vậy trong phân bào, PP1 kết hợp với Aurora B tạo thành phức, điều hòa biểu hiện của H3PS10. Khi bƣớc vào nguyên phân (từ kỳ đầu đến kỳ giữa), nồng độ H3PS10 tăng dần cùng với hoạt động của Aurora B, PP1 bị ức chế bởi Cdc2 [15]. Đến đầu kỳ sau, Aurora B tách khỏi nhiễm sắc thể, cùng với đó là sự kích hoạt của PP1 dẫn đến biểu hiện H3P10 giảm dần (Hình 3-B). 3.1.1.1. Điểm kiểm soát thoi phân bào (mitotic spindle checkpoint) Điểm kiểm soát thoi phân bào là một ví trí hết sức quan trọng, nó giúp tế bào dừng lại ở kỳ giữa để kiểm tra, đảm bảo rằng tất cả các sợi vô sắc đƣợc gắn chính xác với nhiễm sắc thể, hình thành cấu trúc thoi phân bào hoàn chỉnh trƣớc khi bƣớc vào kỳ sau.Khi các nhiễm sắc tử chị em bắt đầu gắn với các sợi vô sắc của thoi phân bào, không phải tất cả xảy ra hoàn toàn đối xứng nhau ở hai cựcvà trong cùng thời Nguyễn Thị Như Trang K20 - Sinh học thực nghiệm 8
  18. Luận văn cao học gian.Bất kỳ một sai sót nào cũng làm cho tế bào bị dừng lại.Ngoài việc gắn đúng vị trí, tế bào còn phải đảm bảo đƣợc độ căng giữa sợi vô sắc với kinetochore trên nhiễm sắc thể.Đây cũng chính là tín hiệu cơ bản kích hoạt trạm kiểm soát thoi phân bào. Hình 4: Cơ chế hoạt động của điểm kiểm soát phân bào [13] Điểm kiểm soát quan trọng này hoạt động bằng cách ức chế phức hệ thúc đẩy kỳ sau APC/C, ngăn cản không cho tế bào bƣớc vào kỳ sau. APC/C là một enzymnối có chức năng đánh dấu một sốyếu tố điều hòa chu trình tế bào để chúng bị các tiêu thể 26S nhận diện và phân giảibằng quá trình ubiquitin hóa. Các protein tham gia kiểm soát thoi phân bào gồm có Mad1, Mad2, BubR1, Bub1, Bub3 mà Mps1. Hệ thống protein này ức chế hoạt động của Cdc20, yếu tố gắn đặc hiệu với APC/C. Khi tất cả các kinetochore đã đƣợc gắn chính xác, Cdc20 đƣợc giải phóng ra, đi đến gắn và kích hoạt APC/C, trạm kiểm soát đóng lại, tế bào bƣớc vào kỳ sau. Các protein trong điểm kiểm soát phân bào chủ yếu đóng vai trò nhận biết tín hiệu, Nguyễn Thị Như Trang K20 - Sinh học thực nghiệm 9
  19. Luận văn cao học một số điều hòa hoạt động của APC/C hay làm nhiệm vụ đóng cửa trạm kiểm soát. Trong số đó, securin đóng vai trò chủ chốt.Securin là một protein ức chế separase, enzym có nhiệm vụ phân hủy phân tử kết nối hai nhiễm sắc tử chị em. Khi securin gắn với phức hệ APC/C ở dạng hoạt động sẽ kích thích tín hiệu phân hủy và giải phóng separase, từ đó đẩy nhiễm sắc thể về hai cực tế bào (Hình 4) [13]. 3.1.1.2. Hiện tượng “mitotic slippage” Mitotic slippage, còn đƣợc biết đến nhƣ một quá trình đáp ứng điểm kiểm soát, là hiệntƣợng tế bào thoát khỏi nguyên phân để trốn tránh quá trình apoptosis khi tế bào bị dừng lại trong thời gian dài.Ở tế bào ngƣời, mitotic slippage thƣờng liên quan đến sự phân hủy cyclin B. Khi có tín hiệu bất thƣờng trong quá trình gắn sợi vô sắc với nhiễm sắc thể, kinetochore sẽ giải phóng Mad2.Mad2 gắn vào Cdc20, làm tách phân tử này ra khỏi phức hệ APC/C. Lúc này APC/C bị bất hoạt và ngăn cản phân hủy securin.Quá trình này giúp giữ tế bào lại để sửa chữa sai hỏng. APC/C hoạt động trở lại khi liên kết đƣợc với Nek2A, sẽ ức chế hoạt động của phức hệ cyclin B/Cdk1 bằng cách phân cắt cyclin B[51]. Điều này giúp tế bào thoát khỏi nguyên phân với tình trạng thoi phân bào bị sai hỏng. Một ý kiến khác cũng đƣợc đề xuất, đó là sự khuyết thiếu trong hoạt động của CPC ở tâm động cũng có thể dẫn đến sự thoát khỏi nguyên phân sớm khi không có sự tham gia của Mad2 và Bub1 [50]. 3.2. AURORA KINAZAVÀ VAI TRÒ TRONG UNG THƢ 3.2.1. Aurora kinaza Quá trình phân chia tế bào là một trong những dấu hiệu đặc trƣng của cơ thể, và đƣợc kiểm soát chặt chẽ bởi rất nhiều loại protein.Trong mạng lƣới protein điều hòa đó, Aurora kinaza là một thành phần quan trọng, đóng vai trò thiết yếu trong quá trình phân bào.Chúng liên quan đến việc điều hoà hoạt động của một số điểm kiểm soát, sự sắp xếp của các nhiễm sắc thể ở kỳ giữa và sự định hƣớng các nhiễm sắc thể khi phân ly về hai cực.Hoạt động của Aurora kinaza đƣợc điều hoà rất chính xác, chủ yếu là bởi quá trình phosphoryl hoá và phân huỷ. Sự mất kiểm soát trong Nguyễn Thị Như Trang K20 - Sinh học thực nghiệm 10
  20. Luận văn cao học điều hoà hoạt động của Aurora kinaza có thể dẫn đến bất thƣờng trong nguyên phân, ảnh hƣởng đến sự bền vững di truyền, làm mất chức năng của trung tử trong hình thành thoi vô sắc, sự sắp xếp của nhiễm sắc thể bị rối loạn, và ảnh hƣởng đến quá trình phân chia tế bào chất[12]. Sự điều hoà tăng trong cả mức độ biểu hiện và hoạt động của Aurora kinaza đƣợc tìm thấy trong rất nhiều loại ung thƣ ở ngƣời. Các Aurora kinaza đƣợc đặc biệt chú ý từ khi chúng đƣợc xác định là các gen gây ung thƣ thực sự. Aurora kinaza là enzym thuộc họ kinaza serine/threonin, có tính bảo thủ cao ở các loài sinh vật.Aurora kinaza đầu tiên đƣợc tìm thấy là ở Drosophila [12]. Bởi những đột biến của enzym này gây sai hỏng trong quá trình phân tách của trung thể, làm ảnh hƣởng đến quá trình hình thành hai cực của thoi vô sắc, vì vậy nó đƣợc gọi là Aurora (có nghĩa là Bắc Cực).Sau đó, các enzym có cấu trúc đồng đẳng cũng đã đƣợc tìm thấy ở những loài khác nhau.Saccharomyces cerevisae cũng có một loại Aurora kinaza là Ipl1, ở giun tròn[43, 44], Drosophila[14], và Xenopus [3, 42], có hai loại Aurora kinaza là A và B. Đặc biệt, hệ gen của động vật có vú chứa các gen mã cho đầy đủ ba loại Aurora kinaza là A, B và C. Từ những sự khác biệt này có thể nhận thấy cấu trúc của các loại Aurora có sự rẽ nhánh khi tiến hóa. Hơn nữa, từ cây phát sinh chủng loại cũng cho thấy rằng họ Aurora ở động vật có xƣơng sống có liên quan đến nhau và xuất phát từ cùng một tổ tiên chung. Aurora A bắt nguồn từ sự rẽ nhánh giữa động vật máu lạnh và lớp thú, trong khi đó Aurora B và C có thể đƣợc suy đoán là hình thành từ một gen chung Aurora B/C ở động vật máu lạnh[5]. 3.2.1.1. Cấu trúc Aurora kinaza Enzym Aurora chia làm ba loại là Aurora A, B và C, có kích thƣớc phân tử khác nhau từ 309 – 403, và giữa các loài cũng có sự khác nhau về cấu trúc. Ví dụ, độ tƣơng đồng về cấu trúc enzym Aurora A giữa ngƣời và động vật gặm nhấm là82%, của Aurora B là 84% và Aurora C là 78%[4]. Các cấu trúc chung của Aurora gồm một vùng đầu N dài 39-129, một vùng thực hiện chức năng phosphoryl hóa và vùng đầu C ngắn có kích thƣớc 15-20 axit amin (Hình 3). Đầu N của Aurora Nguyễn Thị Như Trang K20 - Sinh học thực nghiệm 11
ADSENSE

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

LV.11: Bộ Luận Văn Tốt Nghiệp Chuyên Ngành Tài Chính Ngân Hàng
172 tài liệu
841 lượt tải
THÔNG TIN
TRỢ GIÚP
HỖ TRỢ KHÁCH HÀNG
Theo dõi chúng tôi

Chịu trách nhiệm nội dung:

Nguyễn Công Hà - Giám đốc Công ty TNHH TÀI LIỆU TRỰC TUYẾN VI NA

LIÊN HỆ

Địa chỉ: P402, 54A Nơ Trang Long, Phường 14, Q.Bình Thạnh, TP.HCM

Hotline: 093 303 0098

Email: support@tailieu.vn

Giấy phép Mạng Xã Hội số: 670/GP-BTTTT cấp ngày 30/11/2015 Copyright © 2022-2032 TaiLieu.VN. All rights reserved.

 

Đồng bộ tài khoản
7=>1