intTypePromotion=1
zunia.vn Tuyển sinh 2024 dành cho Gen-Z zunia.vn zunia.vn
ADSENSE
 » 
 » 

Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu phát hiện vi khuẩn lao kháng đa thuốc bằng kỹ thuật sinh học phân tử

Chia sẻ: Na Na | Ngày: | Loại File: DOC | Số trang:84

Thêm vào BST
Báo xấu
191
lượt xem 29
download
 
  Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu nghiên cứu: Phát hiện nhanh các chủng vi khuẩn lao kháng thuốc thông qua xác định các vị trí đột biến liên quan kháng thuốc trên gen katG và rpoB bằng phương pháp giải trình tự và kỹ thuật multiplex real-time PCR.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu phát hiện vi khuẩn lao kháng đa thuốc bằng kỹ thuật sinh học phân tử

  1. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­ Nguyễn Văn Bắc NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN VI KHUẨN LAO KHÁNG ĐA  THUỐC BẰNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
  2. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN KHOA SINH HỌC Nguyễn Văn Bắc NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN VI KHUẨN LAO KHÁNG ĐA  THUỐC BẰNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60 42 30 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS. TS. Nghiêm Ngọc Minh
  3. Hà Nội – 2010
  4. Luận văn thạc sĩ                                                                                      Nguy ễn Văn  Bắc Lời cảm ơn! Tôi xin bày tỏ  lòng biết  ơn sâu sắc tới PGS.TS. Nghiêm Ngọc Minh, Trưởng   phòng Công nghệ sinh học Môi trường, Viện Công nghệ  Sinh học – người thầy đã   tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, dìu dắt, giúp đỡ  tôi trong thời gian thực tập và hoàn   thành khóa luận này. Tôi cũng xin bày tỏ  lòng biết  ơn sâu sắc tới PGS.TS. Nguyễn Thái Sơn Học   viện Quân y cùng tập thể cán bộ phòng Công nghệ sinh học Môi trường, Viện Công   nghệ  Sinh học đã nhiệt tình giúp đỡ, truyền đạt kinh nghiệm quý báu cho tôi trong   suốt thời gian thực tập và hoàn thành khóa luận. Qua đây, tôi cũng xin gửi lời cảm  ơn chân thành tới các thầy cô giáo trong   khoa Sinh học và các thầy cô giáo trong bộ  môn Sinh lý Thực vật và Hóa sinh,   trường Đại học KHTN đã hướng dẫn, truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá   trình học tập và nghiên cứu. Cuối cùng, tôi xin dành cho những người thân trong gia đình và bạn bè lòng   biết  ơn sâu sắc, những người thân yêu đã luôn bên tôi, động viên và góp ý cho tôi   trong suốt quá trình học tập và hoàn thành khóa luận. Hà Nội, tháng 12 năm 2010                                                                                                     H ọc viên                                                                                                       Nguyễn Văn Bắc
  5. Luận văn thạc sĩ                                                                                      Nguy ễn Văn  Bắc DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Bp : Base pairs CNSH ̣ ̣ : Công nghê sinh hoc CTCLQG : Chương trinh chông lao quôc gia ̀ ́ ́ DNA : Acit deoxyribonucleic dNTPs : Deoxyribonucleotide Triphosphate EDR ́ ở rông) : Extensively drug resitant (Khang thuôc m ́ ̣ EMB : Ethambutol. HRS ̣ : Ba loai thuôc isoniazid, rifampicin, streptomycin ́ HRSE : Bốn loai thuôc isoniazid, rifampicin, streptomycin và ethambutol ̣ ́ INH : Isoniazid IPTG : Isopropyl­thio­β­D­galactoside Kb : Kilo base LB : Luria ­ Bertani MDR : Multidrugs resistant (Khang đa thuôc)  ́ ́ PAS : Paraminosalicylic acid PAZ : Pyrazinamid PCR : Polymerase Chain Reaction RMP : Rifampicin RNA : Acid Ribonucleic  RRDR : Rifampin resistance determining region (Vùng quyết định kháng  rifampicin) Taq polymerase : Thermus aquaticus DNA polymerase TCYTTG ̉ ưc Y tê Thê gi : Tô ch ́ ́ ́ ới
  6. Luận văn thạc sĩ                                                                                      Nguy ễn Văn  Bắc V : Volume (thể tích) X­gal : 5­bromo­4­chloro­3­indolyl­β­D­galactopyranoside MỤC LỤC  Kết quả phát hiện đột biến                                                                                                      ..................................................................................................       61
  7. Luận văn thạc sĩ                                                                                      Nguy ễn Văn  Bắc MỞ ĐẦU Bệnh lao và vi khuẩn lao (Mycobacterium tuberculosis) đã được biết rõ từ  một thế  kỷ  nay. Hiện nay tỷ  lệ  nhiễm lao được  ước tính là 1/3 dân số  thế  giới,   khoảng 9 triệu người mắc lao mới và hơn 3 triệu người chết do lao mỗi năm. Bệnh  lao đang trở  nên nghiêm trọng hơn với sự  xuất hiện các chủng lao kháng đa thuốc  (Multi­Drugs Resistant ­ MDR), tức là thể  lao với vi khuẩn kháng ít nhất hai loại   thuốc chống lao mạnh nhất là isoniazid (INH) và rifampicin (RMP). Theo số  liệu   thống   kê   của   chương   trình   chống   lao   Quốc   gia   năm   2007,   thế   giới   có   khoảng   511.000 trường hợp nhiễm lao kháng đa thuốc, trong đó có hơn 130.000 trường hợp  tử  vong. Do những khó khăn trong việc điều trị  những bệnh nhân mang các chủng   lao kháng thuốc phổ  rộng và đa kháng mà việc phát hiện sớm các chủng lao kháng   đa thuốc sẽ trở nên rất quan trọng trong điều trị bệnh lao. Hiện nay nhiều nơi chẩn đoán vi khuẩn lao kháng thuốc vẫn dựa vào phương   pháp nuôi cấy vi khuẩn và làm kháng sinh đồ là chủ yếu, tuy nhiên, việc ứng dụng   sinh học phân tử cũng đang tạo ra những đột phá trong phát hiện vi khuẩn lao kháng   thuốc. Cơ  chế  kháng thuốc  ở  vi khuẩn lao là do trong quá trình tiến hóa, có nhiều   đột biến xuất hiện trong một số  gen chức năng, trước hết là  ở  gen rpoB và  katG.  Thời gian chẩn đoán có thể rút ngắn chỉ còn vài ngày, với độ  nhạy và độ  đặc hiệu   cao, tạo điều kiện cho kiểm soát bệnh lao dễ dàng hơn. Các nghiên cứu về sinh học  phân tử  trong chẩn đoán lao kháng thuốc đã chỉ  ra rằng mỗi loại kháng thuốc là do  xuất hiện các đột biến trên gen tương ứng chịu trách nhiệm. Chính vì vậy việc xác  định các trường hợp nhiễm lao kháng thuốc thường đi kèm với những chẩn đoán  phát hiện đột biến gen đối với các chủng lao phát hiện được. Các chủng vi khuẩn  lao kháng isoniazid là do có liên quan tới đột biến tại codon 315 trên gen  katG, đối  1
  8. Luận văn thạc sĩ                                                                                      Nguy ễn Văn  Bắc với các chủng kháng rifampicin do xuất hiện các đột biến ở một vùng nóng gồm 27   codon nằm gần trung tâm của gen rpoB.  Xuất phát từ  những lý do trên, chúng tôi tiến hành đề  tài: “Nghiên cứu phát   hiện vi khuẩn lao kháng đa thuốc bằng kỹ thuật sinh học phân tử” Với mục tiêu nghiên cứu: phát hiện nhanh các chủng vi khuẩn lao kháng   thuốc thông qua xác định các vị trí đột biến liên quan kháng thuốc trên gen katG   và rpoB bằng phương pháp giải trình tự và kỹ thuật multiplex real­time PCR. Để đạt được mục tiêu của đề tài, chúng tôi tiến hành một số nội dung nghiên  cứu như sau: 1. Xác định trình tự gen rpoB và katG. 2. Phân tích đặc điểm phân tử  của các chủng vi khuẩn lao kháng thuốc  phân lập tại Việt Nam trên cơ sở trình tự nucleotide của hai gen  rpoB và  katG. 3. Tối  ưu hóa thành phần và chu trình bộ  kit multiplex real­time PCR phát  hiện nhanh vi khuẩn lao kháng thuốc. 2
  9. Luận văn thạc sĩ                                                                                      Nguy ễn Văn  Bắc Chương 1 – TỔNG QUAN 1.1. BỆNH LAO Lao (Tuberculosis) là một bệnh truyền nhiễm mạn tính, là tình trạng nhiễm vi  khuẩn Mycobacterium tuberculosis, thường gặp nhất ở phổi nhưng cũng có thể ảnh  hưởng đến hệ  thần kinh trung  ương (lao màng não), hệ  bạch huyết, hệ  tuần hoàn   (lao kê), xương và khớp. Bệnh lao gắn liền với sự phát triển của xã hội loài người   từ  hàng ngàn năm nay, trên thế  giới chưa bao giờ và không một quốc gia nào, một  khu vực nào, một dân tộc nào không có người mắc và chết vì bệnh lao. Trực khuẩn   lao lần đầu tiên được bác sĩ Robert Koch đã phát hiện vào ngày 24/3/1882 .  Trong  thời gian này ở Mỹ và châu Âu, cứ 7 người thì có 1 người chết vì lao, do vậy, phát   hiện của Robert Koch là một bước ngoặt quan trọng trong việc khống chế và loại  trừ  căn bệnh này. Trước đây, lao được xem là một trong những căn bệnh truyền   nhiễm nguy hiểm nhất trên thế giới, lưu hành với tỷ lệ mắc bệnh khá cao, đặc biệt  ở các nước thuộc châu Phi và khu vực châu Á, trong đó có Việt Nam. Việt Nam đứng thứ 12 trong 22 nước có số bệnh nhân lao cao trên toàn cầu.  Trong khu vực Tây Thái Bình Dương, Việt Nam đứng thứ  ba sau Trung Quốc và  Philippines về  số  bệnh nhân lao, cũng như  số  bệnh nhân lao xuất hiện hằng năm.  Hiện nay nguy cơ nhiễm lao  ở nước ta hằng năm được ước tính là 1,5% dân số  (ở  các tỉnh phía Nam là 2%,  ở  các tỉnh phía Bắc là 1%). Trên thực tế  chỉ  số  nguy cơ  nhiễm lao hàng năm có thể  cao hơn 1,5%, như vậy, các con số  nêu trên còn có thể  3
  10. Luận văn thạc sĩ                                                                                      Nguy ễn Văn  Bắc lớn hơn. Điều đó sẽ tăng thêm sự khó khăn đối với công tác phòng chống lao không  những trong các năm tới mà có thể  trong thời gian khá dài, có thể  đến hàng chục  năm, ngay cả khi ở thiên niên kỷ mới [3, 35]. 1.2. TÌNH HÌNH LAO KHÁNG THUỐC Bệnh lao ngày càng trở nên phức tạp và có ảnh hưởng nặng nề khi xuất hiện   thêm vi khuẩn lao kháng thuốc tạo nên một dạng bệnh khó phòng chống. Các chủng   lao   kháng   thuốc   được   chia   làm   hai   thể,   đó   là   lao   kháng   đa   thuốc   (Multi­drugs   resistant ­ MDR) và lao kháng thuốc phổ  rộng (Extensively drug resistant ­ XDR),   những chủng vi khuẩn lao kháng thuốc này là nguồn lây nhiễm và là mối đe dọa cho  sức khỏe của cộng đồng. Theo ước tính của Tổ chức Y tế thế giới (WHO), trên thế  giới có khoảng 42 vạn người mắc lao kháng đa thuốc, chiếm số lượng lớn nhất là ở  khu vực Tây Thái Bình Dương có 15 vạn trường hợp, kế đến là khu vực Đông Nam  Á và sau đó là khu vực Châu Phi và Đông Âu. Một số chủng lao vừa kháng đa thuốc   vừa kháng thuốc phổ  rộng, có thể  coi là loại siêu kháng thuốc   [17]. Tình hình lao  siêu kháng thuốc cũng ngày càng trở  nên trầm trọng, do vậy từ  tháng 11/2004 đến  11/2005, WHO và Trung tâm Kiểm soát Bệnh Hoa Kỳ đã phân tích 17.890 mẫu đờm   gửi từ  40 quốc gia trên toàn thế  giới, và thấy rằng có 20% trường hợp là kháng đa  thuốc và 2% trường hợp là kháng thuốc phổ rộng. Ở Việt Nam, theo nghiên cứu của  Chương trình Chống lao Quốc gia thì có 32,5% các trường hợp bệnh lao mới mang   vi khuẩn lao kháng thuốc [1, 3]. Vi khuẩn lao kháng thuốc là một thách thức lớn, đe dọa công cuộc phòng   chống lao trên toàn cầu, vì các thuốc chống lao có hiệu quả  hiện nay đang bị  vi   khuẩn lao kháng lại nhất là kháng đa thuốc [10]. Thuốc chống lao có nhiều loại, tác  dụng của mỗi thuốc trên trực khuẩn lao không giống nhau. Hiện nay người ta chia  thuốc chống lao thành hai loại: (1) các thuốc chống lao chủ  yếu (còn gọi là các   4
  11. Luận văn thạc sĩ                                                                                      Nguy ễn Văn  Bắc thuốc chống lao loại một, thuốc chống lao hàng đầu), (2) các thuốc chống lao thứ  yếu (còn gọi là các thuốc chống lao loại hai, thuốc chống lao hàng thứ  hai). Trong   khi các thuốc chống lao loại một là những thuốc có hiệu quả  nhất và cũng ít độc   tính nhất, thì các thuốc chống lao hàng thứ hai là những thuốc có tác dụng kém hơn  lại có độc tính cao và giá thành rất đắt.  Ở  New York, chi phí điều trị  bệnh nhân   nhạy với thuốc chỉ mất 2.000 USD trong khi đó điều trị  bệnh nhân kháng thuốc hết  250.000 USD. Hiện nay số tử vong hàng năm do lao trên thế giới còn lớn hơn số tử  vong do HIV, sốt rét và các bệnh nhiệt đới cộng lại. Tổ chức Y tế Thế giới đã nhận  định bệnh lao hiện nay đã quay trở lại và trở nên tồi tệ hơn bởi sự kháng thuốc của  vi khuẩn lao [17]. Thuốc kháng sinh đầu tiên dùng để điều trị lao là streptomycin, nhưng vài năm  sau khi kháng sinh này được sử dụng thì người ta đã nhận thấy hiện tượng đề kháng  lại streptomycin của vi khuẩn lao. Sau đó các kháng sinh chống lao khác tiếp tục ra   đời: para – aminosalysilic, isoniazid, rifampicin nh ưng  đều không mang lại hiệu  quả sau một thời gian điều trị nhất định [7]. Nghiên cứu tìm kiếm hoá dược mới có  hiệu quả điều trị lao, đặc biệt là lao kháng thuốc luôn luôn được thực hiện và càng  ngày càng có nhiều hợp chất chống lao mới được đưa vào sử dụng, ví dụ, gần đây  là linezolid [43]. Tuy nhiên, theo cơ chế và áp lực, vi khuẩn không ngừng biến đổi   tạo nên nhiều chủng mới hơn có khả năng kháng thuốc nhanh chóng hơn [52]. Khả  năng điều trị  thành công có thể  đạt 95­100% đối với những bệnh nhân mắc lao   thông thường, trong khi tỷ lệ thành công với bệnh nhân mắc lao kháng thuốc chỉ là   20 – 30%, thậm chí còn không điều trị  được khi mắc lao kháng đa thuốc và kháng   thuốc phổ  rộng mặc dù đã dùng kết hợp đến năm loại kháng sinh điều trị  lao. Vì  vậy, việc phát hiện và ngăn chặn sự  lan truyền các chủng lao kháng đa thuốc là  vấn đề quan trọng nhất trong điều trị lao hiện nay [7, 10, 35]. 5
  12. Luận văn thạc sĩ                                                                                      Nguy ễn Văn  Bắc 1.3. VI KHUẨN LAO 1.3.1. Cấu tạo  Trực khuẩn lao có dạng hình que, thân mảnh dẻ, không có nha bào, kích  thước 2 ­ 3 µm, dày 0,3 µm, kháng cồn, kháng acid (hình 1.1). Khi được nhuộm bằng  phương pháp Ziehl ­ Neelsen, trực khuẩn lao bắt màu đỏ  thẫm, do không bị  cồn và   acid làm mất màu carbonfuchsin.  Ở môi trường nuôi cấy có độ  acid đậm đặc nhất   định, trực khuẩn lao vẫn phát triển được, vì vậy, chúng được gọi là trực khuẩn  kháng cồn, kháng toan (acid fast bacilli ­ AFB), đây là đặc điểm nổi bật của vi khuẩn  thuộc chi mycobacteria. Đặc điểm này rất quan trọng để  phát hiện trực khuẩn lao  bằng phương pháp hình thái học (nhuộm màu) trong các mẫu bệnh phẩm. Một số  giả  thiết cho rằng mức kháng acid là do độ  dài của các chuỗi mycolic acid.   M.  tuberculosis  có khả  năng thể  hiện tất cả  các cơ  chế  cần thiết  để  tổng hợp các  vitamin, amino acid và các enzyme cofactor thiết yếu của tế  bào. Mycobacteria có  cấu trúc gần giống với vi khuẩn Gram dương nhưng chúng không được xếp vào  loại vi khuẩn Gram dương do các phân tử  gắn với thành tế  bào là lipid chứ  không   phải protein hay polysaccharide. Do đó, chúng không giữ  lại tinh thể  màu tím xuất  hiện trong nhuộm Gram [2, 5, 37, 38]. Trực khuẩn lao rất hiếu khí, phát triển tốt nhất  ở  37oC và dưới áp suất của  O2 là 100 mmHg. Đỉnh phổi và vùng phổi dưới xương đòn thường hay mắc lao nhất   vì có áp suất O2 từ 120 – 130 mmHg (khi đứng) rồi đến thân xương và đầu xương vì  áp suất O2  ở  đây là 100 mmHg. Lách, gan, dạ  dày, thực quản ít mắc lao hơn vì áp  suất O2 thấp. Trực khuẩn lao sinh sản rất chậm, cứ  20 giờ  mới có một lần phân chia tế  bào, trong điều kiện phòng thí nghiệm thì cứ 12 đến 24 giờ M. tuberculosis phân chia  một lần trên môi trường nuôi cấy giàu dinh dưỡng Loewenstein [46]. Tốc độ  phát   6
  13. Luận văn thạc sĩ                                                                                      Nguy ễn Văn  Bắc triển chậm có thể là do tính thẩm thấu của thành tế bào hạn chế trong việc hấp thụ  chất dinh dưỡng và liên quan đến tốc độ tổng hợp ribosome (Hình 1.2).               Hình 1.1. Hình dạng của tế bào M.  Hình 1.2. Tế  bào vi khuẩn lao phát  tuberculosis triển trong môi trường nuôi cấy. (http://www.diseasedetectives.org/micro (http://abcnews.go.com/Health/Germs/st be_gallery/tuberculosis) ory?id=3079114&page=1) Trực khuẩn lao có cấu tạo rất phức tạp, hoàn hảo mà ít vi sinh vật nào có   được. Dưới kính hiển vi điện tử trực khuẩn lao có cấu tạo chính như sau (hình 1.3): ­ Lớp trong cùng có cấu trúc màng, có thành phần chủ yếu là các phospholipid  gồm 2 nhóm: nhóm ưa nước hướng vào bên trong, nhóm kỵ nước quay ra ngoài. Cấu  trúc này tạo nên màng sinh học có tác dụng giúp trực khuẩn điều hòa sự  thẩm thấu  của vỏ ngoài trực khuẩn, màng còn chứa các protein chức năng khác như các protein  truyền tín hiệu đến bộ  máy trao đổi chất và di truyền trong nguyên sinh chất, các   enzyme liên quan đến quá trình trao đổi chất và sinh năng lượng, các chất mang làm  trung gian cho quá trình vận chuyển các chất dinh dưỡng và các ion. Các enzyme   xuyên màng và tổng hợp màng, tạo thành vách ngăn trong phân chia tế bào, tập hợp  và tiết một số enzyme ngoại bào, sao chép DNA [2, 4, 37, 38]. ­ Lớp tiếp theo là peptidoglucan liên kết với đường arabinose và các phân tử  mycolic acid tạo nên một bộ khung định hình cho vi khuẩn đảm bảo cho vi khuẩn có  7
  14. Luận văn thạc sĩ                                                                                      Nguy ễn Văn  Bắc độ cứng nhất định. Thành tế  bào của  mycobacteria là cấu trúc phức tạp nhất được  biết  ở prokaryote, có một số  thành phần hóa học và liên kết chéo bất thường, mức   độ liên kết giữa peptidoglucan ở thành tế bào M. tuberculosis là 70 ­ 80% trong khi ở  vi khuẩn E. coli là 20 ­ 30% [38] ­ Lớp ngoài được tạo nên bởi sự liên kết giữa các mycolic acid và các chất  phức tạp, đây là lớp tạo nên độc tính của vi khuẩn lao và có cấu trúc phức tạp   làm tăng khả  năng chống thấm nước của thành tế  bào vi khuẩn giúp trực khuẩn   tồn tại lâu với môi trường bên ngoài, chống khả  năng bị  hủy diệt bởi đạ i thực   bào và các tế bào miễn dịch [38].  ­ Lớp vỏ  ngoài cùng có vai trò rất quan trọng, có cấu trúc peptidoglyolipid.  Nó đảm bảo cho sự  tồn tại c ủa tr ực khu ẩn, làm cho trực khuẩn bền vững với   hiện tượng thực bào, giúp bảo vệ khỏi áp suất thẩm thấu nên khi vào cơ thể trực   khuẩn khó bi tiêu diệt. Hình 1.3. Cấu tạo thành tế bào của M. tuberculosis  (http://www3.niaid.nih.gov/topics/tuberculosis/Research/basicResearch/biology cell.htm) 1.3.2. Cơ chế gây bệnh 8
  15. Luận văn thạc sĩ                                                                                      Nguy ễn Văn  Bắc Vi khuẩn lao có thể  xâm nhập vào cơ  thể  qua nhiều con đường khác nhau:  thường là đường hô hấp, hoặc có thể qua đường tiêu hóa, da, kết mạc mắt. Sau khi   gây tổn thương tiên phát, vi khuẩn lao có thể  theo đường bạch huyết hoặc đường  máu để  đến gây tổn thương thứ  phát  ở  các cơ  quan khác: Phổi, thận, màng não,   xương, hạch nhưng thường bị hơn cả là đỉnh phổi, nơi có áp suất oxy là 120 mmHg  vì đây là điều kiện hoạt động tốt cho vi khuẩn lao. Độc lực của vi khuẩn lao có liên   quan đến “Cord factor” (trehalose ­ 6,6’­ dimycolate) là chất gây  ức chế  hoạt động  của tế bào bạch cầu, gây nên những u hạt mạn tính [7]. Khi vi khuẩn lao xâm nhập vào cơ thể, trong cơ thể xuất hiện đáp ứng miễn  dịch qua trung gian tế bào. Lúc này, đại thực bào, các tế bào lympho T, lympho B và   các nguyên bào sợi kết tập lại tạo các u hạt, với các tế  bào lympho vây quanh đại   thực bào. Chức năng của các u hạt không chỉ  ngăn cản sự  lan tỏa của tế  bào   M.  tuberculosis mà còn tạo môi trường tại chỗ cho các tế bào của hệ miễn dịch trao đổi  thông tin [23]. Bên trong các u hạt, tế  bào lympho T tiết ra các cytokine, như  γ   interferon, hoạt hóa đại thực bào khiến chúng diệt khuẩn tốt hơn. Tế bào lympho T   cũng tiêu diệt trực tiếp các tế  bào bị  nhiễm. Nhưng điều quan trọng là vi khuẩn   không bị u hạt loại trừ hoàn toàn mà trở nên bất hoạt tạo dạng nhiễm khuẩn “tiềm   ẩn” (latent tuberculosis) [18]. 1.3.3. Đặc điểm hệ gen Toàn bộ  hệ  gen của vi khuẩn lao   M. tuberculosis  chủng  H37Rv được giải  trình tự, phân tích và công bố  năm 1998 gồm   4.411.529 bp, với đặc tính là chứa  nhiều guanine và cystosine (G + C khoảng 65 %). Trên 90% trình tự được dự  đoán   là có mã hóa cho protein và chỉ có 6 gen giả (pseudogene ­ gen không mang thông tin  di truyền mã hóa cho protein) [28, 38, 44]. Dữ  li ệu h ệ  gen c ủa m ột s ố vi khu ẩn   thuộc chi  Mycobacterium, trước hết là của vi khuẩn lao ( M.  tuberculosis) và vi  9
  16. Luận văn thạc sĩ                                                                                      Nguy ễn Văn  Bắc khuẩn phong (M.  leprae) có tầm quan trọng đặc biệt trong nghiên cứu đặc điểm   sinh học phân tử  hỗ  trợ  dịch tễ học, di truyền học và nghiên cứu kháng thuốc, số  liệu đã được lưu giữ tại một số trung tâm và có thể sử  dụng một số chương trình  để truy cập khám phá và sử dụng [11, 53]. 1.4. CƠ CHẾ KHÁNG THUỐC Ở VI KHUẨN LAO 1.4.1. Kháng sinh trong điều trị lao  Thuốc chống lao có nhiều loại, và tác dụng của chúng lên trực khuẩn lao  cũng không giống nhau. Hiện nay người ta chia thuốc chống lao làm hai loại: (1) Các  thuốc chống lao chủ yếu: gồm năm thuốc chủ yếu đó là: isoniazid (INH), rifampicin  (RMP),   ethambutol  (EMB),   pyrazinamid  (PZA),  streptomycin  (SM).   Đây là   những  thuốc kháng lao hiệu quả và cũng ít độc tính nhất. (2) Các thuốc chống lao thứ yếu:   là những thuốc chống lao có tác dụng kém hơn và có độc tính cao, không được dùng  trong phác đồ  điều trị  lao nhưng lại được dùng trong các trường hợp điều trị  thất  bại do vi khuẩn lao kháng lại các loại thuốc chống lao loại một. Các thuốc này gồm  có:   ethionamide,   prothionamide,   paraminosalysilic   acid   (PAS),   cycloserine,  kanamycin, capreomycin, thiacetazone, ofloxacin, các quinolone… Các thuốc isoniazid, cycloserine, kanamycin có tác dụng  ức chế tổng vách tế  bào. Các thuốc streptomycin, kanamycin, capreomycin có tác dụng  ức chế tổng hợp  protein. Các thuốc rifampicin và ethambutol có tác dụng ức chế sự tổng hợp nucleic  acid. Thuốc paraminosalicylic acid có tác dụng chống chuyển hóa [7, 35, 37, 38]. 1.4.2. Nguyên nhân gây kháng thuốc Vi khuẩn lao kháng thuốc là khi chúng không chịu sự  tác động của các loại   kháng sinh dùng điều trị  chúng. Thường nói tới vi khuẩn lao kháng thuốc là nói tới   10
  17. Luận văn thạc sĩ                                                                                      Nguy ễn Văn  Bắc những trường hợp vi khuẩn lao kháng với một trong những thuốc chống lao dòng thứ  nhất: isoniazid, rifampicin, pyrazinamide, ethambutol hoặc streptomycin [7, 35] Tính kháng thuốc bao gồm chủ yếu 3 nguyên nhân chính: ­ Thuốc hoặc các gen đích bị làm biến đổi trong các chủng kháng thuốc do đó   các thuốc không còn tác dụng nữa trong việc tiêu diệt vi khuẩn. ­ Sản phẩm của gen, mà hoạt tính của nó bị   ức chế  bởi thuốc  được vi  khuẩn sản xuất thừa ra, do đó lượng thuốc mà bệnh nhân uống vào không  đủ để ức chế hoàn toàn vi khuẩn lao. ­ Những thay đổi xảy ra  ở  mức độ  phân tử  và cơ  chế  xâm nhập của thuốc   vào bên trong tế  bào vi khuẩn làm cho nồng độ  thuốc bên trong tế  bào   không đạt tới nồng độ tối thiểu có khả năng giết chết vi khuẩn gây bệnh. Hiện tượng kháng thuốc của vi khuẩn lao có thể  xảy ra trước khi xâm nhập  (tiên phát) hoặc sau khi nhập vào cơ thể người bệnh (thứ  phát). Vi khuẩn lao kháng  thuốc tiên phát là hiện tượng lây nhiễm bởi một chủng đã kháng thuốc mà vi khuẩn  này đã có sự đề kháng tự nhiên. Vì vậy, bệnh nhân mắc lao do sự lây nhiễm này, ngay   từ đầu vi khuẩn lao xâm nhập vào cơ thể đã có sự đề kháng với thuốc đang sử dụng.  Còn hiện tượng kháng thuốc thứ phát xảy ra đối với các chủng vi khuẩn lao  ở bệnh   nhân nào đó dùng thuốc chống lao không đúng quy định, không đúng liều lượng, thời  gian sử dụng thuốc do đó đã chọn lọc vi khuẩn lao khang thuốc [1, 38]. Các chủng vi lao kháng thuốc được chia làm hai loại: (1) Các chủng lao kháng   đa thuốc (MDR – TB): Là trường hợp khi các chủng vi khuẩn lao kháng đồng thời  hai thuốc chống lao mạnh nhất hiện nay là isoniazid và rifampicin. (2) Các chủng lao   kháng thuốc phổ  rộng (XDR – TB): Là trường hợp khi vi khuẩn lao đã ở  tình trạng  11
  18. Luận văn thạc sĩ                                                                                      Nguy ễn Văn  Bắc kháng   đa   thuốc   và   có   thêm   tính   kháng   một   trong   ba   loại   thuốc   chống   lao   là   capreomycin, kanamycin, amikacin [49]. Ngày nay khi nghiên cứu về sinh học phân tử, người ta đã xác định được cơ  chế kháng lại nhiều loại kháng sinh có liên quan đến các gen tương ứng. Trong hình  1.4 mô tả các cơ chế phân tử của hiện tượng kháng đa thuốc ở vi khuẩn lao. Trong  đó, kháng isoniazid được cho là liên quan đến các gen:  KatG, inhA, aphC  và  kasA.  Kháng streptomycin có thể là do đột biến ở gen  rpsL. Kháng pyrazinamid có thể liên  quan đến gen pncA. Kháng quinolone có thể liên quan tới gen gyrA. Kháng rifampicin  được xác định là liên quan đến đột biến  ở  vùng gần lõi của gen rpoB, gen mã hóa  tiểu phần  β  của RNA polymerase [7, 25]. Trong luận văn này, chúng tôi tập trung  nghiên cứu cơ chế kháng đa thuốc, tức là trường hợp vi khuẩn lao kháng đồng thời  hai thuốc chống lao mạnh nhất hiện nay là isoniazid và rifampicin, điều đó đồng   nghĩa với việc nghiên cứu các đột biến trên gen rpoB với katG. 12
  19. Luận văn thạc sĩ                                                                                      Nguy ễn Văn  Bắc Hình 1.4. Cơ chế kháng đa thuốc của vi khuẩn lao  (http://www3.niaid.nih.gov/topics/tuberculosis). 1.4.3. Rifampicin và cơ chế kháng Rifampicin  tên khoa học là 3 –[[(4 – methyl – 1 – pipeainyl) imino] methyl]   (hình 1.5A). Rifampicin là dẫn xuất bán tổng hợp từ  rifampicin B, một kháng sinh  được chiết xuất từ nấm  Streptomyces mediterranei, là thuốc có hoạt tính diệt khuẩn  mạnh, tiệt khuẩn, thuốc diệt vi khuẩn lao trong và ngoài tế  bào. Rifampicin không  có hiện tượng kháng thuốc chéo với các loại thuốc chữa lao khác. Nồng độ  ức chế  tối thiểu (minimum inhibitory concentration ­ MIC) đối với vi khuẩn là 5 ­ 200 ng/ml   (in vitro). Đây là thuốc ức chế RNA polymerase mạnh nhất [29, 48]. 13
  20. Luận văn thạc sĩ                                                                                      Nguy ễn Văn  Bắc                                             A          B Hình 1.5. Công thức cấu tạo của rifampicin (A) và isoniazid (B) [48] C ơ   ch ế   tác   động   c ủa   rifampicin   liên   quan   đế n   khả   năng   ứ c   chế   hoạ t   đ ộng củ a RNA polymerase. Enzyme này là một ph ức h ợp oligomer g ồm b ốn   ti ểu đơn vị  khác nhau ( α,  β,  β’,  ω), và đượ c mã hóa tươ ng  ứ ng b ởi các gen  rpoA, rpoB, rpoC, rpoD [7, 20]. Khi rifampicin gắn với tiểu đơn vị β của RNA polymerase (rpoB), làm ức chế  các hoạt động sao chép tạo ra các mRNA của vi khuẩn lao và do đó làm ngưng trệ  các hoạt động sống của vi khuẩn lao. Đây là cơ  chế cơ chế tác dụng của RMP đối  với vi khuẩn lao (hình 1.6). 14
ADSENSE

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

LV.01: Bộ Luận Văn Thạc Sĩ Quản Trị Kinh Doanh MBA
165 tài liệu
2066 lượt tải
THÔNG TIN
TRỢ GIÚP
HỖ TRỢ KHÁCH HÀNG
Theo dõi chúng tôi

Chịu trách nhiệm nội dung:

Nguyễn Công Hà - Giám đốc Công ty TNHH TÀI LIỆU TRỰC TUYẾN VI NA

LIÊN HỆ

Địa chỉ: P402, 54A Nơ Trang Long, Phường 14, Q.Bình Thạnh, TP.HCM

Hotline: 093 303 0098

Email: support@tailieu.vn

Giấy phép Mạng Xã Hội số: 670/GP-BTTTT cấp ngày 30/11/2015 Copyright © 2022-2032 TaiLieu.VN. All rights reserved.

 

Đồng bộ tài khoản
3=>0