Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu sản xuất phân bón vi sinh dạng hạt có khả năng kích thích sinh trưởng từ vi khuẩn Bacillus megaterium VACC 118 và chất mang được xử lý chiếu xạ

Chia sẻ: Trương Yến | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:58

Thêm vào BST

Báo xấu

38
lượt xem 10
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận văn được thực hiện với mục tiêu Nhằm cung cấp lựa chọn mới cho người dân, giảm thiểu sử dụng phân bón hóa học, cũng như thúc đẩy ứng dụng năng lượng nguyên tử vì hòa bình, cụ thể là xử lý chiếu xạ biến tính tinh bột sắn. Mời các bạn cùng tham khảo.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu sản xuất phân bón vi sinh dạng hạt có khả năng kích thích sinh trưởng từ vi khuẩn Bacillus megaterium VACC 118 và chất mang được xử lý chiếu xạ

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------- NGUYỄN THỊ THU THỦY NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT PHÂN BÓN VI SINH DẠNG HẠT CÓ KHẢ NĂNG KÍCH THÍCH SINH TRƯỞNG TỪ VI KHUẨN Bacillus megaterium VACC 118 VÀ CHẤT MANG ĐƯỢC XỬ LÝ CHIẾU XẠ LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2019
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------- NGUYỄN THỊ THU THỦY NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT PHÂN BÓN VI SINH DẠNG HẠT CÓ KHẢ NĂNG KÍCH THÍCH SINH TRƯỞNG TỪ VI KHUẨN Bacillus megaterium VACC 118 VÀ CHẤT MANG ĐƯỢC XỬ LÝ CHIẾU XẠ Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 8420101.07 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. TRẦN MINH QUỲNH PGS. TS. BÙI THỊ VIỆT HÀ Hà Nội – 2019
LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, tôi xin trân trọng cảm ơn Trung tâm Chiếu xạ Hà Nội (Viện Năng lƣợng nguyên tử Việt Nam) đã tạo mọi điều kiện để tôi được học tập và thực hiện đề tài nghiên cứu. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Trần Minh Quỳnh đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và thực hiện luận văn này. Xin cảm ơn các nghiên cứu viên phòng Nghiên cứu Công nghệ Bức xạ đã giúp đỡ và thảo luận với tôi trong suốt quá trình tiến hành thí nghiệm. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới PGS.TS. Bùi Thị Việt Hà đã luôn đồng hành cùng tôi tại trường Đại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội, chia sẻ với tôi những kỹ năng, kinh nghiệm trong suốt quá trình nghiên cứu và góp ý cho tôi để hoàn thành luận văn này. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy, cô giáo thuộc Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội, đặc biệt là các thầy, cô giáo thuộc Bộ môn Vi sinh vật học đã truyền đạt cho tôi những kiến thức quý báu trong suốt thời gian học tập và thực tập. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè, những người đã tạo cho tôi động lực và điều kiện tốt nhất để hoàn thành luận văn này. Luận văn được thực hiện với sự hỗ trợ kinh phí của đề tài Khoa học và Công nghệ cấp Nhà nước, mã số ĐTĐLCN 19/16 do TS. Trần Minh Quỳnh làm chủ nhiệm. Hà Nội, ngày tháng năm 2019 Học viên Nguyễn Thị Thu Thủy
DANH MỤC HÌNH Hình 1. Cây phát sinh của một số loài thuộc chi Bacillus căn cứ vào trình tự 16S rRNA [49] .................................................................................................................10 Hình 2. Bố trí hệ thống thiết bị tạo hạt phân bón ......................................................25 Hình 3. Quy trình sản xuất phân bón vi sinh vật dạng hạt ........................................26 Hình 4. Hạt phân bón được tạo ra từ thiết bị tạo hạt và thành phẩm sau khi sấy khô ...................................................................................................................................34 Hình 5. Thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của phân vi sinh đến cây cải bắp, cà chua và cải củ. (A) Khảo nghiệm đồng ruộng của cây bắp cải, (B) Khảo nghiệm đồng ruộng của cây cà chua, (C) Khảo nghiệm đồng ruộng của cây cải củ. .....................37
DANH MỤC BẢNG Bảng 1. Một số nhóm VSV sử dụng trong sản xuất phân bón vi sinh ........................5 Bảng 2. Thành phần hóa học của rỉ đường mía [13] và nước chiết đậu [12]............12 Bảng 3. Nồng độ muối khoáng cần thiết đối với vi khuẩn, nấm và xạ khuẩn. .........13 Bảng 4. Điều kiện nhân sinh khối đối với B.megaterium VACC 118 ......................20 Bảng 5. Các môi trường nuôi cấy và nhân sinh khối vi khuẩn .................................21 Bảng 6. Hỗn hợp đệm pH pha môi trường nước chiết đậu .......................................23 Bảng 7. Ảnh hưởng của môi trường và thời gian lên men đến quá trình sinh trưởng và phát triển của B.megaterium VACC 118 ............................................................28 Bảng 8. Ảnh hưởng của pH và thời gian lên men đến quá trình sinh trưởng và phát triển của B.megaterium VACC 118. ........................................................................29 Bảng 9. Ảnh hưởng của nhiệt độ môi trường lên quá trình sinh trưởng và phát triển của các chủng vi khuẩn sinh tổng hợp IAA ..............................................................30 Bảng 10. Ảnh hưởng của lượng khí cấp đến quá trình sinh trưởng và phát triển của các chủng vi khuẩn sinh tổng hợp IAA .....................................................................31 Bảng 11. Ảnh hưởng tốc độ cánh khuấy đến quá trình sinh trưởng và phát triển của các chủng vi khuẩn sinh tổng hợp IAA .....................................................................32 Bảng 12. Ảnh hưởng tỷ lệ giống cấp 1 đến quá trình sinh trưởng và phát triển của các chủng vi khuẩn sinh tổng hợp IAA .....................................................................33 Bảng 13. Chất lượng của phân vi sinh vật dạng hạt.................................................35 Bảng 14. Ảnh hưởng của thời gian bảo quản đến mật độ tế bào trong hạt phân bón ...................................................................................................................................35 Bảng 15. Tỉ lệ sống sót của B.megaterium trong hạt phân bón sau thời gian bảo quản ...........................................................................................................................36 Bảng 16. Ảnh hưởng của phân vi sinh dạng hạt đến đặc điểm nông học của cà chua....37
Bảng 17. Ảnh hưởng của phân vi sinh dạng hạt đến đặc điểm nông học của cải bắp ...39 Bảng 18. Ảnh hưởng của phân vi sinh dạng hạt đến đặc điểm của cải củ .....................40
MỤC LỤC MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1 CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................4 1.1. Tổng quan về phân bón vi sinh vật ................................................................4 1.1.1. Định nghĩa phân bón vi sinh vật ................................................................4 1.1.2. Phân loại phân bón vi sinh .........................................................................4 1.1.3. Vai trò của phân bón vi sinh với cây trồng ................................................6 1.1.4. Hạn chế của phân bón vi sinh ....................................................................7 1.2. Vai trò của vi khuẩn vùng rễ đối với đất trồng và sự sinh trưởng phát triển của thực vật ..............................................................................................................8 1.3. Vi sinh vật sinh tổng hợp chất kích thích sinh trưởng thực vật Bacillus megaterium ..............................................................................................................9 1.4. Một số đặc điểm nuôi cấy vi sinh vật ..........................................................10 1.4.1. Nguồn dinh dưỡng....................................................................................10 1.4.2. Điều kiện nhiệt độ ....................................................................................14 1.4.3. Hàm lượng O2 ..........................................................................................14 1.4.4. pH môi trường ..........................................................................................14 1.4.5. Ảnh hưởng của tỷ lệ tiếp giống ................................................................15 1.5. Đặc điểm của chất mang sử dụng trong sản xuất phân bón vi sinh ............15 1.6. Bọc tế bào VSV trong chất mang nguồn gốc alginate ................................16 1.7. Xử lý chiếu xạ biến tính tinh bột sắn ...........................................................16 1.8. Tính mới của đề tài ......................................................................................17 1.9. Mục đích nghiên cứu ...................................................................................18 CHƢƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................20
2.1. Vật liệu. .......................................................................................................20 2.2. Thiết bị, dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu ................................................20 2.3. Môi trường nuôi cấy VSV sử dụng trong nghiên cứu .................................21 2.4. Phương pháp nghiên cứu .............................................................................22 2.4.1. Hoạt hóa chủng B.megaterium VACC 118 .............................................22 2.4.2. Xác định điều kiện lên men B.megaterium VACC 118 phù hợp ............22 2.4.2.1. Đánh giá ảnh hưởng của môi trường và thời gian lên men đến quá trình sinh trưởng và phát triển của B.megaterium VACC 118......................................22 2.4.2.2. Đánh giá ảnh hưởng của pH môi trường đến quá trình sinh trưởng của B.megaterium VACC 118 .....................................................................................22 2.4.2.3. Đánh giá ảnh hưởng của nhiệt độ lên men đến quá trình sinh trưởng của B.megaterium VACC 118 ..............................................................................23 2.4.2.4. Đánh giá ảnh hưởng của lưu lượng cấp khí và tốc độ khuấy đến quá trình sinh trưởng của B.megaterium VACC 118 ..................................................23 2.4.2.5. Đánh giá ảnh hưởng của tỉ lệ giống gốc đến quá trình sinh trưởng của B.megaterium VACC 118 .....................................................................................24 2.4.3. Tạo hạt phân bón vi sinh vật ....................................................................24 2.4.4. Đánh giá chất lượng của phân bón vi sinh dạng hạt ................................26 2.4.5. Đánh giá ảnh hưởng của phân bón VSV đối với cây rau .........................27 CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................28 3.1. Xác định điều kiện lên men thích hợp cho chủng Bacillus megaterium VACC 118 và đánh giá chất lượng của sản phẩm phân bón vi sinh dạng hạt. .....28 3.1.1. Xác định điều kiện lên men B.megaterium VACC 118 thích hợp ...........28 3.1.1.1. Đánh giá ảnh hưởng của môi trường và thời gian lên men đến quá trình sinh trưởng của B.megaterium VACC 118 ...........................................................28
3.1.1.2. Đánh giá ảnh hưởng của pH môi trường đến quá trình sinh trưởng của B.megaterium VACC 118. ....................................................................................29 3.1.1.3. Đánh giá ảnh hưởng của nhiệt độ môi trường lên men đến quá trình sinh trưởng của B.megaterium VACC 118. .........................................................30 3.1.1.4. Đánh giá ảnh hưởng của lưu lượng cấp khí và tốc độ khuấy lên men đến quá trình sinh trưởng của B.megaterium VACC 118 ....................................31 3.1.1.5. Đánh giá ảnh hưởng của tỉ lệ tiếp giống đến quá trình sinh trưởng của B.megaterium VACC 118. ....................................................................................33 3.1.2. Đánh giá chất lượng phân bón vi sinh dạng hạt .......................................34 3.2. Đánh giá hiệu quả phân bón trên cây rau ....................................................37 CHƢƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ......................................................41 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT .............................................................42 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG ANH ..............................................................42
BẢNG CHỮ VIẾT TẮT Vi khuẩn vùng rễ kích thích sự tăng trưởng của thực vật (Plant PGPR Growth Promoting Rhizobacteria) VOCs Các hợp chất hữu cơ dễ bay hơi (Volatile organic compounds) VSV Vi sinh vật SX BA Môi trường sản xuất nhân sinh khối Bacillus ĐC Mẫu đối chứng TN1 Thí nghiệm 1 TN2 Thí nghiệm 2 LSD(0.05) Chênh lệch nhỏ nhất ở mức độ tin cậy 95% CV Hệ số biến thiên
MỞ ĐẦU Phân bón là nguồn cung cấp các chất dinh dưỡng bổ sung cho cây, giúp tăng sản lượng cây trồng. Song theo các nhà khoa học đất đai và dinh dưỡng thực vật, cây trồng chỉ có thể sử dụng chưa tới 50% lượng đạm (nitrogen) từ phân khoáng hóa học cho sự phát triển, khoảng 50% còn lại được cung cấp từ phân chuồng, phân hữu cơ, và một phần khá lớn do hoạt động của vi sinh vật (VSV) hữu ích trong đất trồng như các chủng VSV cố định đạm (Azotobacter, Azospirilium, Rhizobium…), VSV phân giải hợp chất phosphat thành dạng dễ tiêu (Bacillus, Pseudomonas…) hay VSV sinh tổng hợp các hormon sinh trưởng thực vật (Azotobacter, Bacillus). Theo định nghĩa, phân vi sinh là chế phẩm “inoculant” gồm các VSV sống được bổ sung vào đất với khả năng cung cấp hoặc chuyển hóa chất dinh dưỡng giúp cây trồng sinh trưởng tốt hơn, với năng suất và chất lượng cao hơn. Phân bón vi sinh có thể được dùng ở dạng lỏng để phun trực tiếp vào đất hoặc ngâm với hạt giống trước khi gieo. Tuy nhiên, ở dạng này, khả năng sống của các tế bào VSV và mật độ của chúng trong quần thể nhanh chóng bị giảm xuống trong quá trình vận chuyển và bảo quản. Trong những năm qua, các chế phẩm vi sinh dạng rắn trên nền chất mang (carrier) đã được phát triển với các nguyên liệu sẵn có trong tự nhiên như than bùn, đất sét, bentonite và các phế thải nông nghiệp… song các chất mang này đòi hỏi điều kiện đặc biệt để khử trùng do có mức độ tạp nhiễm ban đầu cao, và dễ bị nhiễm tạp nên chỉ giữ được hiệu quả trong thời gian 3-6 tháng. Vì vậy, các nhà khoa học đã quan tâm hơn đến việc làm thế nào để cải thiện tính ổn định của sản phẩm và tăng thời gian bảo quản chúng. Gần đây, các chất mang nguồn gốc polymer đã được các nhà khoa học quan tâm nhờ khả năng hình thành cấu trúc mạng lưới không gian cho phép cố định các tế bào sống để bảo vệ chúng chống lại các kích thích ngoại lai, giúp các tế bào vi khuẩn ở trạng thái tiềm sinh dễ dàng nảy mầm khi được bón vào đất. Các tế bào có thể được bọc vào trong gel polymer bằng cách phối trộn trước với chất mang hoặc được hấp phụ vào trong chất mang dạng gel. Việc bọc “encapsulation” các tế bào 1
VSV trong lớp vỏ polymer như các polyacrylamide, alginate… có thể ngăn chặn nhiễm tạp một cách hiệu quả, và kéo dài hoạt lực của các VSV. Nhiều loại chất mang polymer đã được nghiên cứu và sử dụng như giá thể cố định enzyme, tế bào VSV. Đáng chú ý nhất trong số đó là sodium alginate, một polysaccharide tích điện âm có khả năng tạo gel khâu mạch với các ion tích điện dương. Vì vậy, các hạt (bead) khâu mạch hình thành giữa alginate và ion calcium (Ca2+) đã được sử dụng phổ biến như chất mang để vận chuyển các chất có hoạt tính sinh học, các enzym và tế bào. Kết quả là, một số sản phẩm phân bón trên nền chất mang dạng gel alginate- calcium đã được phát triển [7, 29]. Tuy nhiên, do alginate là polysaccharide có kích thước phân tử lớn và độ nhớt cao, dung dịch alginate thường chỉ có nồng độ thấp, làm cho gel tạo được không đồng nhất và có tính bền cơ học kém. Hơn nữa, polymer này rất ưa nước, nên sản phẩm dễ bị nhiễm tạp. Vì vậy, một số polymer khác đã được sử dụng như chất độn (filler) để cải thiện tính bền cơ lý của hạt, đồng thời giảm chi phí làm khô, bảo quản. Gần đây, người ta thấy rằng tinh bột biến tính có thể được sử dụng như chất độn bổ sung vào công thức để tạo thành chất mang có tính bền cải thiện mà vẫn phân hủy sinh học. Bên cạnh đó, polysaccharide này cũng có thể được các VSV tận dụng như nguồn cacbon để duy trì khả năng sống trong quá trình bảo quản. Trong những năm qua, kỹ thuật khử trùng sử dụng công nghệ bức xạ đã được nghiên cứu và ứng dụng tại Trung tâm Chiếu xạ Hà Nội để diệt côn trùng, nấm mốc, đảm bảo chất lượng hàng hóa và kéo dài thời gian bảo quản. Xử lý chiếu xạ cũng có thể tạo các hiệu ứng khâu mạch, cắt mạch và ghép mạch polymer tạo cho chúng những đặc tính mới phù hợp với ứng dụng. Phương pháp này đã được áp dụng để biến tính tinh bột sắn tạo sản phẩm tinh bột biến tính có khả năng tan trong nước tốt hơn, dễ phân hủy sinh học hơn, với các đặc tính hóa lý phù hợp cho nhiều ứng dụng khác nhau thay vì chỉ sử dụng như thành phần thực phẩm hoặc thức ăn gia súc như hiện nay. Quá trình chiếu xạ với liều phù hợp cũng có tác dụng thanh trùng, giúp tận dụng tinh bột biến tính bức xạ như thành phần chất mang chất lượng cao trong sản xuất phân bón vi sinh trên nền chất mang khử trùng. 2
Nhằm cung cấp lựa chọn mới cho người dân, giảm thiểu sử dụng phân bón hóa học, cũng như thúc đẩy ứng dụng năng lượng nguyên tử vì hòa bình, cụ thể là xử lý chiếu xạ biến tính tinh bột sắn, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu sản xuất phân bón vi sinh dạng hạt có khả năng kích thích sinh trưởng từ vi khuẩn Bacillus megaterium VACC 118 và chất mang được xử lý chiếu xạ”. 3
CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tổng quan về phân bón vi sinh vật 1.1.1. Định nghĩa phân bón vi sinh vật Phân bón vi sinh hay phân vi sinh là chế phẩm có chứa các loài vi sinh vật (VSV) sống, mà khi được bón vào đất hay tiếp xúc với bề mặt rễ sẽ kích thích sự phát triển của cây trồng bằng cách tăng lượng dinh dưỡng hữu ích cho cây trồng [58]. Phân bón sinh học nói cách khác là một dạng phân bón hữu cơ hiện đại kết hợp với sự có mặt của lợi khuẩn [55]. Theo Mohammadi và Sohrabi công bố năm 2012, phạm trù phân bón vi sinh có thể được sử dụng để chỉ tất cả các loại phân bón hữu cơ giúp kích thích sinh trưởng thực vật thông qua sự tương tác giữa vi sinh vật có trong phân bón đó với đất hoặc với cây trồng [44] 1.1.2. Phân loại phân bón vi sinh Phân bón vi sinh được phân loại thành nhiều loại tùy thuộc vào chức năng của các nhóm VSV chứa trong đó. Bảng 1. trình bày một số loại phân bón vi sinh được sử dụng phổ biến trong canh tác nông nghiệp hiện nay. Phân bón vi sinh cố định nitơ (Nitrogen fixing bio-fertilizers - NFB): Ví dụ Rhizobium spp., Azospirillum spp. và bèo hoa dâu; chúng cố định nitơ trong khí quyển chuyển thành dạng nitơ hữu cơ (cây có thể sử dụng) trữ trong đất hoặc trong nốt sần của rễ như ở cây họ đậu [18]. Phân bón vi sinh hòa tan phosphate (Phosphate solubilizing bio-fertilizer – PSB): Một số VSV được sử dụng phổ biến để sản xuất phân bón loại này gồm Bacillus spp., Pseudomonas spp. và Aspergillus spp. Các VSV này hòa tan phosphate không tan trong đất chuyển thành dạng hòa tan, giúp cây trồng dễ dàng hấp thu. Trong thực tế, phốt pho trong đất hầu hết tồn tại ở dạng không tan và cây trồng không thể sử dụng [15]. Tuy vậy, một vài nhóm vi khuẩn và nấm trong đất có tham gia vào quá trình chuyển hóa phốt phát bằng cách tiết ra axit hữu cơ làm giảm pH đất, giúp hòa tan các hợp chất phosphate không tan [15]. Phân bón vi sinh chuyển hóa phosphate (Phosphate mobilizing bio-fertilizer – PMB): Ví dụ nấm rễ Mycorrhiza sẽ biến đổi các hợp chất phosphat thông qua quá 4
trình khoáng hóa và hòa tan phốt pho cung cấp cho cây. Hiện nay, cơ chế và chứng năng của PMB vẫn chưa được hiểu rõ [17]. Bảng 1. Một số nhóm VSV sử dụng trong sản xuất phân bón vi sinh Loại phân bón Nhóm VSV Phân bón vi sinh cố định nitơ (Nitrogen fixing bio- fertilizers) Azotobacter, Bejerinkia, Clostridium, Klebsiella, Sống tự do Anabaena, Nostoc Sống cộng sinh Rhizobium, Frankia, Anabaena, Azollae Hoại sinh Azospirillum Phân bón vi sinh hòa tan phốt phát (Phosphate solubilizing bio-fertilizer) Bacillus megaterium var, Phosphaticum, Bacillus Vi khuẩn subtilis, Bacillus circulans Nấm Penicillum spp. , Aspergillus awamori Phân bón vi sinh chuyển hóa photphat thành dạng dễ tiêu (Phosphate mobilizing bio-fertilizers) Nấm cộng sinh Glomus spp., Gigaspora spp., Acaulospora spp., (Arbuscular Mycorrhiza) Scutellospora spp. and Sclerocystis spp Nấm rễ ngoài Laccaria spp. Pisolithus spp., Boletus spp. and Amanita (Ectomycorrhiza) spp Ericoid Mycorrhiza Pezizella ericae Orchid Mycorrhiza Rhizoctonia solani Phân bón vi sinh cung cấp dinh dƣỡng vi lƣợng (Bio-fertilizers for micronutrients) VSV hòa tan silicat và kẽm (Silicate and zinc Bacillus sp. solubilizers) VSV rễ kích thích sinh trưởng thực vật 5
Pseudomonas Pseudomonas fluorescens Nguồn tham khảo: "Biofertilizer, a way towards organic agriculture: A review", in trên tạp chí African Journal of Microbiology Research năm 2014 [10] Phân bón vi sinh kích thích sinh trƣởng thực vật (Plant growth promoting bio-fertilizer – PGPB). Nhóm này gồm các VSV vùng rễ như Pseudomonas spp…. Nhiệm vụ của nhóm VSV này là sản xuất ra các hocmon và chất kháng chuyển hóa (anti- metabolites) giúp kích thích rễ phát triển, phân hủy chất hữu cơ, thúc đẩy quá trình khoáng hóa trong đất, làm tăng năng suất cây trồng [11, 44] Phân bón vi sinh hòa tan kali (Potassium solubilizing bio-fertilizer – KSB). Thuộc nhóm này gồm Bacillus spp. và Aspergillus niger. Kali trong đất chủ yếu tồn tại dạng khoáng silicat và cây trồng không sử dụng được kali dạng này. Một số VSV tổng hợp ra các axit hữu cơ gây phân giải silicat, chuyển kali từ dạng khó tan thành dạng dễ tan giúp cây dễ dàng hấp thụ. Phân bón vi sinh làm di động kali (Potassium mobilizing bio-fertilizer – KMB). Đại diện được sử dụng trong nhóm này bao gồm Bacillus spp. Các VSV này sẽ thu hút kali dạng khó tan về khu vực chúng hoạt động và phân giải kali. Một số phân bón vi sinh hòa tan phosphate có chứa Bacillus spp. và Aspergillus spp., đồng thời cũng có khả năng di động kali [31]. Phân bón vi sinh oxi hóa sulfur (Sulfur oxidizing bio-fertilizer – SOB): Thiobacillus spp. là một trong số các VSV có khả năng này. Chúng oxi hóa sulfur thành sulfate giúp cây dễ dàng hấp thụ [31] 1.1.3. Vai trò của phân bón vi sinh với cây trồng Phân bón vi sinh đóng vai trò quan trọng trong cải thiện độ màu mỡ của đất. Bên cạnh đó, chúng cải thiện cấu trúc đất và giảm việc lạm dụng phân bón hóa học. Tại các vùng đất ngập nước, việc sử dụng tảo xanh (blue green algae – BGA) cùng với Azospirillum giúp cải thiện đáng kể năng suất của các cây họ lúa. Phân bón vi sinh kết hợp Azotobacter, Rhizobium và Vesicular Arbuscular Mycorrhiza bón kèm phosphate vô cơ giúp các cây họ lúa đạt năng suất tối đa [10]. Bèo hoa dâu (Azolla) 6
vừa không tốn kém, kinh tế lại thân thiện môi trường góp phần quan trọng trong việc làm giàu carbon và nitơ cho đất. Đối kháng sinh học (antagonis) là một đặc điểm khác mà phân bón vi sinh có thể mang lại. Các chủng nấm Trichoderma đã được chứng minh là có khả năng kiểm soát bệnh thối rễ ở cây đậu [10]. Tốc độ sinh trưởng, năng suất và chất lượng là những thước đo cơ bản để đánh giá hiệu quả tác động của phân bón vi sinh lên cây trồng, trong đó phải kể đến một số phân bón chứa các nhóm VSV hữu ích phổ biến như nhóm vi khuẩn cố định đạm, hòa tan phosphate và kali [44]. Tóm lại, phân bón vi sinh có vai trò quan trọng trong nông nghiệp mà trong đó phải kể tới 5 hiệu quả chính yếu sau: (1) kích thích sinh trưởng thực vật; (2) bảo vệ cây trồng khỏi sự tấn công của sâu bệnh; (3) cải thiện độ màu mỡ của đất; (4) thay thế một phần và giảm sử dụng phân bón hóa học; (5) tham gia vào chu trình tái tạo đất tự nhiên và cải thiện lượng mùn hữu cơ. 1.1.4. Hạn chế của phân bón vi sinh Hạn chế quan trọng nhất của phân bón vi sinh là hàm lượng dinh dưỡng của chúng so với phân bón vô cơ. Điều này có nghĩa rằng, khi chỉ sử dụng phân bón vi sinh sẽ dẫn tới sự thiếu hụt một số chất trong quá trình sinh trưởng của cây trồng. Tuy nhiên, vấn đề này có thể được cải thiện bằng cách bổ sung một số cơ chất như bột xương (giàu phốt pho), tro gỗ (giàu kali) hoặc các cơ chất khác có nguồn gốc tự nhiên như quặng apatit để bổ sung vào phân bón vi sinh. Ngoài ra việc sử dụng các phụ phẩm nông nghiệp giàu dinh dưỡng như khô dầu cọ (giàu kali), tro gỗ (giàu kali)… làm thành phần phân bón vi sinh cũng cung cấp thêm nguồn dinh dưỡng cho đất. Mahimairaja và cộng sự đã cho thấy việc bổ sung phốt pho từ các phụ phẩm nông nghiệp giúp phân bón sinh học cân bằng hơn và giảm hao hụt nitơ [40]. Một điểm hạn chế nữa của phân bón vi sinh là kém bền và dễ bị giảm chất lượng sau một thời gian bảo quản do VSV bị chết hoặc nhiễm tạp. Thông thường, phân vi sinh được đóng vào các túi polyethylene (PE) có độ dày khoảng 50-70 m, và bảo quản ở nhiệt độ thấp (4C) hoặc trong phòng không bị chiếu sáng trực tiếp (25C) [43]. Thời gian sử dụng ngắn, chất mang không phù hợp, nhiệt độ cao, và 7
những khó khăn trong vận chuyển, bảo quản là những vấn đề cần được cải thiện để giúp phân bón vi sinh trở nên phổ biến trong nông nghiệp. 1.2. Vai trò của vi khuẩn vùng rễ đối với đất trồng và sự sinh trƣởng phát triển của thực vật Vi khuẩn vùng rễ kích thích sinh trưởng thực vật (Plant Growth Promoting Rhizobacteria- PGPR) là vi khuẩn trong đất, sinh sống xung quanh hoặc trên bề mặt rễ, trực tiếp hoặc gián tiếp tham gia kích thích sinh trưởng và phát triển thực vật thông qua sản xuất và tiết ra những chất hóa học khác nhau vào vùng rễ cây [34]. PGPR phát triển qua ba giai đoạn: phát tán từ hạt giống, nhân nhanh mật độ trong vùng rễ, bám vào bề mặt rễ và phát triển trong hệ thống cây [33]. Sự giảm tác dụng của PGPR trong các thí nghiệm ngoài đồng ruộng thường là do vi khuẩn thiếu khả năng bám trụ vào rễ cây [9, 14]. Các nhà khoa học phỏng đoán có nhiều gene chịu trách nhiệm giúp vi sinh vật xâm nhập vào rễ cây, tuy nhiên, hiện tại mới có một số ít gene được giải mã [9, 38]. Các gene này chi phối khả năng di động của vi sinh vật như khả năng hình thành tiêm mao hoặc roi, khả năng sản sinh ra những chất đặc biệt giúp bám trên bề mặt rễ cây hoặc khả năng sản sinh các chất cảm ứng [38]. PGPR tạo điều kiện thuận lợi cho sinh trưởng thực vật bởi trực tiếp hoặc hỗ trợ việc thu thập nguồn dưỡng chất (đạm, lân và các khoáng chất thiết yếu) hoặc điều chỉnh hormone thực vật, hoặc gián tiếp làm giảm các tác nhân gây bệnh khác nhau ức chế sinh trưởng thực vật. Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng, PGPR kích thích sinh trưởng thực vật nhờ khả năng hòa tan phốt pho [21, 50], kali [48] hoặc cố định nitơ [59] từ dạng tự do trong không khí. Không chỉ vậy, PGPR còn thúc đẩy sự tăng trưởng thực vật thông qua việc sản xuất các phytohormone như auxin, cytokinin và gibberellin [52]. Ngoài ra, các hợp chất hữu cơ dễ bay hơi (VOCs - Volatile organic compounds) như acetoin và 2,3-butanediol có tác dụng điều hòa nội cân bằng auxin trong cây cũng được Bacillus subtilis, Bacillus amyloliqufaciens và Enterobacter cloacae tạo ra như các chất kich thích tăng trưởng thực vật [30, 60]. Các cofactor PQQ (pyroquinoline quinine) cũng là tác nhân kích thích tăng trưởng thực vật được tìm thấy ở Pseudomonas fluorescens [30]. Bên cạnh khả năng sinh tổng hợp các 8
chất có hoạt tính kích thích sinh trưởng, một số chủng vi khuẩn cũng sinh enzyme phân hủy các hợp chất hữu cơ, góp phần cải tạo đất, hoặc sinh tổng hợp các phytoalexin có hiệu quả kích thích khả năng chống chịu của thực vật đối với một số dịch bệnh do virut, vi khuẩn gây ra [22]. Nhiều nghiên cứu cũng đã ghi nhận việc ứng dụng PGPR trong trồng trọt làm tăng sức đề kháng và năng suất của các loại cây trồng khác nhau trong cả điều kiện bình thường và bất lợi [11]. Các vi khuẩn có lợi ở vùng rễ thực vật có thể làm giảm sự phụ thuộc vào nông dưỡng nguy hại gây bất ổn cho hệ sinh thái nông nghiệp. Do những đặc tính trên, PGPR đã đươc ứng dụng rất nhiều trong sản xuất. 1.3. Vi sinh vật sinh tổng hợp chất kích thích sinh trƣởng thực vật Bacillus megaterium B.megaterium lần đầu được miêu tả bởi Anto De Bary từ năm 1884 [6]. Tên “megaterium” do vi khuẩn này có kích thước lớn, thực tế đây là vi khuẩn lớn nhất trong số các bacilli với kích thước từ 1.5 - 4µm. Rất lâu trước khi Bacillus subtilis được sử dụng như một sinh vật đại diện cho nhóm Gram Dương, B.megaterium đã được nghiên cứu trong lĩnh vực hóa sinh như một bacteriophages [20] B.megaterium là vi khuẩn Gram Dương, có hình que, có bào tử và được xếp là loài chìa khóa (key species) trong quá trình phát sinh loài của nhóm Bacillus. Vị trí của B.megaterium trong cây phát sinh được mô tả trong Hình 1. B.megaterium có rất nhiều ứng dụng trong công nghiệp dược phẩm và nông nghiệp. B.megaterium là một trong số những sinh vật được sử dụng áp dụng công nghệ gene để sản xuất B12 [23]. Đặc biệt, B.megaterium được chứng minh có thể tổng hợp vitamin B12 trong điều kiện có hoặc không có oxy [25]. Bên cạnh đó, B.megaterium được sử dụng như sinh vật chuyển gene để sản xuất protein tái tổ hợp nhờ có vùng multiple cloning sites và khả năng tạo protein thể vùi dễ tinh sạch [51]. Trong nông nghiệp, B.megaterium được chứng minh có khả năng hòa tan phosphate vô cơ, tổng hợp IAA – một loạt chất kích thích sinh trưởng thực vật, chuyển hóa sắt vô cơ và tổng hợp một số chất có hoạt tính kháng nấm [16] 9
Hình 1. Cây phát sinh của một số loài thuộc chi Bacillus căn cứ vào trình tự 16S rRNA [49] 1.4. Một số đặc điểm nuôi cấy vi sinh vật 1.4.1. Nguồn dinh dƣỡng Vi sinh vật cũng như các loài động thực vật khác, chúng luôn có nhu cầu sử dụng các nguồn dinh dưỡng để duy trì các hoạt động sống. Các chất dinh dưỡng cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển của VSV có thể được hấp thụ từ môi trường xung quanh và được sử dụng làm nguyên liệu cung cấp năng lượng hoặc chuyển hóa trao đổi chất tạo ra các thành phần của tế bào. Tuy nhiên không phải mọi thành phần của môi trường nuôi cấy đều được coi là chất dinh dưỡng. Một số chất rắn cần 10