Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu sử dụng enzyme xylanaza để tẩy trắng bột giấy của công ty giấy Bãi Bằng

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:71

Thêm vào BST

Báo xấu

17
lượt xem 3
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu của đề tài là xác định ảnh hưởng của mức dùng enzyme và thời gian xử lý tới độ trắng của bột giấy; xác định ảnh hưởng của xử lý enzyme tới sự biến đổi của xylan trong bột giấy; xác định ảnh hưởng của xử lý enzyme tới khả năng giảm mức tiêu hao chất tẩy trắng sử dụng enzyme.... Mời các bạn cùng tham khảo.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu sử dụng enzyme xylanaza để tẩy trắng bột giấy của công ty giấy Bãi Bằng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI ----------------------------- LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG ENZYME XYLANAZA ĐỂ TẨY TRẮNG BỘT GIẤY CỦA CÔNG TY GIẤY BÃI BẰNG NGÀNH: CÔNG NGHỆ HÓA HỌC CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ XENLULZA VÀ GIẤY MÃ SỐ: HỒ THỊ THUÝ LIÊN Người hướng dẫn khoa học: TS LÊ QUANG DIỄN HÀ NỘI – 10/2009
LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Lê Quang Diễn, người đã hướng dẫn tận tình, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành tốt luận văn này. Tôi xin chân thành cảm ơn sự ủng hộ, giúp đỡ về mọi mặt của các thầy cô giáo trong Bộ môn Công nghệ xenluloza và giấy, Khoa Công nghệ Hoá học, Đại học Bách khoa Hà Nội. Tôi xin cám ơn tập thể giáo viên khoa công nghệ trường Cao đẳng nghề Công nghệ giấy và Cơ Điện Phú Thọ đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình làm nghiên cứu khoa học. Cuối cùng, cho phép tôi xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã chia sẻ những khó khăn và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian nghiên cứu và thực hiện luận văn tại Trường Đại học Bách khoa Hà Nội. Hà Nội, tháng 10 năm 2009 Tác giả - Hồ Thị Thuý Liên
MỤC LỤC Trang phụ bìa ................................................................................................. 1 Lời cam đoan .................................................................................................. 2 Lời cám ơn ..................................................................................................... 5 Danh mục các hình ......................................................................................... 6 Danh mục các bảng ........................................................................................ 7 Mở đầu ........................................................................................................... 9 Chương I: Tổng quan về sử dụng enzyme cho sản xuất bột giấy ............ 13 1.1. Khái quát về enzym và một số tính chất của chúng ................................ 13 1.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình phản ứng được xúc tác bởi enzym ................................................................................................ 15 1.2.1. Ảnh hưởng của nồng độ enzyme ................................................... 15 1.2.2. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất ................................................... 15 1.2.3. Ảnh hưởng của chất kìm hãm ....................................................... 16 1.2.4. Ảnh hưởng của ion kim loại .......................................................... 17 1.2.5. Ảnh hưởng của pH đến độ bền enzyme ........................................ 17 1.2.6. Ảnh hưởng của nhiệt độ ................................................................ 18 1.2.7. Ảnh hưởng của điều kiện bảo quản đến độ bền cuả enzyme .......... 20 1.2.8. Các yếu tố khác .............................................................................. 20 1.3. Các phương pháp xác định hoạt độ của enzym. ...................................... 21 1.4. Tình hình sản xuất và ứng dụng enzym ở Việt Nam và trên thế giới ..... 23 1.5. Ứng dụng enzym trong công nghiệp giấy ............................................... 25 1.5.1. Cơ sở lý thuyết ..................................................................................... 25 1.5.2. Tổng quan các nghiên cứu sử dụng enzyme cho tẩy trắng bột giấy .... 34 1.6. Kết luận .................................................................................................. 46 Chương II: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu ................................. 47 2.1. Chuẩn bị nguyên liệu cho nghiên cứu ..................................................... 47
2.2. Các thiết bị và dụng cụ chính sử dụng cho nghiên cứu .......................... 47 2.3. Phương pháp xử lý bột giấy sunfat bằng enzyme ................................... 48 2.4. Quy trình tẩy trắng bột giấy ................................................................... 49 2.5. Chuẩn bị mẫu bột giấy cho xác định tính chất cơ lý ............................... 50 2.6. Các phương pháp phân tích tính chất bột giấy ....................................... 50 Chương III: Kết quả và thảo luận .............................................................. 52 3.1. Xác định hoạt độ của enzym ................................................................... 52 3.2. Xác định tính chất của bột sunfat chưa tẩy trắng .................................... 52 3.3. Xác định ảnh hưởng của mức dùng enzym tới độ trắng của bột sunfat tẩy trắng ................................................................................................... 53 3.4. Ảnh hưởng của thời gian xử lý bằng enzym tới độ trắng của bột .......... 56 3.5. Ảnh hưởng của xử lý bột sunfat bằng enzym tới tốc độ hoà tan lignin .. 58 3.6. Xác định mức giảm hoá chất tẩy trong quá trình tẩy trắng sử dụng enzyme ............................................................................................ 61 3.7. Ảnh hưởng của xử lý enzym tới hàm lượng pentozan trong bột giấy sunfat ................................................................................................ 62 3.8. Ảnh hưởng của enzym tới quá trình nghiền bột sunfat ........................... 63 3.9. Ảnh hưởng của enzym tới tính chất của bột giấy ................................... 64 Kết luận ......................................................................................................... 66 Kiến nghị những nghiên cứu tiếp theo ........................................................... 67 Tài liệu tham khảo .......................................................................................... 68 Phụ lục ........................................................................................................... 71 Tóm tắt luận văn ............................................................................................. 73
9 MỞ ĐẦU Công nghiệp giấy là một ngành kinh tế quan trọng cần được ưu tiên phát triển phù hợp với đường lối đổi mới của nền kinh tế, với tiến trình công nghiệp hóa hiện đại hóa của đất nước. Theo Hiệp hội bột giấy và giấy Việt Nam, mặc dù chịu ảnh hưởng của khủng hoảng kinh tế song tiêu dùng giấy Việt Nam năm 2008 vẫn đạt mức bình quân đầu người 22- 23 kg và lượng giấy tiêu thụ trong nước năm 2008 là khoảng 1,98 triệu tấn. Dự đoán đến năm 2020 mức tiêu dùng giấy bình quân đầu người sẽ đạt khoảng 50 kg, tức lượng giấy tiêu dùng trong nước sẽ vào khoảng 5 triệu tấn/năm, sản lượng giấy trong nước đạt khoảng 3,6 triệu tấn, bột giấy đạt 1,8 triệu tấn. Tháng 3/2007 Bộ Công nghiệp đã phê duyệt Quy hoạch phát triển ngành công nghiệp giấy Việt Nam đến năm 2010, tầm nhìn 2020 nhằm xây dựng ngành công nghiệp giấy Việt Nam với công nghệ hiện đại, hình thành các khu vực sản xuất giấy, bột giấy tập trung với công suất đủ lớn, đáp ứng nhu cầu trong nước và xuất khẩu. Đến năm 2020, đáp ứng 70% nhu cầu tiêu dùng trong nước, đẩy mạnh xuất khẩu các mặt hàng giấy, tạo thế cạnh tranh với các thị trường trong khu vực và quốc tế; xây dựng vùng nguyên liệu giấy tập trung nhằm đáp ứng đủ nhu cầu nguyên liệu để cung cấp cho sản xuất 600.000 tấn bột giấy vào năm 2010 và 1.800.000 tấn vào năm 2020, tạo điều kiện để xây dựng các nhà máy chế biến bột giấy tập trung, quy mô lớn. Phấn đấu đến năm 2010, trồng được 470.000 ha rừng nguyên liệu, sản xuất được 600.000 tấn bột giấy và 1.380.000 tấn giấy; đến năm 2020, trồng thêm 907.000 ha rừng nguyên liệu, sản xuất được 1.800.000 tấn bột giấy và 3.600.000 tấn giấy. Bên cạnh đó, với thực trạng hiện nay và trước tình hình mới, vấn đề đáp ứng các yêu cầu về bảo vệ môi trường của công nghiệp giấy đang hết sức
10 cấp bách. Vì vậy song song với áp dụng các biện pháp kịp thời về xử lý chất thải, việc cải tiến công nghệ nhằm nâng cao hiệu quả kinh tế và giảm thiểu ảnh hưởng đến môi trường cũng cần được quan tâm đúng mức. Trên thế giới, ứng dụng công nghệ sinh học trong tẩy trắng bột giấy đã thực sự thu hút sự quan tâm và đã đạt được nhiều thanh tựu trong những năm gần đây . Sử dụng enzyme kết hợp vào công đoạn tẩy trắng bột giấy đã khẳng định những ưu việt của mình so với chỉ sử dụng các chất tẩy truyền thống. Ở nước ta, “Đề án phát triển và ứng dụng công nghệ sinh học trong lĩnh vực công nghiệp chế biến đến năm 2020” do Thủ tướng Chính phủ ban hành theo Quyết định số 14/2007/QĐ-TTg ngày 25/01/2006 đã được triển khai trong nhiều ngành công nghiệp và đang mang lại những hiệu quả kinh tế xã hội đáng kể. Theo Quyết định này, mục tiêu đến năm 2010 phải nghiên cứu tạo ra các công nghệ sinh học tiên tiến ở trong nước, sản xuất ở quy mô công nghiệp các sản phẩm enzyme (kể cả enzyme tái tổ hợp), các chế phẩm vi sinh, các hoạt chất sinh học đáp ứng nhu cầu phát triển ngành công nghiệp chế biến.Nghiên cứu tạo ra các công nghệ sinh học tiên tiến ở trong nước, kết hợp với việc nhập khẩu và làm chủ các công nghệ sinh học hiện đại trong lĩnh vực công nghiệp chế biến của nước ngoài phù hợp với điều kiện sản xuất ở nước ta. Ứng dụng rộng rãi và có hiệu quả các công nghệ này vào sản xuất để chủ động tạo ra các sản phẩm công nghiệp chế biến có chất lượng tốt và sức cạnh tranh cao trên thị trường; Phát triển mạnh và bền vững ngành công nghệ sinh học phục vụ lĩnh vực công nghiệp chế biến, tạo lập thị trường thuận lợi để thúc đẩy sản xuất kinh doanh và dịch vụ các sản phẩm trong lĩnh vực công nghiệp chế biến cũng là một trong những nhiệm vụ trọng tâm của Chương trình. Trong chiến lược này công nghiệp giấy cũng sẽ là một trong những ngành cần quan tâm thúc đẩy ứng dụng công nghệ sinh học.
11 Nhà máy giấy Bãi Bằng (Tổng Công ty giấy Việt Nam) là nhà máy duy nhất ở nước ta sản xuất bột sunfat, có công suất 61.000 tấn bột/năm, nấu bột bằng phương pháp sunfat kết hợp với tẩy trắng sử dụng chất tẩy truyền thống (clo nguyên tố và natri hypoclorit). Mặc dù giai đoạn 2000-2004 đã được đầu tư cải tiến kỹ thuật-công nghệ, song hiện nay tổng mức tiêu hao clo vẫn ở khoảng 50-60 kg/tấn bột. Với mức nước thải từ phân xưởng tẩy khoảng 2500 m3/tấn bột, lượng nước thải tạo ra là 19.000 - 20.500 m3/ngày đêm. Nhà máy đang gặp nhiều khó khăn trong việc xử lý nước thải này đạt yêu cầu với chi phí hàng tỉ đồng và công nghệ xử lý phức tạp. Thực tế công nghiệp giấy thế giới cho thấy, có nhiều phương pháp hữu hiệu để giảm hoặc loại bỏ hoàn toàn việc sử dụng chất tẩy chứa clo, như thay thế clo bằng di oxit clo, ozon, hydropeoxit, …, trong đó ứng dụng công nghệ sinh học là biện pháp hiệu quả và phù hợp với xu hướng phát triển của thời đại… Để có thể mạnh dạn áp dụng các công nghệ thân thiện môi trường cần có các nghiên cứu khả thi, vì vậy trong khuôn khổ luận văn này tôi đã tiến hành nghiên cứu sử dụng enzyme xylanaza để tẩy trắng bột giấy của nhà máy giấy Bãi Bằng. Mục tiêu của đề tài là xác lập hiệu quả của xử lý bột giấy bằng xylanaza trong quá trình tẩy trắng và ảnh hưởng của nó tới tính chất của bột giấy. Đối tượng nghiên cứu là bột giấy sunfat chưa tẩy trắng của nhà máy giấy Bãi Bằng (Tổng Công ty Giấy Việt Nam). Nội dung nghiên cứu bao gồm: - Xác định ảnh hưởng của mức dùng enzyme và thời gian xử lý tới độ trắng của bột giấy; - Xác định ảnh hưởng của xử lý enzyme tới sự biến đổi của xylan trong bột giấy. - Xác định ảnh hưởng của xử lý enzyme tới khả năng giảm mức tiêu
12 hao chất tẩy trắng sử dụng enzyme. - Đánh giá tính chất của bột giấy. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài: - Kết quả nghiên cứu là cơ sở cho việc xây dựng các quy trình công nghệ tẩy trắng bột sunfat ở nước ta áp dụng công đoạn xử lý enzyme, nhằm giảm mức tiêu hao hóa chất tẩy, đáp ứng mục tiêu hoàn thiện và áp dụng các công nghệ thân thiện môi trường hơn trong công nghiệp giấy. - Là tài liệu tham khảo tốt trong lĩnh vực hóa học và công nghệ sản xuất bột giấy, ứng dụng công nghệ sinh học trong công nghiệp chế biến.
13 CHƯƠNG I: TỔNG QUAN VỀ SỬ DỤNG ENZYME TRONG SẢN XUẤT BỘT GIẤY 1.1. Khái quát về enzyme và một số tính chất của chúng Enzyme là các chất xúc tác sinh học cấu tạo từ các phân tử protein, có khả năng hòa tan trong nước và dung dịch muối loãng, phân tử lượng lớn 20.000–1.000.000 Dal.[5] So với các chất xúc tác hoá học, enzyme có những tính chất ưu việt hơn hẳn: - Cường lực xúc tác lớn: trong điều kiện thích hợp các enzyme có khả năng tăng tốc độ của các phản ứng nhanh gấp 108 – 1011 lần so với khi không có xúc tác; - Tính đặc hiệu cao: mỗi enzyme chỉ chuyển hoá một hoặc một số cơ chất nhất định theo một kiểu phản ứng nhất định, do đó không tạo sản phẩm phụ; - Tác dụng trong điều kiện ôn hòa: đa số các enzyme hoạt động ở nhiệt độ 35oC– 40oC, áp suất thường, nồng độ không cần quá cao. Do vậy không đòi hỏi các thiết bị chịu nhiệt, chịu áp… - Không độc hại đối với sức khỏe con người, thân thiện với môi trường; - Dễ kiếm, rẻ tiền. Enzyme có thể thu được từ nhiều nguồn động vật, thực vật, vi sinh vật… Đặc biệt vi sinh vật là nguyên liệu tốt nhất vì có tốc độ sinh trưởng, phát triển nhanh trên các môi trường không đắt tiền. Hơn nữa, ta có thể chủ động điều khiển quá trình sinh tổng hợp enzyme nhằm nâng cao hàm lượng enzyme trong tế bào một cách dễ dàng. Các loại enzyme sử dụng
14 trong công nghiệp rất đa dạng. Mỗi một ngành lại có sự đặc thù nhất định.Với những ưu điểm vượt trội các chế phẩm enzyme được sản xuất ngày càng nhiều và được sử dụng trong hầu hết các lĩnh vực kinh tế. Enzyme đã góp phần thay đổi và môi trường… đáp ứng nhu cầu ngày càng cao của xã hội. Hàng năm lượng enzyme nâng cao một số quá trình công nghệ trong chế biến thực phẩm, nông nghiệp, y tế, được sản xuất ra trên thế giới đạt khoảng trên 300.000 tấn với trị giá trên 500 triệu USD được phân bố trong các lĩnh vực khác nhau.[1] Cơ chế tác dụng của enzyme lên các chủ thể được phản ánh tương đối đầy đủ và sâu rộng trong nhiều tài liệu. Có thể tóm tắt cơ chế xúc tác các phản ứng biến đổi các chủ thể như sau:[2] Khi enzyme tác dụng với cơ chất, tạo thành một hợp chất dạng phức, trong đó enzym tham gia vào các phản ứng biến đổi phức này thành sản phẩm và giải phóng enzyme tự do: E+S ES P+E Một phản ứng như vậy diễn ra qua 3 giai đoạn: - Giai đoạn thứ nhất: Enzyme tác dụng với cơ chất bằng liên kết yếu tạo thành phức enzyme - cơ chất (ES) không bền. Phản ứng này diễn ra rất nhanh và đòi hỏi năng lượng hoạt hóa thấp. Liên kết chủ yếu được tạo thành giữa E và S trong phức ES là liên kết tương tác tĩnh điện, liên kết hidro, tương tác Vander waal. - Giai đoạn thứ hai: Sảy ra sự biến đổi cơ chất dẫn tới sự kéo căng và phá vỡ các liên kết đồng hóa trị. - Giai đoạn thứ ba: Sản phẩm được tạo thành, còn enzyme được giải phóng ra dưới dạng tự do, nguyên dạng. Đây là một quá trình tương đối phức tạp, chịu ảnh hưởng của nhiều yếu
15 tố hóa - lý học. 1.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến các quá trình được xúc tác bởi enzyme [1]: 1.2.1. Ảnh hưởng của nồng độ enzyme: Trong điều kiện thừa cơ chất, tốc độ phản ứng phụ thuộc tuyến tính vào [E]: v= k.[E] Trong đó: v- vận tốc phản ứng. [E]- nồng độ cơ chất. Trường hợp khi nồng độ enzyme quá lớn thì tốc độ phản ứng có thể bị chậm lại. V [E] Hình 1.1: Sự phụ thuộc vận tốc phản ứng vào nồng độ enzyme 1.2.2. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất: Cả Henri (1903), Michaelis & Menten (1913) đều đã đưa ra phương trình biểu diễn mối liên hệ giữa vận tốc phản ứng và nồng độ cơ chất ([S]) giống nhau, tuy nhiên Henri nhấn mạnh tầm quan trọng của vận tốc (V), còn Michaelis & Menten lại nhấn mạnh tầm quan trọng của vận tốc ban đầu (V0) của phản ứng, theo đó:
16 V [S ] k vo = ; K s = −1 K s + [S ] k1 Hình 1.2 Biến thiên vận tốc phản ứng theo nồng độ cơ chất. 1.2.3. Ảnh hưởng của chất kìm hãm (inhibitor): Các chất kìm hãm (I) hay chất ức chế là những chất làm giảm tốc độ phản ứng do enzyme xúc tác. Về bản chất, chúng là các ion, các chất vô cơ, chất hữu cơ hoặc có thể là cơ chất hay sản phẩm của phản ứng (E). Về tác dụng, chất ức chế thường đặc hiệu hoặc không đặc hiệu. Chúng có khả năng kìm hãm thuận nghịch hoặc không thuận nghịch (inactivator). Khi có mặt các chất kìm hãm thuận nghịch, chúng kìm hãm enzyme bằng cách kết hơp với nó và làm ảnh hưởng đến sự kết hợp của E & S, tức là ảnh hưởng đến hoạt độ phân tử của nó.
17 Các chất kìm hãm có thể tác dụng theo nhiều kiểu: Cạnh tranh ( một phần hay toàn phần); Không cạnh tranh; 1.2.4. Ảnh hưởng của các ion kim loại: Các ion kim loại có thể kìm hãm hoặc kích hoạt quá trình xúc tác của enzyme. Tác dụng của ion kim loại phụ thuộc nhiều vào nồng độ của chúng. Giới hạn nồng độ là khác nhau đối với từng loại ion riêng biệt. Tác dụng của ion kim loại có mối quan hệ qua lại giữa enzym và cơ chất. Tác dụng kích hoạt của ion kim loại có tính đặc hiệu, mỗi ion kim loại thường kích hoạt một loại enzyme xúc tác cho 1 kiểu phản ứng nhất định và cũng thay đổi tùy dạng ion. Ví dụ: Mg2+ hoạt hóa các enzyme mà cơ chất được phosphoryl hóa như pyrophosphatase (cơ chất là pyrophosphate), adenosintriphosphatase (cơ chất là ATP). Các cation kim loại có thể có tính đặc hiệu, tính đối kháng và tác dụng còn tuỳ thuộc vào nồng độ. Tính chất hoạt hóa của các cation kim loại: - Mỗi cation kim loại hoạt hóa cho một kiểu phản ứng nhất định. - Cation kim loại có tính đặc hiệu tương đối hay tuyệt đối. - Cation kim loại có thể có sự đối kháng ion. - Phụ thuộc nồng độ cation kim loại . - Cation kim loại làm thay đổi pH tối thích. - Phụ thuộc bản chất cation kim loại. 1.2.5. Ảnh hưởng của pH đến độ bền của enzyme: Sự phân li khác nhau của một phân tử protein ở các giá trị pH khác nhau làm thay đổi tính chất của trung tâm liên kết cơ chất và hoạt động ở phân tử phân tử enzyme, dẩn đến giá trị xúc tác khác nhau phụ thuộc vào giá trị pH.
18 Như đã biết mỗi enzyme có một pH tối thích, mỗi enzyme có đường biểu diễn ảnh hưởng pH lên vận tốc của phản ứng do enzyme xúc tác có dạng như hình 1.3. Độ bền của enzyme cũng phụ thuộc vào trạng thái ion hoá của phân tử, phần lớn các enzyme bền trong khoảng 5
19 k t +10 Q10 = kt . Hệ số này càng lớn thì phản ứng càng khó xảy ra. Ở nhiệt độ thường và trong đại đa số các phản ứng của enzyme thì Q10 thường có giá trị là 2. Nhiệt độ hoạt động thích hợp topt của nhiều enzyme vào khoảng 40÷50oC. Trên 50oC hoạt độ thường bị giảm mạnh do làm hỏng cấu trúc phân tử enzyme. Topt của một số vi sinh vật và enzyme có nguốn gốc thưc vật thường cao hơn. Topt của một enzyme chỉ có nghĩa khi ở điều kiện đó enzyme có hoạt độ cao nhất. Hoạt độ (Nhiệt độ) Hình 1.4 : Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ của enzyme Đối với phản ứng do enzyme xúc tác cũng có thể áp dụng được quy luật này nhưng chỉ trong một phạm vi nhất định. Do bản chất enzyme là protein
20 nên khi tăng nhiệt độ lên trên 40-50 0C sẽ xảy ra quá trình phá hủy chất xúc tác. Ngoài khoảng nhiệt độ thích hợp, tốc độ phản ứng do enzyme xúc tác sẽ giảm. Nhờ có sự tồn tại nhiệt độ tối ưu đối với enzyme mà người ta phân biệt được phản ứng hóa sinh với các phản ứng vô cơ thông thường. Mỗi enzyme có một nhiệt độ thích hợp khác nhau, phần lớn phụ thuộc vào nguồn cung cấp enzyme, thông thường ở trong khoảng từ 40-60 0C. Cũng có enzyme có nhiệt độ thích hợp rất cao như enzyme của những chủng ưa nhiệt. 1.2.7. Ảnh hưởng của điều kiện bảo quản đến độ bền của enzyme Ở khoảng 70oC thì phần lớn enzyme bị mất hoàn toàn hoạt tính, gọi là nhiệt độ tới hạn. Trong khoảng tới hạn enzyme bị biến tính hiếm khi hồi phục lại được. Ngoài ra còn nhiều yếu tố khác như áp suất cao, sự thay đổi mạnh pH của môi trường, phóng xạ, ... Chính vì vậy điều kiện bảo quản enzyme khi sử dụng là yếu tố rất quan trọng, ảnh hưởng trực tiếp tới mức tiêu hao enzyme cho phản ứng. 1.2.8. Các yếu tố khác - Ánh sáng: Có ảnh hưởng khác nhau đến từng loại enzyme, các bước sóng khác nhau có ảnh hưởng khác nhau, thường ánh sáng trắng có tác động mạnh nhất, ánh sáng đỏ có tác động yếu nhất. Ánh sáng vùng tử ngoại cũng có thể gây nên những bất lợi, enzyme ở trạng thái dung dịch bền hơn khi được kết tinh ở dạng tinh thể, nồng độ enzyme trong dung dịch càng thấp. càng kém bền, tác động của tia tử ngoại sẽ tăng lên khi nhiệt độ. Ví dụ: dưới tác động của tia tử ngoại ở nhiệt độ cao, enzyme amylase nhanh chóng mất hoạt tính. - Sự chiếu điện: Điện chiếu với cường độ càng cao thì tác động phá hủy càng mạnh. Tác động sẽ mạnh hơn đối với dịch enzyme có nồng độ thấp. Có thể do tạo thành những gốc tự do, từ đó tấn công vào phản ứng enzyme.
21 - Sóng siêu âm: Tác động rất khác nhau đối với từng loại enzyme, có enzyme bị mất hoạt tính, có enzyme lại không chịu ảnh hưởng. Độ bền phụ thuộc vào trang thái của tồn tại enzyme, càng tinh khiết thì enzyme càng kém bền, dịch càng loãngng thì độ bền càng kém 1.3. Các phương pháp xác định hoạt độ của enzyme[3].[5]. Phân tích liên tục: là phương pháp đo cơ chất bị biến đổi hay sản phẩm tạo thành một cách liên tục theo thời gian. Tuy nhiên yêu cầu đối với thiết bị đo là phải có bộ phận ổn định nhiệt. Đây là mặt hạn chế của phương pháp. Đồng thời, do phải theo dõi sự biến đổi của chất phản ứng một cách liên tục nên khó thực hiện phân tích hoạt độ nhiều mẫu enzyme cùng lúc. Phân tích gián đoạn: là phương pháp cho enzyme tác dụng với cơ chất sau một khoảng thời gian nhất định thì ngừng phản ứng enzyme và sau đó đo lượng cơ chất còn lại hoặc sản phẩm tạo thành. Để ngừng phản ứng có thể dùng các tác nhân làm mất hoạt tính của enzyme như tăng nhiệt độ cao, thay đổi pH, dùng chất tạo phức hay tách enzyme ra khỏi hỗn hợp…Phương pháp này khắc phục những hạn chế của phương pháp đo liên tục, phản ứng có thể tiến hành trong tủ ấm hay bể nhiệt ổn định, có thể tiến hành một lúc nhiều mẫu…tuy nhiên vấn đề đặt ra là phải tìm cách làm ngưng phản ứng bằng cách thích hợp nhất. Dựa theo nguyên tắc xác định hoạt độ trên, có thể xác định theo một hoặc một số phương pháp chính sau đây: - Phương pháp đo độ nhớt: Dùng nhớt kế đo sự biến đổi độ nhớt của dung dịch phản ứng. Áp dụng với các enzyme mà cơ chất có độ nhớt cao hơn hẳn so với sản phẩm (chất có phân tử lớn như axit nucleic, protein, xenluloza). - Phương pháp phân cực kế: Sử dụng khi cơ chất và sản phẩm có khả năng làm quay mặt phẳng ánh sáng phân cực và có góc quay riêng khác nhau.
22 - Phương pháp đo áp suất hay áp kế: Dùng với các phản ứng enzyme có sự tiêu hao hay sinh khí, như các phản ứng oxy hóa, phản ứng tách loại nhóm cacboxyl, tách loại amin. Phản ứng sinh khí hay tiêu hao khí có thể diễn ra trực tiếp hoặc gián tiếp. - Phương pháp quang phổ kế: Được sử dụng phổ biến hiện nay, dựa trên khả năng hấp thụ ánh sáng ở các bước sóng xác định của cơ chất, hoặc sản phẩm phản ứng. - Phương pháp chuẩn độ: Dùng cho các phản ứng enzyme có sự hình thành axit hoặc bazơ. Phương pháp này yêu cầu duy trì pH của môi trường cố định, lượng kiềm hoặc axit chuẩn dùng để chuẩn độ theo thời gian phản ánh hoạt độ của enzyme. - Phương pháp sắc ký: Sử dụng sắc ký để phân tách sản phẩm phản ứng, như tách amino axit sau khi cho hai enzyme aminotranspherase lên cơ chất hay protein tác dụng lên cơ chất và sau đó dịnh lượng các amino axit thu được. Đây là phương pháp tốn nhiều thời gian, vì vậy phương pháp này ít sử dụng. - Phương pháp hóa học: Dùng các phản ứng hóa học để định lượng cơ chất mất đi hay lượng sản phẩm tạo thành. Thông thường phải chọn phản ứng tạo nên các phức chất màu có độ hấp thu ánh sáng cực đại ở vùng nào đó để từ đó định lượng hợp chất này. - Phương pháp định lượng cơ chất còn lại hay sản phẩm tạo thành có thể đơn giản là sự đo cơ chất còn lại hay sản phẩm tạo thành một cách trực tiếp. Tuy nhiên trong nhiều trường hợp có thể đo một cách gián tiếp và do đó phép đo phức tạp hơn. - Phương pháp phóng xạ: Dựa trên sự hình thành các bức xạ của các chất đồng vị phóng xạ gắn vào cơ chất tại nhóm chức thích hợp để có thể đo độ phóng xạ (sự phân rã) của cơ chất còn lại, hay sản phẩm tạo thành. Thường áp
23 dụng xác định hoạt độ các enzyme mà các phương pháp thông thường không thể đo được. Có thể kết hợp phương pháp điện di với phương pháp phóng xạ để xác định hoạt độ enzyme. - Phương pháp huỳnh quang: Dựa trên sự phát quang của một số hợp chất dưới tác dụng của một nguồn sang kích thích đặc trưng. Mức độ phát huỳnh quang được đo nhờ máy huỳnh quang kế. Đây cũng là phương pháp cho độ nhạy cao, cho phép phát hiện hoạt độ enzyme ở mức độ thấp. Bên cạnh những phương pháp phân tích hoạt độ có tính định lượng nêu trên, nhiều trường hợp phân tích định tính hay bán định lượng cũng được sử dụng để nhanh chóng bước đầu xác định sự có mặt của enzyme. Thường được dùng nhiều hơn hết là phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch có chứa đệm và cơ chất (tinh bột với amylase, casein với protease…) sau đó nhuộm màu (iot nhuộm với tinh bột, xanh coomassie hay amido đen với casein…) để phát hiện hay đánh giá hoạt độ enzyme qua vòng phân giải cơ chất. Để khẳng định chắc chắn bản chất phản ứng có phải do enzyme xúc tác hay không, người ta xử lý nhiệt (vì phần lớn enzyme có bản chất protein (hay RNA) đều mất hay giảm phần lớn hoạt tính xúc tác sau khi xử lý ở nhiệt độ cao. Trong một số trường hợp có thể dùng chất ức chế đặc biệt khẳng định sự có mặt của enzyme trong mẫu phân tích (azid natri ức chế đặc hiệu catalase, phenyl methyl sunfonyl fluorid-PMSF ức chế đặc hiệu các protease serine…). 1.4. Tình hình sản xuất và ứng dụng enzyme ở Việt nam và trên Thế giới Hiện nay, việc sản xuất các chế phẩm enzyme đã và đang phát triển mạnh mẽ trên qui mô công nghiệp. Thực tế đã có hàng nghìn chế phẩm enzyme bán trên thị trường thế giới, các chế phẩm này đã được khai thác và