Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu tạo kit multiplex PCR chẩn đoán nhanh các chủng vi khuẩn lao ở Việt Nam

Chia sẻ: Na Na | Ngày: | Loại File: DOC | Số trang:94

Thêm vào BST

Báo xấu

78
lượt xem 9
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Đề tài có các mục tiêu sau: Tạo kit multiplex PCR với 3 gen đích IS6110, IS1081 và 23SrDNA chẩn đoán vi khuẩn lao phù hợp với điều kiện của Việt Nam; đánh giá hiệu quả của kit trên panel mẫu và trên các bệnh phẩm lâm sàng nghi lao.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu tạo kit multiplex PCR chẩn đoán nhanh các chủng vi khuẩn lao ở Việt Nam

MỞ ĐẦU Theo thống kê của tổ chức Y tế Thế giới (WHO), tỉ lệ nhiễm lao hiện nay chiếm 1/3 dân số thế giới. Hàng năm có thêm khoảng 9 triệu người mắc lao mới và có khoảng 3 triệu người chết vì lao. Với tốc độ lây truyền nhanh và tỷ lệ tử vong cao như vậy, hiện nay bệnh lao được xếp vào một trong những bệnh truyền nhiễm nguy hiểm nhất. Tuy nhiên theo ước tính tỷ lệ phát hiện bệnh chỉ đạt 37%. Như vậy số bệnh nhân mắc lao nhưng không được phát hiện và chữa trị kịp thời chiếm đến 63%, đây sẽ là nguồn lây nhiễm rất khó kiểm soát. Theo đánh giá của WHO Việt Nam là một quốc gia đang phát triển và có tỉ lệ nhiễm lao đứng thứ 12 trong số 22 nước có số bệnh nhân mắc lao cao nhất thế giới (WHO 2004). Tính riêng khu vực Tây Thái Bình Dương, Việt Nam đứng thứ 3, chỉ sau Trung Quốc và Philipine [2, 11, 74]. Trước diễn biến nghiêm trọng đó, tổ chức Y tế Thế giới đã kêu gọi các quốc gia trên thế giới quan tâm đặc biệt đến phòng chống và kiểm soát bệnh lao. Bệnh lao ngày càng trở nên nguy hiểm hơn, đặc biệt là lao kháng đa thuốc gây tử vong rất lớn, vì vậy càng cần thiết trong việc phát hiện và điều trị sớm. Việc kiểm soát bệnh lao phụ thuộc vào việc chẩn đoán nhanh và chính xác. Tuy nhiên việc chẩn đoán còn gặp rất nhiều khó khăn. Ở Việt Nam, phương pháp phổ biến nhất hiện nay vẫn là nhuộm Ziehl Neelsen. Tuy nhiên phương pháp này chỉ phát hiện ra trong trường hợp số lượng vi khuẩn lao ≥ 104 AFB/1ml bệnh phẩm, do vậy sẽ để sót nhiều bệnh nhân do kết quả âm tính giả. Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn lao trên môi trường LowensteinJensen được coi là tiêu chuẩn vàng để chẩn đoán, tuy nhiên phải mất 4 đến 8 tuần nuôi cấy mới cho kết quả. Trên môi 1
trường nuôi cấy cải tiến MGIT, BACTEC cũng mất đến 2 tuần, do vậy rất khó đáp ứng yêu cầu giám sát và kiểm soát bệnh lao [4, 19]. Hiện nay, với sự phát triển của công nghệ sinh học chúng ta đã khắc phục được nhược điểm này. Việc áp dụng công nghệ sinh học phân tử trong chẩn đoán lao đã rút ngắn thời gian chẩn đoán xuống còn hai ngày. Phương pháp này có độ nhậy và độ đặc hiệu cao, cho phép phân biệt chính xác các loài có khả năng gây bệnh lao cũng như phát hiện khả năng kháng thuốc thông qua các gen đặc trưng. Hiện nay, một số cơ sở trong nước đã áp dụng sinh học phân tử trong chẩn đoán lao nhưng chủ yếu vẫn sử dụng các kít chẩn đoán cũ nhằm vào nhân đoạn IS6110, đây là trình tự đặc trưng của vi khuẩn lao [28, 34]. Tuy nhiên, gần đây một số nghiên cứu đã công bố tỷ lệ nhất định các chủng lao không chứa trình tự IS6110, đặc biệt là các chủng được tìm thấy ở Ấn Độ và Đông Nam Á trong đó có Việt Nam [34, 72]. Vì vậy rất dễ bỏ sót các bệnh nhân có mang vi khuẩn lao khuyết IS6110. Do vậy cần thiết kế những loại primer mới để chẩn đoán lao ở Việt Nam một cách hiệu quả và chính xác. Theo một số nghiên cứu gần đây cho biết, ngoài đoạn gen IS6110 còn có một số gen đích khác như IS1081 và 23SrDNA có mặt ở tất cả các chủng lao gây bệnh. Do vậy khi sử dụng cùng lúc các cặp mồi đặc hiệu để khuếch đại các đoạn IS6110, IS1081 và 23S rDNA sẽ rất thuận lợi trong việc phát hiện M. tuberculosis complex, tránh bỏ sót bệnh nhân [13]. Xuất phát từ những vấn đề trên chúng tôi đề xuất đề tài “ Nghiên cứu tạo kit multiplex PCR chẩn đoán nhanh các chủng vi khuẩn lao ở Việt Nam” nhằm chẩn đoán nhanh, chính xác vi khuẩn lao, góp phần kiểm soát và nâng cao hiệu quả chẩn đoán lao. Đề tài có hai mục tiêu sau: 2
1. Tạo kit multiplex PCR với 3 gen đích IS6110, IS1081 và 23SrDNA chẩn đoán vi khuẩn lao phù hợp với điều kiện của Việt Nam. 2. Đánh giá hiệu quả của kit trên panel mẫu và trên các bệnh phẩm lâm sàng nghi lao. Chương 1 TỔNG QUAN 1.1. TÌNH HÌNH BỆNH LAO 1.1.1. Tình hình bệnh lao trên thế gới Lao là một bệnh truyền nhiễm mãn tính đã xuất hiện từ rất lâu. Hàng nghìn năm trôi qua, nó đã lây lan và giết chết hàng triệu người, số người chết vì bệnh lao còn lớn hơn cả do AIDS và sốt rét cộng lại. Ngày nay, bệnh lao càng trở nên nghiêm trọng hơn do xuất hiện các chủng lao kháng đa thuốc, lao kháng thuốc phổ rộng và lao đồng nhiễm HIV/AIDS. Cùng với AIDS và sốt rét, lao đang được xếp vào một trong ba bệnh truyền nhiễm nguy hiểm nhất thế giới [2, 53]. Do tính chất có thể lây truyền qua tiếp xúc và qua không khí như các bệnh cúm nên tốc độ lan truyền rất nhanh và khả năng kiểm soát bệnh lao rất phức tạp. Các kết quả thống kê lặp lại nhiều lần đã ước tính có khoảng 1/3 dân số thế giới (khoảng 2,2 tỷ người) bị lây nhiễm tiên phát với M. tuberculosis và 10% trong số đó sẽ phát triển thành bệnh tại một thời điểm nào đó trong đời. Mỗi năm có khoảng 9 triệu bệnh nhân mới được phát hiện, hiện tại hàng năm trên thế giới có khoảng trên 49 triệu bệnh nhân lao lưu hành, con số này đang ngày càng gia tăng. Bệnh lao giết chết 8000 người mỗi ngày, gần 3 triệu người mỗi năm [73]. Đáng báo động là hiện nay bệnh lao đã trở 3
thành nguyên nhân hàng đầu giết hại nhiều thanh thiếu niên và người lớn, chủ yếu là nhóm tuổi đang là nguồn lao động chính của xã hội (từ 20 tới 49 tuổi) [78]. Số bệnh nhân lao ở những nước đang phát triển chiếm 95% trong tổng số bệnh nhân lao trên toàn thế giới. Khoảng 80% số bệnh nhân lao trên toàn thế giới tập trung vào 22 quốc gia có gánh nặng bệnh tật cao. Bệnh lao chiếm 25% nguyên nhân gây tử vong ở các nước này. Tính riêng tại Ấn Độ, hàng năm có khoảng trên 500.000 người chết vì căn bệnh này, tương đương tỷ lệ cứ 1 phút lại có một người ở quốc gia này chết vì lao [63, 73]. Năm 2007, WHO ước tính rằng khu vực Đông Nam Á có số người nhiễm lao chiếm tới 34% trên toàn thế giới. Còn ở cận Sahara châu Phi thì tỷ lệ này cao gấp đôi so với Đông Nam Á, tỷ lệ nhiễm lao ở đây là 343 ca trên 100.000 người dân. Thông báo gần đây nhất năm 2007 của tổ chức y tế thế giới cho biết bệnh lao được xác định bước đầu đã ổn định và giảm đi ở cả 6 vùng trên thế giới. Tuy nhiên số lượng các ca mới nhiễm trên toàn cầu vẫn tăng lên và tập trung ở châu Phi, Đông Địa Trung Hải và Đông Nam Á. Tình hình trên cho thấy là bệnh lao vẫn không giảm nguy hại đối với loài người. Hiện nay tỷ lệ điều trị lao thành công trên toàn cầu đạt 82%, tuy nhiên còn rất nhiều bệnh nhân chưa được phát hiện và không được chữa trị, những bệnh nhân này tiếp tục lây cho cộng đồng. Theo ước tính của WHO thì tỷ lệ phát hiện bệnh nhân mới chỉ đạt 37% trong tổng số người mới nhiễm lao [63]. Sự gia tăng của bệnh lao trên quy mô toàn cầu cùng với mối liên quan với HIV và sự xuất hiện của chủng kháng thuốc đang là một vấn nạn về y 4
tế cộng đồng. Điều này càng khiến cho bệnh lao trở nên khó khăn trong việc kiểm soát và điều trị. Đến năm 1993 WHO phải tuyên bố tình trạng khẩn cấp về bệnh lao trên toàn cầu để kêu gọi các quốc gia trên thế giới chung tay phòng chống lao [64]. 1.1.2. Tình hình bệnh lao ở Việt Nam Theo báo cáo vào năm 2006 trong chương trình chống lao quốc gia thì Việt Nam đứng thứ 12 trong số 22 quốc gia có số bệnh nhân lao cao nhất thế giới. Tại khu vực tây Thái Bình Dương, Việt Nam đứng hàng thứ 3 chỉ sau Trung Quốc và Philipine về tổng số bệnh nhân lao đang lưu hành và số bệnh nhân lao mới phát hiện. Bên cạnh sự gia tăng đáng lo ngại thì tình trạng lao kháng thuốc là một vấn đề cấp bách [2, 10, 53]. Năm 1995, trước những biến động xấu đi của tình hình dịch tễ bệnh lao toàn cầu, công tác chống lao thực sự bắt đầu phải đối mặt với những thách thức mới là bệnh lao kháng thuốc và Lao/HIV, Nhà nước và Bộ Y tế Việt nam đã quyết định đưa Chương trình chống lao thành một trong những Chương trình y tế Quốc gia trọng điểm. Trong giai đoạn 1997 đến 2000, chương trình chống lao Quốc Gia đã phát hiện hơn 532.703 bệnh nhân lao các thể, tỷ lệ phát hiện ước tính đạt 82% số bệnh nhân. Đã điều trị 260.698 bệnh nhân lao phổi với tỷ lệ khỏi 92% [2, 10, 53]. Theo WHO thì Việt Nam là nước có gánh nặng bệnh lao cao trên toàn cầu với khoảng 44% dân số nhiễm lao. Tỷ lệ lao mới mắc các thể là 173/100.000 dân, tỷ lệ lao phổi AFB (+) mới là 77/100.000 dân, tỷ lệ hiện mắc các thể là 225/100.000 dân, tỷ lệ tử vong do lao là 26/100.000 dân, tỷ lệ đồng nhiễm lao/HIV trong các bệnh nhân lao mới là 5% [2], trên thực tế số liệu về nhiễm lao có thể cao hơn những con số thống kê ở trên. Vấn đề 5
đồng nhiễm HIV và lao không chỉ làm tăng số bệnh nhân lao mà còn làm giảm hiệu quả điều trị bệnh, tăng tỷ lệ tử vong. Đó cũng chính là khó khăn, thách thức lớn đối với công tác phòng chống lao quốc gia. Đáng ngại là tỷ lệ lao kháng thuốc ở Việt Nam đang ngày càng gia tăng, tỷ lệ lao kháng đa thuốc trong bệnh nhân lao mới là 2,7% và tỷ lệ lao kháng đa thuốc trong số bệnh nhân điều trị lại là 19%. Như vậy, mỗi ngày có gần 400 người mắc, trong đó có 178 người mắc lao phổi ho khạc ra vi khuẩn làm lây nhiễm cho cộng đồng và 55 người chết vì bệnh lao. Hiện nay, nguy cơ nhiễm lao hàng năm ở nước ta ước tính là 1,5% [2]. Thực tế hiện nay, tỷ lệ phát hiện chỉ đạt khoảng 44% và tỷ lệ chữa khỏi là 81% [2]. Những năm gần đây việc áp dụng kĩ thuật sinh học phân tử như PCR vào chẩn đoán lao là một bước đột phá mang lại nhiều kết quả khả quan. Tuy vậy kĩ thuật này vẫn còn những điểm chưa thực sự hoàn thiện và cần có những nghiên cứu bổ sung, cải tiến nhằm đem lại hiệu quả tối ưu. 1.2. VI KHUẨN LAO 1.2.1. Đặc điểm phân loại Vi khuẩn lao thuộc giới Bacteria, ngành Actinobacteria, bộ Actinomycetales, phân bộ Corynebacterineae, họ Mycobacteriaceae, giống Mycobacterium [75]. Tên khoa học của vi khuẩn lao là: Mycobacterium tuberculosis Các chủng vi khuẩn thuộc giống Mycobacterium được chia làm hai nhóm: 6
+ Mycobacterium tuberculosis complex (MTBC) gồm: M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum, M. Microti. Trong đó M. tuberculosis và M. bovis gây bệnh lao điển hình. + Mycobacterium other than tuberculosis (MOTT) gồm: M. avium, M. ortuitum, M.govdovac, M. kansasii… Nhóm này không gây bệnh lao [33, [58, 61]. 1.2.2. Đặc điểm cấu trúc 1.2.2. 1. Cấu trúc hình thái Vi khuẩn lao được phát hiện bởi Robert Koch khoảng 100 năm trước đây. Trực khuẩn lao có hình que, kích thước 23 µm, dầy 0,3 µm. Nhuộm ZielNellsen trực khuẩn lao bắt màu đỏ thẫm, không bị cồn và axit làm mất màu fucsin, do vậy chúng được gọi là trực khuẩn kháng cồn, kháng toan (acid fast bacilliAFB). Dựa vào đặc điểm này có thể giúp phát hiện vi khuẩn lao trong các mẫu bệnh phẩm bằng cách soi AFB. Một số giả thiết cho rằng mức kháng với axit là do độ dài của các chuỗi axit mycolic. Trực khuẩn lao duy trì tính kháng axit trong dịch huyền phù trong một khoảng thời gian rất dài ngay cả khi có tác dụng của nhiệt. Trực khuẩn lao có khả năng thực hiện tất cả các cơ chế cần thiết để tổng hợp các vitamin, axit amin và các enzyme cofactor thiết yếu cho tế bào [3, 4, 5, 12]. 7
Hình 1.1. Trực khuẩn M. tuberculosis (http://www.textbookofbacteriology.net/tuberculosis.html) Hình 1.2. Trực khuẩn M. tuberculosis sau khi nhuộm Ziehl – Nielsen (http://www.textbookofbacteriology.net/tuberculosis.html) 1.2.2.2. Cấu trúc thành tế bào Thành tế bào của Mycobacterium tuberculosis có cấu trúc đặc biệt, chia thành 4 lớp: 8
1 Lipid ngoài 2 Axit mycolic 3 polysaccharides (arabinogalactan) 4 peptidoglycan 5 màng sinh chất 6 lipoarabinomannan (LAM) 7 phosphatidylinositol mannoside 8 Khung thành tế bào Hình 1.3. Cấu trúc thành tế bào của vi khuẩn lao (http://commons.wikimedia.org/wiki/Image:Mycobacterial_cell_wall_diagram) Lớp ngoài cùng có cấu trúc peptidoglycolipid, đây là lớp chỉ thấy ở vi khuẩn lao, phát triển trong tế bào có tác dụng tăng cường như một lớp áo giáp cho các vi khuẩn nằm trong tế bào chống chịu các enzyme phân giải từ các lyzozyme của tế bào. Khi phát triển trong môi trường nuôi cấy lỏng hoặc trong đại thực bào, M. tuberculosis tích lũy một capsule giả không bám. Thành phần của capsule này chứa protein, polysaccharide và lượng nhỏ lipid. Cấu trúc của capsule có thể bung ra bên trong các đại thực bào. Màng tế bào của vi khuẩn lao gây bệnh hầu như giống với màng của các Mycobacterium trong cùng một giống, bao gồm cả các Mycobacterium không gây bệnh. Lớp tiếp theo được tạo nên bởi sự liên kết giữa các axit mycolic và các chất lipit phức tạp. Đây là lớp tạo nên độc tính của vi khuẩn lao, làm tăng khả năng chống thấm nước của thành vi khuẩn, chống lại sự hủy diệt của đại thực bào và các tế bào miễn dịch [1]. Gắn với peptidoglican là một poysaccaharide phân nhánh và arabinogalactan, đầu ngoài của các phân tử này được este hóa với axit béo có khối lượng phân tử cao là axit mycolic. 9
Các axit mycolic được sắp xếp theo tính đặc hiệu loài nên có thể xác định loài Mycobacterium bằng sắc kí lớp mỏng, sắc kí lỏng hiệu năng cao và sắc kí khí lỏng [57]. Các axit mycolic đặc hiệu của M. tuberculosis là alpha keto và mythoxymycolate chứa 76 đến 82, 84 đến 89 và 83 đến 90 carbon. Lớp ngoài của thành tế bào có các phân tử lipid tự do như phthiocerol dilycoserosates (PDIM), phenolic glycolipids (PGL), trehalosecontaining glycolipids và sulfolipids (SL). Xuyên qua toàn bộ lớp màng là những glycolipid như phosphatidyl myoinositol mannosides, lipomannan (LM) và lipoarabinomannan (LAM) được đính vào màng sinh chất và mở rộng ra bên ngoài thành tế bào, trong đó LAM có tính đặc hiệu loài. Thành tế bào Mycobacterium chứa các protein nằm rải rác, một vài protein này tham gia vào cấu trúc thành tế bào, các protein porin hình thành các kênh ưa nước cho phép vận chuyển tích cực các chất tan trong nước thông qua lớp axit mycolic [58, 67]. Lớp thứ ba gồm các peptidoglican liên kết với đường arabinose và các phân tử axit mycolic tạo nên bộ khung định hình cho vi khuẩn, đảm bảo cho vi khuẩn có độ cứng nhất định. Thành tế bào của Mycobacterium có cấu trúc phức tạp với các thành phần hóa học và nhiều liên kết chéo bất thường, mức độ liên kết giữa peptidoglycan ở thành tế bào của M. tuberculosis là 70 đến 80% trong khi ở E. coli là 2030% [58]. Lớp trong cùng là cấu trúc màng sinh chất có thành phần chủ yếu là các photpholipit. Các photpholipit gồm 2 nhóm, nhóm ưa nước hướng vào bên trong, nhóm kị nước hướng ra phía ngoài vỏ [1]. Màng sinh chất giữ vai trò điều hòa áp suất thẩm thấu giữa tế bào chất và môi trường. Ngoài ra các protein của màng giữ các chức năng khác nhau như protein nhạy với nồng độ của các phân tử trong môi trường , protein truyền tín hiệu đến bộ máy 10
trao đổi chất và bộ máy di truyền trong nguyên sinh chất, các enzyme liên quan đến quá trình trao đổi chất và sinh năng lượng. Các enzyme xuyên màng và tổng hợp màng, tạo vách ngăn trong quá trình phân chia tế bào [3, 4, 12]. M. tuberculosis không được phân loại Gram dương hay Gram âm vì chúng không có đặc tính hoá học này, mặc dù thành tế bào có chứa peptidoglycan nhưng do đặc điểm thành tế bào gắn với các phân tử lipit chứ không phải là protein hay polycharcaride nên M. tuberculosis không được xếp vào nhóm vi khuẩn Gram (+). Trên mẫu nhuộm Gram chúng không giữ lại tinh thể màu tím xuất hiện trong nhuộm Gram. Thành tế bào của M. tuberculosis không thẩm thấu aniline và các chất khác sử dụng trong nhuộm trừ khi chúng được kết hợp với phenol. Màng của tế bào vi khuẩn lao là một cấu trúc linh động có thể thay đổi khi phát triển hoặc tồn tại trong các môi trường khác nhau. Trong điều kiện thiếu oxi thành tế bào dầy lên. Trong môi trường nuôi cấy axit nhẹ và trong khoang đại thực bào thì sự biểu hiện của các gen mã hóa cho các porin dường như được điều hòa ngược. Trong điều kiện tự nhiên vi khuẩn lao tồn tại 34 tháng, trong điều kiện phòng thí nghiệm có thể bảo quản trong nhiều năm. Dưới ánh sáng trực tiếp của mặt trời vi khuẩn lao bị tiêu diệt sau 5 phút, dưới ánh sáng của tia cực tím vi khuẩn lao tồn tại từ 23 phút. Ở nhiệt độ 42oC vi khuẩn lao ngừng phát triển, ở 80oC vi khuẩn lao chết sau 10 phút [1, 8]. 11
1.2.3. Đặc điểm nuôi cấy 1.2.3.1. Môi trường và dạng khuẩn lạc Trực khuẩn lao là vi khuẩn ưa khí bắt buộc, không mọc được ở điều kiện kị khí. Nhiệt độ thích hợp để mọc là 37oC , ở nhiệt độ dưới 37oC và trên 42oC vi khuẩn lao hầu như không mọc. Vi khuẩn lao không sinh trưởng trong môi trường thông thường mà phải nuôi trong môi trường đặc biệt giàu chất dinh dưỡng gồm trứng, khoai tây, citrat, glixerol, asparagin, xanh malachite. Môi trường thường dùng là môi trường Loewenstein đặc đã được cải tiến bởi Jensen hoặc môi trường lỏng Sauton. Trong môi trường đặc, trực khuẩn lao mọc rất chậm, phải mất 4 đến 6 tuần mới mọc khuẩn lạc điển hình dạng R. Hình 1.4. Khuẩn lạc M. tuberculosis trên môi trường Lowenstein Jensen (http://www.textbookofbacteriology.net/tuberculosis.html) Sau một thời gian nuôi cấy trực khuẩn M. tuberculosis gây bệnh sẽ phát triển thành các khuẩn lạc có bề mặt dính và xù xì. Các Mycobacterium không 12
gây bệnh và các trực khuẩn lao bị làm yếu đi trong nuôi cấy kéo dài thường mọc khuẩn lạc nhẵn, tạo thành đám trong môi trường nuôi cấy [3, 4, 12, 58]. 1.2.3.2. Chu kì tế bào Trong điều kiện phòng thí nghiệm cứ 12 đến 24 giờ M. tuberculosis phân chia một lần. Chu kì tế bào của M. tuberculosis khá dài, điều này có thể do tính thẩm thấu của thành tế bào gây hạn chế trong việc hấp thụ các chất dinh dưỡng và liên quan đến tốc độ tổng hợp ribosome. Theo Harshey và Ramakrishnan sự tổng hợp RNA là tác nhân liên quan đến thời gian sống kéo dài của trực khuẩn. Tỷ lệ RNA/DNA, tốc độ kéo dài chuỗi RNA ở M. tuberculosis chậm hơn 10 lần so với E.coli. Một đặc điểm nữa là chỉ có một operon duy nhất cần thiết trong tổng hợp RNA. Mặt khác khi trực khuẩn chuyển từ trạng thái ổn định sang pha phân chia thì RNA tổng số chỉ tăng lên hai lần, khiến cho việc tổng hợp protein bị chậm lại [58]. 1.2.4. Khả năng gây bệnh Độc lực của trực khuẩn lao có liên quan trực tiếp đến yếu tố “Cord” (trehalose6,6’dimycolate) là chất gây ức chế hoạt động của tế bào bạch cầu, gây nên những u hạt mãn tính. M. tuberculosis sinh ra ngoại độc tố nhưng không có ý nghĩa gây bệnh. Vi khuẩn lao có thể vào cơ thể qua nhiều đường. Thường là qua đường hô hấp, có thể qua đường tiêu hóa, da, kết mạc mắt…Sau khi gây tổn thương tiên phát, vi khuẩn lao có thể theo đường bạch huyết hoặc đường máu tới cơ quan khác gây tổn thương thứ phát. Nhiều cơ quan như phổi, thận, màng não, xương, da, hạch... đều có thể bị bệnh lao, nhưng thường bị hơn cả là phổi, vị trí thường gặp ở phổi là đỉnh phổi. 13
Miễn dịch trong lao là đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào. Đáp ứng miễn dịch làm chậm sự nhân lên của trực khuẩn lao, gây hạn chế sự lan tràn của vi khuẩn và cuối cùng làm phá hủy trực khuẩn. Đáp ứng miễn dịch trong bệnh lao phát sinh một phản ứng quá mẫn muộn. Một số trường hợp vi khuẩn lao có khả năng ức chế hoặc tiêu diệt trở lại bạch cầu người và tồn tại dưới dạng ngủ ở trong các u hạt nên cơ thể không thanh toán được. Đặc biệt là trong các trường hợp lao kháng thuốc cơ thể không thanh toán được vi khuẩn và các thuốc cũng không tác động được, đây là một vấn đề nan giải trong điều trị lao [1]. 1.2.5. Đặc điểm hệ gen vi khuẩn lao 1.2.5.1. Đặc điểm hệ gen Mycobacterium tuberculosis Hệ gen của chủng H37Rv được công bố năm 1998 có chiều dài 4.411.529 cặp base. Trong đó có 3.918 gen và các gen này đều được dự đoán là có mã hóa protein, tỷ lệ G+C chiếm 65,61% không thay đổi ở các vị trí khác nhau trong toàn bộ hệ gen. Genome của Mycobacterium tuberculosis có tới 90,8% trình tự mã hóa protein và chỉ có 6 gen giả [25, 31, 58]. Ở Mycobacterium có một nhóm gồm 172 gen có tỷ lệ GC >80% mã hóa cho họ protein PE (ProGlu) hoặc PPE (ProProGlu). Trong đó 104 gen mã hóa PE và 68 mã hóa PPE, chiếm hơn 4% các gen của M. tuberculosis. Trình tự PE và PPE có ở vùng đầu N và bảo thủ trong từng họ protein, chiều dài xấp xỉ 110 và 180 amino axit. Các protein PE và PPE đóng vai trò 14
quan trọng trong quá trình nhân lên và sống sót của Mycobacterium trong các môi trường khác nhau. Họ PE được chia thành 3 phân họ, trong đó họ quan trọng nhất gồm 61 thành viên chứa các trình tự đa hình giàu GC (PGRS). Các protein được mã hóa bởi 104 gen mã hóa cho họ protein PE được chia nhỏ hơn thành 3 lớp, lớp thứ nhất chứa 29 protein chỉ với vùng PE, lớp thứ hai gồm 8 protein trong đó vùng PE đi kèm với các trình tự đầu C độc lập 9, lớp thứ 3 gồm 67 protein tạo thành dưới họ PEPGRS. PGRS (polymorphic GCrich repetitive sequences) là nhóm các protein có vùng PE bảo thủ và đầu C mở rộng với sự lặp lại nhiều lần GlyGlyAla hoặc GlyGlyAsn. Chức năng của các họ này vẫn chưa biết rõ nhưng có một số giả thuyết cho rằng một số protein này có liên quan đến tính đa dạng kháng nguyên của M. tuberculosis trong quá trình lây nhiễm. Các protein PEPGRS đặc trưng cho M. tuberculosis có chức năng ức chế trình diện kháng nguyên thông qua phức hệ hoà hợp tổ chức (MHC) lớp đầu tiên. Một số gen PE mã hoá cho các protein chỉ chứa vùng 110 axit amin được đi kèm gần với một gen mã hoá một protein PPE. Trong một số trường hợp, cặp PEPPE (Rv2431cRv2430c) biểu hiện cùng nhau và có thể tạo thành một phức hệ [31, 58, 61, 65]. Một số ít gene với tỷ lệ G+C
Trong số 50 gen mã hoá cho các RNA chức năng thì chỉ có một operon RNA ribosome, operon này nằm ở vị trí cách 1,5 Mbp so với vị trí khởi đầu sao mã (losus oriC). Phần lớn vi khuẩn có nhiều hơn một operon rrn định vị gần locus oriC để tăng quá trình sao mã. Vi khuẩn lao chỉ có một operon rrn đơn ở một vị trí tương đối xa so với oriC do đó gây ra kiểu hình phát triển chậm. Có hai thể tiền thực khuẩn được phát hiện trong genome, cả hai giống nhau về độ dài và cách tổ chức. Một là prophage PhiRv1 có trong hệ gen của M. tuberculosis H37Rv phá vỡ trình tự lặp lại của họ 13E12. Hệ gen của M. tuberculosis chứa 7 vị trí cho PhiRv1 chèn vào do đó các chủng có những vị trí biến đổi cao trong hệ gen. Prophage thứ hai PhiRv2 ổn định hơn, ít biến đổi hơn giữa các chủng. Các gen mã hoá protein ở M. tuberculosis H37Rv mã hoá cho 3.924 ORF (Open Reading Frame), sự khởi đầu khác ở codon GTG được sử dụng trong 35% trường hợp so với 14% hoặc 9% trong Bacillus subtilis hoặc Escherichia coli. Từ trình tự hệ gen cho thấy M. tuberculosis có khả năng chuyển từ một con đường trao đổi chất này thành con đường trao đổi chất khác bao gồm cả hiếu khí (quá trình phosphoryl hoá oxy hoá) và hô hấp kỵ khí (quá trình khử nitrate). Tính linh hoạt này rất có lợi cho sự thích nghi bên trong các môi trường khác nhau như trong cơ thể người cả khi trạng thái áp lực oxy cao trong phế nang và các điều kiện kỵ khí, vi kỵ khí trong các nang lao. Một đặc tính khác của hệ gen M. tuberculosis là có các gen tổng hợp và phân huỷ hầu như tất cả các loại lipid như các axit béo và các phân tử phức như axit mycolic. M. tuberculosis có các gen mã hoá cho 250 enzyme khác nhau liên quan đến trao đổi axit béo, so với 50 loại trong hệ gen của E. coli [37, 78]. Trong số các protein điều khiển, M. tuberculosis có 13 yếu tố sigma (protein liên quan đến tính đặc hiệu sao mã trên RNA polymerase) tương 16
ứng 0,3% tổng số gen và 22 protein điều khiển khác bao gồm 13 nhân tố điều khiển đáp ứng hai thành phần, tương ứng 0,6% tổng số. Số lượng tương ứng trong M. tuberculosis là 125 gen được nghiên cứu cho các chức năng vận chuyển, tương ứng 3% tổng số [65]. Phân tích hệ thống trao đổi chất DNA của M. tuberculosis thấy có một hệ thống sửa chữa DNA rất hiệu quả, bộ máy sao chép có độ chính xác rất cao. Hệ gen của M. tuberculosis không có hệ thống sửa chữa bắt cặp sai dựa trên mutS nhưng được khắc phục bởi sự có mặt của gần 45 gene liên quan đến các cơ chế sửa chữa DNA, bao gồm 3 bản copy của gen mutT. Gen này mã hoá cho enzyme chịu trách nhiệm loại bỏ các Guanine đã bị oxy hoá gây ra sự bắt cặp sai giữa các cặp base trong quá trình sao chép [25, 31, 58]. 1.2.5.2. Gen 23S rDNA Trong DNA vi khuẩn thì locus di truyền rRNA bao gồm các vùng 16S rDNA, 23S rDNA và 5S rRNA, giữa các vùng này là vùng đệm (Internally Transcribed Spacer ITS). DNA trong vùng 16S23S có sự thay đổi lớn về độ dài và trình tự, sự thay đổi này rất có ích cho việc phân biệt loài ở prokaryotes [24, 39]. ITS giữa 16S rDNAvà 23S rDNA có tính đa hình nucleotide cao hơn so với 16S rDNA nhưng không thể phân biệt giữa những loài vi khuẩn có quan hệ gần nhau như những loài thuộc M. tuberculosis complex. IST này có trình tự và tính đa hình thấp hơn so với gen 23S rDNA [73], gen 23S rDNA là đoạn gen mã hóa cho tiểu phần 23S của ribosome. Ngoài ra theo tác giả Mekonnen Kurabachew và cộng sự (2004) gen đích 23S rDNA có mặt ở tất cả các chủng lao gây bệnh do đó sử dụng cặp mồi đặc hiệu 17
khuyếch đại vùng gen đích 23S rDNA là một thuận lợi cho việc phát hiện M. tuberculosis complex trong những trường hợp không có trình tự IS6110 ở một số chủng M. tuberculosis complex. Trình tự 23S rDNA ở M. tuberculosis khác với các loài đã phát hiện ở 7 vị trí, đây là các vị trí thích hợp cho việc thiết kế các primer và probe. Sự khác nhau đáng kể giữa các loài không phải Mycobacterium và Mycobacterium có ý nghĩa trong lâm sàng cho thấy giá trị tiềm năng của vùng này trong chẩn đoán [24, 45]. Trình tự 23S rDNA cũng có thể được sử dụng để phân biệt M. tuberculosis và M. bovis và cũng được sử dụng để phân biệt các chủng lao gây bệnh trong các Mycobacterium [36, 44]. 1.2.5.3. Các trình tự chèn Các trình tự chèn (IS – Insertion sequences) không có chức năng mã hoá mà chỉ liên quan đến đặc tính biến đổi và di chuyển. Chúng gồm các yếu tố cis, các trình tự DNA hoạt động ở hai đầu và enzyme Tpase, enzyme này được mã hoá bởi một hoặc hai khung đọc mở và sử dụng hầu như toàn bộ độ dài của trình tự chèn. Đa số các trình tự chèn có các trình tự lặp lại ngược chiều ở hai đầu (IRInverted Repeat), các trình tự này có chiều dài khoảng 10 đến 40 bp. IR được phân thành hai vùng chức năng, một định vị trong IR và liên quan đến chức năng gắn Tpase, vùng chức năng kia gồm 2 hoặc 3bp ở cuối liên quan đến sự phân cắt và các phản ứng chuyển chuỗi dẫn đến chuyển vị trí của các trình tự chèn. Các promoter của IS thường định vị một phần bên trong trình tự IR về phía đầu gen Tpase, sự sắp xếp này có thể cung cấp một cơ chế tự điều hoà sự tổng hợp Tpase bằng cách gắn Tpase. Các vị trí gắn các 18
protein đặc hiệu cũng được tìm thấy bên trong hoặc ở gần đầu IR và đóng vai trò kích hoạt tính di chuyển hoặc biểu hiện Tpase. Tpase có hoạt tính gắn vào các trình tự DNA đặc hiệu của các protein được quy định ở vùng đầu N trong khi vùng xúc tác thường được quy định ở vùng C. Cấu trúc này tạo nên sự tương tác của phân tử protein mới sinh với các trình tự đích trên IS. Hình 1.5. Cấu trúc của IS [69] IRL left inverted repeat: Trình tự lặp lại ngược chiều bên trái IRR right inverted repeat: Trình tự lặp lại ngược chiều bên phải Khung đọc mở mã hoá transposase bao gồm toàn bộ độ dài của IS và trình tự IRR. XYZ chứa các trình tự lặp lại trực tiếp ngắn được sinh ra do quá trình chèn của IS vào vị trí đích p: Promotor định vị trong IRL có hai vùng. Vùng I chứa các cặp base ở tận đầu của IS cần thiết cho sự nhận biết các trình tự chèn thông qua Tpase. Vùng II chứa các cặp base cần thiết cho quá trình nhận ra các trình tự đặc hiệu và gắn của Tpase Một đặc điểm nữa của IS là có khả năng chèn, đa số tạo nên các trình tự DNA ngắn lặp lại trực tiếp (DRDirect Repeat), độ dài của DR vào khoảng từ 2 đến 14bp, chèn vào chuỗi DNA tại các vị trí nhất định. Chức năng của IS: 19
Kiểm soát sự biểu hiện của các gen bên cạnh: Một số trình tự chèn có tác dụng hoạt hoá sự biểu hiện của các gen gần kề, trong trường hợp di chuyển tạo nên vị trí thích hợp thì các promoter mới có khả năng điều khiển sự biểu hiện của các gen bên cạnh. Khi hai yếu tố đứng cạnh nhau theo kiểu đầuđuôi thì có thể tạo thành các promoter mạnh dẫn đến sự biểu hiện Tpase ở mức cao làm tăng hoạt tính di chuyển của IS. Điều khiển hoạt tính di chuyển: Thông qua biểu hiện và hoạt động của Tpase như cô lập các tín hiệu khởi đầu dịch mã, thay đổi khung dịch mã, kết thúc dịch mã, tác động đến sao mã và độ bền của Tpase [58]. Các trình tự chèn không có chức năng mã hóa mà chỉ liên quan đến đặc tính biến đổi và di chuyển. IS6110 IS 6110 là một trình tự chèn có nhiều bản copy (4 đến 25 bản copy), số lượng bản copy IS6110 có trong hệ gen thay đổi và phụ thuộc vào loài và chủng. IS 6110 tồn tại rải rác nhiều nơi trong genome của M. tuberculosis. IS6110 có chiều dài 1355 bp, đã được xác định là có mặt trong các chủng M. tuberculosis, và chỉ khác nhau ở một vài nucleotid giữa các bản copy với nhau, IS6110 có trình tự rất bảo thủ do đó nó được chọn làm gen đích trong phản ứng multiplex PCR nhằm phát hiện M. tuberculosis [15]. 20