intTypePromotion=1
zunia.vn Tuyển sinh 2024 dành cho Gen-Z zunia.vn zunia.vn
ADSENSE
 » 
 » 

Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu và thử nghiệm hạt nano kim loại được chức năng hóa bề mặt trong chẩn đoán vi khuẩn lao

Chia sẻ: Na Na | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:66

Thêm vào BST
Báo xấu
76
lượt xem 7
download
 
  Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu của luận văn nhằm xây dựng quy trình gắn kết hạt nano kim loại có từ tính đã được chức năng hóa bề mặt với kháng thể kháng vi khuẩn lao và đánh giá khả năng làm giàu MTB bằng hạt nano kim loại có từ tính đã được chức năng hóa bề mặt gắn anti-TB để phát hiện MTB bằng kỹ thuật PCR.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu và thử nghiệm hạt nano kim loại được chức năng hóa bề mặt trong chẩn đoán vi khuẩn lao

  1. Luận văn Thạc sĩ Khoa học Chử Lương Luân ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN      Chử Lƣơng Luân NGHIÊN CỨU VÀ THỬ NGHIỆM HẠT NANO KIM LOẠI ĐƢỢC CHỨC NĂNG HÓA BỀ MẶT TRONG CHẨN ĐOÁN VI KHUẨN LAO LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2012 Khoa Sinh học Khóa 2010 - 2012
  2. Luận văn Thạc sĩ Khoa học Chử Lương Luân ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN      Chử Lƣơng Luân NGHIÊN CỨU VÀ THỬ NGHIỆM HẠT NANO KIM LOẠI ĐƢỢC CHỨC NĂNG HÓA BỀ MẶT TRONG CHẨN ĐOÁN VI KHUẨN LAO Chuyên ngành : Sinh học Thực nghiệm Mã số : 60.42.30 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC : PGS. TS. Phan Tuấn Nghĩa Hà Nội - 2012 Khoa Sinh học Khóa 2010 - 2012
  3. Luận văn Thạc sĩ Khoa học Chử Lương Luân LỜI CẢM ƠN Trong suốt quá trình thực hiện luận văn tốt nghiệp, tôi luôn nhận được rất nhiều sự quan tâm, giúp đỡ và chỉ dẫn tận tình. Trước tiên, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Phan Tuấn Nghĩa, TS. Phạm Bảo Yên và TS. Nguyễn Thị Vân Anh đã tận tình hướng dẫn, tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trong Bộ môn Sinh lý thực vật và Hóa sinh, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã mang đến những kiến thức quý báu và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu tại trường. Tôi cũng xin gửi lời cảm các cán bộ viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương, Khoa Vi sinh – Viện Quân Y 103 đã cung cấp mẫu cho tôi trong quá trình nghiên cứu. Qua đây, tôi cũng xin chân thành cảm ơn các cán bộ và tập thể nhóm nghiên cứu tại Phòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Enzym và Protein đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện luận văn thạc sĩ. Luận văn được thực hiện dưới sự tài trợ kinh phí của đề tài mã số 2/2010/HĐ-NCCBUD do GS.TSKH. Nguyễn Hoàng Lương làm chủ trì. Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới gia đình, người thân và bạn bè luôn động viên, giúp đỡ để tôi có thể hoàn thành luận văn tốt nghiệp này. Một lần nữa tôi xin trân trọng cảm ơn ! Hà Nội, ngày 21 tháng 12 năm 2012 Học viên Chử Lương Luân Khoa Sinh học Khóa 2010 - 2012
  4. Luận văn Thạc sĩ Khoa học Chử Lương Luân MỤC LỤC MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................. 3 1.1. TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN LAO ...........................................................…3 1.1.1. Đặc điểm của vi khuẩn lao ................................................................................3 1.1.2. Hệ gene vi khuẩn lao.........................................................................................4 1.1.3. Khả năng gây bệnh và tình hình bệnh lao .........................................................6 1.1.4. Các phƣơng pháp chẩn đoán vi khuẩn lao ........................................................8 1.2. NHỮNG KHÁI NIỆM CƠ BẢN VỀ HẠT NANO KIM LOẠI .................. 11 1.2.1. Tính chất của hạt nano kim loại ......................................................................11 1.2.2. Một số loại hạt nano kim loại .........................................................................13 1.2.3. Ứng dụng của hạt nano kim loại trong y học ..................................................17 1.3. CHỨC NĂNG HÓA BỀ MẶT HẠT NANO TỪ, GẮN KẾT VÀ LÀM GIÀU TẾ BÀO VI KHUẨN LAO…………………...……..…………………...17 1.3.1. Chức năng hóa bề mặt hạt nano từ ..................................................................17 1.3.2. Quá trình gắn kết hạt nano từ với kháng thể kháng lao ..................................19 1.3.3. Làm giàu tế bào vi khuẩn lao bằng từ trƣờng .................................................21 CHƢƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP .......................................... 22 2.1. NGUYÊN LIỆU................................................................................................ 22 2.1.1. Mẫu đờm lao và vaccine BCG ........................................................................22 2.1.2. Hạt nano kim loại có từ tính ............................................................................23 2.1.3. Mồi đặc hiệu ....................................................................................................23 2.1.4. Các loại đệm ...................................................................................................23 2.1.5. Các hóa chất và nguyên liệu khác ...................................................................24 2.1.6. Máy móc và thiết bị.........................................................................................24 Khoa Sinh học Khóa 2010 - 2012
  5. Luận văn Thạc sĩ Khoa học Chử Lương Luân 2.2. PHƢƠNG PHÁP .............................................................................................. 24 2.2.1. Phƣơng pháp chấm kết tủa miễn dịch .............................................................24 2.2.2. Phƣơng pháp gắn kết hạt nano từ đã đƣợc chức năng hóa bề mặt với kháng thể kháng vi khuẩn lao ..............................................................................................26 2.2.3. Phƣơng pháp làm giàu vi khuẩn lao để làm khuôn cho phản ứng PCR…..…27 2.2.4. Phƣơng pháp ly giải tế bào vi khuẩn lao thu ADN…………….……………27 2.2.5. Đánh giá độ bền của phức hệ hạt từ gắn kháng thể kháng lao………………28 2.2.6. Nhân bản đoạn gen đích đặc hiệu bằng PCR ..................................................29 2.2.7. Điện di trên gel agarose...................................................................................31 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................... 32 3.1. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CÁC ĐIỀU KIỆN GẮN KHÁNG THỂ LÊN BỀ MẶT HẠT NANO TỪ TRÊN BCG ................................................................32 3.1.1. Kiểm tra sự có mặt của kháng thể kháng lao ..................................................32 3.1.2. Kiểm tra hiệu suất phản ứng gắn kết trong các đệm khác nhau……….……34 3.1.3. Kết quả ly giải tế bào vi khuẩn lao bằng các phƣơng pháp khác nhau ...........38 3.1.4. Tối ƣu hóa nồng độ BCG sử dụng ..................................................................41 3.1.5. Tối ƣu hóa thời gian phản ứng gắn kết ...........................................................42 3.1.6. Độ đặc hiệu của phƣơng pháp .........................................................................43 3.2. THỬ NGHIỆM CÁC ĐIỀU KIỆN TỐI ƢU LÊN MẪU BỆNH PHẨM ....45 3.3. ĐÁNH GIÁ ĐỘ BỀN CỦA PHỨC HỆ HẠT NANO TỪ GẮN KHÁNG THỂ KHÁNG LAO.................................................................................................49 KẾT LUẬN VÀ HƢỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO .................................... 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................... 54 Khoa Sinh học Khóa 2010 - 2012
  6. Luận văn Thạc sĩ Khoa học Chử Lương Luân DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ADN Acid deoxyribonucleic AFB Acid Fast Bacilli Đệm gồm 100 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2, pH AP 9,5 APTS 3 – aminopropyl triethoxysilane BCG Bacillus Calmette Guerin bp Cặp bazơ (base pair) BSA Albumin huyết thanh bò (Bovine Serum Albumin) dNTP Deoxyribonucleoside triphosphate ĐC Đối chứng EDC 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid IS Trình tự đoạn chèn vào (Insert Sequence) kb Kilobase MES 2 - (N-morpholino) ethanesulfonic acid MTB Mycobacterium tuberculosis NP-NH2 Hạt nano từ có gắn nhóm amine NHS N-hydroxysuccinimide PCR Phản ứng chuỗi polymerase (Polymerase Chain Reaction) PBS Muối chứa đệm phosphate (Phosphate Buffered Saline) Đệm PBS pH 7,4 bổ sung 0,01% Tween20; 0,1% BSA và 0,05 PBS-TBN M NaN3 TB Lao (Tuberculosis) TAE Tris base – Acid acetic - EDTA TE Tris-HCl – EDTA TET Tris-HCl – EDTA – Triton X-100 WHO Tổ chức Y tế Thế giới (World Health Organization) Khoa Sinh học Khóa 2010 - 2012
  7. Luận văn Thạc sĩ Khoa học Chử Lương Luân DANH MỤC CÁC BẢNG Tên bảng Số trang Bảng 2.1. Trình tự các mồi dùng trong phản ứng PCR 23 Bảng 2.2. Các thành phần trong phản ứng PCR với vaccine BCG 30 Bảng 2.3. Các thành phần trong phản ứng PCR với mẫu đờm lao 30 Bảng 2.4. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR 31 Bảng 3.1. Kết quả phân tích độ sáng của vết đốm tròn trên màng lai 33 Bảng 3.2. Thành phần và tỷ lệ các chất tham gia gắn kết 35 Bảng 3.3. Đánh giá mức độ gắn kết qua phần mềm Image J 38 Khoa Sinh học Khóa 2010 - 2012
  8. Luận văn Thạc sĩ Khoa học Chử Lương Luân DANH MỤC CÁC HÌNH Số Tên hình trang Hình 1.1. Vi khuẩn lao trong tiêu bản nhuộm Ziehl – Neelsen [35] 3 Hình 1.2. Hệ gene của chủng MTB H37Rv [16] 5 Hình 1.3. Một cấu trúc tinh thể từ các phân tử nano vàng [36] 14 Hình 1.4. Hình ảnh hiển vi điện tử của hạt nano từ Fe3O4 [37] 16 Hình 1.5. Hạt nano từ tính Fe3O4 đƣợc chức năng hóa bề mặt bằng nhóm 19 amine sử dụng APTS [34] Hình 1.6. Quy trình gắn kết hạt nano đƣợc chức năng hóa với kháng thể 20 [20] Hình 1.7. Nguyên tắc chọn lọc và làm giàu tế bào bằng từ trƣờng [6] 21 Hình 2.1. Vaccine BCG sản xuất tại Việt Nam 22 Hình 2.2. Mô hình hóa phức hệ hạt nano từ đã đƣợc chức năng hóa bề mặt 26 với kháng thể kháng vi khuẩn lao Hình 3.1. Kết quả kiểm tra sự có mặt của kháng thể kháng lao 33 Hình 3.2. Quy trình đánh giá mức độ phức hệ kháng thể gắn hạt 36 Hình 3.3. Kết quả đánh giá mức độ phức hệ kháng thể gắn hạt 37 Hình 3.4. Kết quả ly giải tế bào vi khuẩn lao bằng các phƣơng pháp khác 39 nhau Hình 3.5. Kết quả thử nghiệm nồng độ BCG sử dụng 41 Hình 3.6. Tối ƣu hóa thời gian phản ứng gắn kết giữa hạt nano – EDC - 42 kháng thể kháng lao Hình 3.7. Kết quả thí nghiệm kiểm tra tính đặc hiệu 44 Hình 3.8. Quy trình ứng dụng các điều kiện tối ƣu trên mẫu đờm lao 45 Hình 3.9. Kết quả thử nghiệm các điều kiện tối ƣu trên 7 mẫu bệnh lao 46 Hình 3.10. Kết quả thử nghiệm các điều kiện tối ƣu trên 5 mẫu bệnh lao 47 Hình 3.11. Tối ƣu hóa thời gian ủ mẫu đờm lao 48 Hình 3.12. Quy trình đánh giá độ bền vững của phức hạt nano từ gắn 49 kháng thể Hình 3.13. Kết quả đánh giá độ bền vững của phức hạt nano từ gắn kháng 50 thể với mẫu vaccine BCG Hình 3.14. Thử nghiệm độ bền vững của phức hạt nano từ gắn kháng thể 51 với mẫu đờm lao Khoa Sinh học Khóa 2010 - 2012
  9. Luận văn Thạc sĩ Khoa học Chử Lương Luân MỞ ĐẦU Bệnh lao là một trong ba bệnh truyền nhiễm gây tử vong cao nhất thế giới, bệnh đƣợc gây ra bởi vi khuẩn lao có tên khoa học là Mycobacterium tuberculosis (MTB). Tổ chức Y tế thế giới (WHO) ƣớc tính khoảng 1/3 dân số toàn cầu hiện nay đã bị nhiễm MTB và có khoảng 1,7 triệu ngƣời tử vong do lao hàng năm, tức là khoảng 4700 ngƣời tử vong mỗi ngày vì lao. Mặc dù công tác tiêm chủng vaccine BCG, phòng chống và phát triển thuốc chống lại vi khuẩn lao đã có những bƣớc tiến đáng kể nhƣng cho đến nay bệnh lao vẫn là một vấn đề sức khỏe có tính thách thức đối với toàn cầu. Bệnh nhân bị nhiễm các chủng vi khuẩn lao nếu phát hiện muộn sẽ rất khó điều trị và tăng nguy cơ lây truyền sang ngƣời lành. Do đó việc chẩn đoán sớm các chủng vi khuẩn lao sẽ góp phần đáng kể trong điều trị bệnh lao [1, 33]. Để chẩn đoán vi khuẩn lao, hiện nay bệnh viện và các cơ sở y tế trong nƣớc vẫn phải dựa vào các phƣơng pháp cổ điển nhƣ soi trực tiếp, nuôi cấy vi khuẩn…, yêu cầu số lƣợng vi khuẩn lao lớn hoặc thời gian chẩn đoán lao cần ít nhất 4 – 6 tuần. Với những nhƣợc điểm nhƣ vậy sẽ khó khăn cho công tác điều trị, khó đáp ứng yêu cầu giám sát và thanh toán bệnh lao [2, 3]. Khắc phục những nhƣợc điểm đó, việc ứng dụng sinh học phân tử kết hợp công nghệ nano đang tạo ra những đột phá trong chẩn đoán vi khuẩn lao cũng nhƣ các chủng vi khuẩn khác. Thời gian chẩn đoán có thể rút ngắn xuống còn vài ngày, với độ nhạy và độ đặc hiệu cao, tạo điều kiện cho việc kiểm soát bệnh lao dễ dàng hơn [23, 25]. Công nghệ nano ngày nay đang có những bƣớc tiến quan trọng trong chẩn đoán và hỗ trợ điều trị bệnh nhằm mục đích cải thiện và nâng cao sức khỏe của con ngƣời. Trong số đó, các hạt nano kim loại đặc biệt là hạt nano kim loại có từ tính đƣợc chức năng hóa bề mặt đã và đang đƣợc nghiên cứu, ứng dụng rộng rãi trong Khoa Sinh học Khóa 2010 - 2012
  10. Luận văn Thạc sĩ Khoa học Chử Lương Luân những năm gần đây, ví dụ nhƣ phân tách tế bào, tách chiết acid nucleic (ADN, ARN), gắn kết với kháng thể…[5, 27]. Xuất phát từ thực tế trên chúng tôi tiến hành “Nghiên cứu và thử nghiệm hạt nano kim loại đƣợc chức năng hóa bề mặt trong chẩn đoán vi khuẩn lao” với các mục tiêu sau : Xây dựng quy trình gắn kết hạt nano kim loại có từ tính đã đƣợc chức năng hóa bề mặt với kháng thể kháng vi khuẩn lao và đánh giá khả năng làm giàu MTB bằng hạt nano kim loại có từ tính đã đƣợc chức năng hóa bề mặt gắn anti-TB để phát hiện MTB bằng kỹ thuật PCR. Khoa Sinh học Khóa 2010 - 2012
  11. Luận văn Thạc sĩ Khoa học Chử Lương Luân CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN LAO Vi khuẩn lao do Robert Koch tìm ra năm 1882, vì vậy còn đƣợc gọi là Bacilie de Koch (viết tắt là BK). Đã hơn một thế kỷ kể từ khi phát hiện ra vi khuẩn lao, nhờ việc áp dụng các kỹ thuật hiện đại trong hóa sinh, miễn dịch, sinh học phân tử…cùng với kính hiển vi điện tử, ngƣời ta đã hiểu tƣơng đối rõ về cấu trúc, đặc điểm sinh học và khả năng gây bệnh của vi khuẩn lao. Tuy nhiên, vi khuẩn lao vẫn là đối tƣợng nghiên cứu của nhiều công trình khoa học vì sự tinh vi trong siêu cấu trúc, tính chất phức tạp của các kháng nguyên, sự đa dạng trong hình thức tồn tại, nhất là những đột biến gen khi vi khuẩn kháng thuốc [2, 3]. 1.1.1. Đặc điểm của vi khuẩn lao Tác nhân gây bệnh lao là Mycobacterium tuberculosis (MTB), tế bào MTB dài 3-5µm, rộng 0,3-0,5µm, không có lông, hai đầu tròn, thân có hạt, tế bào đứng riêng rẽ hoặc xếp thành hình chữ N, Y, V hoặc thành dãy phân nhánh nhƣ cành cây trên tiêu bản nhuộm Ziehl – Neelsen, không bị cồn và acid làm mất màu đỏ của fucsin. MTB Hình 1.1. Vi khuẩn lao trong tiêu bản nhuộm Ziehl – Neelsen [35] MTB là vi khuẩn hiếu khí, phân chia mỗi lần từ 16 đến 20 giờ, rất chậm so với thời gian phân chia tính bằng phút của các vi khuẩn khác (trong số các vi khuẩn phân chia nhanh nhất là một chủng E. coli, có thể phân chia mỗi 20 phút). MTB Khoa Sinh học Khóa 2010 - 2012
  12. Luận văn Thạc sĩ Khoa học Chử Lương Luân không đƣợc phân loại Gram dƣơng hay Gram âm vì chúng không có đặc tính hoá học này, mặc dù thành tế bào có chứa peptidoglycan. Trên mẫu nhuộm Gram, tế bào vi khuẩn cho kết quả nhuộm rất yếu hoặc là không biểu hiện gì cả. MTB có thể chịu đựng đƣợc chất sát khuẩn yếu và sống sót trong trạng thái khô trong nhiều tuần nhƣng trong điều kiện tự nhiên, chỉ có thể phát triển trong sinh vật ký chủ (cấy MTB in vitro cần thời gian dài để có kết quả, nhƣng ngày nay là công việc bình thƣờng ở phòng xét nghiệm) [2, 3]. Hiện nay xu hƣớng phân loại vi khuẩn lao dựa vào trình tự ADN của chúng đã đƣợc áp dụng. Ngƣời ta nhận thấy đoạn IS6110 với 1361 cặp base chỉ có ở bốn loại mycobacteria là M. tuberculosis , M. bovis, M. africanum và M. microti (gọi chung là M. tuberculosis complex) mà không có ở các mycobacteria khác [17, 31]. 1.1.2. Hệ gene vi khuẩn lao Từ năm 1998, nhờ Cole và cộng sự [16], toàn bộ trình tự của chủng MTB H37Rv đã đƣợc giải mã và phân tích, cung cấp những kiến thức sinh học về loài vi khuẩn sinh sản chậm này, mở ra những khái niệm mới trong can thiệp phòng và điều trị bệnh. Toàn bộ hệ gene gồm 4411529 bp chứa khoảng 4000 gene, với tỷ lệ GC cao khoảng 65%. Điểm khác cơ bản trong hệ gene giữa MTB với những vi sinh vật khác là phần lớn các gene mã hoá những enzyme có liên quan đến việc tổng hợp và phân giải lipid, có 2 họ protein mới (PE và PPE) giàu glycine với cấu trúc lặp lại. MTB thƣờng kháng ngẫu nhiên với nhiều thuốc làm cho việc điều trị lao trở nên khó khăn. Sự kháng thuốc này chủ yếu là do vách tế bào kỵ nƣớc tác dụng nhƣ là rào cản thấm, tuy vậy nhiều yếu tố quyết định sự kháng thuốc đƣợc mã hóa trong hệ gene vi khuẩn nhƣ là enzyme thủy phân, enzyme biến đổi tác dụng của thuốc nhƣ β-lactamase, aminoglycoside acetyl transferase…và nhiều hệ thống vận chuyển thuốc ra ngoài khác. Khoa Sinh học Khóa 2010 - 2012
  13. Luận văn Thạc sĩ Khoa học Chử Lương Luân Hình 1.2. Hệ gene của chủng MTB H37Rv [16] Vòng tròn ngoài cùng biểu hiện thang cho MTB, 0 – nơi bắt đầu sao chép. Vòng tròn đầu tiên tính từ ngoài vào cho thấy vị trí gene ARN ổn định, trình tự DR đại diện bằng hình khối hồng. Vòng tròn thứ 2 bên trong chỉ trình tự mã hoá (theo chiều kim đồng hồ - xanh lá đậm, ngược chiều kim đồng hồ - xanh lá nhạt). Vòng tròn thứ 3 minh họa trình tự ADN lặp (trình tự chèn – cam, họ 13E12 REP – hồng đậm, prophage – xanh dương), vòng tròn thứ 4 chỉ vị trí họ PPE (xanh lá), vòng tròn thứ 5 chỉ họ PE (tím, ngoại trừ PGRS), và vòng tròn thứ 6 chỉ vị trí trình tự PGRS (đỏ sậm). Biểu đồ tròn khu vực trung tâm biểu hiện lượng GC, màu vàng chỉ ít hơn 65% GC, khu vực màu đỏ là GC cao hơn 65% [16]. Các nghiên cứu cho thấy nhóm MTB có hệ gene bảo tồn cao. Các thành viên trong họ MTB có tính đa dạng cao khi xét về kiểu hình hoặc kiểu kí chủ, đây là ví dụ điển hình cho tính ổn định di truyền giữa các chủng, với tốc độ đột biến vô nghĩa làm nên điểm đa hình ƣớc tính khoảng 0,01% - 0,03%, nhất là không có bằng chứng nào cho thấy có sự di truyền ngang vật chất di truyền trong cùng thế hệ giữa các vi khuẩn lao nhƣ các vi khuẩn khác [16]. Khoa Sinh học Khóa 2010 - 2012
  14. Luận văn Thạc sĩ Khoa học Chử Lương Luân 1.1.3. Khả năng gây bệnh và tình hình bệnh lao Về mặt dịch tễ học, tất cả những bệnh nhân lao đều có thể là nguồn lây, nhƣng mức độ lây rất khác nhau. Đối với các thể lao ngoài phổi (lao màng não, màng bụng, hạch, xƣơng khớp…) đƣợc gọi là những thể lao “kín”, nghĩa là vi khuẩn ít khả năng nhiễm vào môi trƣờng bên ngoài. Lao phổi là thể lao dễ đƣa vi khuẩn ra môi trƣờng bên ngoài. Bệnh nhân lao phổi khác nhau thì khả năng lây bệnh cho ngƣời khác cũng khác nhau, tùy thuộc vào: số lƣợng vi sinh vật thoát ra ngoài môi trƣờng, mật độ vi sinh vật trong không khí, thời gian vật chủ phơi nhiễm không khí đã bị ô nhiễm, tình trạng miễn dịch của từng cá thể. Bệnh nhân nhiễm HIV và những bệnh nhân rối loạn miễn dịch qua trung gian tế bào thì bệnh càng trầm trọng khi bị nhiễm MTB. Tuy vậy khả năng lan truyền bệnh của những bệnh nhân này không cao [2, 3]. MTB tồn tại trong các hạt khí dung nhỏ lơ lửng ngoài không khí. Khi đƣợc hít vào, vi khuẩn sẽ đi vào phổi, đến phế nang. Tại đây, vi khuẩn sẽ nhân lên hoặc bị ức chế tuỳ thuộc vào tình trạng hệ thống miễn dịch của cơ thể. Trong vòng 2-10 tuần, các đại thực bào đƣợc hoạt hoá, bao quanh vi khuẩn tạo nên lớp vỏ cứng giúp kìm hãm và kiểm soát vi khuẩn (giai đoạn lao nhiễm). Nếu hệ thống miễn dịch của cơ thể không thể kiểm soát đƣợc vi khuẩn, vi khuẩn sẽ nhân lên nhanh chóng và có thể theo đƣờng máu và đƣờng bạch huyết tấn công vào các bộ phận khác nhau nhƣ phổi, thận, não, xƣơng (giai đoạn lao bệnh) [2, 3]. MTB có cơ chế đặc biệt để tấn công vào tế bào. MTB có thể gắn trực tiếp vào thụ thể mannose trên đại thực bào nhờ glycolipid đã đƣợc mannose hoá trên vách, hoặc nhờ lipoarabinomannan, hay gắn gián tiếp nhờ thụ thể bổ thể, thụ thể Fc. Thông thƣờng khi vật lạ bị đại thực bào bắt giữ sẽ bị cơ chế thực bào qua trung gian chất oxy hoá tiêu diệt. MTB biến đổi cơ chế gây độc này, ngăn cản sự kết hợp phagosome với lysosome. Vách MTB có loại acid mycolic là lipid chuyên biệt nhánh alpha, những phân tử kị nƣớc mạnh, hình thành lớp vỏ lipid bao quanh vi sinh vật, ảnh hƣởng đến khả năng thấm vật chất qua bề mặt tế bào. Cho đến nay ngƣời ta cho rằng acid mycolic là nhân tố chính quyết định độc tính của MTB, có Khoa Sinh học Khóa 2010 - 2012
  15. Luận văn Thạc sĩ Khoa học Chử Lương Luân thể nhờ đó mà MTB tránh đƣợc các protein tích điện dƣơng, lysozyme và các gốc tự do trong các hốc thực bào, giúp MTB ngoại bào thoát khỏi sự tấn công của các bổ thể trong huyết thanh. Một trong những sản phẩm liên kết acid mycolic với các chất lipid phức tạp là cord factor - yếu tố gây độc đối với tế bào động vật có vú. Chủng MTB độc tính sinh ra rất nhiều nhân tố cord factor. Những lợi điểm giúp MTB gây bệnh rất phức tạp và chƣa đƣợc hiểu đầy đủ. Chính vì vậy, hiện nay tình hình bệnh lao trên thế giới cũng nhƣ ở Việt Nam đang trở nên nghiêm trọng và có những diễn biến phức tạp [2, 13]. Theo WHO ƣớc tính trên thế giới có khoảng 1,7 triệu ngƣời tử vong do lao hàng năm, trong đó có khoảng 380.000 phụ nữ, tức là khoảng 4700 ngƣời tử vong mỗi ngày vì lao. Tỷ lệ tử vong do lao giảm đi khoảng 35% từ năm 1990 cho đến nay. Bệnh lao đƣợc tính là một trong 3 nguyên nhân gây tử vong nhiều nhất cho phụ nữ tuổi 15-44. Về số ngƣời mới mắc hàng năm ƣớc tính khoảng 9,4 triệu, trong đó 3,3 triệu phụ nữ, 1,1 triệu ngƣời có HIV dƣơng tính. Từ năm 2004, tỷ lệ mắc mới hàng năm đã giảm đi nhƣng tốc độ giảm quá chậm. Thêm nữa, lao đa kháng thuốc đang là một thách thức rất lớn đối với nhân loại, ƣớc tính khoảng 0,5 triệu bệnh nhân mắc lao đa kháng thuốc với tỷ lệ 3,3% trong số bệnh nhân lao mới mắc. Theo điều tra lớn nhất của WHO năm 2010, tỷ lệ lao đa kháng thuốc cao nhất ở một số khu vực thuộc Liên Xô cũ, tới 28% số bệnh nhân lao mới và nguy hiểm hơn là bệnh lao siêu kháng đã xuất hiện trên 58 quốc gia, trong đó có Việt Nam. Nhiều quốc gia đã triển khai kế hoạch quản lý lao đa kháng, tuy nhiên xét trên bình diện thế giới thì còn ở mức độ rất thấp, còn cách xa yêu cầu kiểm soát bệnh lao [1, 33]. Nhƣ vậy có thể nói rằng, đã qua 130 năm sau khi Robert Kock tìm ra vi khuẩn lao, bệnh lao mới chỉ khống chế đƣợc một phần về số ngƣời mắc nhƣng lại nguy hiểm hơn vì đã xuất hiện bệnh lao đa kháng và siêu kháng đang lan rộng trên quy mô lớn. Cần phải có phƣơng pháp giải quyết mới trƣớc khi quá muộn. Theo báo cáo của WHO, năm 2011 Việt Nam xếp thứ 12 trong 22 nƣớc có số lƣợng bệnh nhân lao cao nhất thế giới và thứ 14 trong 27 nƣớc có tình hình lao đa Khoa Sinh học Khóa 2010 - 2012
  16. Luận văn Thạc sĩ Khoa học Chử Lương Luân kháng và siêu kháng cao. Hàng năm ƣớc tính có thêm 180.000 bệnh nhân lao, trong đó có khoảng 6000 bệnh nhân lao đa kháng và khoảng 7400 bệnh nhân lao/HIV. Tuy nhiên chúng ta mới chỉ phát hiện đƣợc khoảng 60% số bệnh nhân ƣớc tính tức là trên dƣới 100.000 bệnh nhân mỗi năm [1, 33]. Điều này cho thấy tăng cƣờng phát hiện tất cả các thể bệnh lao, chẩn đoán vi khuẩn lao là một ƣu tiên hàng đầu trong công tác chống lao ở Việt Nam hiện nay. 1.1.4. Các phƣơng pháp chẩn đoán vi khuẩn lao Phát hiện đƣợc vi khuẩn lao là tiêu chuẩn quyết định để chẩn đoán bệnh lao. Chẩn đoán vi khuẩn lao đã đƣợc tiến hành từ lâu và gần đây có nhiều kỹ thuật hiện đại đƣợc áp dụng 1.1.4.1. Các phƣơng pháp cổ điển Kỹ thuật nhuộm soi kính Bệnh phẩm thƣờng là đờm, điều quan trọng là phải hƣớng dẫn bệnh nhân lấy đờm đúng để xét nghiệm. Số mẫu đờm cần thiết thử cho một bệnh nhân nghi lao là 3 mẫu: một mẫu lấy tại chỗ khi bệnh nhân đến khám; một mẫu lấy vào buổi sáng sau khi ngủ dậy (toàn bộ đờm lao ho khạc trong vòng 2 giờ); mẫu thứ ba lấy tại chỗ khi bệnh nhân mang mẫu đờm buổi sáng đến khám. Khi trong bệnh phẩm ít vi khuẩn (thƣờng là dịch màng phổi, màng bụng…) cần tiến hành ly tâm rồi lấy phần cặn lắng đọng nhuộm thì khả năng tìm thấy vi khuẩn nhiều hơn. Kỹ thuật Ziehl-Neelsen là kỹ thuật cổ điển sử dụng để phát hiện vi khuẩn lao. Đánh giá kết quả đang đƣợc sử dụng ở nƣớc ta nhƣ sau: - Khi không có AFB (Acid Fast Bacilli) trên 100 vi trƣờng : kết quả âm tính. - Khi có từ 1 đến 9 AFB trên 100 vi trƣờng: dƣơng tính (ghi cụ thể số vi khuẩn). - Khi có từ 10 đến 99 AFB trên 100 vi trƣờng : dƣơng tính (1+). - Khi có từ 1 đến 10 AFB trên 1 vi trƣờng : dƣơng tính (2+). - Khi có trên 10 AFB trên 1 vi trƣờng : dƣơng tính (3+). Khoa Sinh học Khóa 2010 - 2012
  17. Luận văn Thạc sĩ Khoa học Chử Lương Luân Phƣơng pháp soi kính có ƣu điểm là cho kết quả nhanh, chẩn đoán chính xác bệnh lao và khả năng lây truyền của bệnh nhân cho những ngƣời xung quanh, kỹ thuật và phƣơng tiện đơn giản có thể tiến hành đƣợc ở tuyến quận, huyện. Nhƣng có nhƣợc điểm là trong 1 ml đờm phải có từ khoảng 5000 vi khuẩn trở lên mới cho kết quả dƣơng tính. Phƣơng pháp soi kính chỉ biết đƣợc hình thể của vi khuẩn, không biết đƣợc vi khuẩn còn sống hay đã chết. Phƣơng pháp này cũng không cho phép phân biệt đƣợc các chủng vi khuẩn lao [3, 18, 19]. Phƣơng pháp nuôi cấy Môi trƣờng dùng nuôi cấy vi khuẩn lao là môi trƣờng Loeweinstein – Jensen. Sau 1 – 2 tháng vi khuẩn lao phát triển thành khuẩn lạc hình súp lơ, màu trắng ngà. Ƣu điểm của phƣơng pháp nuôi cấy là cho kết quả chính xác, có thể tiến hành các phản ứng sinh học để phân loại vi khuẩn lao và làm đƣợc kháng sinh đồ giúp chọn thuốc lao thích hợp điều trị bệnh nhân, nhất là trong những trƣờng hợp bệnh lao có vi khuẩn kháng thuốc. Phƣơng pháp nuôi cấy đòi hỏi phƣơng tiện và kỹ thuật hiện đại. Hiện nay ở nƣớc ta, ngoài các tuyến y tế chuyên khoa ở trung ƣơng, kỹ thuật này cũng đƣợc tiến hành ở một số bệnh viện chuyên khoa (tỉnh, thành phố). Ngày nay ngƣời ta đã áp dụng kỹ thuật nuôi cấy cho kết quả nhanh từ 5 - 7 ngày, phục vụ kịp thời cho điều trị bệnh nhân [3, 18, 19]. Phƣơng pháp chụp X Quang Chẩn đoán lao phổi bằng chụp X quang phổi thƣờng chi phí tốn kém. Tuy có độ nhạy cao nhƣng độ đặc hiệu thấp. Có nhiều loại bệnh khác có thể có biểu hiện hình ảnh tổn thƣơng trên phim chụp phổi giống bệnh lao, thêm nữa nhiều khi bệnh lao phổi dù đã đƣợc điều trị khỏi vẫn để lại di chứng ở phổi suốt đời. Do vậy dùng X quang rộng rãi để chẩn đoán lao phổi dễ bị nhầm và lãng phí. Thực tế thƣờng vận dụng chẩn đoán lao phổi trong một số trƣờng hợp: lao phổi AFB (-), ở bệnh nhân chỉ có một mẫu xét nghiệm đờm (+), và một số trƣờng hợp đặc biệt khác nhƣ các loại tổn thƣơng có tính chất tƣơng đối đặc thù hay gặp trong lao: vị trí hay gặp ở vùng đỉnh và hạ đòn, tổn thƣơng thƣờng đa dạng, phối hợp nhiều loại và tiến triển chậm [3, 19]. Khoa Sinh học Khóa 2010 - 2012
  18. Luận văn Thạc sĩ Khoa học Chử Lương Luân 1.1.4.2. Một số kỹ thuật hiện đại chẩn đoán vi khuẩn lao Sử dụng hệ Bactec Ngƣời ta gắn Carbon phóng xạ vào acid palmitric và acid formic trong môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn lao. Khi vi khuẩn chuyển hóa sẽ lấy các acid béo này và giải phóng ra CO2 (có carbon phóng xạ) đƣợc đo bằng máy Bactec 960. Kỹ thuật đo phóng xạ (hệ thống BACTEC) có thể phát hiện nhanh vi khuẩn. Tuy nhiên giá cả khá đắt đỏ, không phù hợp với nguồn lực có hạn của nhiều quốc gia [3, 12]. Kỹ thuật MGIT (Mycobacterium Growth Indicator Tube) Kỹ thuật ống chỉ thị sự sinh trƣởng của vi khuẩn lao là phƣơng pháp sử dụng biện pháp đặc biệt để kích thích vi khuẩn lao sinh sản nhanh. Vi khuẩn lao phát triển sẽ sử dụng oxy và thải CO2. Bằng bộ phận nhạy cảm có phát quang có thể nhận biết đƣợc CO2. Kết quả đƣợc đọc bằng chiếu tia tử ngoại, MGIT dƣơng tính sẽ phát quang vàng, da cam. Kết quả dƣơng tính sau 6 ngày, nếu thử kháng sinh đồ thì dƣơng tính sau 7 ngày. Phƣơng pháp này tốt với nhóm nguy cơ nhiễm HIV và là phƣơng pháp đƣợc WHO khuyến cáo sử dụng [3, 7, 19]. Phản ứng chuỗi polymerase (Polymerase chain reaction - PCR) Kỹ thuật PCR cho phép xác định tác nhân gây bệnh trực tiếp trong bệnh phẩm nhờ khả năng nhận biết và sao chép để khuyếch đại về mặt số lƣợng đoạn trình tự đặc hiệu trên genome của vi khuẩn. Đối với MTB, kỹ thuật PCR phát hiện trình tự 249 bp nằm trên đoạn IS6110, là trình tự gắn đặc hiệu và có khả năng tự sao chép với số lƣợng lớn trong genome vi khuẩn thuộc nhóm MTB (M. tuberculosis, M. microti, M. bovis và M. africanum). Kỹ thuật này có ƣu điểm là cho kết quả nhanh (từ 24 đến 48 giờ), cho kết quả dƣơng tính cả khi có ít vi khuẩn (dƣới 10 vi khuẩn trong đờm vẫn phát hiện đƣợc) và còn cho biết vi khuẩn có kháng thuốc lao hay không, vì khi kháng thuốc sẽ có đột biến trong gen làm thay đổi cấu trúc ADN [3, 18, 19, 31]. Khoa Sinh học Khóa 2010 - 2012
  19. Luận văn Thạc sĩ Khoa học Chử Lương Luân 1.2. NHỮNG KHÁI NIỆM CƠ BẢN VỀ HẠT NANO KIM LOẠI Hạt nano kim loại là một khái niệm để chỉ các hạt có kích thƣớc nano đƣợc tạo thành từ các kim loại. Ngƣời ta biết rằng hạt nano kim loại chế tạo từ vàng, bạc đƣợc sử dụng từ hàng nghìn năm nay. Nổi tiếng nhất có thể là chiếc cốc Lycurgus đƣợc ngƣời La Mã chế tạo vào khoảng thế kỉ thứ tƣ trƣớc công nguyên và hiện nay đƣợc trƣng bày ở Bảo tàng Anh. Chiếc cốc đó đổi màu tùy thuộc vào cách ngƣời ta nhìn nó. Nó có màu xanh lục khi nhìn ánh sáng phản xạ trên cốc và có màu đỏ khi nhìn ánh sáng đi từ trong cốc và xuyên qua thành cốc. Các phép phân tích ngày nay cho thấy trong chiếc cốc đó có các hạt nano vàng và bạc có kích thƣớc 70 nm và với tỉ phần mol là 14:1. Tuy nhiên, phải đến năm 1857, khi Michael Faraday nghiên cứu một cách hệ thống các hạt nano vàng thì các nghiên cứu về phƣơng pháp chế tạo, tính chất và ứng dụng của các hạt nano kim loại mới thực sự đƣợc bắt đầu và cho đến nay đã có rất nhiều loại hạt nano kim loại đƣợc ứng dụng vào thực tiễn mà điển hình là hạt nano kim loại có từ tính [5]. 1.2.1. Tính chất của hạt nano kim loại 1.2.1.1. Tính chất quang học Kim loại có nhiều điện tử tự do, các điện tử tự do này sẽ dao động dƣới tác dụng của điện từ trƣờng bên ngoài nhƣ ánh sáng. Thông thƣờng các dao động bị dập tắt nhanh chóng bởi các sai hỏng mạng hay bởi chính các nút mạng tinh thể trong kim loại khi quãng đƣờng tự do trung bình của điện tử nhỏ hơn kích thƣớc. Nhƣng khi kích thƣớc của kim loại nhỏ hơn quãng đƣờng tự do trung bình thì hiện tƣợng dập tắt không còn nữa mà điện tử sẽ dao động cộng hƣởng với ánh sáng kích thích. Do vậy, tính chất quang của hạt nano đƣợc có đƣợc do sự dao động tập thể của các điện tử dẫn đến từ quá trình tƣơng tác với bức xạ sóng điện từ. Khi dao động nhƣ vậy, các điện tử sẽ phân bố lại trong hạt nano làm cho hạt nano bị phân cực điện tạo thành một lƣỡng cực điện. Do vậy xuất hiện một tần số cộng hƣởng phụ thuộc vào nhiều yếu tố nhƣng các yếu tố về hình dáng, độ lớn của hạt nano và môi trƣờng xung quanh là các yếu tố ảnh hƣởng nhiều nhất. Ngoài ra, mật độ hạt Khoa Sinh học Khóa 2010 - 2012
  20. Luận văn Thạc sĩ Khoa học Chử Lương Luân nano cũng ảnh hƣởng đến tính chất quang. Nếu mật độ loãng thì có thể coi nhƣ gần đúng hạt tự do, nếu nồng độ cao thì phải tính đến ảnh hƣởng của quá trình tƣơng tác giữa các hạt [5]. 1.2.1.2. Tính chất điện Tính dẫn điện của kim loại rất tốt hay nói cách khác điện trở của kim loại nhỏ nhờ vào mật độ điện tử tự do cao trong đó. Đối với vật liệu khối, các lí luận về độ dẫn dựa trên cấu trúc vùng năng lƣợng của chất rắn. Tập thể các điện tử chuyển động trong kim loại (dòng điện I) dƣới tác dụng của điện trƣờng (U) có liên hệ với nhau thông qua định luật Ohm: U = IR, trong đó R là điện trở của kim loại. Định luật Ohm cho thấy đƣờng I-U là một đƣờng tuyến tính. Khi kích thƣớc của vật liệu giảm dần, hiệu ứng lƣợng tử do giam hãm làm rời rạc hóa cấu trúc vùng năng lƣợng. Hệ quả của quá trình lƣợng tử hóa này đối với hạt nano là I-U không còn tuyến tính nữa mà xuất hiện một hiệu ứng gọi là hiệu ứng chắn Coulomb (Coulomb blockade) làm cho đƣờng I-U bị nhảy bậc với giá trị mỗi bậc sai khác nhau một lƣợng e/2C cho U và e/RC cho I, với e là điện tích của điện tử, C và R là điện dung và điện trở khoảng nối hạt nano với điện cực [5]. 1.2.1.3. Tính chất từ Các kim loại quý nhƣ vàng, bạc,… có tính nghịch từ ở trạng thái khối do sự bù trừ cặp điện tử. Khi vật liệu thu nhỏ kích thƣớc thì sự bù trừ trên sẽ không toàn diện nữa và vật liệu có từ tính tƣơng đối mạnh. Các kim loại có tính sắt từ ở trạng thái khối nhƣ các kim loại chuyển tiếp sắt, cô ban, ni ken thì khi kích thƣớc nhỏ sẽ phá vỡ trật tự sắt từ làm cho chúng chuyển sang trạng thái siêu thuận từ. Vật liệu ở trạng thái siêu thuận từ có từ tính mạnh khi có từ trƣờng và không có từ tính khi từ trƣờng bị ngắt đi, tức là từ dƣ và lực kháng từ hoàn toàn bằng không [5]. Khoa Sinh học Khóa 2010 - 2012
ADSENSE

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

LV.15: Bộ Đồ Án Tốt Nghiệp Chuyên Ngành Cơ Khí
65 tài liệu
2431 lượt tải
THÔNG TIN
TRỢ GIÚP
HỖ TRỢ KHÁCH HÀNG
Theo dõi chúng tôi

Chịu trách nhiệm nội dung:

Nguyễn Công Hà - Giám đốc Công ty TNHH TÀI LIỆU TRỰC TUYẾN VI NA

LIÊN HỆ

Địa chỉ: P402, 54A Nơ Trang Long, Phường 14, Q.Bình Thạnh, TP.HCM

Hotline: 093 303 0098

Email: support@tailieu.vn

Giấy phép Mạng Xã Hội số: 670/GP-BTTTT cấp ngày 30/11/2015 Copyright © 2022-2032 TaiLieu.VN. All rights reserved.

 

Đồng bộ tài khoản
8=>2