intTypePromotion=1
zunia.vn Tuyển sinh 2024 dành cho Gen-Z zunia.vn zunia.vn
ADSENSE
 » 
 » 

Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu vai trò của gen ABCC4 liên quan đến rối loạn tự kỷ bằng mô hình ruồi giấm

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:68

Thêm vào BST
Báo xấu
30
lượt xem 6
download
 
  Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Đề tài nghiên cứu nhằm 2 mục tiêu chính: Knockdown gen ABCC4 trên mô hình ruồi giấm và phân tích các biểu hiện hành vi và cấu trúc mối nối thần kinh cơ NMJ trên ruồi knockdown ABCC4 trong mối liên quan đến bệnh tự kỷ.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu vai trò của gen ABCC4 liên quan đến rối loạn tự kỷ bằng mô hình ruồi giấm

  1. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN z-- -------------------------- Trần Quốc Đạt NGHIÊN CỨU CHỨC NĂNG CỦA GEN ABCC4 LIÊN QUAN ĐẾN RỐI LOẠN TỰ KỶ BẰNG MÔ HÌNH RUỒI GIẤM LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HÀ NỘI - 12/2019
  2. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Trần Quốc Đạt NGHIÊN CỨU CHỨC NĂNG CỦA GEN ABCC4 LIÊN QUAN ĐẾN RỐI LOẠN TỰ KỶ BẰNG MÔ HÌNH RUỒI GIẤM Chuyên ngành : Sinh học thực nghiệm Mã số : 8420101.14 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hướng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Trọng Tuệ PGS. TS. Võ Thị Thương Lan HÀ NỘI - 12/2019
  3. LỜI CẢM ƠN Để thực hiện thành công luận văn này, tôi xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Nguyễn Trọng Tuệ - Khoa Kỹ thuật Y học, Trường Đại học Y Hà Nội và PGS.TS. Võ Thị Thương Lan – Khoa Sinh học, Trường ĐH Khoa học Tự Nhiên, ĐHQGHN – những người thầy đã trực tiếp hướng dẫn, truyền đạt cho tôi những kiến thức và kinh nghiệm quý báu, cho tôi những hành trang để bước vào nghề, bước vào sự nghiệp nghiên cứu khoa học của mình. Họ cũng là những người thầy, người cô mang đến cho tôi tình yêu và niềm đam mê khoa học, luôn nhắc nhở, bảo ban và động viên tôi trong suốt thời gian học tập và thực hiện luận văn tốt nghiệp này. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới GS Matsamitsu Yamaguchi và nhóm nghiên cứu ruồi giấm tại Khoa Sinh học Ứng dụng, Học viện Công nghệ Kyoto– người đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình học tập và trao đổi ngắn hạn tại Nhật Bản. Thầy cũng là người hỗ trợ tôi rất nhiều trong việc thu thập các dòng ruồi giấm cần thiết cho nghiên cứu, đồng thời tạo điều kiện thuận lợi về trang thiết bị để tôi có thể hoàn thành tốt đề tài. Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Giám Hiệu, lãnh đạo Trung tâm Nghiên cứu Gen-Protein, Trường Đại học Y Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi để tôi học tập và nghiên cứu. Trong thời gian thực hiện luận văn, tôi cũng xin cảm ơn sự quan tâm, giúp đỡ và động viên của các anh chị thuộc nhóm nghiên cứu ứng dụng mô hình ruồi giấm và các bạn đồng nghiệp tại Trung tâm nghiên cứu Gen-Protein, Trường Đại học Y Hà Nội. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, người thân và bạn bè đã luôn giúp đỡ, ủng hộ và động viên tôi rất nhiều để tôi có thể hoàn thành luận văn này. Hà Nội, ngày 5 tháng 12 năm 2019 Học viên
  4. Trần Quốc Đạt
  5. LỜI CAM ĐOAN Tôi là Trần Quốc Đạt, học viên cao học khoá 26, chuyên ngành Sinh học thực nghiệm, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội, xin cam đoan: 1. Đây là luận văn do tôi trực tiếp thực hiện dưới sự hướng dẫn của TS. Nguyễn Trọng Tuệ và PGS.TS. Võ Thị Thương Lan 2. Công trình nghiên cứu này hoàn toàn mới không trùng lặp với bất kỳ công trình nghiên cứu nào khác. 3. Các số liệu và thông tin trong nghiên cứu chính xác, trung thực và khách quan. Tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm trước pháp luật về những cam kết này Hà Nội, ngày 5 tháng 12 năm 2019 Học viên Trần Quốc Đạt
  6. Luận văn thạc sĩ khoa học Trần Quốc Đạt – K26 Sinh học thực nghiệm MỤC LỤC Mở đầu ........................................................................................................................... 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................................... 3 1.1 Tổng quan về hội chứng rối loạn phổ tự kỷ ..................................................... 3 1.1.1. Chẩn đoán ...................................................................................................... 4 1.1.2. Nguyên nhân .................................................................................................. 4 1.1.3. Điều trị ........................................................................................................... 6 1.2. Tổng quan về ruồi giấm ................................................................................... 7 1.2.1. Chu kỳ vòng đời ............................................................................................ 8 1.2.2. Hệ gen của ruồi giấm ..................................................................................... 9 1.3. Ứng dụng mô hình ruồi giấm trong nghiên cứu ............................................. 12 1.4. Hệ thống kiểm soát biểu hiện gen GAL4-UAS và ứng dụng trong nghiên cứu mô hình ruồi giấm ..................................................................................................... 16 1.4.1. Hệ thống GAL4/UAS .................................................................................. 16 1.4.2. Phương pháp knockdown một gen bằng kỹ thuật RNAi và biểu hiện gen knockdown bằng hệ thống GAL4/UAS ................................................................ 17 1.5. Họ gen ABC và gen ABCC4 ........................................................................... 18 1.5.1. Tổng quan về họ gen ABC ........................................................................... 18 1.5.2. Gen ABCC4 ................................................................................................. 19 1.6. Ứng dụng mô hình ruồi giấm trong nghiên cứu rối loạn tự kỷ ...................... 20 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 22 2.1. Đối tượng nghiên cứu..................................................................................... 22 2.2. Nguyên vật liệu, hoá chất và thiết bị .............................................................. 22 2.2.1. Nguyên vật liệu và hoá chất ........................................................................ 22 2.2.2. Dụng cụ và thiết bị ...................................................................................... 23 2.3. Phương pháp nghiên cứu................................................................................ 24 2.3.1 Phương pháp lai tạo dòng ruồi giấm knockdown biểu hiện dABCC4 tại mô não của ruồi ........................................................................................................... 24 2.3.2. Phương pháp đánh giá biểu hiện của protein ABCC4 tại mô não ruồi giấm bằng kỹ thuật western blotting .............................................................................. 26 2.3.3. Đánh giá khả năng vận động của ruồi giấm bằng thí nghiệm leo trèo ........ 27 2.3.4. Phương pháp đánh giá khả năng tương tác xã hội ....................................... 28 2.3.5. Phương pháp đánh giá nhịp sinh học của ruồi giấm (activity assay) .......... 29 2.3.6. Phương pháp đánh giá tuổi thọ của ruồi giấm (viability assay) .................. 30 2.3.7. Xác định sự thay đổi trong cấu trúc mối nối thần kinh cơ bằng phương pháp nhuộm miễn dịch huỳnh quang ............................................................................. 31 2.3.8. Phân tích kết quả ......................................................................................... 34 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ................................................................ 36 3.1. So sánh mức độ tương đồng giữa protein ABCC4 của người và ruồi giấm ...... 36
  7. Luận văn thạc sĩ khoa học Trần Quốc Đạt – K26 Sinh học thực nghiệm 3.2. Kết quả đánh giá mức độ biểu hiện protein ABCC4 tại mô não ruồi giấm ....... 37 3.3. Kết quả đánh giá khả năng vận động và tương tác ở ruồi trưởng thành. ........... 40 3.4. Kết quả xác định nhịp sinh học của ruồi giấm ................................................... 43 3.5. Kết quả xác định sự thay đổi trong cấu trúc mối nối thần kinh cơ (neuromuscular junction-NMJ) ruồi giấm bằng phương pháp nhuộm miễn dịch huỳnh quang .............................................................................................................. 46 3.6. Kết quả đánh giá tuổi thọ của ruồi giấm ............................................................ 49 KẾT LUẬN .................................................................................................................. 51 Tài liệu tham khảo ..........................................................................................................
  8. Luận văn thạc sĩ khoa học Trần Quốc Đạt – K26 Sinh học thực nghiệm DANH MỤC HÌNH Hình 1. Hoạt động lưu trữ và thao tác trên ruồi giấm trong thực nghiệm ...................... 8 Hình 2: Chu kỳ vòng đời của ruồi giấm.. ....................................................................... 9 Hình 3: Quy tắc kí hiệu kiểu gen của ruồi giấm và ứng dụng trong viết phép lai ....... 10 Hình 4. Chức năng của các cơ quan có sự tương đồng giữa người và ruồi giấm. ....... 11 Hình 5: Bảo tồn về mặt chức năng của các cơ quan trong hệ thần kinh (A) và hệ vận động (B) giữa người và ruồi giấm ................................................................... 12 Hình 6: Phương pháp chuyển gen vào ruồi giấm sử dụng vectơ P-element. ............... 13 Hình 7: Hoạt động của hệ thống GAL4/UAS. ............................................................. 17 Hình 8: Cơ chế RNA can thiệp (RNA interference – RNAi). ...................................... 18 Hình 9: Sơ đồ cấu trúc và các vùng chức năng của protein ABC. ............................... 19 Hình 10: Sơ đồ miêu tả quá trình lai tạo các dòng ruồi giấm thí nghiệm và cơ chế hoạt động của các thành phần trong con lai F1. ...................................................... 25 Hình 11: Thiết kế thí nghiệm đánh giá khả năng leo trèo ............................................ 27 Hình 12: Thiết kế thí nghiệm đánh giá khả năng tương tác xã hội của ruồi giấm ....... 29 Hình 13: Thiết kế thí nghiệm xác định nhịp sinh học của ruồi giấm.. ......................... 30 Hình 14: Cấu trúc thần kinh cơ (neuromuscular junction)ở ấu trùng ruồi giấm. ......... 32 Hình 15: Sơ đồ thiết kế các thí nghiệm trong nghiên cứu. ........................................... 35 Hình 16: Mức độ tương đồng giữa protein ABCC4 của người và ruồi giấm. ............. 36 Hình 17: Kết quả western blotting xác định mức độ biểu hiện của protein dABCC4 ở mô não của ruồi giấm....................................................................................... 38 Hình 18: Thí nghiệm hành vi tương tác xã hội trên ruồi giấm trưởng thành. .............. 41 Hình 19: Kết quả thí nghiệm leo trèo xác định khả năng vận động của ruồi giấm trưởng thành ở thời điểm 3 ngày tuổi, 7 ngày tuổi và 14 ngày tuổi................. 42 Hình 20: Kết quả xác định nhịp sinh học của ruồi giấm.. ............................................ 44 Hình 21: Kết quả phân tích nhịp thức-ngủ ở ruồi giấm ............................................... 45 Hình 22: Kết quả phân tích cấu trúc thần kinh cơ (neuromuscular junction-NMJ) của ruồi giấm bằng phương pháp nhuộm miễn dịch huỳnh quang ........................ 47 Hình 23: Kết quả xác định mật độ protein BRP tại vùng hoạt động trước synap ở ấu trùng ruồi giấm bằng phương pháp nhuộm miễn dịch huỳnh quang. .............. 48 Hình 24: Biểu đồ đánh giá tỷ lệ sống của ruồi giấm. ................................................... 50
  9. Luận văn thạc sĩ khoa học Trần Quốc Đạt – K26 Sinh học thực nghiệm DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ Chú thích Tiếng Anh Chú thích Tiếng Việt viết tắt ATP-binding cassette subfamily C Thành viên số 4 phân lớp C của ABCC4 member 4 protein bám ATP ASD Autism Spectrum Disorder Hội chứng rối loạn phổ tự kỷ ATP Adenosine Triphosphat BRP Brurchpilot dsRNA double stranded RiboNucleic Acid RNA mạch đôi DLG Disc-large HRP Horseradish Peroxidase Enzyme củ cải ngựa HL3 hemolymph-like 3 saline IR Inverted Repeat Trình tự lặp-đảo kDal kilo Dalton NBD Nucleotide Binding Domain Vùng bám nucleotide NGS Normal goat serum Huyết thanh dê NMJ Neuromuscular-junction Mối nối thần kinh cơ PBS Phosphat Buffer Saline PFA Paraformandehide RISC RNA induced silencing complex Phức hệ gây bất hoạt RNA RNAi RNA interference RNA can thiệp Reverse transcription – Polymerase Phản ứng PCR sử dụng enzyme RT-PCR Chain Reaction phiên mã ngược TMD Transmembrane Domain Vùng xuyên màng UAS Upstream Activation Sequence Trình tự hoạt hóa thượng nguồn MSSR Subsynap Reticulum Vùng dưới synap
  10. Luận văn thạc sĩ khoa học Trần Quốc Đạt – K26 Sinh học thực nghiệm Mở đầu Theo tiêu chuẩn DSM-IV (The Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders – 5th Edition), tự kỷ là tình trạng rối loạn hành vi nghiêm trọng, nằm trong nhóm các rối loạn phát triển lan tỏa (pervasive developmental disoders). Gần đây, rối loạn phổ tự kỷ và tự kỷ là tên gọi chung cho toàn bộ các thể bệnh này. Bệnh đặc trưng bởi tình trạng rối loạn thần kinh phức tạp bao gồm những khiếm khuyết trong tương tác xã hội, phát triển ngôn ngữ và kỹ năng giao tiếp kết hợp với hành vi cứng nhắc, lặp đi lặp lại. Do mang đồng thời nhiều triệu chứng nên còn được gọi là rối loạn phổ tự kỷ (autism spectrum disorder - ASD). Bệnh được phân loại gồm: rối loạn tự kỷ, rối loạn Asperger, rối loạn Rett, rối loạn phân rã tuổi thơ và rối loạn phát triển lan tỏa không đặc hiệu khác. Việc nghiên cứu căn bệnh này ở mức độ phân tử và tế bào cũng trở nên khó khăn đối với các nhà khoa học bởi tính phức tạp và trở ngại trong việc lựa chọn, xây dựng mô hình thực nghiệm. Hầu hết các nghiên cứu cơ bản đều dừng lại ở mức độ in vitro, tập trung vào việc phát hiện đột biến gen được cho là liên quan đến bệnh mà chưa đi sâu vào nghiên cứu ở mức độ in vivo. Mô hình ruồi giấm chuyển gen mang lại những giá trị to lớn trong nghiên cứu bệnh học phân tử với rất nhiều ưu điểm như: vòng đời ngắn, sinh trưởng nhanh, bản đồ hệ gen đã giải mã chi tiết, có khoảng 70% gen gây bệnh tương đồng với người, ít hạn chế pháp lý đối với các thử nghiệm, dễ tạo dòng, dễ chuyển gen và biểu hiện protein ngoại lai. Cấu trúc và chức năng của hệ cơ, hệ thần kinh, hệ tiêu hoá…được bảo tồn giữa ruồi giấm và người, do đó ruồi giấm biến đổi gen thực sự là mô hình lý tưởng để nghiên cứu các bệnh lý ở người đặc biệt là các bệnh lý thần kinh. Trên thế giới, đã có nghiên cứu sử dụng mô hình ruồi giấm để xác định mối liên quan giữa đột biến một số gen với bệnh tự kỷ bằng việc giảm biểu hiện của các gen này (knockdown) tại hệ thần kinh, đồng thời phân tích ảnh hưởng của gen liên quan đến các biểu hiện hành vi, khả năng vận động, khả năng sống sót, các thay đổi về nhịp sinh học và biến đổi trong cấu trúc thần kinh NMJ ruồi giấm. Một nghiên cứu gần đây khi knockdown gen ABCA13 (ATP-binding cassette subfamily A member 13) – một gen thuộc họ ABC có vai trò quan trọng trong việc vận chuyển lipid, ion, vitamin, các chất hữu cơ và một số phân tử thuốc qua màng tế bào đã cho thấy sự giảm tương tác rõ 1
  11. Luận văn thạc sĩ khoa học Trần Quốc Đạt – K26 Sinh học thực nghiệm rệt giữa các cá thể trong quần thể ruồi giấm. Ruồi bị rối loạn giấc ngủ và cấu trúc thần kinh cơ bị biến đổi. Kiểu hình ghi nhận được trên mô hình này tương tự như triệu chứng rối loạn tự kỷ ở người. Bên cạnh đó, đột biến gen ABCA13 cũng đã được chứng minh là có liên quan đến rối loạn tự kỷ trên mô hình khỉ thực nghiệm. Như vậy, họ gene ABC đóng vai trò quan trọng trong việc hình thành cấu trúc và duy trì chức năng của hệ thần kinh ở động vật. Để tiếp nối hướng nghiên cứu này, nhóm nghiên cứu của chúng tôi đã lựa chọn nhắm vào gen đích ABCC4, một gen cũng nằm trong họ gen ABC tuy nhiên chức năng của nó liên quan đến hệ thần kinh và ảnh hưởng đến rối loạn tự kỷ lại chưa được biết đến và cũng chưa có một nghiên cứu nào trên mô hình động vật xác định được vai trò sinh bệnh học của gen này. Trên cơ sở đó, chúng tôi tiến hành đề tài ‘Nghiên cứu vai trò của gen ABCC4 liên quan đến rối loạn tự kỷ bằng mô hình ruồi giấm’ với hai mục tiêu chính: (1) knockdown gen ABCC4 trên mô hình ruồi giấm và (2) phân tích các biểu hiện hành vi và cấu trúc mối nối thần kinh cơ NMJ trên ruồi knockdown ABCC4 trong mối liên quan đến bệnh tự kỷ. Đây là hướng tiếp cận hoàn toàn mới, sẽ góp phần làm sáng tỏ vai trò không chỉ của gen ABCC4 mà còn cho thấy chức năng mới của họ gen ABC trong cơ chế phân tử của bệnh, đồng thời cung cấp một mô hình tiềm năng và kinh tế cho những nghiên cứu thử nghiệm và sàng lọc thuốc. 2
  12. Luận văn thạc sĩ khoa học Trần Quốc Đạt – K26 Sinh học thực nghiệm CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 . Tổng quan về hội chứng rối loạn phổ tự kỷ Rối loạn phổ tự kỷ (Autism Spectrum Disoders – ASD) là một bệnh lý rối loạn về phát triển thần kinh phức tạp ở trẻ em được giả thuyết do sự phơi nhiễm với các chất độc hoặc do thay đổi về những yếu tố di truyền [5]. Bệnh được phân loại bao gồm: rối loạn Rett, rối loạn phân rã tuổi thơ, rối loạn Asperger, rối loạn phát triển lan toả không đặc hiệu và hội chứng nhiễm sắc thể X dễ gãy… [72]. Những rối loạn về hành vi thường phát triển trong những năm đầu tiên của cuộc đời. Đây là căn bệnh đang có xu hướng phát triển với một tốc độ đáng báo động không chỉ ở Việt Nam mà còn trên toàn thế giới. Theo số liệu thống kê năm 2012, thế giới có khoảng 62/10 000 người bị mắc hội chứng rối loạn tự kỷ. Trước đó, nhiều nghiên cứu khảo sát toàn diện về tỷ lệ mắc bệnh từ khu vực Tây Thái Bình Dương đến Nhật Bản và Trung Quốc. Năm 2000, tỷ lệ mắc tự kỷ dao động từ 2,8/10000 đến 94/10000 với giá trị trung bình là 11,6 /10 000. Chỉ có một nghiên cứu về hội chứng này ở khu vực Đông Nam Á, được thực hiện ở Indonesia vào năm 1992; ước tính tỷ lệ mắc tự kỷ là 11,7/10 000 [23]. Công bố năm 2014 của Trung tâm kiểm soát dịch bệnh Hoa kỳ- CDC khi điều tra trên 11 bang của Mỹ cho thấy trung bình cứ 59 trẻ ở độ tuổi 8 tuổi thì có 1 trẻ bị hội chứng tự kỷ. Tỷ lệ này có thể khác nhau giữa các bang (khoảng từ 13.1 đến 29.3 trên 1.000 trẻ em 8 tuổi) và thay đổi theo giới tính và chủng tộc/sắc tộc. Bé trai có nguy cơ mắc tự kỷ cao gấp từ 4 -5 lần so với bé gái [72]. Tại Việt Nam, số trẻ được chẩn đoán tự kỷ ngày càng tăng lên. Cụ thể, tại Bệnh viện Nhi Trung ương, số trẻ được chẩn đoán tự kỷ trong năm 2008 là 450 trẻ, năm 2009 là 963 trẻ, con số này vào năm 2010 lên tới 1792 trẻ [2]. Nghiên cứu của Hoàng Văn Minh và cs năm 2019 về tỷ lệ mắc tự kỷ ở nhóm trẻ 18-30 tháng tuổi ở Miền Bắc Việt Nam là 75,2/10 000 trẻ, cao hơn so với thống kê giai đoạn 2013-2014. Cũng trong nghiên cứu này, tác giả còn chỉ ra tỷ lệ mắc rối loạn tự kỷ cao hơn ở những trẻ em sống trong môi trường đô thị. Mức độ đô thị hoá ngày càng tăng dẫn đến trẻ có nguy cơ mắc bệnh cao hơn [29]. 3
  13. Luận văn thạc sĩ khoa học Trần Quốc Đạt – K26 Sinh học thực nghiệm 1.1.1. Chẩn đoán Về mặt chẩn đoán, trong khoảng thời gian dài tranh luận và sửa đổi, các nhà tâm thần học đã đi đến thống nhất và mô tả hoàn chỉnh các tiêu chí trong hai bảng phân loại bệnh quốc tế là “The Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders – 5th Edition” (DSM-V) và “Autism Spectrum Diagnostic Observation Schedule” (ASD-OC) [27], [31]. Trẻ mắc hội chứng này thường biểu hiện sự thiếu hụt và bất thường ở ba yếu tố chẩn đoán cốt lõi là tương tác xã hội, khả năng giao tiếp và hành vi có tính lặp lại. Trong đó, tiêu chuẩn chẩn đoán bao gồm việc xuất hiện ít nhất ba dấu hiệu của sự giảm giao tiếp xã hội hoặc hai dấu hiệu của việc lặp đi lặp lại các hành vi và có phản ứng quá mức, hoặc dưới mức với các tác động từ môi trường [27]. Một số biểu hiện khác như động kinh, tăng động giảm chú ý, lo âu, trầm cảm cũng được sử dụng làm tiêu chuẩn chẩn đoán. Dấu hiệu của sự giảm tương tác xã hội và khả năng giao tiếp bao gồm sự suy giảm rõ rệt các hành vi phi ngôn ngữ như ánh mắt, biểu cảm khuôn mặt hay ngôn ngữ cơ thể. Các hành vi của trẻ có tính lặp đi lặp lại và dập khuôn. Trẻ không có hứng thú với việc giao tiếp và hoạt động xã hội. Những biểu hiện này thường đi kèm với rối loạn giấc ngủ và thay đổi nhịp sinh học [59]. Đây cũng là một trong những tiêu chí quan trọng để chẩn đoán hội chứng rối loạn tự kỷ. 1.1.2. Nguyên nhân Ngày nay, có nhiều giả thuyết khác nhau về nguyên nhân gây ra hội chứng rối loạn tự kỷ như: cấu tạo não bất thường, thiếu cân bằng về kích thích tố, dị ứng, di truyền, nhiễm độc thuỷ ngân, căn nguyên tâm lý hoặc tổn thương trong khi sinh … Tuy nhiên, các nhà khoa học hiện đang quan tâm đến yếu tố về gen và di truyền. Yếu tố này chiếm khoảng 10-20% số ca bệnh và đóng vai trò quan trọng trong sinh bệnh học của rối loạn tự kỷ với nhiều hướng tiếp cận khác nhau như xác định số bản copy của biến thể di truyền, xác định đột biến đơn gen, phân tích đa hình thái đơn nucleotid và mối liên quan của gen trong toàn bộ genome [8]. Kết quả của nghiên cứu giải trình tự toàn bộ genome (whole-genome sequencing) và phân tích toàn bộ vùng mã hoá (whole-exome) đã xác định được nhiều gen có liên quan đến hội chứng rối loạn tự kỷ [34], [54], [66], [82]. Những gen này có chức năng và vai trò quan trọng trong nhiều quá trình như: phiên mã và tái cấu trúc sợi 4
  14. Luận văn thạc sĩ khoa học Trần Quốc Đạt – K26 Sinh học thực nghiệm nhiễm sắc, tổng hợp và phân giải protein, cấu tạo và nâng đỡ bộ khung xương tế bào, và hình thành các synap thần kinh [78]. Bên cạnh đó, còn có các gen mã hoá cho protein tham gia vào quá trình tổng hợp và phân giải protein như mTOR, UBE3A, PAM. Việc thay đổi trong cách sắp xếp của các protein cấu tạo nên khung xương tế bào cũng là một trong những nguyên nhân được nhắc đến trong cơ chế sinh bệnh học của hội chứng này. Quá trình định vị các protein ở đúng vị trí của nó có vai trò trong việc tạo liên kết và sự kết dính giữa các tế bào, thụ thể trên bề mặt tế bào và là kênh dẫn truyền tín hiệu giữa các synap thần kinh. Các gen liên quan đến quá trình này bao gồm SHANK, NBEA, ANK3 [10], [53], [85]. Biến đổi di truyền ngoại gen cũng được đề cập đến là một trong những yếu tố có liên quan đến hội chứng rối loạn tự kỷ [24], [67]. Những thay đổi này ảnh hưởng đến quá trình và mức độ biểu hiện gen, thay vì ảnh hưởng trực tiếp lên chính trình tự DNA. Trong đó, methyl hoá DNA là một ví dụ điển hình nhất trong việc tái cấu trúc sợi nhiễm sắc và bất hoạt quá trình phiên mã. Một số biến đổi được chứng minh gần đây nhất như sự methyl hoá dưới mức của gen PRRT1, hay sự methyl hoá quá mức của gen FAM181A, CHFR. Đột biến trên gen POGZ – mã hoá cho protein tham gia quy định cấu trúc dị nhiễm sắc, hay đột biến gen mã hoá cho protein H3K9 tham gia vào quá trình methyl hoá histon H3 đã được xác định là có liên quan đến rối loạn tự kỷ [10], [25], [40]. Yếu tố môi trường cũng được xem là tác nhân thúc đẩy sự biểu hiện của biến đổi di truyền ngoại gen, gây nên hội chứng rối loạn tự kỷ tạm thời [74]. Ở mức độ di truyền học, nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng, ở các cặp sinh đôi cùng trứng, nếu một trong hai trẻ mắc tự kỷ thì nguy cơ mắc bệnh ở trẻ còn lại là 36%- 95%. Tỷ lệ này ở các cặp trẻ không sinh đôi cùng trứng chỉ là 0-30% [28]. Anh chị em ruột của những trẻ tự kỷ cũng có 2-8% nguy cơ mắc bệnh, con số này tăng lên 12%- 20% nếu những đứa trẻ đó có dấu hiệu của hai trong ba yếu tố chẩn đoán cốt lõi. Bệnh có xu hướng biểu hiện rõ nét hơn ở những bệnh nhân có bất thường mức độ nhiễm sắc thể. Khoảng 10% trẻ mắc hội chứng rối loạn tự kỷ có kèm theo hội chứng Down hoặc hội chứng nhiễm sắc thể X dễ gãy [21]. Cha mẹ có tiền sử rối loạn tâm thần, tâm thần phân liệt hoặc rối loạn cảm xúc cũng có nguy cơ sinh con mắc bệnh [36]. Ngoài ra, tuổi của cha mẹ cũng có thể trở thành yếu tố nguy cơ. Trẻ được sinh ra từ cha mẹ lớn tuổi có nguy cơ mắc bệnh cao 5
  15. Luận văn thạc sĩ khoa học Trần Quốc Đạt – K26 Sinh học thực nghiệm hơn [22]. Trẻ sinh thiếu tháng (dưới 33 tuần tuổi) hoặc thiếu cân (dưới 2,5kg) cũng có nguy cơ mắc bệnh cao gấp hai lần trẻ bình thường. Những thai nhi bị phơi nhiễm với thuốc trừ sâu như chlorpyrifos có liên quan đến sự giảm trọng lượng và chiều dài cơ thể đồng thời có nguy cơ chậm phát triển tâm lý và mắc hội chứng rối loạn tự kỷ cao hơn [41], [61]. Nhiều nghiên cứu dịch tễ học gần đây cũng chỉ ra rằng, phụ nữ mang thai (đặc biệt trong tuần đầu hoặc tuần thứ 2 của thai kỳ) bị nhiễm virus hoặc vi khuẩn sẽ thúc đẩy việc kích hoạt hệ miễn dịch và có nguy cơ sinh con mắc các bệnh lý rối loạn phát triển thần kinh cao hơn 13% so với trường hợp không bị nhiễm [55]. Quá trình kích hoạt hệ miễn dịch này ở thai phụ có liên quan đến sự tăng tiết cytokines tại các vị trí viêm thần kinh và xuất hiện những bất thường trong biểu hiện protein ở vùng synap. Điều này là cơ sở của sinh bệnh học rối loạn tự kỷ. 1.1.3. Điều trị Hiện nay, việc điều trị rối loạn tử kỷ bao gồm 2 hướng: dùng thuốc và không dùng thuốc. Các phương pháp điều trị bằng thuốc chủ yếu sử dụng các nhóm thuốc có tác dụng kích thích thần kinh, chống loạn thần không điển hình, thuốc chống trầm cảm, thuốc đối kháng thụ thể alpha-adregenic và N-methyl-D-aspartate (NMDA), thuốc ức chế cholinesterase, thuốc chống động kinh [4]. Các loại thuốc này nằm trong nhóm được sử dụng phổ biến để điều trị các bệnh lý thần kinh. Tuy nhiên, tính an toàn, hiệu quả và khả năng dung nạp của chúng đối với trẻ tự kỷ cần được kiểm chứng thêm bằng các nghiên cứu và thử nghiệm lâm sàng, chưa kể tới việc những thuốc này chỉ có khả năng cải thiện một số triệu chứng cơ bản. Với hướng điều trị không sử dụng thuốc bao gồm các phương pháp điều trị bổ trợ và điều trị thay thế [12]. Phương pháp này dựa trên cơ sở phối hợp các giác quan, yoga, châm cứu và sử dụng phương pháp trị liệu bằng âm nhạc, trị liệu hành vi. Bên cạnh đó, việc bổ sung các hormone như oxytocine, vasopressin hay omega-3, vitamin và các dược chất có nguồn gốc thiên nhiên, hay việc bổ sung dinh dưỡng vào chế độ ăn uống cũng là một trong những cách thức hỗ trợ điều trị bệnh [12], [46]. Tại Việt Nam, các nghiên cứu về rối loạn tự kỷ chủ yếu tập trung vào dịch tễ học, xã hội học và tâm lý học, chú trọng vào phương pháp giúp trẻ tự kỷ hoà nhập cộng đồng, phục hồi chức năng và giảm thiểu các tổn thương não [1], [3]. Trong khi 6
  16. Luận văn thạc sĩ khoa học Trần Quốc Đạt – K26 Sinh học thực nghiệm đó, các nghiên cứu về cơ chế phân tử, sinh bệnh học còn rất hạn chế. Đặc biệt, chưa có nghiên cứu nào xây dựng được mô hình động vật thực nghiệm cho bệnh tự kỷ, phục vụ nghiên cứu ở mức độ in-vivo. 1.2. Tổng quan về ruồi giấm Ruồi giấm (tên khoa học là Drosophila melanogaster) là sinh vật được sử dụng trong lĩnh vực di truyền học với lịch sử nghiên cứu hơn 100 năm. Nó được nhà di truyền học người Mỹ T.H. Morgan sử dụng trong nghiên cứu của mình từ những năm đầu thế kỷ XX. Ngày nay, ruồi giấm là loài được sử dụng phổ biến trong các phòng thí nghiệm di truyền. Nó được coi là sinh vật mô hình có khả năng ứng dụng rộng rãi nhất trong việc tìm hiểu cơ chế gây bệnh ở mức độ phân tử, hay các vấn đề của sinh học cơ bản từ sinh lý cho đến thần kinh, chuyển hoá. Ruồi giấm được coi là mô hình tuyệt vời để thiết lập trong phòng thí nghiệm với các đặc tính và ưu điểm sau: — Hệ gen đơn giản và đã được lập bản đồ chi tiết, dễ dàng so sánh, tra cứu các gen có chức năng tương đồng với người — Có khoảng 70% gen gây bệnh tương đồng với người — Ít hạn chế về mặt pháp lý và vấn đề đạo đức với các thử nghiệm — Dễ tạo dòng, chuyển gen, biểu hiện protein ngoại lai — Có vòng đời ngắn (khoảng 30 ngày) (Hình 2), đây là lợi thế cho các nghiên cứu giải mã quy trình sinh học phức tạp như lão hoá, bệnh liên quan đến các thế hệ, phả hệ — Ruồi giấm chỉ có 4 cặp nhiễm sắc thể, do vậy việc thao tác, phân tích, sàng lọc di truyền trở nên dễ dàng — Tuy chúng có một cơ thể nhỏ bé nhưng cấu trúc cơ thể lại hoàn chỉnh, tạo lợi thế trong nghiên cứu về chuyển hoá và dinh dưỡng — Hiểu rõ được quá trình phát triển từ phôi đến ấu trùng. Do đó có lợi thế trong nghiên cứu tế bào gốc và ung thư — Chi phí thấp, dễ nuôi trong phòng thí nghiệm dễ tạo ra quần thể lớn, có tiềm năng trong sàng lọc dược chất và thuốc. 7
  17. Luận văn thạc sĩ khoa học Trần Quốc Đạt – K26 Sinh học thực nghiệm Hình 1. Hoạt động lưu trữ và thao tác trên ruồi giấm trong thực nghiệm [60]. (A)Tủ lưu giữ, (B) Ống nghiệm nuôi ruồi, (C) Chọn cá thể, (D, E) Dùng CO2 làm ruồi ngủ. Hiện nay trên thế giới có nhiều trung tâm bảo tồn các dòng ruồi biến đổi gen dành cho nghiên cứu, trong đó phải kể đến các trung tâm lớn nhất bao gồm trung tâm Bloomington, Indiana, Mỹ; DGRC của Học viện Kỹ thuật Kyoto, Nhật Bản; NIG-FLY thuộc viện di truyền quốc gia Nhật Bản; DSSC ở đại học California, Hoa Kỳ; VDRC của Viena, Australia; TRiP thuộc trường Y của Đại học Harvad, Hoa Kỳ….Tại các trung tâm này, rất nhiều các dòng ruồi đã được biến đổi gen, chúng được tạo mã và kèm theo là các thông số biến đổi di truyền. Các phòng thí nghiệm có thể nhận được dòng ruồi biến đổi gen mà họ quan tâm từ các trung tâm này với kinh phí rất nhỏ. Ngược lại, bất kỳ các nghiên cứu nào tạo ra các nguồn gen mới đều có thể gửi tới các trung tâm này để duy trì và cung cấp cho các nhà nghiên cứu khác trên thế giới. Các trung tâm này là nơi cung cấp nguồn ruồi chuyển gen và cũng là nơi trao đổi với các nhà khoa học để tạo thêm nhiều dòng ruồi nghiên cứu khác nhau. Nếu ở người, toàn bộ thông tin chi tiết về hệ gen đều có thể tìm thấy ở cơ sở dữ liệu thuộc Trung tâm thông tin Công nghệ sinh học Quốc Gia Hoa Kỳ NCBI [86] thì đối với ruồi giấm cũng có một cơ sở dữ liệu Flybase phục vụ việc tra cứu thông tin di truyền [87]. Điều này giúp các nhà nghiên cứu dễ dàng trao đổi, tìm hiểu thông tin và theo đuổi các nghiên cứu dựa trên cơ sở dữ liệu khoa học đã công bố. 1.2.1. Chu kỳ vòng đời Chu kỳ phát triển của ruồi giấm trải qua 4 giai đoạn: Trứng, ấu trùng, nhộng và ruồi trưởng thành. Ruồi cái dài khoảng 3mm và đẻ khoảng 750- 1500 trứng trong suốt vòng đời. Trứng sau khi được thụ tinh sẽ phát triển thành phôi trong vòng 24 giờ. Các phôi sẽ trải qua liên tiếp các thay đổi để trở thành ấu trùng bậc một, bậc hai và bậc ba 8
  18. Luận văn thạc sĩ khoa học Trần Quốc Đạt – K26 Sinh học thực nghiệm (tương ứng với một, hai và ba ngày tuổi). Giai đoạn ấu trùng được đặc trưng bởi sự tiêu thụ thức ăn trong khoảng 5 ngày trước khi phát triển thành nhộng. Sau khoảng 4 ngày nhộng sẽ lột xác phát triển thành ruồi trưởng thành. Do vậy, chỉ mất khoảng 10 ngày để thu được ruồi trưởng thành từ phôi ở nhiệt độ 25 ℃ [57]. Tuổi thọ trung bình của ruồi giấm khi nuôi ở điều kiện nhiệt độ 29 ℃ là khoảng 30-40 ngày. Thụ tinh Ruồi giấm trưởng thành Phôi Nhộng 3,5-4,5 ngày ở 1 ngày giai đoạn nhộng Ấu trùng ngày 1 2,5-3 ngày Vòng đời của ruồi giấm 1 ngày Ấu trùng 1 ngày Ấu trùng ngày 3 ngày 2 Hình 2: Chu kỳ vòng đời của ruồi giấm. Trứng sau thụ tinh sẽ trải qua các giai đoạn ấu trùng ngày 1, ngày 2 và ngày 3, sau đó phát triển thành giai đoạn nhộng sau khoảng 2,5 đến 3 ngày rồi nở thành ruồi trưởng thành sau khoảng 3,5 đến 4,5 ngày. Ruồi trưởng thành có thời gian sống khoảng 50-60 ngày [57]. 1.2.2. Hệ gen của ruồi giấm Hệ gen ruồi giấm chứa khoảng 132 triệu cặp base gồm 15500 gen nằm trên 4 cặp nhiễm sắc thể, trong đó có 3 cặp nhiễm sắc thể thường và 1 cặp nhiễm sắc thể giới tính (XX, XY) [57]. Do cặp nhiễm sắc thể thứ 4 rất nhỏ và chứa ít gen nên thường được bỏ qua, và chỉ tập trung vào ba cặp nhiễm sắc thể còn lại. Theo đó, quy cách viết kiểu gen của ruồi giấm cũng sẽ chỉ biểu thị ba cặp nhiễm sắc thể theo thứ tự: nhiễm sắc thể giới tính; nhiễm sắc thể số 2; nhiễm sắc thể số 3. Các nhiễm sắc thể ngăn cách nhau bởi dấu “;”. Các allen tương đồng được phân cách bằng một 9
  19. Luận văn thạc sĩ khoa học Trần Quốc Đạt – K26 Sinh học thực nghiệm đường gạch ngang. Ví dụ như: ruồi đực mang gen vestigial ở dạng dị hợp tử biểu # &' ( hiện kiểu hình cánh ngắn sẽ có kiểu gen ; ; . $ ( ( NST số 1 NST số 2 Hình 3 : Quy tắc kí hiệu kiểu gen của ruồi giấm và ứng dụng trong viết phép lai di truyền. P: thế hệ bố mẹ; F1: thế hệ con lai; w: gen white quy định kiểu hình mắt trắng; vg: gen vestigial quy định kiểu hình cánh ngắn; B: gen Bar quy định giảm kích thước mắt; “+”: gen kiểu dại (wildtype) [62]. Bằng cách so sánh hệ gen của người và ruồi giấm, các nhà nghiên cứu có thể hiểu rõ hơn về cấu trúc, chức năng các gen trên người. Ngoài ra, việc so sánh cũng cung cấp bằng chứng cho nghiên cứu di truyền tiến hóa giữa các sinh vật. Với việc hiểu rõ về cấu trúc bộ gen, các thao tác di truyền cũng dễ dàng được thực hiện như: - Đưa một gen gây bệnh vào bộ gen của ruồi giấm, biểu hiện và nghiên cứu chức năng của nó - Loại bỏ một gen ra khỏi bộ gen của ruồi, từ đó xem xét vai trò của gen này như thế nào, gây bệnh gì, ảnh hưởng đến sự phát triển ra sao - Hoặc đồng thời bất hoạt 1 gen và biểu hiện một gen khác có chức năng thay thế nhằm chứng minh vai trò và chức năng của các gen đó - Dễ dàng gây đột biến…. - Đa phần các dòng ruồi chuyển gen đều có thể lưu trữ trong ống nghiệm cho các mục đích ứng dụng lâu dài. 10
  20. Luận văn thạc sĩ khoa học Trần Quốc Đạt – K26 Sinh học thực nghiệm Tuy ruồi giấm chỉ là một côn trùng nhỏ, nhưng có tổ chức đa bào hoàn chỉnh về mặt cấu trúc, và có sự tương đồng cao về mặt chức năng khi so sánh với các hệ cơ quan của người như hệ thần kinh, hệ vận động (Hình 5). Sự tương đồng thể hiện ở hình thái, cấu trúc cơ thể (Hình 4). Cơ thể của con người và ruồi được chia thành các phân đoạn. Khi quan sát từ bên ngoài, sự phân chia này có thể không rõ ràng. Tuy nhiên, khi quan sát cách sắp xếp các phân đoạn dây thần kinh xuất phát từ tuỷ sống của con người (một cặp trên mỗi phân đoạn) hoặc xem các đốt sống trong xương sống của người như một phân đoạn, có thể thấy sự phân chia rõ ràng trong từng phần của cơ thể. Các phân đoạn này được tổ chức thành các đơn vị cấu trúc lớn hơn. Ở người và ruồi, có thể phân biệt được đầu, ngực và bụng. Mặc dù phần phụ của hai loài khác nhau (2 cánh tay và 2 chân so với 6 chân và 2 cánh) nhưng chúng có chung nguyên tắc là nằm ở những vị trí nhất định và gắn với các phân đoạn cơ thể cụ thể. Xét riêng trên hệ thần kinh, ở người và ruồi đều tồn tại hệ thống thần kinh trung ương (central nervous system) ở phần đầu và thần kinh tuỷ sống ở phần thân. Cùng là đơn vị chức năng nhỏ nhất, các tế bào thần kinh có chung hệ thống gen/protein chức năng và cấu trúc bởi các synap. Cả hai loài đều có sự phân chia các vùng chức năng ở não tương tự nhau như vùng thị giác, vùng khứu giác, vùng tiếp nhận-xử lý-lưu trữ thông tin và vùng vận động [60]. Hình 4. Chức năng của các cơ quan có sự tương đồng giữa người và ruồi giấm. Sự tương đồng thể hiện ở cách sắp xếp từng phần của cơ thể, cách phân chia hệ thống thần kinh, chức năng từng cơ quan trong hệ vận động [60]. 11
ADSENSE

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

TL.01: Bộ Tiểu Luận Triết Học
207 tài liệu
1474 lượt tải
THÔNG TIN
TRỢ GIÚP
HỖ TRỢ KHÁCH HÀNG
Theo dõi chúng tôi

Chịu trách nhiệm nội dung:

Nguyễn Công Hà - Giám đốc Công ty TNHH TÀI LIỆU TRỰC TUYẾN VI NA

LIÊN HỆ

Địa chỉ: P402, 54A Nơ Trang Long, Phường 14, Q.Bình Thạnh, TP.HCM

Hotline: 093 303 0098

Email: support@tailieu.vn

Giấy phép Mạng Xã Hội số: 670/GP-BTTTT cấp ngày 30/11/2015 Copyright © 2022-2032 TaiLieu.VN. All rights reserved.

 

Đồng bộ tài khoản
6=>0