Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu xác định oxalate trong mẫu thực phẩm bằng phương pháp điện di mao quản sử dụng detector đo độ dẫn không tiếp xúc

Chia sẻ: Na Na | Ngày: | Loại File: DOCX | Số trang:64

Thêm vào BST

Báo xấu

101
lượt xem 12
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Trong nghiên cứu này, với mục tiêu xây dựng một phương pháp phân tích nhanh, hiệu quả, đơn giản với chi phí thấp, hướng tới nhu cầu phân tích ở tuyến địa phương, luận văn đã xây dựng, phát triển quy trình phân tích đồng thời các chất oxalate, tartrate, citrate trong thực phẩm bằng phương pháp điện di mao quản sử dụng detector độ dẫn không tiếp xúc kết nối kiểu tụ điện (CE-C4D) trên cơ sở hệ thiết bị tự chế, bán tự động.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu xác định oxalate trong mẫu thực phẩm bằng phương pháp điện di mao quản sử dụng detector đo độ dẫn không tiếp xúc

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN -------------- TRẦN ĐĂNG TUẤN NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH OXALAT TRONG MẪU THỰC PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI MAO QUẢN SỬ DỤNG DETECTOR ĐO ĐỘ DẪN KHÔNG TIẾP XÚC LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
Hà Nội – 2015 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN -------------- TRẦN ĐĂNG TUẤN NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH OXALAT TRONG MẪU THỰC PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI MAO QUẢN SỬ DỤNG DETECTOR ĐO ĐỘ DẪN KHÔNG TIẾP XÚC Chuyên ngành: Hóa phân tích Mã số: 60440118 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. NGUY ỄN TH Ị ÁNH HƯỜNG
Hà Nội – 2015 LỜI CẢM ƠN Sau một thời gian nghiên cứu và học tập tôi đã hoàn thành luận văn cao học của mình với đề tài: “Nghiên cứu xác định oxalate trong mẫu thực phẩm bằng phương pháp điện di mao quản sử dụng detector đo độ dẫn không tiếp xúc” dưới sự hướng dẫn của TS. Nguyễn Thị Ánh Hường và các thầy cô, anh chị, các bạn trong bộ môn Hóa phân tích. Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tôi xin chân thành cảm ơn TS. Nguyễn Thị Ánh Hường người đã giao đề tài và tận tình chỉ dẫn tôi trong quá trình hoàn thành luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn Công ty 3Sanalysis và đối tác tại Khoa Hóa học, Trường Đại học Basel, Thụy sĩ đã thiết kế lắp đặt và hỗ trợ các trang thiết bị cũng như tư vấn kỹ thuật trong quá trình thực hiện nghiên cứu này. Tôi xin chân thành cảm ơn các Thầy cô trong Bộ môn Hóa Phân tích nói riêng và trong khoa Hóa học nói chung đã dạy dỗ, chỉ bảo và động viên tôi trong thời gian học tập tại trường Đại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội. Tôi xin cảm ơn sinh viên Nguyễn Thị Minh Hòa, lớp k57T Tài năng Hóa, sinh viên Nguyễn Thị Liên, lớp K56A Hóa học đã hỗ trợ tôi trong quá trình nghiên cứu. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn gia đình, các bạn học viên và sinh viên bộ môn Hóa phân tích đã giúp đỡ tôi trong thời gian học tập và nghiên cứu này. Hà Nội, ngày 24 tháng 10 năm 2015 Học viên Trần Đăng Tuấn
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC HÌNH Tên viết tắt Tên đầy đủ Ace Acetic Arg L arginine C4 D Detector đo độ dẫn kết nối kiểu tụ điện CE Phương pháp điện di mao quản CHES Axit 2(cyclohexylamino) ethanesunlfomic CTAB Cetyl trimethyl amonium bromide EOF Dòng điện di thẩm thấu GC Sắc ký khí His Histidine HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao Leff Chiều dài hiệu dụng của mao quản Ltot Tổng chiều dài mao quản LOD Giới hạn phát hiện LOQ Giới hạn định lượng MeOH Methanol MEKC Điện di mao quản điện động học Mixen MES axit 2(Nmorphonlino)ethane sulfonic PGTP Phụ gia thực phẩm %RSD % độ lệch chuẩn tương đối SD Độ lệch chuẩn UPLC Sắc ký lỏng siêu hiệu năng TAPS Axit N [tris(hydroxylmetyl)metyl]3 aminopropansunphonic
MỞ ĐẦU Hiện nay, tình hình an toàn vệ sinh thực phẩm ở nước ta đang rất được quan tâm, với nhiều vụ ngộ độc tập thể xảy ra hàng loạt và ở nhiều khu vực khác nhau. Có nhiều nguyên nhân dẫn đến mất an toàn thực phẩm, trong đó có nguyên nhân xuất phát từ việc sử dụng các chất phụ gia thực phẩm. Gần đây, dư luận đặc biệt quan tâm đến sự xuất hiện của oxalate trong một số sản phẩm thực phẩm như bia, mỳ tôm,…gây ảnh hưởng xấu tới sức khỏe người sử dụng. Theo các nghiên cứu, oxalate là một trong những tác nhân chính gây nên bệnh sỏi thận [12, 23] do tạo kết tủa với các ion kim loại như magie, canxi… (kết tủa này chiếm tới 80% về khối lượng của sỏi thận). Cùng với oxalate, axit tương ứng của tartrate, citrate là những chất phụ gia thực phẩm thường xuất hiện đồng thời trong nhiều loại thực phẩm. Sự xuất hiện của citrate đồng thời với oxalate sẽ làm giảm nguy cơ hình thành sỏi thận do citrate có khả năng ức chế quá trình kết tinh hình thành canxi oxlate [13]. Vì vậy, ngoài việc phân tích, kiểm tra hàm lượng oxalate, quy trình sẽ kết hợp phân tích, kiểm tra xác định đồng thời hàm lượng của tartrate và citrate trong mẫu thực phẩm. Có nhiều phương pháp khác nhau để xác định hàm lượng các chất oxalate, tartrate, citrate như: sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC), phương pháp sắc ký khối phổ (GCMS), sắc ký ion [13, 15],....Các phương pháp này thường chỉ được trang bị ở các phòng thí nghiệm hiện đại với chi phí khá lớn và yêu cầu đội ngũ kỹ thuật cao. Trong nghiên cứu này, với mục tiêu xây dựng một phương pháp phân tích nhanh, hiệu quả, đơn giản với chi phí thấp, hướng tới nhu cầu phân tích ở tuyến địa phương, chúng tôi đã xây dựng, phát triển quy trình phân tích đồng thời các chất oxalate, tartrate, citrate trong thực phẩm bằng phương pháp điện di mao 6
quản sử dụng detector độ dẫn không tiếp xúc kết nối kiểu tụ điện (CEC4D) trên cơ sở hệ thiết bị tự chế, bán tự động. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Giới thiệu chung về các chất phụ gia thực phẩm 1.1.1. Giới thiệu chung về phụ gia thực phẩm Chất phụ gia thực phẩm là những chất không được coi là thực phẩm hoặc một thành phần của thực phẩm; Ít hoặc không có giá trị dinh dưỡng; Bổ sung vì mục đích công nghệ trong quá trình sản xuất, chế biến… [3]. Như vậy, PGTP không phải là thực phẩm mà nó được thêm vào nhằm đáp ứng yêu cầu nhất định của sản phẩm. Việc sử dụng PGTP phải tuân theo quy định hiện hành của các cơ quan chức năng, ở Việt Nam là Bộ Y tế. 1.1.2. Phân loại phụ gia thực phẩm Tùy vào từng cơ sở mà có nhiều cách phân loại phụ gia thực phẩm khác nhau như: 1.1.2.1. Phân loại theonguồn gốc Dạng tự nhiên: có nguồn gốc động vật và thực vật Dạng tổng hợp: Do con người tạo ra 1.1.2.2. Phân loại theo tác dụng Tác dụng trực tiếp: Bao gồm các chất có tác dụng bảo quản (như chống lại quá trình oxy hóa, chống tác hại của vi sinh vật, côn trùng, ký sinh gây hại…) và tác dụng cảm quan (như tạo màu, tạo mùi, tăng thêm hương vị tăng thêm vị ngọt, vị mặn, làm giảm bớt vị đắng, tạo vị chua…) Tác dụng gián tiếp: Bao gồm các loại axit, kiềm, dung môi chiết xuất, các chất làm trong, làm lắng cặn, chất chống đông đặc, các chất trao đổi ion, chất men sinh học, các chất chống tạo bọt... [2] 7
Ngoài ra còn nhiều cách phân loại khác như phân loại theo sức khỏe người sử dụng, phân loại theo chức năng, phân loại theo nhóm chất… 1.1.3. Lợi ích và tác hại của phụ gia thực phẩm Nếu sử dụng đúng loại, đúng liều lượng, các phụ gia thực phẩm có tác dụng tích cực, như: tạo được nhiều sản phẩm phù hợp với sở thích và khẩu vị của người tiêu dùng, giữ được chất lượng toàn vẹn của thực phẩm cho tới khi sử dụng, tạo sự dễ dàng trong sản xuất, chế biến thực phẩm và làm tăng giá trị thương phẩm hấp dẫn trên thị trường, kéo dài thời gian sử dụng của thực phẩm, …. Tuy nhiên, khi sử dụng phụ gia thực phẩm không đúng liều lượng, chủng loại nhất là những phụ gia không cho phép dùng trong thực phẩm sẽ gây những tác hại cho sức khỏe như: Gây ngộ độc cấp tính nếu dùng quá liều cho phép. Gây ngộ độc mạn tính dù dùng liều lượng nhỏ, thường xuyên, liên tục, một số chất phụ gia thực phẩm tích lũy trong cơ thể, gây tổn thương lâu dài. Nguy cơ gây hình thành khối u, ung thư, đột biến gen, quái thai, nhất là các chất phụ gia tổng hợp. Nguy cơ ảnh hưởng tới chất lượng thực phẩm như phá huỷ các chất dinh dưỡng, vitamin...[4]. Vì vậy, Khi sử dụng chất PGTP phải tuân thủ các quy định sử dụng dựa trên các tiêu chuẩn cụ thể theo ISO (International Standard Organization) và Hội đồng tiêu chuẩn thực phẩm CAC (Codex Alimentarius Commision) gồm h ơn 130 nước thành viên, trong đó có Việt Nam. Mỗi quốc gia sẽ qui định cụ thể về các chất PGTP được dùng cho nước mình. Tóm lại, ở Việt Nam, các chất PGTP phải nằm trong danh mục cho phép sử dụng và đảm bảo các yêu cầu về kĩ thuật, hàm lượng và vệ sinh an toàn thực phẩm theo quy định do Bộ Y tế ban hành. 1.2. Thông tin chung về oxalate, tartrate và citrate 8
Các chất oxalic, tartric và citric là một trong số các chất phụ gia thực phẩm nằm trong danh mục được phép sử dụng ở Việt Nam với hàm lượng nhất định. Bảng 1.1. Thông tin chung về 3 hợp chất oxalic, tartaric và citric Tên chất Axit oxalic Axit tartaric Axit citric Danh pháp Axit etanedioic Axit 2,3 Axit 2 (IUPAC) dihidroxibutandioic hydroxypropan 1,2,3tricacboxylic Công thức C2H2O4 (khan) C4H6O6 C6H8O7 phân tử C2H2O4.2H2O(ngậ m nước) Công thức cấu tạo Khối lượng 90,03 (khan) 150,087 192,123 phântử (g/mol) 126,07 g/mol(khan) (ngậm nước) pKa(1;2;…) 1,23; 4,19 3,04; 4,37 3,15; 4,77; 6,40 Độ tan trong 0,143 1,33 1,33 nước (L hoặc Dtartaric) (g/ml ở20°C) Nhiệt độ 157 (thăng hoa) 171174 (L hoặc D 153 nóng chảy (oC) tartaric, tinh khiết) 1.3. Ứng dụng và tác hại của các oxalate, tartrate và citrate 1.3.1. Oxalate 9
Ứng dụng  Là chất hỗ trợ chế biến thực phẩm, phụ gia thực phẩm  Axit oxalic được sử dụng trong một số sản phẩm hóa chất dùng trong gia đình, chẳng hạn một số chất tẩy rửa hay trong việc đánh gỉ sét  Dung dịch axit oxalic được dùng để phục chế đồ gỗ  Axit oxalic là một chất được sử dụng trong quá trình nhuộm vải, phân bón..... Tác hại  Ở liều cao, axit oxalic (muối oxalate) có khả năng gây ra ngô đ ̣ ộc câṕ tinh, có th ́ ể dẫn đến tử vong với hàm lượng 45g. Liêu ng ̀ ộ độc (LD50) của axit oxalic nguyên chất được ươć khoảng 378 mg/kg thể trọng (khoảng 22,68 g/người 60 kg).  Sự kêt h ́ ợp cua axit oxalic v ̉ ơi canxi tao ra canxi oxalate, co thê gây k ́ ̣ ́ ̉ ết tủa lăng đong tao thanh soi ́ ̣ ̣ ̀ ̉ ở cac c ́ ơ quan tiêt niêu, gan mât, tuy… [9]. ́ ̣ ̣ ̣ 1.3.2. Tartrate Ứng dụng  Phụ gia thực phẩm (ký hiệu: E334) với tác dụng là chất điều vị, chống oxi hóa  Ứng dụng trong lĩnh vực dược phẩm  Ứng dụng trong công nghiệp và nông nghiệp Tác hại  Khi sử dụng quá mức có thể gây ra nhiều tác dụng phụ khó chịu như: nôn mửa, tiểu chảy và gia tăng khả năng viêm đường tiêu hóa. 1.3.3. Citrate Ứng dụng 10
 Phụ gia thực phẩm (ký hiệu: E330): Điều vị, chống oxi hóa  Giảm tác hại của nước cứng  Sử dụng trong công nghệ sinh học, hoạt hóa một số dung dịch tẩy rửa, … Tác hại Axit citric được hầu hết các quốc gia và tổ chức quốc tế công nhận là an toàn để sử dụng trong thực phẩm. Nó hiện diện tự nhiên trong gần như mọi dạng sự sống, các lượng axit citric dư thừa dễ dàng trao đổi và bài tiết ra khỏi cơ thể. Tuy nhiên, việc tiếp xúc với axit citric khô hay đậm đặc có thể gây ra kích ứng da và mắt, vì thế phải sử dụng các trang bị bảo hộ lao động khi tiếp xúc với axit citric. Việc sử dụng quá nhiều axit citric cũng dễ làm tổn hại men răng. Tiếp xúc gần với mắt có thể gây bỏng và làm mất thị giác. Đôi khi hàm lượng quá cao axit citric có thể gây tổn hại cho tóc, do nó mở lớp cutin của tóc. Nó có thể làm mất các chất cần thiết cho tóc và làm tóc bị bạc màu. 1.4. Vấn đề sử dụng oxalate, tartrate và citrate trên thế giới và ở Việt Nam 1.4.1. Vấn đề sử dụng oxalate, tartrate và citrate trên thế giới Vấn đề sử dụng oxalate trên thế giới Hiện tại, Ủy ban chuyên gia của FAO/WHO về phụ gia thực phẩm (JECFA) chưa có nghiên cứu toàn diện về ảnh hưởng của axit oxalic cũng như muối oxalate trong thực phẩm đối với sức khỏe con người và vẫn đưa axit oxalic vào danh mục các chất hỗ trợ chế biến trong thực phẩm. Trên cơ sở danh mục của Codex, một số các quốc gia trên thê gi ́ ới như Nhật Bản, Hàn Quốc… Vấn đề sử dụng tartrate và citrate trên thế giới Tartrate và citrate được sử dụng nhiều trong quá trình chế biến nhiều loại thực phẩm, nước giải khát… Với vai trò là một chất điều vị, 11
chống oxi hóa... Các chất này được các quốc gia và tổ chức quốc tế cho phép sử dụng với vai trò là chất phụ gia thực phẩm. 1.4.2. Vấn đề sử dụng oxalate ở Việt Nam Vấn đề sử dụng oxalate ở Việt Nam Việt Nam đã quy định cho phép sử dụng axit oxalic như một chất hỗ trợ chế biến. Theo Luật an toàn thực phẩm và Danh mục chất hỗ trợ chế biến thực phẩm ban hành kèm theo Quyết định số 46/2007/QĐBYT ngày 19/12/2007 của Bộ trưởng Bộ Y tế quy định giới hạn tối đa ô nhiễm sinh học và hóa học trong thực phẩm, axit oxalic sử dụng trong thực phẩm phải đảm bảo độ tinh khiết, đảm bảo an toàn thực phẩm, không chứa các chất độc hại ảnh hưởng đến sức khỏe và đáp ứng các yêu cầu đối với chất hỗ trợ chế biến, phụ gia sử dụng trong chế biến thực phẩm: ̉ ̉ (1) San phâm phải được công bố hợp quy hoặc công bố phù hợp quy định về an toàn thực phẩm với cơ quan quản lý nhà nước có thẩm quyền. ̉ ̉ (2) San phâm phải có nguồn gốc xuất xứ rõ ràng, còn hạn sử dụng. (3) Sử dung ch ̣ ất hỗ trợ chế biến, phụ gia thực phẩm phai theo ̉ đung ́ hương dân cua nha san xuât (đúng danh m ́ ̃ ̉ ̀ ̉ ́ ục, đúng liêu l ̀ ượng, đúng đối tượng thực phẩm…). Kết quả giám sát đến ngày 19/12/2013 của Cục an toàn thực phẩm cho thấy 22,05% mẫu thực phẩm được kiểm tra có chứa axit oxalic, hàm lượng dao động từ 10,7 đến 1809 mg/kg. Chủ yếu phát hiện trong các sản phẩm rau quả tươi, bột mỳ và một số sản phẩm chế biến từ bột mỳ (mỳ gói, mỳ sợi). Trong đó hàm lượng axit oxalic trong các loại mỳ gói từ 31,9 đến 177 mg/kg. Trong một số mẫu rau củ quả tươi cũng chứa axit oxalic với hàm lượng dao động từ 10,7 1809 mg/kg tùy theo chủng loại. 12
Từ các thông tin trên, có thể thấy rằng axit oxalic (muối oxalate) tồn tại sẵn có trong một số loại thực phẩm, khó khăn để phân biệt giữa axit oxalic tồn tại tự nhiên với axit oxalic chủ động cho vào thực phẩm. Do vậy, đê bao đam an ̉ ̉ ̉ ̀ ực phâm cho ng toan th ̉ ười sử dụng, cần có cac bi ́ ện pháp để kiểm soát. Vấn đề sử dụng tartrate và citrate ở Việt Nam Cũng như hầu hết các quốc gia và tổ chức quốc tế, Việt Nam cho phép sử dụng tartrate và citrate với vai trò là chất phụ gia thực phẩm. Các chất này thường được sử dụng để điều vị và chống oxi hóa thực phẩm. 1.5. Các phương pháp xác định oxalate, tartrate và citrate 1.5.1. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Sắc ký lỏng hiệu năng cao là một phương pháp chia tách trong đó pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một chất mang đã được biến đổi bằng liên kết hoá học với các nhóm chức hữu cơ. Quá trình sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi Ion hay phân loại theo kích cỡ (Rây phân tử). Phương pháp này ra đời từ năm 19671968 trên cơ sở phát triển và cải tiến từ phương pháp sắc ký cột cổ điển. Hiện nay, phương pháp HPLC ngày càng phát triển và hiện đại hoá cao nhờ sự phát triển nhanh chóng của ngành chế tạo máy phân tích. Hiện nay nó áp dụng trong nhiều lĩnh vực, xác định nhiều loại chất khác nhau trong đó nhiều tác giả đã dùng phương pháp này để xác định oxalate, tartrate và citrate. Trong công trình nghiên cứu của Muhammad Iqbal Bhanger và các cộng sự [13] đã sử dụng phương pháp HPLC để xác định đồng thời axit oxalic và axit citric trong nước tiểu để giám sát nồng độ của axit oxalic và axit citric trong quá 13
trình hình thành sỏi thận. Pha động trong phương pháp gồm KH 2PO4 (25%) và (C4H9)4NHSO4 (2,5 mmol) ở pH 2,0. Hiệu suất thu hồi cho axit oxalic và axit citric tương ứng là 97% và 102%. Bằng cách sử dụng phương pháp HPLC, Ruben RellanAlvarez [19] đã xác định đồng thời 10 axit hữu cơ có phân tử lượng thấp trong đó có axit oxalic với giới hạn phát hiện 255pmol, P
Sắc ký lỏng khối phổ là sự ghép nối giữa sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector khối phổ. Sau khi ra khỏi cột sắc ký dung dịch được hóa hơi và bị ion hóa thành các mảnh ion mang điện tích. Sau đó, các ion này được đưa sang bộ phận phân tích khối lượng để định tính và được định lượng. B.G. Wolthers và các cộng sự [7] đã xác định oxalate bằng một số phương pháp khác nhau như IDMS, HPLC, GC cho thấy có thể sử dụng phương pháp GCMS với độ chính xác và lặp lại cao như là một phương pháp tiêu chuẩn để đánh giá các phương pháp hiện có và mới phát triển. Phương pháp sắc ký khối phổ đã được J. G. March và các cộng sự sử dụng để xác định hàm lượng oxalate trong sỏi thận. Các bước tiến hành là: hòa tan của oxalate trong sỏi thận bằng HCl, loại bỏ các cation bằng cách sử dụng nhựa trao đổi cation, bốc hơi nước, pha loãng với ethyl acetate, tạo các este của axit oxalic trimetylsilyl với chlorotrimethylsilane. Với việc xử lý mẫu hích hợp, phương pháp này cũng đã được áp dụng cho mẫu nước tiểu và mẫu thực phẩm. Các kết quả thu được: khoảng tuyến tính là 0,25,0 mg oxalate/l, giới hạn phát hiện 0,06 mg oxalate /l, hệ số biến thiên của phương pháp 1,3%. Hai mươi bảy mẫu sỏi thận đã được phân tích bằng phương pháp này. Kết quả hàm lượng trung bình của axit oxalic trong sỏi axit uric là 0,11 mg/g (SD = 0,08, n = 13). Oxalate được tìm thấy trong sỏi struvite với hàm lượng trung bình là 0,2 mg axit oxalic/g (SD = 0,13, n = 8). Trong sỏi đá hydroxyapatite, hàm lượng oxalate cao nhất, có thể lên đến 0,801 mg axit oxalic/g [24]. 1.5.3. Phương pháp sắc ký ion Sắc ky ion là ky thu ́ ̃ ật tách các cấu tử anion hay cation tư h ̀ ỗn hợp qua cột sắc ky d ́ ựa trên ái lực khác nhau của mỗi ion đối với pha tĩnh va pha đ ̀ ộng. Để cung cấp thông tin cho quá trình chuẩn đoán và điều trị bệnh liên quan đến chuyển hóa oxalate. Bằng cách sử dụng phương pháp sắc ký ion, Hoppe B và 15
các cộng sự [10] đã xác định đồng thời oxalate, citrate và sulfate trong huyết tương của các mẫu được lấy từ 50 trẻ sơ sinh và trẻ em (23 nam, 27 nữ độ tuổi từ 0,2 đến 17 tuổi) với chức năng thận bình thường. Máu được lấy vào ống Li Heparin, đặt trong nước đá. Sau khi lấy, mẫu máu ngay lập tức bảo quản bằng HCl với tỷ lệ 40µM/ml. Mẫu được phân tích bằng hệ thống sắc ký ion với pha động là dung dịch NaOH. Khoảng tuyến tính thu được từ 5mM đến 52,5mM với thời gian phân tích là hơn 21 phút. Kết quả thu được về hàm lượng oxalate là (6,43 +/ 1,06 µmol/L), citrate (79,3 +/ 27,4 µmol/L) và sulfate (235,0 +/ 85,3 µmol/L). Kết quả cũng cho thấy không có sự khác biệt cụ thể về độ tuổi và giới tính. Phương pháp cho độ tin cậy cao và tái lặp tốt (hệ số phương sai 1,95 4,75%). Cũng sử dụng phương pháp sắc ký ion, tác giả Zongbao (Kent) Zhao và các cộng sự [21] đã xác định đồng thời 29 anion gồm có 19 anion của axit hữu cơ (trong đó có oxalate, tartrate, citrate) và 10 anion của axit vô cơ với hiệu xuất thu hồi trong khoảng 88% 105%, RSD
CTAB 0,5mM (pH = 6,25), thế áp vào hai đầu mao quản là 10kV. Kết quả thu được về giới hạn phát hiện và độ lệch chuẩn tương đối tương ứng với oxalate và citrate là: LOD mM (0,71 và 1,26), RSD (5,0% và 3,6%); Ph. Puig và các cộng sự [17] đã xác định thành công đồng thời 11 anion của các axit hữu cơ và vô cơ trong đó có oxalate, tartrate và citrate bằng phương pháp điện di mao quản vùng kết hợp với detector UV với độ lệch chuẩn tương đối (RSD) nhỏ hơn 1%. Giới hạn phát hiện của các ion trong khoảng 0,0061,072 mg/l. Phương pháp có thể dễ dàng áp dụng xác định đồng thời 11 anion trong đó có oxalate, tartrate và citrate trong các mẫu nước giải khát và mẫu thực phẩm với thời gian phân tích ngắn và độ nhạy tốt. Trong nghiên cứu của Michael Trevaskis V. Craige Trenerry [12], việc phân tích được thực hiện bằng cách sử dụng một máy điện di mao quản loại Isco Mode1 3 140 Electropherograph (Isco Inc., Lincoln, NE, USA) hoạt động ở 20 kV và ở 28 °C với mao quản 75 cmx75 id (Polymicro Technologies, Phoenix, AZ, USA) có chiều dài hiệu dụng là 50cm. Chất phân tích được phát hiện bằng cách sử dụng kỹ thuật hấp thụ gián tiếp. Giữa mỗi lần phân tích mao quản được rửa trong 2 phút bằng dung dịch đệm chứa 10% methanol, 10 mM natri cromat tetrahydrate và 4 mM OFM AnionBT. Giới hạn định lượng đạt được là 0,01g/100 g. Nghiên cứu này được áp dụng để xác định axit oxalic trong rau và một số loại đồ uống. Một nghiên cứu đáng tin cậy khác của Corinne Rivasseau [8] sử dụng phương pháp điện di mao quản vùng (CZE) với detector UV đã định lượng được axit citric, malic, succinic, oxalic, formic, fumaric, acetic, và phosphoric chứa trong thực vật với thời gian tích ngắn trong khi vẫn giữ độ phân giải tốt bằng cách tối ưu chiều dài mao quản, điện áp tách, thành phần và pH của dung dịch đệm. Quá trình phân tích được thực hiện trong một mao quản không tráng silica, chiều dài hiệu dụng 30cm, đảo ngược dòng điện di thẩm thấu và thế điện di là 30 kV. 17
Dung dịch đệm chứa 3.104 mol/L tetradecyltrimethylammonium và 10 2 mol/L trimellitate pH = 9,0. Quá trình tách đạt được trong 100s. Khoảng tuyến tính đối với oxalate từ 6.10 5 đến 10 3 mol/L. 1.6. Phương pháp điện di mao quản Điện di mao quản là một kỹ thuật tách các chất dựa trên sự di chuyển khác nhau của các phân tử chất (chủ yếu là các ion mang điện tích) trong dung dịch chất điện ly có chất đệm pH và trong tác dụng của điện trường nhất định do thế (V) đặt vào hai đầu mao quản sinh ra. Cấu tạo của hệ điện di được cho trong hình 1.1 [1]. Hình 1.1 Sơ đồ phân tích hệ điện di mao quản Độ điện di, tốc độ điện di và thời gian điện di Trong điện di, tốc độ di chuyển của các hạt tích điện (v) tỉ lệ thuận với cường độ điện trường (E): v = μ. E (1.1) Trong đó: v: tốc độ di chuyển của ion μ: là độ diện di E: là điện trường ngoài 18
Trong điều kiện tốc độ của dòng ổn định, lực tác động lên các tiểu phân tích điện từ phía điện trường ngoài và lực ma sát sẽ cân bằng: q.E= fe.v (1.2) Trong đó: q: là điện tích hạt nhân f e: là lực ma sát, fe = 6.π.η.r (η: là độ nhớt của dung dịch, r là bán kính ion) Từ các công thức trên có thể suy ra công thức tính độ linh động của ion như sau: μ = v/E = q/(6.π.η.r) (1.3) Như vậy độ linh động điện di tỉ lệ thuận với điện tích của ion chất phân tích và tỷ lệ nghịch với độ nhớt η của dung dịch pha động điện di và độ lớn (bán kính hydrat r) của ion chất phân tích. 1.6.1. Mao quản Mao quản là một bộ phận quan trọng trong phương pháp điện di mao quản. Đây chính là một trong các yếu tố quyết định sự điện di hỗn hợp của các chất mẫu. Mao quản được chế tạo chủ yếu là silica được gọi là mao quản silica. Trong một số trường hợp cũng có thể dùng mao quản teflon, khi mao quản silica không phù hợp, ví dụ mẫu có ion F và tách ở pH thấp [1]. 19
Hình 1.2 Mặt cắt ngang của mao quản Lớp điện kép trên thành mao quản và dòng điện di thẩm thấu Trong quá trình điện di, lớp điện kép và thế của chúng (thế Zêta) xuất hiện ở sát thành mao quản, nó phụ thuộc vào lực ion của dung dịch pha động điện di. Hình 1.3 Lớp điện tích kép trên bề mặt mao quản Dòng EOF di chuyển từ cực dương sang cực âm, dưới tác dụng của điện trường, các cation di chuyển cùng chiều với dòng EOF do đó di chuyển nhanh hơn, ngược lại các anion di chuyển ngược chiều với dòng EOF do đó di chuyển chậm hơn còn các phần tử trung hòa không chịu tác động của điện trường nên di chuyển cùng tốc độ với dòng EOF. Hình 1.4 Ảnh hưởng của dòng EOF đến tốc độ của các ion trong quá trình điện di Do vậy, để có được hiệu quả tách cao cần thiết phải tìm được điều kiện tối ưu và/hoặc sử dụng các biện pháp kiểm tra và khống chế (như thêm các chất 20