Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu xây dựng phương pháp định tính, định lượng các hoạt chất chính trong dược liệu hà thủ ô đỏ Fallopia multiflora (Thunb.) Haraldson

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:79

Thêm vào BST

Báo xấu

38
lượt xem 7
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu của đề tài là xây dựng được phương pháp định tính ba hợp chất 2,3,5,4′-tetrahydroxystilben- 2-O-β-D-glucosid (THSG), resveratrol (RV) và emodin (EM) trong dược liệu hà thủ ô đỏ; xây dựng được phương pháp định lượng hai hợp chất THSG và EM trong dược liệu hà thủ ô đỏ; đánh giá hàm lượng THSG và EM trong một số mẫu hà thủ ô đỏ thu hái tại các vùng khác nhau và trong sản phẩm chế biến từ hà thủ ô đỏ.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu xây dựng phương pháp định tính, định lượng các hoạt chất chính trong dược liệu hà thủ ô đỏ Fallopia multiflora (Thunb.) Haraldson

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------- NGUYỄN THỊ HÀ LY NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƢỢNG CÁC HOẠT CHẤT CHÍNH TRONG DƢỢC LIỆU HÀ THỦ Ô ĐỎ FALLOPIA MULTIFLORA (THUNB.) HARALDSON LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2013 1
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------- NGUYỄN THỊ HÀ LY NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƢỢNG CÁC HOẠT CHẤT CHÍNH TRONG DƢỢC LIỆU HÀ THỦ Ô ĐỎ FALLOPIA MULTIFLORA (THUNB.) HARALDSON Chuyên ngành: Hóa phân tích Mã số: 60440118 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. HDC: TS. PHƢƠNG THIỆN THƢƠNG 2. HDP: PGS.TS TẠ THỊ THẢO Hà Nội - 2013 2
LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên cho em gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS. Phƣơng Thiện Thƣơng và PGS.TS Tạ Thị Thảo đã tận tình hƣớng dẫn và tạo mọi điều kiện giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện đề tài và viết luận văn. Tôi xin đƣợc gửi lời cảm ơn chân thành tới ban lãnh đạo Viện Dƣợc liệu và các anh chị, các bạn công tác tại khoa Hoá phân tích – Tiêu chuẩn, Viện Dƣợc liệu đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi đƣợc học tập và nghiên cứu trong môi trƣờng hiện đại. Em xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy cô giáo giảng dạy tại khoa Hoá, đặc biệt là các thầy cô trong bộ môn Hoá Phân tích, đã cho em những kiến thức quý giá trong quá trình học tập và thực hiện đề tài này. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn các anh chị, bạn bè của tập thể lớp cao học hoá k22, đặc biệt là những ngƣời bạn trong nhóm hoá phân tích k22 đã giúp đỡ, chia sẻ những khó khăn trong suốt quá trình tôi học tập và thực hiện đề tài này. Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và bạn bè đã luôn động viên, chia sẻ mọi khó khăn cùng tôi. Hà Nội, tháng 12 năm 2013 Học viên Nguyễn Thị Hà Ly 3
MỤC LỤC MỞ ĐẦU……………………………………………………………………….. 01 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN........................................................................................ 03 1.1.Tổng quan về dƣợc liệu hà thủ ô đỏ………………………………………... 03 1.1.1 Cây hà thủ ô đỏ……………………………………………………... 03 1.1.2 Dƣợc liệu hà thủ ô đỏ………………………………………………. 04 1.1.2.1 Thành phần hoá học………………………………………… 04 1.1.2.2 Công dụng và tác dụng sinh học của hà thủ ô đỏ…………... 05 1.2. Tổng quan về các phƣơng pháp phân tích thành phần hóa học……………. 07 1.2.1 Các phƣơng pháp phân tích thành phần hóa học của dƣợc liệu ……. 07 1.2.2 Phân tích thành phần hóa học của dƣợc liệu hà thủ ô đỏ ………….. 08 1.2.3 Kiểm nghiệm dƣợc liệu hà thủ ô đỏ….…………………………….. 11 1.3. Các phƣơng pháp xử lý mẫu dƣợc liệu……………………………………. 12 1.4. Các vấn đề cần giải quyết………………………………………………….. 13 1.5. Mục tiêu nghiên cứu……………………………………………………….. 14 CHƢƠNG 2: THỰC NGHIỆM.................................................................................... 15 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu……………………………………………………... 15 2.2 Chất chuẩn, hóa chất, thiết bị………………………………………………. 16 2.2.1 Chất chuẩn………………………………………………………….. 16 2.2.2 Hóa chất…………………………………………………………….. 17 2.2.3 Thiết bị, dụng cụ……………………………………………………. 17 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu.…………...……………………………………... 18 2.3.1 Chuẩn bị dung dịch mẫu chuẩn và mẫu đối chiếu………………….. 18 2.3.2 Phƣơng pháp xử lý mẫu…………………………………………….. 18 2.3.3 Phƣơng pháp phân tích……………………………………………... 19 2.4. Nghiên cứu điều kiện tối ƣu và đánh giá phƣơng pháp phân tích………… 21 2.4.1 Phƣơng pháp nghiên cứu các điều kiện tối ƣu cho quá trình phân tích HPLC………………………………………………………………… 21 4
2.4.2 Đánh giá phƣơng pháp phân tích…………………………………… 22 2.4.2.1 Đánh giá độ lặp lại và tái lặp lại……………………………. 22 2.4.2.2 Đánh giá độ đúng của phƣơng pháp………………………... 22 2.4.3 Phân tích mẫu thực tế………………………………………………. 23 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN................................................................ 24 3.1. Nghiên cứu tối ƣu hóa các điều kiện đo của hệ thống sắc ký……………... 24 3.1.1 Khảo sát bƣớc sóng hấp thụ cực đại của các chất nghiên cứu….….. 24 3.1.2 Khảo sát thành phần pha động……………………………………... 25 3.1.3 Khảo sát ảnh hƣởng pH của pha động và loại axit dùng trong pha động………………………………………………………………………. 32 3.1.4 Khảo sát ảnh hƣởng của thể tích mẫu tiêm vào cột………………… 36 3.1.5 Điều kiện tối ƣu cho quá trình tách các anthaquinon và stilben……. 38 3.1.6 Định tính các hợp chất THSG, RV và EM trong mẫu hà thủ ô đỏ…. 38 3.2. Đƣờng chuẩn, giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng…………………. 39 3.2.1 Khảo sát khoảng tuyến tính và xây dựng đƣờng chuẩn……………. 39 3.2.2 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng…………………………. 42 3.2.3 Đánh giá phƣơng trình đƣờng chuẩn……………………………….. 43 3.2.3.1 Kiểm tra sự khác nhau có nghĩa giữa hệ số a và giá trị 0…... 43 3.2.3.2 Kiểm tra sự sai khác giữa b và b′…………………………… 45 3.3. Khảo sát phƣơng pháp xử lý mẫu…………………………………………. 46 3.3.1 Khảo sát tỷ lệ dung môi chiết………………………………………. 47 3.3.2 Khảo sát phƣơng pháp chiết siêu âm……………………………….. 48 3.3.2.1 Khảo sát nhiệt độ chiết siêu âm…………………………….. 48 3.3.2.2 Khảo sát thời gian chiết siêu âm……………………………. 48 3.3.3 Khảo sát phƣơng pháp chiết hồi lƣu………………………………... 49 3.3.3.1 Khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ chiết hồi lƣu…………….. 49 3.3.3.2 Khảo sát ảnh hƣởng của thời gian chiết và số lần chiết…….. 50 3.3.4 Phƣơng pháp xử lý mẫu dƣợc liệu hà thủ ô đỏ……………………... 51 3.4. Đánh giá phƣơng pháp phân tích………………………………………….. 52 5
3.4.1 Đánh giá độ đúng của phƣơng pháp……………………………….. 52 3.4.1.1 Đánh giá độ thu hồi của phƣơng pháp……………………… 52 3.4.1.2 Đánh giá sự sai khác giữa giá trị phân tích lại và giá trị thêm chuẩn………………………………………………………………… 54 3.4.2 Đánh giá độ lặp lại và tái lặp lại…………………………………….. 55 3.4.2.1 Đánh giá độ lặp lại của thiết bị……………………………… 55 3.4.2.2 Đánh giá độ chụm, độ lệch chuẩn lặp lại và tái lặp của phƣơng pháp phân tích……………………………………………… 56 3.5 Phân tích mẫu thực tế………………………………………………………. 58 3.5.1 Mẫu dƣợc liệu hà thủ ô đỏ…………………………………………... 58 3.5.2 Mẫu sản phẩm từ hà thủ ô đỏ……………………………………….. 61 BÀN LUẬN…………………………………………………………………….. 63 KẾT LUẬN…………………………………………………………………….. 64 TÀI LIỆU THAM KHẢO 6
DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 2.1: Thông tin về các mẫu phân tích…………………………………………. 16 Bảng 2.2: Chƣơng trình dung môi rửa giải…………………………………………. 21 Bảng 3.1: Các gradient thử nghiệm với pha động MeOH – nƣớc………………….. 27 Bảng 3.2: Thời gian lƣu, độ phân giải và hệ số đối xứng pic của các cấu tử ứng với từng chế độ gradient………………………………………………………………. 27 Bảng 3.3: Các gradient thử nghiệm với pha động ACN – nƣớc…………………… 29 Bảng 3.4: Thời gian lƣu, độ phân giải và hệ số đối xứng pic của các cấu tử ứng với từng chế độ gradient………………………………………………………………... 29 Bảng 3.5: Các gradient thử nghiệm với pha động ACN – nƣớc chứa 0,01% axit photphoric………………………………………………………………………....... 31 Bảng 3.6: Thời gian lƣu, độ phân giải và hệ số đối xứng pic của các cấu tử ứng với từng chế độ gradient…………………………………………………….. …….. 31 Bảng 3.7: Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của pH (axit axetic)……………………….. 34 Bảng 3.8: Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của pH (axit fomic)……………….............. 34 Bảng 3.9: Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của pH (axit photphoric)………….............. 35 Bảng 3.10: Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của thể tích mẫu tiêm vào cột……………. 37 Bảng 3.11: Nồng độ và diện tích pic trung bình của các chất……………………… 40 Bảng 3.12: Phƣơng trình đƣờng chuẩn của các chất……………………………….. 41 Bảng 3.13: Giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng của các chất……………….. 43 Bảng 3.14: Kết quả so sánh giữa giá trị a với giá trị 0 của phƣơng trình đƣờng chuẩn THSG……………………………………………………………………....... 44 Bảng 3.15: Kết quả so sánh giữa b và b′ trong phƣơng trình đƣờng chuẩn của THSG…………………………………………………………………………... 45 Bảng 3.16: Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của dung môi chiết………………………. 47 Bảng 3.17: Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ chiết siêu âm……………….. 48 Bảng 3.18: Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của thời gian chiết siêu âm………………. 49 Bảng 3.19: Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ chiết hồi lƣu………………... 50 7
Bảng 3.20: Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của thời gian chiết và số lần chiết……….. 51 Bảng 3.21: Kết quả đánh giá hiệu suất thu hồi đối với phƣơng pháp phân tích THSG…………………………………………………………………….. 54 Bảng 3.22: Kết quả đánh giá hiệu suất thu hồi đối với phƣơng pháp phân tích EM……………………………………………………………………… 54 Bảng 3.23: Kết quả phân tích lặp lại các mẫu dƣợc liệu hà thủ ô đỏ thêm chuẩn….. 55 Bảng 3.24: Các đại lƣợng thống kê………………………………………………… 55 Bảng 3.25: Độ lặp lại thời gian lƣu và diện tích pic của các chất………………….. 56 Bảng 3.26: Kết quả hàm lƣợng THSG và EM tìm lại đƣợc bằng phƣơng pháp thêm chuẩn của 3 kỹ thuật viên khác nhau…………………………………………. 56 Bảng 3.27: Các dữ kiện thống kê đánh giá độ lặp lại của phƣơng pháp phân tích tiến hành bởi ba kỹ thuật viên khác nhau……………………………………… 57 Bảng 3.28: Các dữ kiện đánh giá độ tái lặp lại của phƣơng pháp phân tích……….. 58 Bảng 3.29: Kết quả phân tích mẫu dƣợc liệu hà thủ ô đỏ………………………….. 59 Bảng 3.30: Kết quả phân tích mẫu sản phẩm hà thủ ô của công ty Traphaco……… 61 8
DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1: Hình ảnh cây hà thủ ô đỏ……………….……………………………….. 03 Hình 1.2: Hình ảnh dƣợc liệu và phiến dƣợc liệu hà thủ ô đỏ……………………... 04 Hình 1.3: Công thức cấu tạo một số thành phần hóa học trong dƣợc liệu hà thủ ô đỏ…………………………………………………………………………………… 05 Hình 2.1: Hình ảnh dƣợc liệu hà thủ ô đỏ và sản phẩm từ hà thủ ô đỏ……………. 16 Hình 3.1: Phổ UV-VIS của các chất……………………………………………….. 24 Hình 3.2: Sắc ký đồ HPLC đối với các chế độ gradient thử nghiệm với hệ dung môi MeOH – nƣớc………………………………………………………... 28 Hình 3.3: Sắc ký đồ HPLC đối với các chế độ gradient thử nghiệm với hệ dung môi ACN – nƣớc…………………………………………………………. 30 Hình 3.4: Sắc ký đồ HPLC đối với các chế độ gradient thử nghiệm với hệ dung môi ACN – nƣớc chứa 0,01% axit photphoric…………………………... 32 Hình 3.5: Sắc ký đồ định tính THSG, RV, EM trong mẫu hà thủ ô đỏ…………… 39 Hình 3.6: Khoảng tuyến tính………………………………………………………. 40 Hình 3.7: Đƣờng chuẩn các chất…………………………………………………... 41 Hình 3.8: Sắc ký đồ HPLC phân tích định lƣợng THSG (A) và EM (B) trong các mẫu dƣợc liệu hà thủ ô đỏ………………………………………………………….. 60 Hình 3.9: Sắc ký đồ HPLC phân tích định lƣợng THSG (A) và EM (B) trong mẫu thuốc T-TPC………………………………………………………………………... 62 9
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Tên viết tắt Tên đầy đủ AC Aceton ACN Acetonitril Abs Absorbance: Độ hấp thụ quang AS Asymmetry factor: Hệ số đối xứng pic BuOH n-Butanol DĐVN Dƣợc Điển Việt Nam DĐTQ Dƣợc Điển Trung Quốc EM Emodin EtOH Etanol GC Gas chromatography: Sắc ký khí High performance liquid chromatography: Sắc ký lỏng hiệu HPLC năng cao HPLC-ESI-MS/MS Sắc ký lỏng ghép đầu dò khối phổ HPLC-DAD/FLD Sắc ký lỏng ghép nối detector PDA và phát quang HPLC-DAD- Sắc ký lỏng ghép nối detector PDA và khối phổ với hệ ion APCI/MSn hóa hóa học ở áp suất khí quyển LOD Limit of Detection: Giới hạn phát hiện LOQ Limit of Quantitation: Giới hạn định lƣợng MeOH Metanol PDA Photo-diode-array: Mảng điot điện tử ppm Parts per million: Phần triệu ppb Parts per billion: Phần tỷ ppt Parts per trillion: Phần nghìn tỷ R Correlation coefficient: Hệ số tƣơng quan RS Resolution: Độ phân giải RP-HPLC Reverse phase-HPLC: Sắc ký lỏng pha đảo % RSD % Relative standard deviation: % Độ lệch chuẩn tƣơng đối % Reproducibility standard deviation: % Độ lệch chuẩn tái % RSDR lặp tƣơng đối RV Resveratrol SD Standard deviation: Độ lệch chuẩn tR Retention time: Thời gian lƣu THSG 2,3,5,4′-tetrahydroxystilben-2-O-β-D-Glucosid UV-VIS Ultraviolet-Visible: Tử ngoại và khả kiến VWD Variable Wavelength Detector IR Infrared: Hồng ngoại 10
MỞ ĐẦU Từ ngàn xƣa, ông cha ta đã biết sử dụng nguồn cây cỏ phong phú xung quanh để làm thuốc trị bệnh, bồi bổ cơ thể, tăng cƣờng sức khỏe. Các dƣợc liệu quý đã đƣợc ghi chép thành các bài thuốc cổ truyền với nhiều tác dụng quý báu. Một trong số các dƣợc liệu quý đó là hà thủ ô đỏ. Trong một số tài liệu ghi chép còn lƣu giữ, hà thủ ô đỏ đƣợc coi nhƣ vị thuốc trƣờng sinh, có khả năng làm ngƣời già thành trẻ, tóc bạc lại đen. Theo quan điểm của y học cổ truyền, hà thủ ô đỏ có nhiều tác dụng quý nhƣ bổ huyết, điều hoà khí huyết, bổ gan thận, mạnh gân cốt, nhuận tràng, giúp ích cho sự tiêu hoá. Y học hiện đại còn phát hiện hà thủ ô đỏ có tác dụng làm giảm lƣợng đƣờng trong máu, có tác dụng tốt đối với các trƣờng hợp suy nhƣợc thần kinh và bệnh về thần kinh, làm tăng hoạt động của tim, làm tăng sự co bóp của ruột, có tác dụng chống viêm. Do đó, hà thủ ô đỏ đƣợc sử dụng rộng rãi để làm thuốc phục vụ đời sống con ngƣời từ xƣa đến nay. Tuy nhiên, hiện nay trên thị trƣờng, vị thuốc quý này đang bị giả mạo bằng một số loại rễ củ nhƣ: hà thủ ô trắng, củ nâu, củ cọc... hoặc tình trạng ngƣời sử dụng mua phải dƣợc liệu rác đã bị chiết hết các hoạt chất, gây ảnh hƣởng đến sức khoẻ ngƣời bệnh và quyền lợi ngƣời tiêu dùng. Vì vậy, việc nghiên cứu đánh giá chất lƣợng, tiêu chuẩn hoá dƣợc liệu hà thủ ô đỏ là vấn đề hết sức cần thiết. Ở Việt Nam, qui định chính thống việc kiểm tra chất lƣợng dƣợc liệu hà thủ ô đỏ còn rất sơ sài. Chuyên luận hà thủ ô đỏ trong Dƣợc Điển Việt Nam IV (2009) chỉ quy định hàm lƣợng chất chiết đƣợc trong etanol 30%, tiêu chí đánh giá này không phản ánh đƣợc chính xác chất lƣợng dƣợc liệu hà thủ ô đỏ. Trên thế giới đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về phƣơng pháp phân tích định tính, định lƣợng dƣợc liệu hà thủ ô đỏ. Trong đó, phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) thƣờng đƣợc sử dụng nhất bởi độ nhạy tốt, phù hợp với đối tƣợng phân tích là dƣợc liệu và giá thành không quá cao. Dƣợc Điển Trung Quốc (2010) có sử dụng phƣơng pháp này để định lƣợng hai thành phần emodin và 2,3,5,4′-tetrahydroxystilben-2-O- β-D-glucosid trong dƣợc liệu hà thủ ô đỏ, là tiêu chí đánh giá chất lƣợng dƣợc liệu hà thủ ô đỏ. 11
Trong phạm vi luận văn thạc sĩ “Nghiên cứu xây dựng phƣơng pháp định tính, định lƣợng các hoạt chất chính trong dƣợc liệu hà thủ ô đỏ Fallopia multiflora (Thunb.) Haraldson” chúng tôi tiến hành khảo sát các điều kiện HPLC thích hợp để định tính, định lƣợng các hoạt chất chính trong dƣợc liệu hà thủ ô đỏ. Sau đó, áp dụng phƣơng pháp này để đánh giá chất lƣợng dƣợc liệu hà thủ ô đỏ và các sản phẩm chế biến từ hà thủ ô đỏ. Kết quả của nghiên cứu này nhằm gợi ý cho việc nâng cấp chuyên luận dƣợc liệu hà thủ ô đỏ trong Dƣợc Điển Việt Nam IV. Mục tiêu nghiên cứu:  Xây dựng đƣợc phƣơng pháp định tính ba hợp chất 2,3,5,4′-tetrahydroxystilben- 2-O-β-D-glucosid (THSG), resveratrol (RV) và emodin (EM) trong dƣợc liệu hà thủ ô đỏ.  Xây dựng đƣợc phƣơng pháp định lƣợng hai hợp chất THSG và EM trong dƣợc liệu hà thủ ô đỏ.  Đánh giá hàm lƣợng THSG và EM trong một số mẫu hà thủ ô đỏ thu hái tại các vùng khác nhau và trong sản phẩm chế biến từ hà thủ ô đỏ. 12
CHƢƠNG 1 – TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về dƣợc liệu hà thủ ô đỏ 1.1.1 Cây hà thủ ô đỏ Hà thủ ô đỏ có tên khoa học là: Fallopia multiflora (Thunb.) Haraldson, thuộc họ Rau răm (Polygonaceae), bộ Cẩm chƣớng (Caryophyllales), còn có một số tên khác nhƣ: dạ giao đằng, dạ hợp... Cây hà thủ ô đỏ là loại dây leo, sống nhiều năm. Thân mềm, nhẵn, mọc xoắn vào nhau. Rễ phình thành củ, màu nâu đỏ, củ nguyên có hình giống nhƣ củ khoai lang. Lá mọc so le, hình mũi tên, gốc hình tim, đầu thuôn nhọn, dài 5-8 cm, rộng 3- 4 cm; 3-5 gân xuất phát từ gốc lá, hai mặt nhẵn, mặt trên sẫm bóng; cuống dài khoảng 2 cm, phủ lông tơ, bẹ chìa mỏng, ngắn, có lông dài. Cụm hoa mọc ở kẽ lá hoặc đầu cành thành chùy phân nhánh, dài hơn lá; lá bấc ngắn; hoa nhỏ nhiều, màu trắng; nhị 8, thƣờng dính vào gốc của bao hoa. Quả hình 3 cạnh, nhẵn bóng, nằm trong bao hoa mà 3 mảnh ngoài phát triển thành những cánh rộng. Mùa hoa từ tháng 9-11; mùa quả từ tháng 12-2 hàng năm. Bộ phận dùng là rễ củ của cây [3],[8]. Hình 1.1: Hình ảnh cây hà thủ ô đỏ Ở Việt Nam, hà thủ ô đỏ chỉ có ở một số vùng núi cao (từ 1000 m trở lên) phía bắc, mọc nhiều ở Hà Giang, Lai Châu, Lào Cai, Sơn La. Các tỉnh ít gặp hơn nhƣ Hòa Bình (Mai Châu, Đà Bắc), Thanh Hóa (Sơn Bá Mƣời), Nghệ An (Kỳ Sơn), Lạng Sơn (núi Mẫu Sơn), Cao Bằng (Bảo Lạc), Yên Bái (Mù Cang Chải). Hà thủ ô đỏ là loại cây ƣa khí hậu ẩm mát của vùng cận nhiệt đới và nhiệt đới núi cao, cây ƣa sáng và có thể hơi chịu bóng. Nơi mọc tự nhiên thích hợp nhất là các quần thể rừng 13
núi đá vôi, độ cao tới 1700 m, nhiệt độ trung bình quanh năm dƣới 20oC. Hà thủ ô đỏ thƣờng mọc ở đất ẩm, xốp, nhiều mùn, nhất là loại ở chân núi đá [3]. Hà thủ ô đỏ ra quả hàng năm, mỗi cây có thể ra nhiều quả. Sau khi quả già, phần thân leo trên mặt đất làm hạt giống phát tán xung quanh và sẽ nảy mầm vào mùa xuân hè năm sau [8]. 1.1.2 Dược liệu hà thủ ô đỏ Dƣợc liệu hà thủ ô đỏ (Radix Fallopia multiflora) là phần rễ củ phơi hay sấy khô của cây Hà thủ ô đỏ [1], có dạng hình củ tròn, hoặc hình thoi, không đều, củ nhỏ để nguyên, củ to bổ đôi theo chiều dọc, hay chặt thành từng miếng to. Mặt ngoài có những chỗ lồi lõm do các nếp nhăn ăn sâu tạo thành. Mặt cắt ngang có lớp bần mỏng màu nâu sẫm, mô mềm vỏ màu đỏ hồng, có nhiều bột, ở giữa có ít lõi gỗ. Vị chát [1]. Hình 1.2: Hình ảnh dược liệu và phiến dược liệu hà thủ ô đỏ 1.1.2.1 Thành phần hoá học Qua nghiên cứu các nhà khoa học thấy rằng trong hà thủ ô đỏ có chứa một số thành phần sau: anthraquinon nhƣ: emodin, chrysophanol, physcion, citreorosein, chrysophanol-8-O-β-D-glucosid, physcion-8-O-β-D-glucosid, emodin-8-O-β-D- glucosid, emodin-1,6-dimethylether, questin, questinol, 2-acetylemodin, 2-methoxy- 6-acetyl-7-methyljuglon, emodin-8-O-(6′-O-malonyl)-glucosid; các dẫn xuất stilben nhƣ: resveratrol, 2,3,5,4′-tetrahydroxystilben-2-O-β-D-glucosid, 2,3,5,4′- tetrahydroxystilben- 2,3-di-O-β-D-glucosid [23]; protid; tinh bột; lipid; chất vô cơ; các chất tan trong nƣớc, lecitin, rhaponticin (rhapontin, ponticin). Trong đó, 2,3,5,4′-tetrahydroxystilben-2-O-β-D-glucosid và emodin là các thành phần chính 14
trong hà thủ ô đỏ. Dƣợc Điển Trung Quốc (2010) quy định hàm lƣợng 2,3,5,4′- tetrahydroxystilben-2-O-β-D-glucosid không đƣợc thấp hơn 1,0%, hàm lƣợng emodin và physcion không đƣợc thấp hơn 0,1%. Đặc biệt, hàm lƣợng các hoạt chất này thay đổi rõ rệt sau khi chế biến. Lúc chƣa chế, hà thủ ô đỏ chứa 7,68% tanin; 0,25% dẫn chất anthraquinon tự do; 0,8058% dẫn chất anthraquinon toàn phần. Sau khi chế, còn 3,82% tanin; 0,1127% dẫn chất anthraquinon tự do và 0,2496% dẫn chất anthraquinon toàn phần [3]. 2,3,5,4′-tetrahydroxystilben-2-O-β-D- Emodin glucosid Resveratrol Physcion Hình 1.3: Công thức cấu tạo một số thành phần hóa học trong dược liệu hà thủ ô đỏ 1.1.2.2 Công dụng và tác dụng sinh học của hà thủ ô đỏ Hà thủ ô đỏ có vị đắng chát, hơi ngọt, tính bình, có tác dụng bổ huyết, cố tinh, điều hoà khí huyết, bổ gan thận, mạnh gân xƣơng, nhuận tràng. Nó đƣợc dùng để điều trị thần kinh suy nhƣợc, ngủ kém, thiếu máu, đau lƣng, mỏi gối, di mộng tinh, bạch đới, đại tiểu tiện ra máu, mẩn ngứa. Uống lâu làm đen râu tóc đối với ngƣời bạc tóc sớm, làm tóc đỡ khô, đỡ rụng [3],[4],[8]. 15
Trong y học cổ truyền Trung Quốc, hà thủ ô đỏ sống tƣơi và khô có tác dụng thông tiểu, giải độc, tiêu ung thũng, chữa táo bón cho phụ nữ sau khi đẻ hoặc ngƣời già, mụn nhọn, ghẻ lở, tràng nhạc. Hà thủ ô đỏ chế có tác dụng bổ gan thận, ích tinh huyết, dùng làm thuốc an thần, bổ và tăng lực trong các chứng thân thể suy yếu, hoa mắt, chóng mặt, tim hồi hộp, nhức đầu, mất ngủ,… Ở Ấn Độ, rễ hà thủ ô đỏ đƣợc dùng làm thuốc bổ và làm đen tóc [3]. Theo y học hiện đại, hà thủ ô đã đƣợc chứng minh là có tác dụng làm giảm lƣợng đƣờng trong máu, chống viêm, chống ho, lợi tiểu, điều kinh, hạ sốt, kích thích tiêu hóa, có tác dụng tốt đối với các trƣờng hợp suy nhƣợc thần kinh, làm tăng hoạt động của tim, làm tăng sự co bóp của ruột, kích thích tiêu hóa, cải thiện dinh dƣỡng [3]. Trong hà thủ ô đỏ có ba thành phần hóa học có nhiều tác dụng sinh học lý thú đã đƣợc tìm thấy là 2,3,5,4′-tetrahydroxystilben-2-O-β-D-glucosid, emodin, resveratrol. Qua nghiên cứu, các nhà khoa học thấy rằng emodin có nhiều đặc tính đáng quý nhƣ:  Tác dụng làm giảm yếu tố gây bệnh tiểu đƣờng typ 2 [16].  Tác dụng chống một số căn bệnh ung thƣ trong đó có cả ung thƣ tuyến tụy [25], [29], [20].  Tác dụng bảo vệ hệ thần kinh, ngăn ngừa độc tính của các glutamat [17].  Tác dụng an thần, chống rối loạn thần kinh cho bệnh nhân tâm thần phân liệt. Các anthraquinon là dẫn xuất của emodin giúp cải thiện sự thiếu hụt của chức năng an thần [33].  Tác dụng nhanh làm liền vết thƣơng [22]. Các dẫn xuất stilben (2,3,5,4′-tetrahydroxystilben-2-O-β-D-glucosid, resveratrol) cũng đƣợc tìm thấy trong hà thủ ô đỏ với nhiều tác dụng sinh học nhƣ:  Tác dụng chống oxi hóa.  Điều hòa cân nặng.  Tác dụng trên tim mạch [22].  Tác dụng chống dị ứng [32]. 16
 Tác dụng kháng viêm [14].  Tác dụng chống khối u, đặc biệt là ngăn ngừa ung thƣ vú, ở liều thấp cũng chỉ ra khả năng làm giảm quá trình di căn [13]. Với nhiều công dụng nhƣ vậy, nhu cầu sử dụng của ngƣời tiêu dùng ngày càng lớn, hà thủ ô đỏ và các sản phẩm từ hà thủ ô đỏ ngày càng xuất hiện nhiều trên thị trƣờng. Nhằm kiểm soát chất lƣợng hàng hoá, đảm bảo lợi ích cho ngƣời tiêu dùng, công tác kiểm tra chất lƣợng đóng vai trò vô cùng quan trọng. Tuy nhiên, việc kiểm tra chất lƣợng dƣợc liệu hà thủ ô đỏ ở Việt Nam hiện nay còn rất sơ sài. Chuyên luận hà thủ ô đỏ - DĐVN IV (2009) chỉ quy định chỉ tiêu định lƣợng chất chiết đƣợc trong EtOH 30% [1] sử dụng phƣơng pháp cân. Tiêu chí này không đánh giá đƣợc chính xác chất lƣợng dƣợc liệu hà thủ ô đỏ và kết quả thu đƣợc có độ tin cậy không cao, gây khó khăn và hạn chế trong công tác kiểm tra chất lƣợng dƣợc liệu hà thủ ô đỏ. Vì vậy, trong nghiên cứu này, chúng tôi xây dựng một phƣơng pháp định lƣợng đồng thời các hoạt chất thuộc nhóm anthaquinon và stilben nhằm đánh giá đúng chất lƣợng dƣợc liệu hà thủ ô đỏ, gợi ý cho việc nâng cấp chuyên luận dƣợc liệu hà thủ ô đỏ trong Dƣợc Điển Việt Nam IV. 1.2.Tổng quan về các phƣơng pháp phân tích thành phần hóa học 1.2.1 Các phương pháp phân tích thành phần hóa học của dược liệu Dƣợc liệu là đối tƣợng phân tích có thành phần nền phức tạp. Thông thƣờng, trong dƣợc liệu không chỉ có một chất, một hỗn hợp chất có tính chất khác nhau, mà thƣờng chứa một nhóm các chất có tính chất tƣơng đối giống nhau (flavonoid, anthraquinon, terpenoid, nhóm các dẫn xuất stilben,…). Các chất trong cùng một nhóm chất đều giống nhau về khung cơ bản, khác nhau một vài nhóm thế hoặc các thành phần khác, tức là khác nhau không nhiều về tính chất vật lý, tính chất hoá học. Chính vì vậy, việc sử dụng các phƣơng pháp quang phổ (UV-VIS, IR, huỳnh quang,…) để phân tích định lƣợng một thành phần trong dƣợc liệu gặp nhiều khó khăn và hầu nhƣ là không thể thực hiện đƣợc. Sắc ký là một trong những phƣơng pháp xác định hàm lƣợng các chất thông dụng nhất hiện nay trong phân tích hiện đại. Khác với các phép định lƣợng hoá học, 17
các phƣơng pháp sắc ký cho phép định lƣợng riêng từng chất cụ thể trong một hỗn hợp, phù hợp với quá trình phân tích các mẫu dƣợc liệu. Ngƣời ta có thể định lƣợng một chất hay định lƣợng đồng thời nhiều chất trong một lần định lƣợng nếu chọn đƣợc điều kiện thích hợp. Các phƣơng pháp sắc ký thƣờng dùng là: sắc ký khí (GC), sắc ký lớp mỏng (TLC), sắc ký điện di mao quản, sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) [2]. Trong đó, sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là phƣơng pháp có nhiều ứng dụng trong nghiên cứu các hợp chất tự nhiên nói chung và nghiên cứu dƣợc liệu nói riêng. Ƣu điểm lớn nhất của phƣơng pháp này là có thể phân tích nhiều loại hợp chất khác nhau, nên khả năng phân tích rộng hơn nhiều so với sắc ký khí (thƣờng dùng với các đối tƣợng dễ bay hơi). Có thể dùng HPLC để phân tích các chất từ phân cực tới không phân cực, từ các chất bay hơi tới các chất không bay hơi, từ các chất trung tính tới các chất điện ly,…Trong lĩnh vực dƣợc liệu, HPLC thƣờng đƣợc sử dụng nhất trong định lƣợng riêng lẻ các chất trong hỗn hợp phức tạp của dịch chiết dƣợc liệu bằng việc so sánh diện tích pic với chất chuẩn trong cùng điều kiện phân tích. Với pha tĩnh ngày càng đƣợc hoàn thiện và đổi mới để nâng cao hiệu năng tách, detector ngày càng nhạy, HPLC ngày nay có thể dễ dàng phân tích các chất trong hỗn hợp ở mức ppm tới ppb, thậm chí ppt [2]. Với mục tiêu đặt ra là xây dựng một phƣơng pháp phân tích định lƣợng nhanh, chính xác các hợp chất thuộc nhóm anthraquinon và dẫn xuất stilben trong dƣợc liệu hà thủ ô đỏ, chúng tôi lựa chọn phƣơng pháp nghiên cứu là sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). 1.2.2 Phân tích thành phần hóa học của dược liệu hà thủ ô đỏ Có rất nhiều kỹ thuật HPLC đã đƣợc dùng để phân tích các chất thuộc nhóm stilben và anthraquinon nhƣ: HPLC – ESI – MS/MS, HPLC – DAD/FLD, HPLC – DAD – APCI/MSn,… Các kỹ thuật này đều hiện đại, đòi hỏi trang thiết bị đắt tiền nên khó có thể áp dụng rộng rãi ở các đơn vị kiểm nghiệm và sản xuất. Kỹ thuật HPLC – UV/VIS khắc phục đƣợc những nhƣợc điểm trên vì vậy chúng tôi chọn phƣơng pháp này để phân tích các thành phần hóa học trong dƣợc liệu hà thủ ô đỏ. Một số tác giả [24] đã sử dụng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao để xác định EM, THSG, physcion trong mẫu dƣợc liệu hà thủ ô đỏ trên hệ thống HPLC 18
của hãng Agilent, bơm G1311A Quart, bộ đuổi bọt khí G1322A, bộ tiêm mẫu tự động G1313A và detector PDA. Quá trình phân tích sử dụng cột phân tích pha đảo Alltima C18 (250 mm x 4,6 mm; 5 μm). Hệ dung môi pha động gồm kênh A là ACN chứa 0,1% axit fomic, kênh B là nƣớc chứa 0,1% axit fomic, sử dụng chế độ rửa giải gradient: T (phút) 0–8 8 – 20 20 – 25 25 – 35 A (%) 23 23 – 70 70 – 75 75 - 100 Tốc độ dòng 1 ml/phút, thể tích mẫu tiêm vào cột là 20 μl và detector đƣợc đặt tại bƣớc sóng 290 nm. Kết quả cho thứ tự các chất ra khỏi cột là THSG → EM → physcion. Tổng thời gian chạy một mẫu là 35 phút. Ngoài ra, nghiên cứu này đã đƣa ra một phƣơng pháp xử lý mẫu sử dụng 50 ml MeOH và chiết hồi lƣu với 0,3 g mẫu trong 120 phút. Các tác giả còn khẳng định rằng phƣơng pháp này cho hiệu suất chiết cao hơn so với các phƣơng pháp chiết soxhlet và chiết siêu âm. Phƣơng pháp này đã đƣợc thẩm định về tính tuyến tính, độ thu hồi, độ lặp lại và tái lặp lại, độ chụm, giới hạn định lƣợng và đƣợc dùng để đánh giá chất lƣợng các mẫu dƣợc liệu hà thủ ô đỏ trên thị trƣờng ở Quảng Đông – Trung Quốc. Nhóm các tác giả [19] cũng đã sử dụng đồng thời hai phƣơng pháp HPLC- PDA và HPLC-VWD để tách 13 chất thuộc các nhóm anthraquinon, stilben, axit phenolic và flavonoid, nhằm đánh giá chất lƣợng 3 loài dƣợc liệu thuộc cùng một chi là: hà thủ ô đỏ, cốt khí củ và đại hoàng. Các mẫu đƣợc chiết siêu âm bằng MeOH 70% trong 60 phút, sau đó lọc qua màng cellulose axetat 0,45 μm để thu đƣợc dịch chạy sắc ký HPLC. Các chất đƣợc dùng để phân tích gồm: axit gallic, epicatechin, piceid, THSG, sennosid A, sennosid B, RV, aloe-emodin, rhein, EM, chrysophanol, physcion, emodin-8-O--D-glucosid. Hệ dung môi pha động gồm kênh A là ACN, kênh B là nƣớc chứa 0,1% axit fomic, chế độ rửa giải gradient: T (phút) 0–2 2–4 4 – 10 10 – 11 11 – 14 14 – 21 B (%) 5 - 10 10 - 15 15 15 - 21 21 21 - 29 T (phút) 21 – 23 23 – 25 25 – 26 26 – 28 28 – 30 30 – 32 B (%) 29 - 40 40 – 50 50 50 – 80 80 - 100 100 19
Tốc độ dòng là 0,8 ml/phút, thể tích mẫu tiêm vào cột là 5 μl. Đối với hệ HPLC- PDA, detector đƣợc đặt quan sát tại ba bƣớc sóng 280 nm, 254 nm và 320 nm. Đối với hệ HPLC-VWD, detector VWD đƣợc đặt theo một chƣơng trình nhƣ sau: 0 – 6 phút (280 nm), 6 – 12 phút (320 nm), 12 – 14,5 phút (254 nm), 14,5 – 18 phút (320 nm), 18 – 24 phút (280 nm), 24 – 32 phút (254 nm). Kết quả cho thấy cả hai kỹ thuật sử dụng đều cho độ nhạy tốt, có thể xác định các chất có hàm lƣợng cỡ ng trong mẫu. Kỹ thuật HPLC-PDA vốn đƣợc sử dụng rộng rãi do có thể quan sát tại nhiều bƣớc sóng sau một lần phân tích và cho ta nhiều thông tin về đối tƣợng phân tích hơn detector VWD. Tuy nhiên, kỹ thuật HPLC-VWD cho các kết quả về độ chọn lọc, độ chụm và độ tuyến tính tốt hơn so với kỹ thuật HPLC-PDA. Điều này đƣợc giải thích bởi sử khác nhau về cấu tạo và sơ đồ truyền ánh sáng trong từng loại detector [26]. Thêm một nghiên cứu nữa về phƣơng pháp định lƣợng EM và THSG, theo tài liệu [31], tác giả Yu Jie và các cộng sự đã nghiên cứu và ứng dụng phƣơng pháp HPLC-PDA xác định EM, THSG và physcion trong các mẫu hà thủ ô sống và hà thủ ô chế. Sử dụng hệ máy Dionex Ultimate 3000 (Dionex Technologies, USA), cột Zobax SB-C18 (4,6 mm x 250 mm). Pha động gồm kênh A là nƣớc chứa 0,1% axit photphoric (H3PO4) và kênh B là MeOH, sử dụng chế độ rửa giải gradient: T (phút) 0–5 5 – 10 10 – 15 15 – 20 20 – 25 B (%) 40 - 70 70 - 80 80 – 85 85 - 90 90 Tốc độ dòng là 1 ml/phút, thời gian chạy là 25 phút, nhiệt độ cột là 300C và detector đƣợc đặt tại 254 nm. Kết quả thu đƣợc cho thấy hàm lƣợng THSG trong các mẫu hà thủ ô chế thấp hơn trong các mẫu hà thủ ô sống, ngƣợc lại, hàm lƣợng EM và physcion thì tăng sau quá trình chế hà thủ ô đỏ. Phƣơng pháp này có ƣu điểm là sử dụng MeOH là dung môi rẻ tiền hơn ACN, thời gian phân tích ngắn hơn (25 phút) so với các nghiên cứu [24],[19]. 20