Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu xây dựng phương pháp multiplex PCR xác định một số tác nhân gây nhiễm khuẩn huyết

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:91

Thêm vào BST

Báo xấu

34
lượt xem 7
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu của đề tài là lựa chọn và thiết kế các mồi đặc hiệu các gen đích của các chủng vi khuẩn gây nhiễm khuẩn huyết; tối ưu điều kiện phản ứng multiplex PCR; thử nghiệm phương pháp multiplex PCR trên mẫu bệnh phẩm của bệnh nhân nhiễm khuẩn huyết.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu xây dựng phương pháp multiplex PCR xác định một số tác nhân gây nhiễm khuẩn huyết

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ---------- Phạm Thị Thùy NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP MULTIPLEX PCR XÁC ĐỊNH MỘT SỐ TÁC NHÂN GÂY NHIỄM KHUẨN HUYẾT LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2016
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ---------- Phạm Thị Thùy NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP MULTIPLEX PCR XÁC ĐỊNH MỘT SỐ TÁC NHÂN GÂY NHIỄM KHUẨN HUYẾT Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. Lã Thị Huyền PGS.TS. Nguyễn Quang Huy Hà Nội - 2016
Lời cam đoan Tôi xin cam đoan: Luận văn là công trình nghiên cứu thực sự của cá nhân, được thực hiện dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS. TS. Nguyễn Quang Huy và TS. Lã Thị Huyền. Các số liệu, kết quả trong luận văn là trung thực và chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tôi xin chịu trách nhiệm về nghiên cứu của mình. Hà Nội, tháng 12 năm 2016 Học viên Phạm Thị Thùy
Lời cảm ơn Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới: PGS. TS. Nguyễn Quang Huy – Trưởng khoa Sinh học - Trường đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc Gia Hà Nội và TS. Lã Thị Huyền – Phụ trách phòng Công nghệ Tế bào Động vật – Viện Công nghệ Sinh học – Viện Hàn lâm và Khoa học Việt Nam đã tận tình hướng dẫn tôi trong quá trình nghiên cứu để hoàn thành luận văn thạc sĩ. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo Khoa Sinh học – Trường đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc Gia Hà Nội nói chung và thầy cô giáo chuyên ngành Sinh học thực nghiệm học nói riêng đã chỉ bảo tận tình và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn Khoa Hóa sinh, khoa Vi sinh và các khoa phòng liên quan của Bệnh viện Thanh Nhàn đã cung cấp mẫu thí nghiệm cho tôi. Tôi xin gửi lời cảm ơn tới các cô chú, anh chị và các bạn công tác tại phòng phòng Công nghệ Tế bào Động vật cùng toàn thể các cô chú, anh chị và các bạn đồng nghiệp Khoa Hóa sinh – Bệnh viện 198 đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành luận văn. Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn tất cả những người thân, bạn bè đã động viên và giúp đỡ tôi trong thời gian qua. Hà Nội, tháng 12 năm 2016 Học viên Phạm Thị Thùy
MỤC LỤC MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................3 1.1. Nhiễm khuẩn huyết ..........................................................................................3 1.1.1. Khái niệm, lịch sử và tình hình nhiễm khuẩn huyết trên thế giới và Việt Nam ......................................................................................................................3 1.1.2. Dấu hiệu của nhiễm khuẩn huyết...............................................................7 1.2. Tác nhân vi khuẩn gây nhiễm khuẩn huyết thường gặp ...................................7 1.2.1. Tụ cầu khuẩn Staphylococcus aureus ........................................................8 1.2.2. Acinetobacter baumannii ...........................................................................9 1.2.3. Klebsiella pneumoniae.............................................................................11 1.2.4. Pseudomonas aeruginosa ........................................................................12 1.2.5. Escherichia coli .......................................................................................14 1.3. Các phương pháp chẩn đoán nhiễm khuẩn huyết ...........................................15 1.3.1. Chẩn đoán nhiễm khuẩn huyết bằng phương pháp cấy máu ...................15 1.3.2. Lai huỳnh quang tại chỗ ..........................................................................15 1.3.3. Các kỹ thuật khuếch đại DNA .................................................................16 1.3.4. Giải trình tự ..............................................................................................18 1.4. Multiplex PCR và ứng dụng ...........................................................................19 1.4.1. Giới thiệu chung về multiplex PCR .........................................................19 1.4.2. Các loại phản ứng multiplex PCR ...........................................................19 1.4.3. Thiết kế mồi cho phản ứng multiplex PCR .............................................20 1.4.4. Ưu điểm của phương pháp multiplex PCR ..............................................21 1.4.5. Tối ưu hóa các thành phần cho phản ứng multiplex PCR .......................22 1.4.6. Ứng dụng của phản ứng multiplex PCR ..................................................24 1.4.7. Tình hình ứng dụng kỹ thuật PCR trong việc xác định các tác nhân nhiễm khuẩn huyết ........................................................................................................25 CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................27
2.1. Vật liệu ...........................................................................................................27 2.1.1. Hóa chất và sinh phẩm .............................................................................27 2.1.2. Thiết bị .....................................................................................................28 2.2. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................28 2.2.1. Thiết kế primer ........................................................................................29 2.2.2. Tách chiết DNA .......................................................................................29 2.2.3. Phương pháp làm giàu DNA vi khuẩn.....................................................30 2.2.4. Xác định nồng độ DNA ...........................................................................31 2.2.5. Phương pháp điện di DNA trên gel agarose ............................................31 2.2.6. Phương pháp PCR....................................................................................32 2.2.7. Phương pháp giải trình tự gen .................................................................33 2.2.8. Đạo đức trong nghiên cứu .......................................................................34 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .........................................................35 3.1. Kết quả lựa chọn và thiết kế mồi đặc hiệu gen đích.......................................35 3.2. Kết quả kiểm tra các cặp mồi bằng thực nghiệm ...........................................38 3.2.1. Kiểm tra DNA tổng số tách chiết từ các chủng vi khuẩn ........................38 3.2.2. Kết quả PCR kiểm tra từng cặp mồi đơn trên các chủng vi khuẩn đích .39 3.2.3. Kết quả xác định trình tự các sản phẩm PCR từ các chủng vi khuẩn Staphylococcus aureus, Acinetobacter baumannii, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae và Pseudomonas aeruginosa .........................................................40 3.2.4. Kiểm tra tính đặc hiệu của các cặp mồi ...................................................43 3.2.5 Kết quả kiểm tra tính đặc hiệu của các cặp mồi và các gen đích trong phản ứng multiplex PCR....................................................................................45 3.3. Kết quả tối ưu phản ứng multiplex PCR xác định đồng thời 5 vi khuẩn đích ....... 47 3.3.1. Kết quả tối ưu nồng độ mồi của phản ứng multiplex PCR ......................47 3.3.2. Kết quả tối ưu nhiệt độ gắn mồi của phản ứng multiplex PCR ...............48 3.3.3. Kết quả lựa chọn Master Mix trong phản ứng multiplex PCR ................50 3.4. Kết quả thử nghiệm phương pháp multiplex PCR trên các chủng nhiễm khuẩn thuần ...........................................................................................................51
3.5. Kết quả thử nghiệm phương pháp multiplex PCR trên mẫu bệnh phẩm .......53 3.5.1. Kết quả thử nghiệm phương pháp multiplex PCR trên các mẫu bệnh phẩm cấy máu ....................................................................................................53 3.5.2. Kết quả thử nghiệm phương pháp multiplex PCR trên các mẫu lâm sàng ....................................................................................................................58 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................61 TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................62 PHỤ LỤC
DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Tiêu chí đặt tên của ACCP / SCCM [16] ....................................................4 Bảng 2.1. Trình tự Nucleotide của các cặp mồi ........................................................27 Bảng 3.1. Trình tự mồi và kích thước sản phẩm PCR theo tính toán lý thuyết ........37 Bảng 3.2. Kết quả thử nghiệm phản ứng multiplex PCR..........................................52 Bảng 3.3. So sánh kết quả multiplex PCR trên các mẫu bệnh phẩm cấy máu .........55 với kết quả của phương pháp cấy máu ......................................................................55
DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Mối quan hệ giữa các phản ứng viêm toàn thân và nhiễm trùng, vùng giao nhau chỉ ra nhiễm khuẩn huyết [16, 56]......................................................................5 Hình 1.2. Hình ảnh và cấu trúc gen vi khuẩn Staphylococcus aureus ........................8 Hình 1.3. Hình ảnh và cơ chế xâm nhập của vi khuẩn Acinetobacter baumannii ....10 Hình 1.4. Hình ảnh và tác động của vi khuẩn Klebsiella pneumonia .......................11 Hình 1.5. Hình ảnh và tác động của vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa .................13 Hình 1.6. Hình ảnh và phân loại vi khuẩn Escherichia coli .....................................14 Hình 1.7. Mô hình mô tả phản ứng multiplex PCR ..................................................20 Hình 3.1. Điện di kiểm tra DNA tổng số của các chủng Staphylococcus aureus, Acinetobacter baumannii, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae và Pseudomonas aeruginosa tách chiết từ các chủng chuẩn .........................................38 Hình 3.2. Kiểm tra tính đặc hiệu của các cặp mồi và các gen đích của các chủng vi khuẩn gây nhiễm khuẩn huyết tương ứng. ................................................................40 Hình 3.3. Kiểm tra khả năng nhân bản đặc hiệu của các cặp mồi femA, gltA, oprL, mdh, phoA với các chủng Staphylococcus aureus, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae và Escherichia coli. ..............................................43 Hình 3.4. Kiểm tra tính đặc hiệu giữa các cặp mồi và các gen đích trong phản ứng multiplex PCR. ..........................................................................................................45 Hình 3.5. Tối ưu nồng độ mồi cho phản ứng multiplex PCR. ..................................47 Hình 3.6. Tối ưu nhiệt độ gắn mồi cho phản ứng multiplex PCR ............................49 Hình 3.7. Lựa chọn thành phần Mastermix trong phản ứng multiplex PCR ............50 Hình 3.8. Thử nghiệm phương pháp multiplex PCR trên mẫu bệnh phẩm cấy máu. ...........................................................................................................................53 Hình 3.9. Thử nghiệm phương pháp multiplex PCR trên mẫu lâm sàng..................59
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ACCP American College of Chest Physicians AW1 Wash buffer AW1 AW2 Wash buffer AW2 BN Bệnh nhân DNA Deoxyribonucleic acid (acid Deoxyribonucleic) dNTP Deoxyribonucleoside triphosphate EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid EtBt Ethidium bromide EtOH Ethanol ICU Intensive care unit (Đơn vị chăm sóc đặc biệt ) MLST Multilocus sequence typing (Xác định trình tự nhiều gen đặc trưng) MRSA Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (Tụ cầu vàng kháng Methicillin) Mutiplex PCR Phản ứng khuếch đại nhiều DNA đích NKH Nhiễm khuẩn huyết NVYT Nhân viên y tế PAF Platelet-activating factor RNA Ribonucleic acid (Acid Ribonucleic) SCCM Socity Critical Care Medicine SDS Sodium dodecyl sulfate SNP Single nucleotide polymorphism (Đa hình sợi đơn ) TAE Tris-EDTA-Acetic acid
MỞ ĐẦU Nhiễm khuẩn huyết (NKH) là một bệnh nhiễm khuẩn toàn thân nặng, gây ra do vi khuẩn và độc tố của vi khuẩn lưu hành trong máu. NKH có nguy cơ tử vong cao do sốc nhiễm khuẩn và rối loạn chức năng nhiều cơ quan. Đặc điểm lâm sàng của NKH rất đa dạng, diễn tiến thường nặng và không có chiều hướng tự khỏi nếu không được điều trị kịp thời. Nhiều năm qua, NKH vẫn là một trong mười nguyên nhân chủ yếu gặp ở bệnh nhân nhập viện. Theo báo cáo của Trung tâm thống kê quốc gia chăm sóc sức khỏe của Mỹ cho thấy: Năm 2008, bệnh nhân nhiễm khuẩn huyết nhập viện tăng gấp đôi so với năm 2000 (326.000 so với 727.000) . Đặc biệt, nghiên cứu của Elixhauser A. và tập thể (2009), nhiễm khuẩn huyết ngay lúc nhập viện là 836.000 ca. Chi phí điều trị mỗi ca NKH dao động từ 10.000- 50.000 đô la và lên tới 17 tỷ đô la mỗi năm cho các trường hợp NKH và thời gian nằm viện trung bình tăng thêm 19,6 ngày. Theo thống kê của Fleischmann C. và tập thể (năm 2016) dựa trên 1553 báo cáo từ năm 1979 đến năm 2015 của các nước cho thấy: Đối với các nước thu nhập cao, cứ 100.000 người nhập viện mỗi năm có 437 trường hợp nhiễm khuẩn huyết (sepsis) và 270 trường hợp nhiễm trùng khuẩn nặng (severe sepsis) và tỉ lệ tử vong là 17% đối với nhiễm khuẩn huyết và 26% đối với các nhiễm khuẩn huyết nặng trong thời gian này. Theo tính toán ngoại suy của các nhà khoa học này ước tính toàn cầu có khoảng 31,5 triệu ca nhiễm khuẩn huyết và 19,4 triệu trường hợp nhiễm khuẩn huyết nặng, và khoảng 5,3 triệu người chết mỗi năm. Bệnh nhân mắc nhiễm khuẩn huyết thường có tiến triển bệnh nhanh, đặc biệt là ở các đối tượng trẻ em và người già. Vì vậy, việc phát hiện sớm tác nhân gây bệnh có ý nghĩa quan trọng để điều trị kịp thời và góp phần hạn chế 1
biến tính, giảm tỷ lệ tử vong ở bệnh nhân mắc nhiễm khuẩn huyết. Hiện nay, cấy máu kết hợp với xét nghiệm sinh hóa là phương pháp phổ biến nhất để phát hiện mầm bệnh. Phương pháp này tiến hành đơn giản, dễ thao tác với chi phí thấp nhưng có nhược điểm là tốn nhiều thời gian, không loại trừ được trường hợp âm tính giả. Việc phát hiện DNA của vi khuẩn trong mẫu máu của bệnh nhân được cho là một phương pháp có độ nhạy và chính xác cao. Tuy nhiên, cho đến hiện nay vẫn chưa có phương pháp phát hiện DNA của vi khuẩn nào được cho là chuẩn để ứng dụng vào chẩn đoán nhiễm khuẩn huyết. Vì vậy, nghiên cứu xây dựng một phương pháp chẩn đoán nhanh, có độ nhạy và độ đặc hiệu cao đang là nhu cầu bức thiết hiện nay. Multiplex PCR có thể coi là giải pháp cho những vấn đề trên. Phương pháp này sử dụng nhiều cặp mồi trong cùng một phản ứng cho phép phát hiện nhiều loại tác nhân gây nhiễm khuẩn huyết trong thời gian ngắn với độ chính xác cao. Xuất phát từ những thực tế trên, chúng tôi đã tiến hành đề tài: “Nghiên cứu xây dựng phƣơng pháp multiplex PCR xác định một số tác nhân gây nhiễm khuẩn huyết” nhằm góp phần vào việc chẩn đoán và điều trị cho các bệnh nhân nghi ngờ mắc nhiễm khuẩn huyết tại Việt Nam. Nội dung chính của đề tài bao gồm:  Lựa chọn và thiết kế các mồi đặc hiệu các gen đích của các chủng vi khuẩn gây nhiễm khuẩn huyết.  Tối ưu điều kiện phản ứng multiplex PCR.  Thử nghiệm phương pháp multiplex PCR trên mẫu bệnh phẩm của bệnh nhân nhiễm khuẩn huyết. 2
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Nhiễm khuẩn huyết 1.1.1. Khái niệm, lịch sử và tình hình nhiễm khuẩn huyết trên thế giới và Việt Nam Trong lịch sử, nhiễm khuẩn huyết là một bệnh rất khó khăn để xác định và chẩn đoán. Từ 100 trước công nguyên, các học giả La Mã (116 TCN-27 TCN) đã mô tả về nhiễm khuẩn huyết như sau: “những sinh vật nhỏ, không thể nhìn thấy bằng mắt, có đầy trong không khí và qua hơi thở gây ra các bệnh nguy hiểm”. Tiếp đó các nhà sử học, nhà triết học, nhân chủng học và tiêu biểu là một học giả thời kì phục hưng Niccolo Machiavelli (1469-1527) trong báo cáo của mình cũng đã lần lượt mô tả đầy đủ về nhiễm khuẩn huyết. Ngày nay, chúng ta đã biết rằng sốt lao phổi không phải nhiễm khuẩn huyết. Tuy nhiên trong một thời gian dài, sốt lao phổi được cho là nhiễm khuẩn huyết bởi trong giai đoạn y học chưa phát triển, việc mô tả nhiễm khuẩn huyết rất khó để được chấp nhận cho đến khi triệu chứng bệnh trở nên rõ ràng và khó khăn trong điều trị cùng với tính nghiêm trọng của bệnh thì người ta bắt đầu quan tâm hơn và nỗ lực tìm hiểu đưa ra khái niệm về nhiễm khuẩn huyết [8]. Trong thực tế sự hiện diện của nhiều vi sinh vật gây bệnh hay độc tố của chúng trong máu hoặc mô dẫn tới sự phủ định của những khái niệm chung này đồng thời kéo theo vô số nỗ lực phát triển về dịch tễ học, các công cụ chẩn đoán và xét nghiệm để xác định nhiễm khuẩn huyết [9]. Vào năm 1992, American College of Chest Physicians (ACCP) và Socity Critical Care Medicine (SCCM) cùng công bố các khái niệm của nhiễm trùng huyết (Bảng 1, Hình 1) [16]. Đây là một trong những khái niệm phổ biến nhất về nhiễm khuẩn huyết trong các đơn vị chăm sóc sức khỏe y tế đặc biệt, các trung tâm dịch vụ chăm sóc sức khỏe chuyên sâu khác nhau trên 3
khắp thế giới. Việc mô tả biểu hiện của các phản ứng viêm toàn thân và đưa ra định nghĩa cụ thể cho nhiễm khuẩn huyết, nhiễm khuẩn huyết nặng, sốc nhiễm trùng và hội chứng rối loạn chức năng đa cơ quan là những vấn đề quan trọng trong lĩnh vực nhiễm khuẩn huyết [14, 16, 56]. Bảng 1.1 Tiêu chí đặt tên của ACCP / SCCM [16] Tiêu chí đặt tên của ACCP / Dấu hiệu, Triệu chứng SCCM Nhiệt độ cơ thể > 38°C hoặc
Hình 1.1 Mối quan hệ giữa các phản ứng viêm toàn thân và nhiễm trùng, vùng giao nhau chỉ ra nhiễm khuẩn huyết [16, 56]. Nhiễm khuẩn huyết là một trong những nguyên nhân gây bệnh tật và tử vong hàng đầu ở các bệnh nhân phải nhập viện trên toàn thế giới. Đây là một tình trạng bệnh lý do đáp ứng của cơ thể với sự có mặt của vi khuẩn hay các vi sinh vật gây bệnh khác hoặc độc tố được tạo ra bởi sinh vật gây bệnh lưu hành trong máu và đi tới khắp các cơ quan trong cơ thể. Nhiễm khuẩn huyết gây ra các triệu chứng lâm sàng đa dạng, suy đa tạng, sốc nhiễm khuẩn với tỉ lệ tử vong rất cao (từ 20 – 50%), trong đó sốc nhiễm khuẩn là biểu hiện nặng của nhiễm khuẩn huyết [15]. Mặc dù tần suất mắc nhiễm khuẩn huyết khác nhau tùy theo quốc gia, bệnh viện, mùa trong năm, đường vào của vi khuẩn và đối tượng bệnh nhân, nhưng nhiều nghiên cứu cho thấy, tỷ lệ NKH chỉ chiếm 3 - 10% bệnh nhân (BN) nhập viện và có thể tăng tới 75% nếu BN nằm điều trị tại khoa Hồi sức tích cực (HSTC). Bệnh gây tỷ lệ tử vong cao, dao động 30 - 50% tùy theo nghiên cứu của các tác giả ở những bệnh viện (BV) khác nhau trên thế giới [12, 24]. NKH trong các đơn vị chăm sóc đặc biệt là một thách thức lớn đối với các bác sĩ điều trị [68]. 5
Tại Mỹ, một nghiên cứu trong vòng 22 năm từ năm 1979 - 2000 trên những BN xuất viện cho thấy, có tổng số 10.319.418 trường hợp được chẩn đoán là NKH, chiếm 1,3% số BN nhập viện, trong đó các trường hợp mắc mới là 17,3%/năm. Tần suất mắc bệnh trên 100.000 dân cư tăng từ 164.000 ca (82,7ca/100.000 dân) năm 1979 lên tới 660.000 ca (240,5 ca/100.000 dân) trong những năm gần đây. Tuy nhiên, ngược lại tỷ lệ tử vong lại giảm từ 28,7% (năm 1979 – 1984) xuống còn 17,9% (năm 1995 – 2000) do những nỗ lực can thiệp trong chẩn đoán, điều trị đem đến [55]. Một nghiên cứu khác của Lambiase và tập thể (2011) cho thấy tỷ lệ NKH tiên phát tăng từ 11,6/10000 ca (năm 2000) lên đến 24/10000 ca (năm 2008) và NKH mắc phải trong quá trình nằm viện tăng từ 22,1/10.000 ca (năm 2000) lên đến 37/10.000 ca (năm 2008) [48]. Tại Anh, nghiên cứu của Harrison và tập thể (2006) trên 92.673 BN nhập viện cho thấy, tình trạng NKH nặng xuất hiện trong vòng 24 giờ đầu tăng từ 23,5% (1996) lên đến 28,7% (2004) và tử vong cũng tăng từ 9.000 ca (48,3%) năm 1996 lên đến 14.000 ca (44,7%) năm 2004 [37]. Nghiên cứu của Jason và tập thể (2011), tại 150 khoa HSTC của 16 nước trong khu vực châu Á, tỷ lệ NKH trên BN nằm tại khoa HSTC tỷ lệ dao động từ 5 – 53% tùy theo quốc gia [40]. Nghiên cứu của Divatia và tập thể (2012), ở Ấn độ trên BN nhập vào khoa HSTC cho thấy, tỷ lệ NKH là 26% và tử vong là 38% [27]. Tại Việt nam, trong báo cáo của Nguyễn Văn Kính và Tập thể (2008), khi phân tích thực trạng sử dụng kháng sinh tại Việt Nam cho thấy, tỷ lệ NKH nói chung là 8% [3]. Mới đây, nghiên cứu của Vũ Đình Phú và tập thể (2013) ở các khoa HSTC của 15 bệnh viện trong toàn quốc cho thấy tỷ lệ NKH chiếm 10,4% [4]. 6
1.1.2. Dấu hiệu của nhiễm khuẩn huyết  Các dấu hiệu và triệu chứng chung: Sốt cao (đôi khi hạ thân nhiệt), thở nhanh hoặc nhiễm kiềm hô hấp, tràn dịch, phù nề.  Dấu hiệu chung về phản ứng gây viêm: Tăng hoặc giảm số lượng tế bào bạch cầu, tăng dấu hiệu viêm (C-reactive protein, procalcitonin, interleukin-6).  Thay đổi huyết áp động mạch: Hạ huyết áp động mạch, nhịp tim nhanh không rõ nguyên nhân, áp lực mạch máu thấp, tràn dịch dưới da, lượng nước tiểu giảm.  Các dấu hiệu của rối loạn chức năng nội tạng: thiếu oxy máu (tổn thương phổi cấp tính), tình trạng thần kinh bị ảnh hưởng, không giải thích được thay đổi chức năng thận, tăng đường huyết, giảm tiểu cầu hoặc đông máu nội mạch rải rác, không rõ nguyên nhân thay đổi trong các thử nghiệm chức năng gan (bilirubin), không dung nạp thức ăn (thay đổi nhu động ruột) [21] 1.2. Tác nhân vi khuẩn gây nhiễm khuẩn huyết thƣờng gặp Nhiễm khuẩn huyết do vi khuẩn xâm nhập trực tiếp vào máu hoặc từ các ổ nhiễm khuẩn ở mô và cơ quan như: Da, mô mềm, cơ, xương khớp, hô hấp, tiêu hóa... Ban đầu, bệnh được mô tả gắn liền với các vi khuẩn Gram âm. Nguyên nhân là do nhiễm khuẩn huyết được coi là một phản ứng của cơ thể với nội độc tố (endotoxin) một phân tử tương đối đặc hiệu cho các vi khuẩn Gram âm. Tuy nhiên trong giai đoạn 1979-2000, nguyên nhân gây nhiễm khuẩn huyết do vi khuẩn Gram dương lại chiếm ưu thế [17]. Trong các chủng vi khuẩn gây nhiễm khuẩn huyết, Staphylococcus aureus là chủng Gram dương phổ biến nhất, còn Acinetobacter baumannii, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae và Pseudomonas aeruginosa chiếm ưu thế trong các chủng Gram âm [38]. Tác nhân gây NKH nổi lên hiện nay là vi khuẩn Gram âm và Gram dương bởi bệnh cảnh lâm sàng thường nặng và hay kèm theo có sốc nhiễm 7
khuẩn. Tử vong ở bệnh nhân có sốc nhiễm khuẩn, có thể lên tới 80%. Hơn nữa, việc điều trị mầm bệnh là vi khuẩn rất khó khăn do khả năng đề kháng với kháng sinh cao của chúng [79]. Do đó phương pháp xác định nhanh tác nhân gây nhiễm khuẩn là hết sức quan trọng. Phương pháp multiplex PCR hiện nay là phương pháp có khả năng đáp ứng được yêu cầu của thực tế. Vì vậy chúng tôi tiến hành nghiên cứu phát hiện 5 chủng vi sinh vật gây nhiễm trùng huyết phổ biến (Staphylococcus aureus, Acinetobacter baumannii, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae và Pseudomonas aeruginosa) sử dụng phương pháp multiplex PCR với mong muốn góp phần vào việc phát hiện sớm nhiễm khuẩn huyết và góp phần điều trị hiệu quả. 1.2.1. Tụ cầu khuẩn Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus là vi khuẩn Gram dương hàng đầu gây nhiều bệnh khác nhau, từ bệnh nhẹ về da, nhiễm trùng mô mềm tới ảnh hưởng đời sống bệnh nhân như nhiễm trùng sau phẫu thuật, nhiễm trùng huyết và hội chứng sốc độc tố. Staphylococcus aureus kháng Methicillin (MRSA) và Staphylococcus aureus mẫn cảm với Methicillin (MSSA) là nguyên nhân gây tỷ lệ lớn nhiễm trùng bệnh viện dẫn tới điều trị khó khăn [65]. Hình 1.2. Hình ảnh và cấu trúc gen vi khuẩn Staphylococcus aureus (http://suckhoedoisong.vn/han-che-benh-do-vi-khuan-tu-cau-n80035.html) http://www.jenner.ac.uk/staphylococcus-aureus https://www.pinterest.com/pin/519462138241501307/ 8
Theo nghiên cứu của Anthony và tập thể (2016), trong số 71 bệnh nhân được chăm sóc đặc biệt thì số bệnh nhân nhiễm khuẩn huyết chiếm 49%, nguyên nhân do Staphylococcus aureus chiếm tỉ lệ cao nhất (18,2%) và 8% Staphylococcus aureus được phân lập kháng Methicillin [11]. Trong thập kỷ qua, các trường hợp nhiễm MRSA ngày càng gia tăng, MRSA gây nhiễm khuẩn bệnh viện và nhiễm khuẩn mắc phải từ cộng đồng bao gồm viêm nội mạc tim, viêm tủy xương, hội chứng sốc nhiễm độc, viêm phổi, ngộ độc thực phẩm và nhọt độc [39]. MRSA kháng methicillin ở tụ cầu qua trung gian PBP2a, một loại protein được gọi là protein liên kết penicillin (78 kDa). Protein này có ái lực thấp với nhóm kháng sinh β-lactam. Gen femA mã hóa cho protein PBP2a kháng methicillin, do đó gen này được sử dụng như một marker phân tử phát hiện MRSA [40, 42]. Staphylococcus aureus kháng Methicillin được phát hiện trong một nghiên cứu của Hassanain và tập thể (2009). Trong nghiên cứu này các tác giả sử dụng phương pháp nhân bản gen đa mồi. 5 gen được nhân bản bao gồm: 16S rRNA của chi Staphylococcus, MecA của Staphylococcus aureus, gen MecA mã hóa cho kháng methicillin, gen Luks mã hóa sản xuất của Panton- Valentine leukocidin (PVL) cytotoxin hoại tử và một gen nội chuẩn để tránh hiện tượng âm tính giả. Thử nghiệm trên 230 chủng phân lập lâm sàng, cho thấy phương pháp có độ nhạy 97,6% và độ đặc hiệu lên tới 99,3% [38, 75]. 1.2.2. Acinetobacter baumannii Acinetobacter baumannii là cầu trực khuẩn, gram âm, hiếu khí, không lên men glucose. Nhu cầu sinh trưởng đơn giản và khả năng chống chịu các điều kiện môi trường rất cao do vậy Acinetobacter baumannii xuất hiện phổ biến trong môi trường và là một phần của hệ vi khuẩn trong cơ thể người [44]. Trong những nghiên cứu gần đây, chúng ngày càng được chỉ ra là một vi sinh vật quan trọng trong các loại nhiễm trùng khác nhau ở bệnh viện bao gồm 9
nhiễm trùng do viêm phổi, nhiễm trùng máu, nhiễm trùng đường tiết niệu, nhiễm trùng vết thương và viêm màng não [45]. Acinetobacter baumannii có khả năng sống sót trong điều kiện khắc nghiệt cùng với khả năng tiếp nhận và tích lũy các gen kháng kháng sinh cao cấp dẫn tới sự kháng thuốc hàng loạt [22, 48]. Hình 1.3. Hình ảnh và cơ chế xâm nhập của vi khuẩn Acinetobacter baumannii http://acinetobacterbaumannii.com/ http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fcimb.2013.00095/full Nguyễn Thị Thanh Hà đã tiến hành nghiên cứu lâm sàng trên 287 bệnh nhân NKH do Acinetobacter baumannii và nhận thấy: NKH gặp nhiều ở trẻ em, tử vong cao (33,1%), lâm sàng thường nặng và diễn tiến nặng gặp ở người lớn nhiều hơn trẻ em với tỷ lệ tử vong cao hơn (50,8% so với 20,4%), hôn mê nhiều hơn (26,6% và 13,7%), phải hô hấp hỗ trợ nhiều (40% và 22,1%), tỷ lệ sốc nhiễm khuẩn cao (45,8% và 26,3%), suy đa tạng nhiều hơn (45,8% và 31,7%), phải sử dụng thủ thuật xâm lấn nhiều hơn và người lớn có nguy cơ tử vong cao hơn trẻ em [2]. Bằng kỹ thuật sinh học phân tử Multiplex-PCR đã phát hiện gen OXA trên 62 chủng Acinetobacter baumannii từ những BN được chẩn đoán NKH: 62 chủng đều mang gen 10