Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu xây dựng quy trình phát hiện nhanh virus cúm gia cầm A/H5N1 trong mẫu bệnh phẩm bằng kỹ thuật Multiplex Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction

Chia sẻ: Na Na | Ngày: | Loại File: DOC | Số trang:84

Thêm vào BST

Báo xấu

71
lượt xem 9
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu của luận văn nhằm thiết kế và lựa chọn được các mồi phù hợp để thực hiện phản ứng multiplex RT-PCR phát hiện virus cúm A/H5N1; nghiên cứu tối ưu hóa được các điều kiện của phản ứng multiplex RT-PCR: nhiệt độ và thời gian gắn mồi, nồng độ mồi,...; thử nghiệm được phản ứng multiplex RT-PCR phát hiện A/H5N1 trên một số mẫu bệnh phẩm thu thập từ người và gia cầm.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu xây dựng quy trình phát hiện nhanh virus cúm gia cầm A/H5N1 trong mẫu bệnh phẩm bằng kỹ thuật Multiplex Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction

MỞ ĐẦU Trong những năm gần đây, dịch cúm gia cầm do virus A/H5N1 là vấn đề quan tâm đối với cả thế giới, đặc biệt là đối với các nước châu Á như Việt Nam, Indonesia, Thái Lan, Trung Quốc... Kể từ cuối năm 2003 đến nay, dịch cúm A/H5N1 đã gây thiệt hại rất lớn cho ngành chăn nuôi gia cầm và gây tử vong cho hàng trăm người. Cả thế giới đang lo sợ trước nguy cơ có thể xảy ra một đại dịch cúm trên người do virus A/H5N1 giống như các vụ đại dịch cúm đã xảy ra trong thế kỷ 20. Các nước trên thế giới đã tiêu tốn hàng tỷ đô la cho việc chuẩn bị chống lại một đại dịch cúm H5N1 có thể xảy ra trong tương lai như mua thuốc và các thiết bị y tế, nghiên cứu sản xuất vaccine, thực hành các phương án phòng chống dịch, thực hiện các chiến lược nhằm kiểm soát chặt chẽ đường biên giới... Ở Việt Nam, kể từ năm 2003 đến nay, dịch cúm gia cầm liên tục xảy ra ở hầu hết các tỉnh thành trên toàn quốc. Mỗi năm có hàng triệu gia cầm bị chết và tiêu hủy. Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới, Việt Nam đang đứng thứ 2 trên thế giới (sau Indonesia) về số người nhiễm và tử vong do virus A/H5N1. Virus cúm A/H5N1 là virus có khả năng biến đổi gen nhanh chóng và hình thành nên các chủng virus mới nên việc sử dụng vaccine để dự phòng thường không đạt được hiệu quả cao. Ở Việt Nam hiện nay, dịch cúm A/H5N1 vẫn liên tục xảy ra trên gia cầm và người, mặc dù mức độ không trầm trọng như giai đoạn trước đây nhưng nếu không được phát hiện và có các biện pháp dập dịch kịp thời thì dịch có thể trở nên bùng phát. Khi có dịch cúm gia cầm, một phương pháp chẩn đoán nhanh, nhạy và chính xác là cần thiết cho việc điều trị, kiểm soát và ngăn chặn kịp thời tránh lây lan rộng ra cộng đồng. Để phát hiện virus cúm A/H5N1 trong các mẫu bệnh phẩm ở người và gia cầm, hiện nay hầu hết các phòng xét nghiệm đều áp dụng kỹ thuật RTPCR (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction). Đây là kỹ thuật 1
sinh học phân tử, cho phép phát hiện virus với độ chính xác cao, thời gian làm xét nghiệm khoảng 46 giờ nếu thực hiện Realtime RTPCR và 1224 giờ nếu thực hiện RTPCR và điện di trên gel agarose. Với RTPCR thông thường, ng ười ta phải thực hiện ba phản ứng để chẩn đoán xác định virus cúm A/H5N1, bao gồm: một phản ứng để xác định virus cúm A, một phản ứng xác định subtype H5 và một phản ứng xác định subtype N1. Để đơn giản hóa quá trình xét nghiệm, rút ngắn thời gian xét nghiệm và tiết kiệm chi phí người ta có thể ứng dụng kỹ thuật multiplex RTPCR, cho phép chẩn đoán xác định cúm A/H5N1 chỉ với một phản ứng RTPCR thay vì phải làm ba phản ứng RTPCR. Tuy nhiên, việc nghiên cứu thiết kế và xây dựng quy trình thực hiện kỹ thuật multiplex RTPCR khá phức tạp nên hiện nay hầu hết các phòng xét nghiệm trong nước chưa áp dụng kỹ thuật này trong chẩn đoán cúm A/H5N1. Chính vì vậy, chúng tôi thực hiện ”Nghiên cứu xây dựng quy trình phát hiện nhanh virus cúm gia cầm A/H5N1 trong mẫu bệnh phẩm bằng kỹ thuật Multiplex Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction” tại Labo Trường Đại học Y Thái Bình với mục tiêu: 1. Thiết kế và lựa chọn được các mồi phù hợp để thực hiện phản ứng multiplex RTPCR phát hiện virus cúm A/H5N1. 2. Nghiên cứu tối ưu hóa được các điều kiện của phản ứng multiplex RT PCR: nhiệt độ và thời gian gắn mồi, nồng độ mồi,... 3. Thử nghiệm được phản ứng multiplex RTPCR phát hiện A/H5N1 trên một số mẫu bệnh phẩm thu thập từ người và gia cầm. 2
Chương 1. TỔNG QUAN 1.1. ĐẠI CƯƠNG VỀ VIRUS CÚM A/H5N1 1.1.1. Phân loại học và danh pháp 1.1.1.1. Phân loại virus cúm Theo ủy ban Quốc tế về phân loại virus (ICTV International Committee on Taxonomy of Viruses), virus cúm thuộc nhóm V, họ Orthormyxoviridae, gồm 3 type là A, B và C. Chúng là các virus có vật liệu di truyền là RNA sợi đơn âm [32]. Sự phân biệt virus cúm A, B và C dựa trên sự khác nhau về đặc tính kháng nguyên của nucleoprotein (NP) và protein nền M1 (matrix protein). Ngoài ra, hệ gen của virus cúm A và B đều có 8 đoạn RNA còn virus cúm C chỉ có 7 đoạn RNA [36]. Trong 3 type thì type A là virus có giới hạn vật chủ rất rộng, lưu hành phổ biến trên gia cầm và một số động vật có vú như lợn, ngựa, chó, mèo, hải cẩu,… và cả con người [32]. Virus cúm A là loại có độc lực mạnh nhất, có khả năng biến đổi gen rất lớn và nguyên nhân chủ yếu gây ra các vụ đại dịch cúm trong thế kỷ qua. Dựa vào sự khác biệt về đặc tính kháng nguyên của hai glycoprotein là haemagglutinin (HA) và neuraminidase (NA), virus cúm A còn được chia thành 16 subtype HA (H1H16) và 9 subtype NA (N1N9). Sự tái tổ hợp giữa các subtype HA và NA, về mặt lý thuyết sẽ tạo ra nhiều subtype khác nhau về độc tính và khả năng gây bệnh [2]. Tất cả các subtype HA và NA đều hiện diện trên 3
các chủng virus lưu hành ở các loài thủy cầm hoang dã. Tuy nhiên, chỉ có một số subtype nhất định thường xuyên lưu hành trên người như H1N1, H1N2, H2N2, H3N2 [11]. Cúm A/H5N1 là một subtype có khả năng gây nhiễm cao của virus cúm. Các chủng của virus cúm gia cầm có thể xâm nhiễm vào nhiều loại động vật khác nhau như chim, lợn, ngựa, hải cẩu, cá voi và con người. Virus cúm B và virus cúm C lưu hành chủ yếu trên người và chỉ gây ra các vụ dịch ở mức độ vừa và nhỏ. 1.1.1.2. Phân loại virus cúm A/H5N1 Virus cúm A/H5N1 được phân biệt với các subtype virus cúm A khác dựa trên sự khác biệt về đặc tính kháng nguyên HA và NA. Do có khả năng biến đổi di truyền nhanh chóng nên các chủng virus cúm A/H5N1 đang lưu hành còn được phân chia thành nhiều clade/subclade (nhóm/phân nhóm), mỗi clade/subclade có các đặc điểm di truyền đặc trưng [2]. Các genotype của virus cúm A/H5N1 Trong những năm gần đây virus cúm A/H5N1 đã có những biến đổi di truyền và được phân chia thành nhiều nhóm dựa vào sự khác biệt về kiểu gen (genotype). Kiểu gen của virus cúm A/H5N1 thể hiện đặc điểm di truyền của virus được hình thành do sự kết hợp của 8 phân đoạn gen. Trên cơ sở gen H5 và N1 của chủng gốc Goose/Guangdong/1/96, virus A/H5N1 được phân chia thành các kiểu gen khác nhau với các đặc điểm di truyền được hình thành do sự tái tổ hợp 6 gen còn lại từ các nguồn khác nhau. Các kiểu gen khác nhau của virus cúm A/H5N1 đã được xác định bao gồm A, B, C, D, E, G, V, W, X 0, X1, X2, X3, Y, Z và Z+ [26]. Trong số các kiểu gen này, chỉ có một số kiểu gen (B, Z, Z+, V, G, W, và X0) lưu hành được trên 2 năm, chứng tỏ chúng đã thích nghi để có thể tồn tại [22]. Kiểu gen Z là kiểu gen lưu hành phổ biến ở Indonesia, Thái Lan, Việt Nam và phía nam Trung Quốc từ năm 2003 đến nay [14]. 4
Các clade của virus cúm A/H5N1 Các tổ chức WHO (World Health Organization), OIE (Organisation for Animal Health) và FAO (Food and Agriculture Organization) đã cùng nhau xây dựng một hệ thống danh pháp thống nhất để có thể xác định các clade A/H5N1 [50]. Hiện nay, hệ thống danh pháp này chia virus A/H5N1 thành 10 clade khác nhau, mỗi clade còn có thể phân thành các subclade (phân dòng) [5, 46]. Hiện tại chỉ có các virus thuộc clade 0, 1, 2 và 7 là lây nhiễm cho người. Clade 2 gồm một số subclade khác nhau vẫn đang lưu hành và tiếp tục hình thành các subclade mới [5]. Kể từ 2008, các clade A/H5N1 hiện đang lưu hành và gây bệnh ở người gồm có clade 2.3.2 (Trung Quốc), 2.3.4 (Trung Quốc và Việt Nam) 2.2 (Ai Cập), 2.1 (Indonesia), 1 (Campuchia) và 7 (Trung Quốc) [51]. 1.1.1.3. Danh pháp virus cúm Tổ chức Y tế thế giới (WHO) đã quy định thống nhất danh pháp c ủa virus cúm theo thứ tự kí hiệu: type virus (A, B hoặc C), vật chủ (có thể bỏ qua nếu vật chủ là người), địa điểm phân lập virus, mã số chủng virus và năm phân lập. Nếu là virus cúm A thì phải thêm kí hiệu của kháng nguyên HA và kháng nguyên NA đặt trong dấu ngoặc đơn. Ví dụ: A/Hong Kong/156/1997 (H5N1) là chủng virus cúm A ở người, phân lập ở Hong Kong, mã số chủng là 156, phân lập năm 1997, có kháng nguyên HA là H5 và kháng nguyên NA là N1. A/Chicken/Vietnam/G62/2005 (H5N1) là chủng virus cúm A phân lập ở gà tại Việt Nam năm 2005, mã số chủng là G62, kháng nguyên HA là H5 và kháng nguyên NA là N1. 1.1.2. Hình thái và cấu trúc virus cúm A/H5N1 ́ ̀ ̣ ̉ ́ ̣ ̣ Orthomyxoviridea. Virus cum H5N1 la môt subtype cua virus cum A, thuôc ho ́ ̣ ̉ ̉ Virus cúm A/H5N1 mang cac đăc điêm cua virus cum A (hình 1.1). ́ 5
Hình 1.1. Cấu trúc của virus cúm A. http://thefutureofthings.com/news/6684/ humanantibodiesneutralizeavianflu.html Virus cúm A là virus có vỏ bọc, cấu trúc dạng hình cầu với đường kính từ 80120 nm (nanomet) hoặc hình sợi dài 200300 nm, đường kính 20 nm. Vỏ bọc của virus là lớp màng lipid kép có nguồn gốc từ tế bào vật ch ủ, trên màng có khoảng 500 cấu trúc hình gai nhô ra. Các cấu trúc này chính là các kháng nguyên bề mặt của virus, dài khoảng 1014 nm, đường kính 46 nm, bản chất là các glycoprotein HA, NA và M2 nằm xen kẽ với nhau. Sự phân bố của các kháng nguyên trên bề mặt của hạt virus không đồng đều, tỉ lệ HA/NA khoảng 45/1. Bên trong màng lipid được lót bởi một lớp protein nền M1 (khoảng 3000 phân tử M1) [36]. Vật chất di truyền (hệ gen) của virus cúm A là RNA sợi đơn âm ()ssRNA, gồm 8 phân đoạn riêng biệt mã hóa cho 10 hoặc 11 protein virus (tuy theo t ̀ ưng ̀ ̉ ̀ ́ ̉ ́ ̣ chung virus ma co thê co hoăc không co protein PB1F2 ́ ). Bên trong hạt virus, mỗi phân đoạn đều liên kết với nucleoprotein (NP) và 3 tiểu đơn vị của enzyme polymerase (bao gồm PB1, PB2, và PA) hình thành nên các phức hợp ribonucleoprotein (viral ribonucleoprotein vRNP) [37]. 1.1.3. Hệ gen và các protein của virus A/H5N1 6
H5N1 có hệ gen là RNA sợi đơn âm bao gồm 8 phân đoạn gen mang tên từ 18 với kích thước phân tử giảm dần hoặc gọi theo tên protein mà chúng mã hóa tổng hợp là PB2, PB1, PB1F2, PA, HA, NP, NA, M (M1 và M2) và NS (NS1 và NEP) (hình 1.2). Hình 1.2. Các phân đoạn gen và các protein của virus cúm A/H5N1 Đặc điểm các phân đoạn gen của virus cúm A/H5N1 như sau: Các phân đoạn mã hóa cho các kháng nguyên bề mặt của virus (đặc trưng theo từng chủng virus): Phân đoạn 4 (gen HA): Có kích thước khoảng 17041707 bases, mang gen mã hóa tổng hợp protein HA, là một kháng nguyên bề mặt của virus cúm có bản chất là glycoprotein. Kháng nguyên này có vai trò trong việc giúp cho virus gắn với tế bào vật chủ và vận chuyển vật liệu di truyền của nó vào bên trong tế bào vật chủ. Quá trình này có thể bị chặn lại nếu có các kháng thể đặc hiệu gắn kết với các kháng nguyên trên bề mặt của virus. Protein HA còn là kháng nguyên bề mặt quan trọng của virus cúm A, kích thích cơ thể sinh ra đáp ứng miễn dịch dịch thể đặc hiệu với từng subtype HA, và tham gia vào phản ứng trung hòa virus. HA là protein vừa quyết định tính kháng nguyên, vừa quyết định độc lực của virus, là đích của bảo vệ miễn dịch nhằm ngăn chặn sự xâm nhiễm của virus ở cơ thể nhiễm, là cơ sở điều chế các vaccine phòng cúm hiện nay. Một đặc điểm di 7
truyền để phân biệt giữa virus cúm gia cầm và virus cúm người là: virus cúm gia cầm chỉ gắn với thụ thể alpha 23 sialic acid còn virus cúm người chỉ gắn với thụ thể alpha 26 sialic acid trên tế bào chủ. Ở một số động vật (lợn, gà...) có cả 2 loại thụ thể nên có thể bị nhiễm cả virus cúm gia cầm và cúm người [24]. Người ta đã phát hiện ra sự đột biến ở một số vị trí trên gen HA làm cho virus cúm gia cầm có thể gắn với tế bào người và gây bệnh cho người [11]. Một số nghiên cứu trong thời gian gần đây đã cho thấy ở người cũng có các thụ thể alpha 23 sialic acid với mật độ rất thấp và ở gia cầm cũng có các thụ thể alpha 26 sialic acid với mật độ rất thấp [28]. Người ta cũng nhận thấy nếu đột biến xảy ra ở 2 vị trí trên gen HA tương ứng với axit amin 182 và 192 thì virus có thể gắn với cả thụ thể của người và gia cầm [10, 27]. Phân đoạn 6 (gen NA): Có kích thước khoảng từ 13501410 bases, mang gen mã hóa cho neuraminidase, một kháng nguyên bề mặt của virus, có vai trò là một enzyme cắt đứt liên kết giữa gốc sialic acid của màng tế bào nhiễm với phân tử carbonhydrate của protein HA, giải phóng các hạt virus con ra khỏi tế bào vật chủ. Ngoài ra, NA còn phân cắt các liên kết glycoside, giải phóng neuraminic acid làm tan loãng màng nhầy bề mặt biểu mô đường hô hấp, tạo điều kiện cho virus nhanh chóng tiếp cận tế bào biểu mô và thoát khỏi các chất ức chế không đặc hiệu . Giống kháng nguyên HA, NA cũng là đích chủ yếu của cơ chế bảo vệ miễn dịch của cơ thể chủ, sinh ra kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên NA của các chủng virus đang nhễm. Như vậy, hai kháng nguyên bề mặt HA và NA của virus là cơ sở điều chế các vaccine phòng cúm hiện này cho người và gia cầm và hạn chế lây truyền sang người [2]. Các phân đoạn mã hóa cho các protein thành phần của enzyme polymerase của virus, có độ dài ổn định và có tính bảo tồn cao, gồm: Phân đoạn 1 (gen PB2) có kích thước khoảng 2431 bases, mang gen mã hóa tổng hợp protein PB2, là tiểu đơn vị thành phần trong phức hợp enzyme 8
polymerase của virus, chịu trách nhiệm khởi đầu phiên mã RNA virus [2]. Nghiên cứu thấy rằng, trên PB2 tất cả các virus cúm gia cầm đều có axit amin ở vị trí 627 là glutamine, còn PB2 ở các chủng A/H5N1 phân lập từ người mang đột biến chứa axit amin lysine ở vị trí 627. Sự có mặt của lysine ở vị trí 627 của PB2 s ẽ tạo thuận lợi cho virus phát triển ở cả đường hô hấp trên và đường hô hấp dưới của động vật có vú, là nguyên nhân làm cho A/H5N1 có độc lực cao [29]. Phân đoạn 2 (gen PB1) có kích thước khoảng 2431 bases, mang gen mã hóa tổng hợp protein PB1 và PB1F2. PB1 là tiểu đơn vị xúc tác của phức hợp enyzme polymerase, chịu trách nhiệm gắn mũ RNA [5]. PB1F2 liên quan đến độc lực của virus và có thể có vai trò quan trọng trong việc xác định mức độ nguy hiểm của dịch cúm [43]. Khi so sánh các chủng virus trong vụ dịch ở Hong Kong năm 1997, người ta nhận thấy sự biến đổi axit amin asparagine ở vị trí 66 thành serine (N66S) trên PB1F2 liên quan đến độc lực của virus. Sự thay đổi axit amin N66S cũng được phát hiện trên PB1F2 của virus cúm gây ra đại dịch cúm năm 1918 [17]. Phân đoạn 3 (gen PA) có kích thước khoảng 2233 bases, là phân đoạn gen bảo tồn cao, mã hóa tổng hợp protein PA, là một tiểu đơn vị của enzyme polymerase chịu trách nhiệm kéo dài RNA trong quá trình tổng hợp RNA của virus [40]. Các phân đoạn mã hóa các protein chức năng khác của virus, chúng có kích thước tương đối ổn định giữa các chủng virus cúm A, gồm: Phân đoạn 5 (gen NP) có kích thước khoảng 1556 bases, mã hóa tổng hợp nucleoprotein (NP), chịu trách nhiệm vận chuyển RNA giữa nhân và bào tương tế bào chủ. NP có đặc tính kháng nguyên biểu hiện theo nhóm virus, tồn tại trong các hạt virus ở dạng kết hợp với mỗi phân đoạn RNA. Phân đoạn 7 (gen M): có kích thước khoảng 1027 bases, mang gen mã hóa tổng hợp protein nền M1 và M2 của virus. Các protein này kết hợp với 2 kháng 9
nguyên bề mặt tạo nên lớp vỏ capsid của virus. Hai protein này được tạo ra từ cùng một phân đoạn RNA với các khung đọc mở khác nhau. Protein M1 gắn với RNA của virus và M2 có tác dụng phá vỡ vỏ bọc của virus để giải phóng các phân đoạn RNA vào tế bào chất của tế bào chủ. M2 là protein xuyên màng có bản chất là một kênh ion, cần thiết cho quá trình xâm nhiễm của virus [36]. Sự thay thế axit amin ở vị trí 31 serin thành asparagine trên protein M2 của một số chủng H5N1 liên quan đến tình trạng kháng amantadin của virus [25]. Phân đoạn 8 (gen NS) có kích thước khoảng 890 bases, ch ứa gen mã hóa cho 2 protein không cấu trúc của virus là NS1 và NEP (nuclear export protein) (thường được gọi là protein NS2). Độc lực của virus liên quan đến protein NS [39]. NS1 là protein có vai trò trong việc ghép nối, dịch mã và vận chuyển RNA qua màng tế bào. NEP có vai trò trung gian trong quá trình v ận chuyển các ribonucleoprotein của virus (vRNPs) vào nhân tế bào chủ. 1.1.4. Chu trình tái bản của virus cúm A/H5N1 Chu trình tái bản của virus cúm xảy ra chủ yếu ở các tế bào biểu mô đường hô hấp, đường tiêu hóa của cơ thể nhiễm (hình 1.3). Hình 1.3. Chu trình tái bản của virus cúm A 10
Khởi đầu chu trình là sự gắn kết của virus với các thụ thể có chứa nhóm sialic acid trên bề mặt tế bào nhiễm nhờ kháng nguyên HA. Khi virus bám gắn được với tế bào, màng tế bào lõm lại hình thành túi thực bào (endosome). Túi thực bào giảm dần pH để giúp cho quá trình hoà nhập màng virus với màng túi thực bào và giải phóng các phức hợp RNP của virus vào tế bào chất của tế bào chủ. Sau đó, cac ph ́ ưc h ́ ợp RNP được vân chuyên vao nhân tê bao đ ̣ ̉ ̀ ́ ̀ ể tổng hợp sợi dương RNA. Sợi dương RNA được làm khuôn để sao mã tạo mRNA và tái bản sợi âm RNA của virus. mRNA được đưa ra tế bào chất để tổng hợp protein của virus. Quá trình tổng hợp protein và tái bản hệ gen của virus là quá trình phức tạp được điều hoà bởi nhiều yếu tố của virus cũng như của tế bào. Các protein PB1, PB2, PA và NP của virus sau khi được tổng hợp sẽ được đưa vào nhân tế bào và kết hợp với RNA virus hình thành các phức hợp RNP và phức hợp được đưa ra tế bào chất. Các protein khác (HA, NA và M2) được glycosyl hoá nhờ mạng lười nội sinh chất và phức hệ golgi của tế bào. Sau khi hoàn thiện, các protein này được đưa đến màng tế bào gắn vào lớp lipid kép và khi mật độ đủ lớn thì các phức hợp RNP và protein M1 cũng tập hợp lại trên màng để hình thành hạt virus thế hệ con gắn trên bề mặt tế bào nhờ liên kết giữa HA với nhóm sialic acid của glycoprotein màng tế bào. Các hạt virus sau đó giải phóng khỏi màng nhờ tác dụng cắt nhóm sialic acid của enzyme neuraminidase. Thời gian từ khi virus xâm nhiễm tế bào đến khi hình thành thế hệ virus con trung bình khoảng 6 giờ. Sự giải phóng các hạt virus mới không phá tan tế bào nhiễm, nhưng các tế bào này bị rối loạn hệ thống tổng hợp các đại phân tử và rơi vào quá trình chết theo chương trình (apoptosis) làm tổn thương mô của cơ thể vật chủ [48]. 1.1.5. Hiện tượng biến đổi kháng nguyên của virus cúm A Virus cúm A là loại virus đặc biệt nhất trong các virus đường hô hấp do có hệ gen phân thành 8 đoạn và khả năng biến đổi kháng nguyên nhanh chóng. Khả 11
năng biến đổi kháng nguyên của virus cúm A là hệ quả của các quá trình biến đổi di truyền của virus. Các cơ chế biến đổi di truyền của virus bao gồm: Hiện tượng trao đổi kháng nguyên (antigenic shift): Antigenic shift là các biến đổi di truyền lớn của virus cúm, tạo ra chủng virus mới từ các chủng virus ban đầu bằng cách sắp xếp lại hệ gen. Quá trình này xảy ra khi virus cúm của các loài khác nhau đồng nhiễm trên cùng một vật chủ (ví dụ như hai chủng virus cúm người và virus cúm gia cầm đồng nhiễm trên lợn) trao đổi hệ gen cho nhau, tạo ra các thế hệ virus mới có các phân đoạn gen kết hợp từ các chủng ban đầu. Sự trao đổi kháng nguyên có thể tạo ra các chủng virus cúm mới có khả năng lây nhiễm các loài vật chủ mới hoặc gia tăng động lực gây bệnh [2]. Hiện tượng lệch kháng nguyên (antigenic drift): Antigenic drift là quá trình tích lũy các đột biến gen trên gen mã hóa cho các kháng nguyên quan trọng của virus (kháng nguyên HA và NA). Do enzyme polymerase của virus không có cơ chế đọc sửa nên trong quá trình tái bản tần số đột biến ở virus rất cao, trung bình mỗi lần tái bản hệ gen của virus sẽ có 1 nucleotid bị biến đổi [21]. Qua nhiều thế hệ virus, các đột biến này dần dần được tích lũy lại và đến một lúc nào đó sẽ làm thay đổi đặc tính kháng nguyên của virus [21]. Chủng virus cúm với các đặc tính kháng nguyên mới có thể thoát khỏi hệ thống miễn dịch của cơ thể và dễ dàng lan truyền trong quần thể. Hiện tượng glycosyl hóa: Glycosyl hóa (glycosylation) là sự gắn kết của một chuỗi oligosaccharide với amino acid asparagine ở một số vị trí nhất định trong chuỗi polypeptide HA hay NA, hay một số polypeptide khác của virus cúm. Thông thường chuỗi oligosaccharide được gắn tại vị trí NXS/T (N = asparagine; X = amino acid bất kì, trừ proline; S/T = serine hoặc threonine) [7]. Đây là những vị trí được cho là gắn kết với các kháng thể được cơ thể sinh ra do kích thích của kháng nguyên, nhằm bảo vệ cơ thể nhiễm. Hiện tượng lệch kháng nguyên sinh ra đột biến điểm hình thành bộ mã của asparagine, tạo tiền đồ cho hiện tượng 12
glycosyl hóa xảy ra khi tổng hợp chuỗi polypeptide HA hay NA, làm thay đổi đặc tính kháng nguyên của HA và NA, giúp cho virus thoát khỏi tác động miễn dịch bảo vệ của cơ thể chủ và điều hoà sự nhân lên của virus [7]. Hiện tượng lệch kháng nguyên và glycosyl hóa tao ra nh ̣ ưng biên đôi di ̃ ́ ̉ ̉ ưng diên ra liên t truyên nho nh ̀ ̃ ục trong qua trinh l ́ ̀ ưu hanh cua virus trong t ̀ ̉ ự nhiên. Ngược lai, hi ̣ ện tượng trao đôi kháng nguyên ̉ có thể xảy ra với tất cả các chủng của virus cúm A khi co hiên t ́ ̣ ượng đồng nhiễm, tao ra cac biên đôi di truyên l ̣ ́ ́ ̉ ̀ ớn ̉ va hinh thanh chung virus m ̀ ̀ ̀ ơi. Đây cũng chính là v ́ ấn đề đáng lo ngại của virus cúm A/H5N1 hiện nay, mặc dù virus này chưa có sự thích nghi lây nhiễm dễ dàng ở người, nhưng nó có khả năng gây bệnh cho người vơi ti lê t ́ ̉ ̣ ử vong rât cao. Nêu ́ ́ như chung virus A/H5N1 trao đôi gen HA hay NA, ho ̉ ̉ ặc cả hai gen vơi môt chung ́ ̣ ̉ virus cúm A đã thích nghi ở người (vi du nh ́ ̣ ư H1N1 hoăc H3N2) co thê t ̣ ́ ̉ ạo ra chủng virus mới thích ứng lây nhiễm dễ dàng ở người, la nguy c ̀ ơ của một đại dịch cúm mới [25]. 1.1.6. Khả năng thích ứng vật chủ của virus cúm A Vật chủ tự nhiên của tất cả các chủng virus cúm A là các loài thủy cầm hoang dã (chủ yếu là vịt trời), đây là nguyên nhân lan truyền virus trong t ự nhiên rất khó kiểm soát. Virus cúm A có khả năng gia tăng biên độ vật chủ của chúng trong quá trình lây truyền ở tự nhiên (hình 1.4). 13
Hình 1.4. Các vật chủ tự nhiên và khả năng lây nhiễm giữa các loài vật chủ của virus cúm A. http://www.medicalecology.org/diseases/influenza/print_influenza.ht Nhờ đặc tính luôn thay đổi kháng nguyên trong tự nhiên, virus cúm A có khả năng xâm nhiễm nhiều loài vật chủ trung gian khác nhau như gia cầm, một số loài động vật có vú (hải cẩu, cá voi, ngựa, lợn…) và cả con người, tạo nên tính thích ứng lan truyền “ nội loài” như gà gà, hay “ ngoại loài” như gà lợn; gà lợn người. Đặc điểm thích ứng vật chủ này là điều kiện thuận lợi cho virus cúm A trao đổi, tái tổ hợp các phân đoạn gen, đặc biệt là các phân đoạn gen kháng nguyên (HA và NA) giữa các chủng, tạo ra một ch ủng virus cúm mới có khả năng thích ứng xâm nhiễm ở loài vật chủ mới của chúng đặc biệt khi chúng vượt qua đượ c “rào cản loài” dễ dàng thích ứng lây nhiễm gây bệnh từ gia cầm sang người và giữa người với người [15]. Các nghiên cứu về virus H5N1 trong thời gian gần đây cho thấy virus đã có những biến đổi để thích nghi lây nhiễm trên người. Hai chủng virus H5N1 phân lập trên người năm 2003 (Hong Kong) cho thấy có hiện tượng giảm ái lực với thụ thể của gia cầm và có ái lực (mặc dù chỉ ở mức thấp) với thụ thể của người và sự thay đổi axit amin ở vị trí 227 (Ser thành Asn) là nguyên nhân làm thay đổi 14
tính đặc hiệu với thụ thể của virus [23]. Đột biến ở vị trí 182 hoặc 192 (Asn182Lys hoặc Gln192Arg) làm cho H5N1 thay đổi đặc tính gắn thụ thể, từ dạng có ái lực với thụ thể của gia cầm chuyển thành dạng có ái lực với thụ thể của người [52]. Trong thế kỷ 20, chỉ có các chủng virus H1N1, H2N2, H3N2 và H1N2 lưu hành trên người. Tuy nhiên trong những năm gần đây có nhiều subtype virus cúm gia cầm như H5N1, H7N3, H7N7, H9N2 và H10N7 đã lây nhiễm cho người. Virus cúm A/H5N1 có khả năng lây nhiễm và gây bệnh cho nhiều loài động vật có vú khác như chó, mèo, hổ, báo… 1.1.7. Độc lực và khả năng gây bệnh của virus cúm A/H5N1 Khả năng gây bệnh của virus cúm A phụ thuộc vào độc lực và tính thích ứng vật chủ của từng chủng virus. Thông thường chúng không gây bệnh hoặc chỉ gây bệnh nhẹ giới hạn ở đường hô hấp của chim hoang dã và gia cầm, nhưng một số chủng thuộc subtype H5, H7, H1, H2 và H3 có thể gây bệnh nặng ở nhiều cơ quan trong cơ thể, gây nên dịch cúm ở gia cầm và người [52]. Dựa vào khả năng gây bệnh của virus trên gia cầm, virus cúm A được chia thành 2 nhóm là nhóm có độc lực cao (Highly Pathogenic Avian Influenza HPAI) và nhóm có độc lực thấp (Low Pathogenic Avian Influenza LPAI). Nhóm LPAI thường chỉ gây ra các bệnh nhẹ ở đường hô hấp, giảm sức đẻ và/hoặc giảm trọng lượng, mặc dù đôi khi có thể gây bệnh với tỉ lệ cao nhưng tỉ lệ chết thường thấp. Trái lại, virus HPAI thường gây chết gia cầm với tỷ lệ cao, ít nhất 75% gia cầm nhiễm đều bị chết [45]. Cho đến nay, tất cả các chủng HPAI đã biết đều thuộc subtype H5 hoặc H7, tuy nhiên không phải tất cả mà chỉ có một số ít các chủng virus thuộc subtype H5 và H7 là HPAI. Protein HA của LPAI có đặc điểm là chỉ có một axit amin kiềm là arginine tại vị trí phân cắt và một axit amin kiềm khác ở trước vị trí phân cắt 3 hoặc 4 axit amin (tùy thuộc vào từng subtype). Do đó, protein HA của LPAI chỉ bị phân cắt bởi các protease ngoại bào (extracellular proteases) do các tế 15
bào hoặc vi khuẩn tại vị trí xâm nhiễm (ví dụ như khí quản và ruột) tiết ra. Trái lại, protein HA của HPAI lại có nhiều axit amin kiềm tại vị trí phân cắt, do đó có thể chịu tác dụng của các protease nội bào (intracellular protease) phổ biến như furin [44]. Chính vì vậy mà HPAI có thể gây bệnh ở nhiều mô, cơ quan khác nhau trên cơ thể vật chủ và gây nên các triệu chứng nặng nề và tỉ lệ tử vong cao. Độc lực và khả năng gây bệnh của virus A/H5N1 được quyết định chủ yếu bởi các protein của virus là HA, PB2, NS1 và PB1F2: Protein HA là kháng nguyên bề mặt quan trong cua virus cúm, giup cho virus co thê găn v ̣ ̉ ́ ́ ̉ ́ ơi cac thu thê sialic ́ ́ ̣ ̉ ̣ ̣ ̀ ̣ ́ ̀ ̉ ị trí phân căt́ acid đăc hiêu trên bê măt tê bao, hoa mang va xâm nhiêm tê bao chu. V ̀ ̀ ̀ ̃ ́ ̀ ̉ ̣ ́ ởi protein HA cua A/H5N1 mang nhiêu axit amin kiêm nên dê dang bi phân căt b ̀ ̀ ̃ ̀ ́ ́ ́ ̉ ̃ ̀ ́ ̉ ở nhiêu mô c cac protease, giup virus co thê lây nhiêm va tai ban ̀ ơ quan khac nhau ́ trong cơ thê vât chu va gây nên cac triêu ch ̉ ̣ ̉ ̀ ́ ̣ ưng năng nê. Protein PB2 la môt thanh ́ ̣ ̀ ̀ ̣ ̀ ̣ ̉ phân quan trong cua ph ̀ ưc h ́ ợp RNP cua virus, tham gia vao qua trinh sao ma va tai ̉ ̀ ́ ̀ ̃ ̀ ́ ̉ ̉ ́ ̉ ̀ ̀ ́ ứng miên dich ban cua virus. Protein NS1 co thê tham gia điêu hoa đap ̃ ̣ ở vât chu, ̣ ̉ ̀ ̣ ́ ̣ ̣ ực cua virus đôi v do đo cung la môt yêu tô quyêt đinh đôc l ́ ̃ ́ ́ ̉ ́ ới con ngươi. PB1F2 ̀ có vai trò gây ra hiện tượng apoptosis làm tổn thương mô, cơ quan của cơ thể nhiễm. 1.1.8. Sức đề kháng của virus cúm A Virus cúm A tương đối nhạy cảm với các tác nhân vật lí hay hóa học. Các hạt virus tồn tại thích hợp trong khoảng pH từ 6.5 đến 7.9. Ở pH quá acid hay quá kiềm, khả năng lây nhiễm của virus bị giảm mạnh. Lớp vỏ ngoài của virus bản chất là lớp lipid kép, có nguồn gốc từ màng tế bào nhiễm, dễ bị phá hủy bởi các dung môi hòa tan lipid, chất tẩy rửa và các chất sát trùng: formaldehyde, phenol, βpropiolacton, sodium hypochloride, acid loãng và hydroxylamine. Virus bị bất hoạt dưới ánh sáng trực tiếp sau 40 giờ, tồn tại được 15 ngày ánh sáng thường, tia tử ngoại bất hoạt được virus nhưng không phá hủy được kháng nguyên của virus. Tuy nhiên, virus cúm A dễ dàng bị tiêu diệt hoàn toàn ở 100oC và ở 60oC/30 phút, tồn tại ít nhất 3 tháng ở nhiệt độ thấp (trong 16
phân gia cầm), và tới hàng năm ở nhiệt độ bảo quản (70oC). Trong phủ tạng gia cầm (40oC), virus tồn tại 2530 ngày nhưng chỉ tồn tại 7 8 ngày ở nhiệt độ cơ thể người (37oC); trong nước, virus có thể sống tới 4 ngày ở nhiệt độ 30oC. 1.2. CHẨN ĐOÁN, ĐIỀU TRỊ VÀ DỰ PHÒNG BỆNH CÚM GIA CẦM A/H5N1 1.2.1. Triệu chứng nhiễm cúm A/H5N1 Ở gia cầm, thời gian ủ bệnh từ vài giờ đến trên hai mươi ngày, biểu hiện các triệu chứng sốt cao, chảy nước mắt, đứng tụm một chỗ, lông xù, phù đầu và mắt, da tím tái, chân xuất huyết, chảy nước dãi ở mỏ. Con vật khi sốt cao có biểu hiện không bình thường ở hệ thống tiêu hóa, hô hấp, sinh sản và thần kinh. Triệu chứng chung là giảm hoạt động, giảm tiêu thụ thức ăn, gầy yếu. Trường hợp nặng có biểu hiện ho, khó thở, rối loạn thần kinh, ỉa chảy, một số con có biểu hiện co giật hoặc ở tư thế không bình thường. Những triệu trứng trên có thể xảy ra cùng một lúc hoặc riêng rẽ [3, 4]. Ở người, thời gian ủ bệnh b ệnh của virus cúm A/H5N1 có thể kéo dài hơn so với cúm mùa, trung bình hầu hết các trường hợp nhiễm A/H5N1 là từ 24 ngày, nhưng một số trường hợp có thể kéo dài hơn, 817 ngày [16]. Các triệu chứng lâm sàng nhiễm cúm A/H5N1 có thể không biểu hiện hoặc biểu hiện các triệu chứng ở các mức độ khác nhau, từ nhẹ như bệnh cúm thông thường (khó thở, ho, sốt) cho đến biểu hiện viêm phổi nặng, hội chứng suy hô hấp cấp (ARDS Acute Respiratory Distress Syndrome) hay hội chứng suy đa tạng (MODS Multiorgan Disfunction Syndrome). Các nghiên cứu cho thấy một số bệnh nhân không biểu hiện triệu chứng (phát hiện qua xét nghiệm) và cũng có trường hợp biểu hiện các triệu chứng không điển hình (viêm não hoặc viêm ́ như cum đường tiêu hóa) [6]. Không giông ́ mua, ̣ nhân nhiêm ̀ bênh ̃ A/H5N1 thương không co biêu hiên nhiêm trung đ ̀ ́ ̉ ̣ ̃ ̀ ường hô hâp trên ma th ́ ̀ ương biêu hiên ̀ ̉ ̣ 17
̣ ̉ ̀ ̀ ường hô hâp d tinh trang viêm phôi va nhiêm trung đ ̀ ̃ ́ ưới. Đăc điêm lâm sang nay co ̣ ̉ ̀ ̀ ́ ̉ ̀ ̣ ̉ ặc hiệu với HA của virus cúm A/H5N1 co nhiêu thê la do cac thu thê đ ́ ́ ̀ ở đường hô ́ ươi. hâp d ́ Triệu chứng cân lâm sang th ̣ ̀ ương găp la: giam sô l ̀ ̣ ̀ ̉ ́ ượng bach câu, đăc ̣ ̀ ̣ ̣ ̀ ̣ ̉ ́ ượng tiêu câu, giam albumin huyêt; tăng ham biêt la bach câu lympho, giam sô l ̀ ̉ ̀ ̉ ́ ̀ lượng môt sô protein huyêt thanh nh ̣ ́ ́ ư aminotransaminase, lactate dehydrogenase va creatine phosphokinase; đ ̀ ường huyêt tăng ro, co thê liên quan đên viêc s ́ ̃ ́ ̉ ́ ̣ ử dung ̣ ̀ ́ ̉ corticosteroid va co thê tăng creatinine mau [31]. ́ Ở nhưng bênh nhân co tai l ̃ ̣ ́ ̉ ượng ̣ ̃ ̀ ̣ ̣ ́ ̉ virus cao trong dich mui va dich nôi khi quan, nh ưng bênh nhân ̃ ̣ ở giai đoan cuôi ̣ ́ ̉ ̣ ̀ ̀ ượng cytokin va chemokin trong mau th cua bênh thi ham l ̀ ́ ương tăng cao, đăc biêt ̀ ̣ ̣ ̀ ́ ́ ́ ư interleukin6, yêu tô hoai t la cac yêu tô nh ́ ́ ̣ ử u va cac interferon, ch ̀ ́ ưng to hiên ́ ̉ ̣ tượng virus đang phat tan trong c ́ ́ ơ thê [19]. ̉ Ở nhưng bênh nhân t ̃ ̣ ử vong, ngươi ta ̀ ̃ ́ ̣ ̀ ̣ ̉ đa phat hiên cac khang nguyên va/hoăc RNA cua virus ́ ́ ở hâu hêt cac mô trong c ̀ ́ ́ ơ ̉ ̉ ́ ̉ ̣ ̣ ̣ ̀ ̉ ương va nao. thê, bao gôm: phôi, khi quan, gan, niêm mac ruôt non, ruôt gia, tuy x ̀ ̀ ̃ Tỉ lệ tử vong đối với bệnh nhân nhiễm cúm A/H5N1 nhập viện tương đối cao, xấp xỉ 60% [13, 16], mặc dù tỷ lệ tử vong chung có lẽ thấp hơn nhiều. Trái ngược với năm 1997, khi phần lớn các ca tử vong xảy ra ở bệnh nhân trên 13 tuổi, cúm A/H5N1 hiện nay gây tỷ lệ tử vong cao ở trẻ nhỏ. Ở trẻ dưới 15 tuổi, tỷ lệ tử vong là 89% [16]. Thời gian trung bình từ khi có triệu chứng đầu tiên đến khi tử vong là 910 ngày (thay đổi từ 630 ngày) và hầu hết bệnh nhân tử vong do suy hô hấp tiển triển [5, 16]. 1.2.2. Các phương pháp xét nghiệm và chẩn đoán nhiễm cúm A/H5N1 Chẩn đoán lâm sàng nhiễm cúm A/H5N1 là rất khó vì triệu chứng của bệnh rất đa dạng và tương tự như một số bệnh khác. Để chẩn đoán xác định người ta thường phải dựa vào các kết quả xét nghiệm xác định sự có mặt của virus, kháng nguyên, kháng thể hoặc RNA của virus trong mẫu bệnh phẩm. 1.2.2.1. Các phương pháp xét nghiệm phát hiện cúm A/H5N1 18
Với đặc điểm cấu tạo và khả năng gây bệnh của virus cúm A/H5N1, kỹ thuật xét nghiệm không chỉ đòi hỏi có độ tin cậy và độ nhạy cao mà thời gian xét nghiệm phải nhanh [34]. Các kỹ thuật xét nghiệm có thể áp dụng trong chẩn đoán virus cúm A/H5N1 bao gồm: phân lập virus; phát hiện kháng nguyên; phát hiện RNA của virus bằng kỹ thuật RTPCR, realtime RTPCR...và phát hiện sự tăng hiệu giá kháng thể trong huyết thanh bệnh nhân. Trong giai đoạn dịch cúm A/H5N1 đang bùng phát thì việc áp dụng các kỹ thuật chẩn đoán nhanh, có thể thực hiện với nhiều mẫu bệnh phẩm cùng một lúc có vai trò hết sức quan trọng. Phương pháp phân lập virus Hiện nay, phân lập virus là tiêu chuẩn vàng trong chẩn đoán cúm A/H5N1 vì các chủng virus sau khi phân lập có thể được dùng trong các nghiên cứu về sau như: giải trình tự, xác định subtype, xác định clade, phân tích các đột biến và hiện tượng tái tổ hợp để tìm hiểu về khả năng tái bản, khả năng lây nhiễm của virus và hiện tượng kháng thuốc của virus. Virus A/H5N1 có thể phân lập bằng cách nuôi cấy trên phôi gà SPF (specific pathogenic free) hoặc nuôi cấy trên tế bào thận chó (MardinDarby canine kidney MDCK) hoặc các dòng tế bào cảm nhiễm với virus cúm khác. Phân lập từ trứng: hầu hết các virus cúm phát triển ổn định trong khoang túi niệu hoặc túi ối của phôi gà 1012 ngày tuổi. Sau khi gây nhiễm trứng 4872 giờ, thu dịch khoang niệu mô, xác định sự có mặt và xác định subtype virus bằng các phản ứng miễn dịch (HA, HI) hoặc RTPCR. Với chủng virus có độc lực cao, phôi có thể bị chết trong vòng 24 giờ sau khi gây nhiễm. Phân lập từ tế bào: Khi nuôi cấy các virus cúm mùa LPAI trên tế bào MDCK, người ta phải bổ sung trypsin để virus có thể tái bản. Tuy nhiên, đối với các virus cúm A/H5N1, vì là HPAI nên virus có thể tái bản mà không cần bổ sung trypsin. 19
Là tiêu chuẩn vàng, nhưng phân lập virus đòi hỏi phải có phòng an toàn sinh học cấp 3 (BioSafety Level 3 BSL3) và thời gian nuôi cấy tương đối lâu, từ 26 ngày. Ngoài ra, sau khi phân lập được virus vẫn phải thực hiện các xét nghiệm khác để chẩn đoán xác định subtype virus. Phương pháp phát hiện kháng nguyên Là phương pháp dùng kháng thể đặc hiệu để phát hiện kháng nguyên virus. Người ta có thể phát hiện kháng nguyên của virus trực tiếp từ mẫu bệnh phẩm bằng một số kỹ thuật khác nhau, tuy nhiên kỹ thuật được sử dụng phổ biến hơn do thời gian xét nghiệm nhanh là: Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang trực tiếp (direct immunofluorescence assay): Tế bào niêm mạc đường hô hấp được cố định trên lam kính, kháng nguyên của virus được phát hiện bằng kháng thể đặc hiệu có gắn huỳnh quang và quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang. Kỹ thuật miễn dịch gắn men (EIA: Enzymelinhked Immunosorbent Assay): Kỹ thuật sử dụng kháng thể đặc hiệu gắn enzyme để phát hiện kháng nguyên virus. Mẫu bệnh phẩm được gắn lên thành giếng, sau khi được ủ với kháng thể có gắn enzyme thì bổ sung cơ chất phù hợp. Nếu có kháng nguyên virus trong mẫu bệnh phẩm thì enzyme sẽ tác dụng với cơ chất làm đổi màu. Kỹ thuật phát hiện kháng nguyên virus nhanh, đơn giản nhưng chỉ phát hiện được các kháng nguyên bảo thủ của virus cúm như NP và M. Do đó, kết quả xét nghiệm dương tính cũng chỉ có thể kết luận là nhiễm virus cúm A, không xác định được có phải là A/H5N1 hay không. Độ nhạy của các kỹ thuật có thể chấp nhận được khi áp dụng trong chẩn đoán cúm mùa ở người, tuy nhiên để chẩn đoán cúm A/H5N1 thì chưa đạt yêu cầu [9, 34]. Hiện nay một số bộ sinh phẩm phát hiện kháng nguyên đặc hiệu của H5N1 đã được đưa ra thị trường và đang được thử nghiệm trong chẩn đoán cho gia cầm. Phương pháp phát hiện kháng thể (chẩn đoán huyết thanh học) 20