Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nông nghiệp: Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của vi khuẩn Salmonella gây bệnh trên vịt nuôi tại huyện Hoài Nhơn, tỉnh Bình Định

Chia sẻ: Xedapbietbay Xedapbietbay | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:71

Thêm vào BST

Báo xấu

43
lượt xem 8
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu chung của đề tài là khảo sát tình hình bệnh do Salmonella gây ra trên vịt, xác định một số đặc điểm sinh học của vi khuẩn Salmonella phân lập được từ vịt nghi mắc bệnh do Salmonella, đánh giá mức độ mẫn cảm kháng sinh của vi khuẩn làm cơ sở cho việc xây dựng phác đồ điều trị hiệu quả trên vịt nuôi tại địa bàn huyện Hoài Nhơn, tỉnh Bình Định.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nông nghiệp: Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của vi khuẩn Salmonella gây bệnh trên vịt nuôi tại huyện Hoài Nhơn, tỉnh Bình Định

i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan rằng, số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực với sự hướng dẫn của giáo viên hướng dẫn TS. Trần Quang Vui. Tôi xin cam đoan số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này hoàn toàn trung thực, chính xác và chưa được dùng để bảo vệ một học vị nào. Tôi cam đoan rằng, mọi sự giúp đỡ để thực hiện luận văn này đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn đều được chỉ rõ nguồn gốc. Thừa Thiên Huế, tháng 7 năm 2016 Tác giả luận văn Hồ Văn Lợi PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
ii LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành được luận văn tốt nghiệp, ngoài sự cố gắng của bản thân, tôi luôn nhận được sự quan tâm giúp đỡ của gia đình, thầy cô giáo, bạn bè đồng nghiệp. Trước hết tôi xin chân thành cảm ơn quý thầy cô giáo Khoa Chăn nuôi - Thú y, phòng Đào tạo sau Đại học, trường Đại học Nông Lâm Huế đã giảng dạy, truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt thời gian học tập tại trường. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy giáo hướng dẫn: TS. Trần Quang Vui đã tận tình giúp đỡ, nhiệt tình hướng dẫn tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn này. Tôi xin chân thành cảm ơn thầy giáo TS. Nguyễn Xuân Hòa - Trưởng bộ môn Vi trùng - Truyền nhiễm, phòng Thí nghiệm Vi trùng – Truyền nhiễm, Khoa Chăn nuôi - Thú y, trường Đại học Nông Lâm Huế đã nhiệt tình giúp đỡ, cung cấp thông tin, tài liệu liên quan và giúp tôi xử lý mẫu, xử lý số liệu trong phòng Thí nghiệm để tôi hoàn thành số liệu nghiên cứu. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến lãnh đạo Chi cục Chăn nuôi và Thú y Bình Định đã tạo điều kiện về thời gian và công việc để tôi được học tập trong suốt 02 năm qua. Tôi xin gửi lời cảm ơn đến lãnh đạo và cán bộ nhân viên Trạm Chăn nuôi và Thú y huyện Hoài Nhơn, toàn thể cán bộ mạng lưới Thú y cơ sở 17 xã, thị trấn của huyện Hoài Nhơn đã tạo điều kiện về công việc điều tra, lấy mẫu, thu thập số liệu trong thời gian thực hiện đề tài. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến gia đình, bạn bè đã chia sẻ, động viên tôi trong suốt thời gian 02 năm học tập. Mặc dù đã có cố gắng, song với kiến thức và năng lực còn nhiều hạn chế, nên không thể tránh khỏi những thiếu sót. Tôi rất mong nhận được sự chỉ bảo của quý thầy cô và ý kiến đóng góp của bạn bè để luận văn của tôi được hoàn thiện hơn. Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn! Thừa Thiên Huế, tháng 7 năm 2016 Học viên Hồ Văn Lợi PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
iii TÓM TẮT Vịt là loài thuỷ cầm có tính thích nghi cao với các điều kiện sinh thái, thích hợp cho việc chăn thả ở những nơi có nguồn nước để tìm kiếm thuỷ động vật và thóc lúa rơi vãi sau thu hoạch. Định hướng phát triển chăn nuôi thủy cầm hiện nay là theo hướng trang trại, công nghiệp và chăn nuôi chăn thả có kiểm soát. Những năm gần đây, chăn nuôi vịt phát triển mạnh, tuy nhiên điều kiện nuôi vịt cần có nước là môi trường thuận lợi cho việc phát triển nhiều loại bệnh truyền nhiễm do vi khuẩn gây ra, trong đó Salmonella có vai trò quan trọng về dịch tể, là một cản trở lớn trong việc phát triển chăn nuôi vịt. Đề tài “Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của vi khuẩn Salmonella gây bệnh trên vịt nuôi tại huyện Hoài Nhơn, tỉnh Bình Định”. Mục tiêu chung của đề tài là khảo sát tình hình bệnh do Salmonella gây ra trên vịt, xác định một số đặc điểm sinh học của vi khuẩn Salmonella phân lập được từ vịt nghi mắc bệnh do Salmonella, đánh giá mức độ mẫn cảm kháng sinh của vi khuẩn làm cơ sở cho việc xây dựng phác đồ điều trị hiệu quả trên vịt nuôi tại địa bàn huyện Hoài Nhơn, tỉnh Bình Định. Đề tài nghiên cứu đã triển khai điều tra phòng vấn 198 hộ chăn nuôi vịt trên địa bàn 6 xã, chia thành 3 vùng theo dõi, vùng ven sông có xã Hoài Đức, Hoài Thanh; vùng ngập nước có xã Tam Quan Nam, Hoài Mỹ; vùng khô có xã Hoài Sơn, Hoài Phú, đã thu thập được mẫu bệnh phẩm vịt nghi mắc bệnh do Salmonella để phân lập vi khuẩn xác định một số đặc điểm sinh học, đánh giá mức độ mẫn cảm kháng sinh, xây dựng phác đồ điều trị thử nghiệm. Kết quả đề tài đã điều tra 54.050 con vịt của 198 đàn, cho thấy tỷ lệ vịt nhiễm bệnh là 23,11% so với tổng đàn điều tra, đề tài cũng đã thu thập được 90 mẫu bệnh phẩm lách vịt mắc bệnh nghi nhiễm Salmonella để phân lập vị khuẩn, kết quả có 54 mẫu phân lập được vi khuẩn Salmonella, chiếm tỷ lệ 59,96%. Kết quả cũng cho thấy Salmonella xảy ra hầu hết ở các xã thuộc các vùng theo dõi. Tất cả các chủng vi khuẩn phân lập được đều có các đặc tính vi sinh vật học của vi khuẩn Salmonella như các tài liệu trong và ngoài nước đã công bố. Các chủng vi khuẩn Salmonella phân lập được đều có độc lực cao, có khả năng gây chết động vật thí nghiệm với tỷ lệ lớn. Khi mổ khám động vật thí nghiệm PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
iv thấy có những triệu chứng bệnh tích điển hình của bệnh ở các cơ quan: tim, gan, lách, ruột, xoang bụng. Các chủng vi khuẩn được phân lập đã kháng với hầu hết các loại kháng sinh phổ biến hiện nay như: Streptomycin, Cefoxitin, Tetracycline, Gentamicin. Phác đồ điều trị sử dụng kháng sinh Colistin và Ampicillin có tỷ lệ vịt khỏi bệnh (85%) cao hơn và thời gian điều trị (4,76 ngày) ngắn hơn so với phác đồ điều trị thường dùng của thú y cơ sở. Trên cơ sở kết quả nghiên cứu của đề tài đề xuất được một số biện pháp phòng và điều trị bệnh hiểu quả đối với bệnh do Salmonella gây ra trên vịt nuôi tại địa phương huyện Hoài Nhơn, tỉnh Bình Định. PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
v MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ........................................................................................................i LỜI CẢM ƠN............................................................................................................ ii TÓM TẮT ................................................................................................................ iii MỤC LỤC .................................................................................................................. v DANH MỤC CÁC BẢNG ...................................................................................... vii DANH MỤC CÁC HÌNH ...................................................................................... viii MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1 1. Tính cấp thiết của đề tài ......................................................................................... 1 2. Mục tiêu của đề tài ................................................................................................. 2 2.1. Mục tiêu chung .................................................................................................... 2 2.2. Mục tiêu cụ thể .................................................................................................... 2 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài ............................................................... 2 3.1. Ý nghĩa khoa học ................................................................................................. 2 3.2. Ý nghĩa thực tiễn ................................................................................................. 3 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU................................... 4 1.1. CƠ SỞ LÝ LUẬN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU ........................................... 4 1.1.1. Hệ vi sinh vật đường tiêu hóa........................................................................... 4 1.1.2. Cảm nhiễm........................................................................................................ 5 1.1.3. Tính gây bệnh của vi khuẩn ............................................................................. 6 1.1.4. Vi khuẩn Salmonella ........................................................................................ 7 1.1.5. Salmonella và bệnh truyền nhiễm .................................................................. 16 1.1.6. Salmonella và trúng độc thực phẩm ............................................................... 17 1.1.7. Salmonella và bệnh phó thương hàn vịt ......................................................... 21 1.2. CƠ SỞ THỰC TIỂN CỦA CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU ............................ 17 1.2.1. Tình hình nghiên cứu bệnh do Salmonella gây ra ở vịt ngoài nước .............. 17 1.2.2. Tình hình nghiên cứu bệnh do Salmonella gây ra ở vịt trong nước ....... Error! Bookmark not defined. PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
vi CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................................................................................................... 28 2.1. ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI NGHIÊN CỨU ........................................................ 28 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ..................................................................................... 28 2.1.2. Phạm vi và thời gian nghiên cứu .................................................................... 28 2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ............................................................................. 28 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................................................................... 29 2.3.1.Vật liệu nghiên cứu ......................................................................................... 29 2.3.2. Phương pháp điều tra...................................................................................... 30 2.3.3. Phương pháp lấy mẫu bệnh phẩm .................................................................. 30 2.3.4. Phương pháp phân lập vi khuẩn Salmonella .................................................. 30 2.3.5. Phương pháp đánh giá độc lực của vi khuẩn Salmonella trên động vật thí nghiệm ...................................................................................................................... 34 2.3.6. Phương pháp kháng sinh đồ ........................................................................... 34 2.3.7. Phương pháp điều trị thử nghiệm trên vịt ...................................................... 36 2.3.8. Phương pháp xử lý số liệu .............................................................................. 36 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ................................. 37 3.1. TÌNH HÌNH BỆNH DO SALMONELLA TRÊN VỊT NUÔI TẠI HUYỆN HOÀI NHƠN, TỈNH BÌNH ĐỊNH .......................................................................... 37 3.2. KẾT QUẢ PHÂN LẬP VI KHUẨN SALMONELLA TỪ MẪU VỊT BỆNH .. 41 3.3. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN SALMONELLA GÂY BỆNH TRÊN VỊT ................................................. 43 3.3.1. Kết quả kiểm tra hình thái vi khuẩn và khuẩn lạc .......................................... 43 3.3.2. Kết quả kiểm tra đặc tính sinh hóa của vi khuẩn ........................................... 46 3.3.3. Kết quả kiểm tra độc lực vi khuẩn Salmonella trên động vật thí nghiệm ...... 51 3.4. KẾT QUẢ LÀM KHÁNG SINH ĐỒ ............................................................... 53 3.5. KẾT QUẢ ĐIỀU TRỊ TRÊN VỊT .................................................................... 56 CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................... 58 4.1. KẾT LUẬN ....................................................................................................... 58 4.2. KIẾN NGHỊ....................................................................................................... 58 TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................ 59 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
vii PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
viii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Thời gian sống của Salmonella trong các loại môi trường ...................... 10 Bảng 1.2. Các biểu hiện sinh hóa của Salmonella ................................................... 12 Bảng 2.1. Dấu hiệu thể hiện khả năng lên men đường của vi khuẩn ....................... 33 Bảng 2.2. Tiêu chuẩn đánh giá mức độ mẫn cảm của vi khuẩn với một số loại kháng sinh ............................................................................................... 35 Bảng 3.1. Tình hình vịt mắc bệnh do Salmonella tại một số xã của huyện Hoài Nhơn, tỉnh Bình Định.............................................................................. 37 Bảng 3.2. Tỷ lệ vịt mắc bệnh và chết do Salmonella ở vịt dưới 2 tháng tuổi .......... 39 Bảng 3.3. Tỷ lệ vịt mắc bệnh và chết do Salmonella ở vịt từ 2 tháng tuổi trở lên... 40 Bảng 3.4. Kết quả phân lập Salmonella từ các mẫu vịt bệnh................................... 42 Bảng 3.5. Kết quả giám định một số đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn Salmonella phân lập được .......................................................................................... 46 Bảng 3.6. Kết quả kiểm tra độc lực của vi khuẩn Salmonella trên chuột nhắt trắng ................................................................................................................. 51 Bảng 3.7. Kết quả kiểm tra mức độ mẫn cảm của vi khuẩn Salmonella đối với một số loại thuốc kháng sinh .......................................................................... 54 Bảng 3.8. Kết quả điều trị trên vịt bệnh do Salmonella ........................................... 57 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
ix DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 2.1. Quy trình phân lập Salmonella “ISO 6579:2002”.................................... 31 Hình 3.1. Biểu đồ tỷ lệ vịt mắc bệnh do Salmonella tại các xã nghiên cứu............. 38 Hình 3.2. Biểu đồ tỷ lệ chết ở vịt mắc bệnh do Salmonella tại các xã nghiên cứu .. 39 Hình 3.3. Tỷ lệ mắc bệnh và tỷ lệ chết do Salmonella theo tuổi vịt ........................ 41 Hình 3.4. Tỷ lệ mẫu vịt bệnh phân lập được vi khuẩn Salmonella theo xã ............. 43 Hình 3.5. Hình thái của vi khuẩn Salmonella sau khi nhuộm Gram........................ 44 Hình 3.6. Đặc điểm của Salmonella trên môi trường tăng sinh ............................... 45 Hình 3.7. Khuẩn lạc Salmonella trên môi trường SS ............................................... 45 Hình 3.8. Đặc điểm của các môi trường khi chưa nuôi cấy vi khuẩn Salmonella ... 47 Hình 3.9. Kiểm tra đặc tính sinh hóa của vi khuẩn Salmonella ............................... 48 Hình 3.10. Đặc điểm của Salmonella trên môi trường KIA..................................... 49 Hình 3.11. Đặc điểm của Salmonella trên môi trường MUI .................................... 50 Hình 3.12. Khuẩn lạc Salmonella trên môi trường thạch máu ................................. 50 Hình 3.13. Mổ khám chuột ....................................................................................... 53 Hình 3.14. Kết quả kiểm tra mức độ mẫn cảm kháng sinh của vi khuẩn Salmonella ............................................................................................. 55 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
1 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Ngành chăn nuôi nước ta chiếm vị trí quan trọng trong sản xuất nông nghiệp và trong cơ cấu kinh tế đất nước. Chăn nuôi với nhiều hình thức khác nhau đã góp phần giải quyết việc làm, nâng cao thu nhập cho người dân, tạo nguồn sản phẩm có giá trị, góp phần tăng trưởng kinh tế đất nước. Mục tiêu chủ yếu của kế hoạch phát triển chăn nuôi của Việt Nam đến năm 2020 cần đạt: Tỷ trọng chăn nuôi trong nông nghiệp chiếm 42%, trong đó sản lượng thịt xẻ các loại đạt khoảng 5.500 ngàn tấn; thịt lợn 63%; thịt gia cầm 32%, thịt bò 4%: sản lượng trứng, sữa đạt khoảng 14 tỷ quả trứng và trên 1.000 ngàn tấn sữa. Định hướng phát triển chăn nuôi gia cầm đến năm 2020, phát triển chăn nuôi gia cầm theo hướng trang trại, công nghiệp và chăn nuôi chăn thả có kiểm soát (Cục chăn nuôi, 2014). Để đạt được những mục tiêu đó cần phải đầu tư cho công tác giống, quan tâm đến vấn đề dinh dưỡng thức ăn, công tác quản lý, đồng thời chú trọng hơn nữa công tác thú y, tăng cường áp dụng các biện pháp khoa học kỹ thuật trong chẩn đoán làm cơ sở cho công tác phòng, chống dịch bệnh ở vật nuôi có hiệu quả. Vịt là loài thuỷ cầm có tính thích nghi cao với các điều kiện sinh thái, thích hợp cho việc chăn thả ở những nơi có nguồn nước để tìm kiếm thuỷ động vật và thóc lúa rơi vãi sau thu hoạch. Những năm gần đây, chăn nuôi vịt thịt phát triển mạnh, tuy nhiên, điều kiện nuôi vịt cần có nước là môi trường thuận lợi cho việc phát triển bệnh do vi khuẩn gây ra, trong đó Salmonella có vai trò quan trọng về dịch tễ, là một cản trở đáng kể trong việc phát triển đàn thủy cầm. Bệnh do Salmonella là một bệnh gây thiệt hại lớn, hay gặp và phổ biến ở vịt còn gọi là bệnh phó thương hàn ở vịt, với những đặc điểm dịch tễ phức tạp, đã gây nên những thiệt hại đáng kể cho người chăn nuôi. Tỷ lệ chết của bệnh khá cao, đặc biệt ở vịt con tỷ lệ chết có thể lên đến 60-70%. Việc ngăn chặn và giảm thiểu được bệnh do Salmonella gây ra ở gia cầm là điều kiện thuận lợi để chăn nuôi thủy cầm phát triển mạnh. Hoài Nhơn là huyện nằm phía bắc của tỉnh Bình Định, có diện tích đất tự nhiên khoảng 412,95 km2, dân số 228.000 người, mật độ dân số 550,7 người/km², PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
2 được đánh giá là một trong những huyện phát triển chăn nuôi tương đối lớn của tỉnh Bình Định. Theo số liệu thống kê tính đến ngày 01 tháng 10 năm 2015, sản lượng chăn nuôi toàn huyện ước đạt: tổng đàn trâu bò 27 ngàn con; đàn heo 130 ngàn con, đàn gia cầm lên đến 530 ngàn con (trong đó đàn thủy cầm 450 ngàn con). Cũng như những địa phương khác trong toàn tỉnh, chăn nuôi vịt ở huyện Hoài Nhơn đang bị đe dọa bởi bệnh do Salmonella gây ra. Hiện nay vẫn chưa có một nghiên cứu cụ thể nào về đặc tính sinh học tiêu biểu của vi khuẩn Salmonella gây bệnh trên đàn vịt nuôi tại địa bàn huyện Hoài Nhơn. Vì vậy việc nghiên cứu phân lập vi khuẩn Salmonella, xác định các đặc tính sinh học, kiểm tra độc lực, mức độ mẫn cảm kháng sinh để đưa ra những nhận định khoa học về các vấn đề nêu trên là rất cần thiết. Xuất phát từ tình hình thực tế đó, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của vi khuẩn Salmonella gây bệnh trên vịt nuôi tại huyện Hoài Nhơn, tỉnh Bình Định”. 2. Mục tiêu của đề tài 2.1. Mục tiêu chung Mục tiêu của đề tài là xác định một số đặc điểm sinh học của vi khuẩn Salmonella phân lập được từ vịt nghi mắc bệnh do Salmonella, đánh giá mức độ mẫn cảm kháng sinh của vi khuẩn làm cơ sở cho việc xây dựng phác đồ điều trị hiệu quả trên vịt nuôi tại địa bàn huyện Hoài Nhơn, tỉnh Bình Định. 2.2. Mục tiêu cụ thể - Xác định được đặc điểm sinh học của một số chủng Salmonella phân lập được. - Xác định được mức độ mẫn cảm với kháng sinh của một số chủng Salmonella đã phân lập. - Xây dựng được phác đồ điều trị thử nghiệm hiệu quả trên vịt bệnh. 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 3.1. Ý nghĩa khoa học Kết quả nghiên cứu cung cấp thông tin và bằng chứng cụ thể về đặc tính sinh học của vi khuẩn Salmonella gây bệnh trên vịt nuôi tại địa phương nghiên cứu. Kết quả nghiên cứu của đề tài là cơ sở để đánh giá mức độ ảnh hưởng của bệnh do vi khuẩn Salmonella đến tình hình chăn nuôi vịt tại huyện Hoài Nhơn, tỉnh Bình Định. PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
3 Kết quả nghiên cứu xác định được những đặc tính sinh vật học đặc trưng của vi khuẩn, chứng minh được khả năng gây bệnh, khả năng kháng một số loại thuốc kháng sinh và sự mẫn cảm với một số loại kháng sinh của vi khuẩn Salmonella phân lập được từ vịt bị bệnh tại địa phương nghiên cứu. 3.2. Ý nghĩa thực tiễn Kết quả nghiên cứu của đề tài phần nào đánh giá được những đặc tính gây bệnh và những nguyên nhân gây bệnh của vi khuẩn Salmonella trên vịt nuôi tại địa phương, Làm cơ sở để xây dựng các biện pháp phòng và chống bệnh, hạn chế những ảnh hưởng của các yếu tố tự nhiên, từ đó có thể giảm được thiệt hại trong chăn nuôi vịt. Kết quả xác định khả năng kháng thuốc kháng sinh và sự mẫn cảm với một số loại kháng sinh thông dụng trên thị trường của Salmonella được phân lập từ đàn vịt nuôi mắc bệnh làm cơ sở xây dựng phác đồ điều trị bệnh phù hợp và có hiệu quả cao cho đàn vịt nuôi, nhằm giảm tỷ lệ chết ở vịt con và tỷ lệ mang trùng của vịt trưởng thành, nâng cao hiệu quả kinh tế trong chăn nuôi. PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
4 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1. CƠ SỞ LÝ LUẬN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1.1. Hệ vi sinh vật đường tiêu hóa Đường tiêu hóa là một ống thông hai phía kéo dài từ miệng đến hậu môn. Do nguồn dinh dưỡng phong phú, phụ thuộc vào mức độ ô nhiễm của thức ăn mà ống tiêu hóa là nơi vi sinh vật rất đa dạng và với số lượng lớn. Xoang miệng là bộ phận đầu tiên của cơ thể động vật tiếp xúc với nhiều loại thức ăn, nước uống từ bên ngoài do đó không tránh khỏi sự xâm nhập của các loại vi sinh vật. Bên cạnh đó biểu bì bong tróc và thức ăn được nhai ở đây là nguồn dinh dưỡng phong phú, nhiều hốc lưu giữ, nhiệt độ thích hợp nên nhiều loại vi sinh vật có thể phát triển tốt. Dạ dày là nơi chứa và tiêu hóa thức ăn. Trong dạ dày đơn có lượng lớn acid chlohydric (HCL, đến 0,2% thể tích chất chứa), đặc biệt nhiều trước khi cho ăn. Acid trong dạ dày có tác dụng ức chế và tiêu diệt vi sinh vật. Vì vậy các vi sinh vật theo thức ăn và nước uống vào dạ dày thường bị tiêu diệt. Tuy nhiên, hiệu quả tiêu diệt thường hạn chế do vi sinh vật thường được bao bọc trong thức ăn và không bị tác động trực tiếp của dịch dạ dày ở nồng độ lớn, do dịch dạ dày bị nước có trong thức ăn pha loãng và sau đó đưa xuống ruột non với dịch tiết có tính kiềm. Hơn nữa, một số vị sinh vật có khả năng đề kháng với acid và phát triển tốt trong môi trường acid. Ruột non có khả năng tự khử trùng mạnh vì vậy lượng vi sinh vật ở đây rất ít, chủ yếu các vi sinh vật đề kháng với acid dạ dày, ngẫu nhiên và không thường trực ở ruột non. Nguyên nhân của khả năng kháng khuẩn của ruột non là dịch dạ dày vẫn còn phát huy, dịch ruột non đặc biệt là dịch niêm mạc không tràng, có tác dụng diệt khuẩn, dịch mật và dịch tụy có khả năng ức chế vi sinh vật. Sự tự khử trùng của ruột non có tác dụng ngăn cản vi sinh vật phát triển, dưỡng chất vì vậy không bị tiêu hao và được hấp thu vào ruột non, ngăn cản sự xâm nhập của vi sinh vật từ phía ruột già và bảo đảm sự an toàn cho ruột non. Tuy vậy ở phần cuối của ruột non dù có van hồi manh tràng trợ lực khi độ kiềm của môi trường giảm có thể có các vi khuẩn lactic có tác dụng ngăn cản vi sinh vật lên men thối, một số cầu khuẩn, trực khuẩn yếm khí sinh nha bào sinh hơi, trực khuẩn có giáp mô sinh hơi PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
5 và E.coli tồn tại. Số lượng và chủng loại vi sinh vật ruột non phụ thuộc nhiều vào điều kiện ngoại cảnh và tình trạng sinh lý sinh hóa của cơ thể con vật. Ruột già là đoạn cuối của ống tiêu hóa, bắt đầu từ manh tràng, qua kết tràng đến trực tràng với điểm kết thúc là hậu môn. Đây là nơi có chức năng hấp thu nước bổ sung, hình thành khuôn phân và có thể hấp thu các acid béo bay hơi và các chất dinh dưỡng khác nhưng thường ở mức độ thấp. Số lượng vi sinh vật ở đây lớn chiếm tỷ trọng lớn trong phân khô và chủng loại vi sinh vật cũng rất phong phú. Vi sinh vật ruột già có mối quan hệ mật thiết với quá trình phân giải chất cặn bả của thức ăn còn sót lại sau tiêu hóa. Trong ruột già quá trình này khá phức tạp và có thể phân thành 2 nhóm: lên men và thối rữa. Sản phẩm của quá trình phân giải chất cặn bả có thể là chất độc như H2S, NH3, CO2, cadaverin, histamin, indol, scatol, phenol...khi được hấp thu vào cơ thể với lượng lớn chúng có thể gây độc cho các cơ năng giải độc của cơ thể (chủ yếu là tế bào gan) chuyển hóa giải độc và làm trở ngại các quá trình đào thải. 1.1.2. Cảm nhiễm Cảm nhiễm hay thường gọi là nhiễm trùng là một trạng thái, quá trình hay hiện tượng mầm bệnh xâm nhập vào cơ thể động vật mẫn cảm, là một hiện tượng sinh học phức tạp xảy ra khi mầm bệnh xâm nhập vào cơ thể động vật, trong những điều kiện nhất định của ngoại cảnh. Sau khi xâm nhập và phát triển trong cơ thể, mầm bệnh tác động nhiều mặt vào cơ thể. Để phản ứng lại, cơ thể chiến đấu với mầm bệnh trong quá trình cảm nhiễm tiến triển. Kết quả của cảm nhiễm có thể dẫn đến phát bệnh hay không phát bệnh tùy thuộc vào nhiều yếu tố. Nếu phát bệnh do cảm nhiễm một mầm bệnh nào đó thì những biểu hiện thường đặc trưng cho bệnh đó. Cùng với sự hình thành và phát triển học thuyết mầm bệnh của Koch và Pasteur. Khi phân tích nguyên nhân và phương pháp phòng bệnh truyền nhiễm, nhiều người đã nhấn mạnh vai trò to lớn của sức đề kháng của cơ thể. Nhiều nhà nghiên cứu đã chứng minh vai trò chủ động của cơ thể trong quá trình nhiễm trùng và đã tìm mọi biện pháp làm tăng sức đề kháng của cơ thể đối với bệnh tật. Tạo điều kiện thuận lợi cho cơ thể và bất lợi đối với mầm bệnh là biện pháp ngăn chặn nhiễm trùng hoặc làm giảm nhẹ sự tiến triển của quá trình đó. Metchnicov đã đưa ra một khái niệm cảm nhiễm là một cuộc đấu tranh giữa hai sinh thể hữu cơ. Hiện tượng đấu tranh giữa cơ thể và mầm bệnh lại xảy ra trong điều kiện nhất định của ngoại cảnh nên còn chịu ảnh hưởng của nhiều nhân tố ngoại cảnh. Trong nhiều trường hợp, ảnh hưởng qua lại của các nhân tố đó đã dẫn đến kết quả là hiện tượng PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
6 cảm nhiễm, phát bệnh hoặc mầm bệnh không thiết lập được sự tồn tại của nó trong cơ thể động vật. Học thuyết stress được coi là thuyết đáng giá đúng tầm quan trọng của cơ thể và môi trường. Học thuyết này đã chứng minh trong thực tiễn rằng khi cơ thể bị kích thích bởi mầm bệnh hoặc yếu tố ngoại cảnh bất kỳ, thần kinh trung ương tiếp nhận và xử lý kích thích để bảo vệ cơ thể. Tuy vậy khả năng chống lại sự xâm nhập của mầm bệnh phụ thuộc vào trạng thái thần kinh, sự tích lũy của cơ thể (tình trạng sức khỏe) và thể trạng của cơ thể. 1.1.3. Tính gây bệnh của vi khuẩn Những thuộc tính chi phối độc tính của vi khuẩn bao gồm: Tính bám dính, tính xâm nhập và sản sinh độc tố. Bám dính là đặc tính thiết yếu đối với vi khuẩn và là tiền đề để phát huy tính gây bệnh. Trong trường hợp không thể bám dính vi khuẩn sẽ bị bài khử khỏi tổ chức ký chủ bởi lớp dày niêm dịch và thể dịch. Sau khi bám dính vi khuẩn hình thành khuẩn lạc nhỏ và bắt đầu giai đoạn tiếp theo của quá trình cảm nhiễm. Vi khuẩn trong quá trình bám dính phải có giai đoạn thiết yếu khi thụ thể của vi khuẩn kết hợp với tính kỵ thủy bề mặt, tính tích điện bề mặt và thụ thể bề mặt tế bào. Tuy nhiên tế bào ký chủ cũng như tế bào vi khuẩn đều có bề mặt tích điện âm nên có tác dụng đẩy nhau. Lực đẩy này bị suy giảm nhờ lực kỵ thủy giữa bề mặt tế bào với vi khuẩn. Bề mặt vi khuẩn càng kỵ thủy thì càng dễ bám dính lên bề mặt tế bào. Nhưng quan trọng hơn, trên bề mặt tế bào cũng như bề mặt vi khuẩn có những phần tử bề mặt phản ứng tương hỗ một cách đặc hiệu. Đa số vi khuẩn có cấu trúc lồi ra bề mặt là khí quan bám dính có dạng lông rung. Xâm nhập: Đối với vi khuẩn mầm bệnh, sự xâm nhập của nó vào tế bào thượng bì ký chủ là giai đoạn trọng yếu trong quá trình cảm nhiễm. Các Salmonella đi qua khoảng gian cách giữa các tế bào thượng bì, còn Yessinia và Chlamydia thì xâm nhập vào trong tế bào thượng bì rồi từ đó đi vào tổ chức. Tế bào vi khuẩn có thể bị đóng kín trong không bào của tế bào chất ký chủ và bị tiêu diệt ở trạng thái này, hoặc không bào dung hợp với lysosome chứa các enzym có tác dụng phân giải mạnh, hình thành các phagolysome trong đó diễn ra quá trình phân hủy vi khuẩn. Nhưng cũng có khi màng không bào bị phân giải, vi khuẩn đi vào tế bào chất và có thể phát triển ở trong đó. Tính sinh độc tố của vi khuẩn thường không liên quan đến tính xâm nhập của chúng, các vi khuẩn không sinh độc tố cũng có thể xâm nhập vào tế bào thượng bì. Tính xâm nhập được chi phối bởi một gene duy nhất của PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
7 nhiễm sắc thể và độc lập với những gen cần thiết cho việc phát huy tính gây bệnh của vi khuẩn do plasmid chi phối. Sinh độc tố: các độc tố do vi khuẩn sản sinh ra được chia thành 2 loại ngoại độc tố và nội độc tố. Ngoại độc tố: các vi khuẩn Gram dương cũng như vi khuẩn Gram âm đều sản sinh độc tố thiết yếu để trở thành nguyên nhân gây bệnh. Độc tố bị làm mất độc tính được goi là giảm độc tố (toxoid) dùng để chế vắc xin phòng bệnh. Các ngoại độc tố cấu thành từ hai bộ phận: phần hấp phụ lên tế bào và phần phát huy độc lực. Enterotoxin là một dạng ngoại độc tố gây tiêu chảy, tiêu chảy có thể do độc tố ruột hoặc do vi khuẩn xâm nhập vào tế bào ruột gây ra. Độc tố gây tiêu chảy gọi là enterotoxin. Enterotoxin do các vi khuẩn sản sinh ra có những thuộc tính lý hóa và sinh học khác nhau nên thường được gọi kèm theo tên loài vi khuẩn. Nội độc tố là phức chất lipopolysacharide của vách tế bào vi khuẩn Gram âm, bài xuất ra môi trường khi tế bào bị dung giải. Các chất này chịu nhiệt, có phân tử lượng 5 – 9.000kDa, có thể chiết xuất bằng phenol. Có thể trắc định nội độc tố bằng trắc nghiệm litmus chất dịch chiết từ tế bào dạng amip của con sam, có khả năng hóa keo khi tiếp xúc với một lượng rất nhỏ nội độc tố vi khuẩn (0,0001g/ml). Tác dụng sinh lý bệnh của các nội độc tố tương tự nhau không phụ thuộc vào loại vi khuẩn, chỉ trừ Bacteroides. Trong bệnh lâm sàng cũng như bệnh thực nghiệm, nội độc tố thường gây sốt, bạch cầu giảm, đường huyết giảm, huyết áp hạ và sốc, lưu dẫn các cơ quan trung khu như não, tim, thận..... bị trở ngại, bổ thể hoạt hóa theo con đường nhánh, đông máu nội huyết quản tràn lan, gây chết... Như vậy, vi khuẩn ảnh hưởng đến cơ thể nhiều mặt. Nhưng sự phát triển và tác động của chúng phụ thuộc vào nhiều yếu tố về bản chất của chúng cũng như phụ thuộc vào sức đề kháng của cơ thể vật chủ. Mầm bệnh có thể bị tiêu diệt hoặc có thể phát triển gây nên bệnh truyền nhiễm (Phạm Hồng Sơn, 2012). 1.1.4. Vi khuẩn Salmonella Vi khuẩn Salmonella là một chi vi khuẩn lớn thuộc họ trực khuẩn đường ruột được Samon và Smith phát hiện vào năm 1886. Hiện nay việc phân loại chi vi khuẩn này không thống nhất giữa các nhà vi sinh vật học khác nhau giữa các khu vực khác nhau. Ở Việt Nam kết quả nghiên cứu bước đầu của (Lê Văn Tạo và cs,1997) cho thấy, S. cholerasuis chiếm 50%, S. typhimurium chiếm 6,25%, S. enteritidis chiếm 12,5% và 31,25% thuộc các loại serotype khác. PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
8 1.1.4.1. Đặc điểm của Salmonella Trực khuẩn Salmonella thuộc bộ Eubacteriales, họ Enterobacteriaceae. Giống Salmonella gồm 2 loài: S. enterica và S. bongori đã được phân chia thành trên 2000 serotype theo bảng phân loại Kauffmann-White trên cơ sở cấu trúc của kháng nguyên thân O, kháng nguyên lông H và đôi khi kháng nguyên vỏ (kháng nguyên K). Gần đây, loài S. enterica đã được phân thành 6 phân loài đó là: S. enterica subsp. enterica, S. enterica subsp. salamae, S. enterica subsp. arizonae, S. enterica subsp. diarizinae, S. enterica subsp. houtenae, S. enterica subsp. indica. Theo (Cù Hữu Phú và cs, 2000), phân loài S. enterica subsp. enterica gồm phần lớn các chủng Salmonella là những tác nhân gây bệnh cho người và động vật. Salmonella spp. được gọi là trực khuẩn đường ruột quan trọng về các khía cạnh bệnh học, dịch tễ học, vệ sinh môi trường, vệ sinh an toàn thực phẩm. Theo (Đào Trọng Đạt và Phan Thanh Phượng, 1986), vi khuẩn Salmonella spp. phân bố rộng khắp trong tự nhiên, có thể xâm nhiễm và gây bệnh cho người, động vật. Sự xâm nhiễm Salmonella spp. vào cơ thể vật chủ và gây bệnh được thực hiện chủ yếu qua đường tiêu hóa và phổ biến nhất là bệnh tiêu chảy. Vi khuẩn phát triển tốt trên môi trường thạch thường ở 35-37oC, sau 20-24 giờ hình thành khuẩn lạc tròn đều từ trong suốt không màu đến hơi đục hoặc có dạng giọt sương, bóng láng. Theo Nguyễn Như Thanh (1997), để nuôi cấy phân lập thường dùng môi trường tuyển lựa như thạch Macconkey, DHL, SS, EMB,… hoặc sau khi nuôi cấy bồi dưỡng trong môi trường 50% dịch mật (bò, lợn,…) rồi dùng môi trường tuyển lựa để nuôi cấy phân lập. 1.1.4.2. Đặc tính về hình thái và tính chất bắt màu Salmonella là trực khuẩn Gram âm, hình que có kích thước dài 2-4 m; rộng 0,6 m. Vi khuẩn không hình thành nha bào và giáp mô, dễ bắt màu với các loại thuốc nhuộm thông thường, khi nhuộm vi khuẩn bắt màu đều toàn thân hoặc hơi đậm ở hai đầu (Đỗ Thị Huyền và Tô Long Thành, 2009). Hầu hết các chủng Salmonella đều có khả năng di động nhờ flagella dạng lông rung, mỗi vi khuẩn có từ 7 đến 12 lông rung xung quanh thân, ngoại trừ S. Gallinarum. Trước kia người ta cho rằng S. Pullorum cũng không có khả năng di động. Nhờ kính hiển vi điện tử, cấu trúc roi của type huyết thanh này cũng được phát hiện là dạng sợi rất mảnh và có số lượng ít hơn flagella của S. Enteritidis. Các chủng Salmonella đều có Fimbriae (Pili hay lông nhung), trừ S. paratyphi A. PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
9 Fimbriae có cấu tạo dạng lông bao phủ trên bề mặt vi khuẩn giúp cho vi khuẩn bám dính vào tế bào chủ. Fimbriae được tạo thành từ các dưới đơn vị fimbrillin chứa lượng lớn amino acid kị nước (40%) (Nguyễn Như Thanh và cs, 2001). 1.1.4.3. Sức đề kháng của Salmonella Salmonella có sức chịu đựng khá lớn với tác động của môi trường bên ngoài. Trong nước thường, Salmonella tồn tại một tuần. Trong nước đá có thể sống 2-3 tháng. Chúng có thể sống sót trong môi trường thạch ở nhiệt độ -10oC trong 115 ngày, sống từ 4 - 8 tháng trong thịt ướp muối với tỷ lệ 29% ở nhiệt độ 6-12oC. Trong phân rác chúng sống trong vòng 4 tháng. Trong xác động vật chết có thể sống từ 2-3 tháng. Ánh sáng mặt trời chiếu thẳng có thể diệt vi khuẩn trong nước trong sau 5 giờ, trong nước đục sau 9 giờ. Ở 50 oC vi khuẩn bị diệt sau 1 giờ, 70oC trong vòng 20 phút, đun sôi trong 5 phút, khử khuẩn theo phương pháp Pasteur cũng bị tiêu diệt. Với hóa chất, Salmonella tỏ ra có sức chịu đựng cao: dung dịch HgCl2 1%, formon 0,2%, axit phenic 3% diệt Salmonella trong 15-20 phút. Dung dịch muối ăn 19%, ở nhiệt độ 8oC Salmonella tồn tại 4-8 tháng. Nhưng đối với một số hóa chất như Cristal violet, lục Malachite, Natrihyposunfit, Dixitrat, muối mật với những nồng độ vừa đủ gây độc cho E. coli thì không ảnh hưởng đến sự phát triển của Salmonella. Dựa vào tính chất này người ta chế tạo những môi trường chọn lọc để kìm hãm sự phát triển của E. coli và giúp cho Salmonella phát triển dễ dàng. Salmonella có thể sống trong thịt ướp muối (29%) được 4-8 tháng ở nhiệt độ từ 6-120C. Xử lý miếng thịt nhiễm trùng bằng hơ lửa hay nướng ít có tác dụng diệt Salmonella ở bên trong (Nguyễn Vĩnh Phước, 1970). Salmonella chủ yếu ký sinh trong ống tiêu hóa của con người và động vật. Ngoài ra vi khuẩn này còn tìm thấy trong nước thải sinh hoạt, sông, các nguồn nước khác và đất. Chúng có khả năng sống rất lâu trong nước (hàng tháng) và trong đất (hàng năm) ( Bảng 1.1). PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
10 Bảng 1.1. Thời gian sống của Salmonella trong các loại môi trường Thời gian sống Môi trường 89 ngày Nước máy 115 ngày Nước ao 120 ngày Đất ngoài 280 ngày Đất đồng cỏ chăn nuôi 28 tháng Phân của các loài thuộc họ chim Nguồn: (Đỗ Thị Huyền và Tô Long Thành, 2009) 1.1.4.4. Đặc tính nuôi cấy Salmonella Vi khuẩn Salmonella là loại vi khuẩn hiếu khí vừa kỵ khí không bắt buộc, dễ nuôi cấy. Nhiệt độ thích hợp là 37oC, nhưng có thể phát triển được ở nhiệt độ từ 6- 42oC. Nuôi cấy ở 43oC có thể loại trừ được tạp khuẩn mà Salmonella vẫn phát triển được, pH thích hợp cho vi khuẩn phát triển là 7,6, tuy nhiên vi khuẩn vẫn phát triển được ở pH từ 6-9. Khi nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường nước thịt: Cấy vài giờ đã đục nhẹ, sau 18 giờ đục đều, nuôi lâu ở đáy ống nghiệm có cặn, trên mặt môi trường có màng mỏng. Trên môi trường thạch thường vi khuẩn tạo khuẩn lạc dạng S (Smooth) tròn, lồi, trơn láng, bờ đều, thường không màu hay màu trắng xám. Đôi khi tạo khuẩn lạc dạng R (Rough), kích thước khuẩn lạc thường trong khoảng 2 – 4 mm. Hiện nay có rất nhiều loại môi trường chọn lọc được các nhà vi sinh vật thú y sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu và phân lập Salmonella như môi trường thạch XLD (Xylose Lysine Desoxycholate Agar): Salmonella cho khuẩn lạc trong suốt, không màu hay có màu hơi nhuốm đỏ đôi khi có tâm đen, thường xuất hiện vùng đỏ hồng xung quanh khi khuẩn lạc Salmonella phát triển mạnh. Trên môi trường Macconkey: Bồi dưỡng trong tủ ấm 35-37oC thời gian 18-24 giờ, Salmonella phát triển thành những khuẩn lạc tròn, trong, không màu, nhẵn bóng và hơi lồi ở giữa. Trên môi trường thạch SS (Shigella - Salmonella Agar): PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
11 Salmonella hình thành những khuẩn lạc tròn, bóng không màu hay có màu hồng và có tâm đen ở giữa. Trên môi trường thạch BGA (Brilliant Green Agar): Salmonella cho khuẩn lạc tròn, màu trắng hồng, môi trường xung quanh đỏ hồng. Trên môi trường thạch BSA (Bismuth Sulphite Agar): Salmonella cho khuẩn lạc có màu nâu xám hay màu đen, thường có ánh kim bao quanh (Nguyễn Như Thanh và cs, 2001). Trên môi trường BPLS (Brilliant Green Phenol Red Lactose Agar): vi khuẩn không lên men đường lactose và phân hủy peptone nên môi trường chuyển sang kiềm, khuẩn lạc của Salmonella có màu đỏ. Môi trường Muller Kaffman: Sau 18-24 giờ nuôi cấy vi khuẩn phát triển làm đục môi trường và làm mất màu xanh đặc trưng của môi trường. Môi trường Selenit cystein broth: Sau 18-24 giờ nuôi cấy vi khuẩn phát triển làm đục môi trường và môi trường chuyển sang màu đỏ. Môi trường thạch máu: Sau khi nuôi cấy 24 giờ khuẩn lạc Salmonella có màu trắng đục, không dung huyết (Nguyễn Phú Quý và cs, 1991). 1.1.4.5. Đặc tính sinh hóa Salmonella Theo Quinn và cs (1994), giống vi khuẩn Salmonella được chia làm 7 phân nhóm, mỗi phân nhóm có khả năng lên men một số loại đường nhất định và không đổi. Phần lớn phân loài Salmonella enteritica subsp. enteritica gây bệnh cho động vật máu nóng. Chúng lên men và sinh hơi: Glucose, Manit, Mantose, Galactose, Dulcitol, Arabonose, Sorbitol. Cũng ở nhóm này, hầu như các chủng Salmonella đều không lên men Lactose và Saccharose. Vi khuẩn Salmonella có phản ứng indol âm tính, MR âm tính, VP âm tính, sử dụng citrat dương tính, di động, lysin decarboxylaza dương tính, adonit âm tính, lên men manit, thường không lên men lactose, saccharose trừ một số ngoại lệ dạng huyết thanh, dạng sinh học nhất định (Nguyễn Như Thanh, 1997). PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma