Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nuôi cấy hoạt hóa và đánh giá tính đáp ứng miễn dịch của tế bào γδT tách từ bệnh nhân ung thư phổi

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:100

Thêm vào BST

Báo xấu

15
lượt xem 4
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Đề tài nghiên cứu nhằm 2 mục tiêu: Xây dựng quy trình phân lập và nuôi cấy hoạt hóa tế bào γδT tách từ bệnh nhân ung thư phổi; bước đầu đánh giá tính đáp ứng miễn dịch của tế bào γδT tách từ bệnh nhân ung thư phổi đã hoạt hóa.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nuôi cấy hoạt hóa và đánh giá tính đáp ứng miễn dịch của tế bào γδT tách từ bệnh nhân ung thư phổi

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------- Nguyễn Quý Linh NUÔI CẤY HOẠT HÓA VÀ ĐÁNH GIÁ TÍNH ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH CỦA TẾ BÀO LYMPHO GAMMA DELTA T (γδT) TỪ BỆNH NHÂN UNG THƯ PHỔI LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – Năm 2019
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------- Nguyễn Quý Linh NUÔI CẤY HOẠT HÓA VÀ ĐÁNH GIÁ TÍNH ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH CỦA TẾ BÀO LYMPHO GAMMA DELTA T (γδT) TỪ BỆNH NHÂN UNG THƯ PHỔI Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 8420101.14 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. Hoàng Thị Mỹ Nhung PGS.TS. Trần Huy Thịnh Hà Nội – Năm 2019
LỜI CẢM ƠN Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới: PGS.TS. Hoàng Thị Mỹ Nhung, Trưởng Bộ môn Sinh học tế bào, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội và PGS.TS. Trần Huy Thịnh, phó Trưởng Bộ môn Hóa sinh, Phó giám đốc Trung tâm kiểm định chất lượng xét nghiệm y học, Trường Đại học Y Hà Nội, người hướng dẫn khoa học, người thầy đã định hướng, tận tình truyền đạt những kiến thức, kinh nghiệm quý báu và tạo mọi điều kiện thuận lợi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu để tôi có thể hoàn thành luận văn này. Tôi xin gửi lời cảm ơn đến GS.TS.BS. Tạ Thành Văn, Hiệu trưởng Trường Đại học Y Hà Nội, Giám đốc Trung tâm nghiên cứu Gen-protein, Trường Đại học Y Hà Nội , PGS.TS.BS. Trần Vân Khánh, Trưởng Bộ môn Bệnh học phân tử, Khoa Kỹ thuật Y Học, phó Giám đốc cùng toàn thể cán bộ Trung tâm nghiên cứu Gen- protein, Trường đại học Y Hà Nội, nơi tôi đã gắn bó 10 năm, đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, làm việc và nghiên cứu. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS. BS. Nguyễn Thanh Bình và các anh chị Kỹ thuật viên Khoa Xét nghiệm Huyết Học bệnh viện Nhi Trung Ương đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu để tôi có thể hoàn thành luận văn này. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban Giám hiệu, Phòng Đào tạo Sau đại học Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã tạo điều kiện cho tôi được học tập và nghiên cứu. Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến các bệnh nhân và người tình nguyện đã giúp đỡ để tôi có thể thực hiện được nghiên cứu này. Cuối cùng tôi xin ghi nhớ công ơn sinh thành, nuôi dưỡng và tình yêu thương của cha mẹ tôi, vợ cùng hai con trai và những người thân trong gia đình cùng bạn bè, những người đã luôn ở bên tôi, động viên tôi và là chỗ dựa vững chắc cho tôi yên tâm học tập và hoàn thành luận văn Hà Nội, ngày 02 tháng 09 năm 2019 Học viên NGUYỄN QUÝ LINH i
Nghiên cứu được thực hiện với sự hỗ trợ kinh phí bởi Đề tài cấp Nhà nước “Nghiên cứu sử dụng tế bào miễn dịch tự thân Gamma Delta T (γδT) và diệt tự nhiên (NK) trong điều trị ung thư phổi”, mã số: KC.10.26/16-20, thuộc chương trình: “Nghiên cứu ứng dụng và phát triển công nghệ tiên tiến phục vụ bảo vệ và chăm sóc sức khỏe cộng đồng”, KC.10/16-20 ii
LỜI CAM ĐOAN Tôi là Nguyễn Quý Linh, học viên cao học khóa 26 Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội, khoa Sinh học, chuyên ngành Sinh học thực nghiệm, xin cam đoan: 1. Đây là luận văn do bản thân tôi trực tiếp thực hiện dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS.TS. Trần Huy Thịnh và PGS.TS. Hoàng Thị Mỹ Nhung. 2. Công trình này không trùng lập với bất kỳ nghiên cứu nào khác đã được công bố tại Việt Nam 3. Các số liệu và thông tin trong nghiên cứu là hoàn toàn chính xác, trung thực và khách quan, là một phần kết quả trong Đề tài cấp Nhà nước “Nghiên cứu sử dụng tế bào miễn dịch tự thân Gamma Delta T (γδT) và diệt tự nhiên (NK) trong điều trị ung thư phổi”đã được chấp thuận của cơ sở nơi nghiên cứu. Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước pháp luật về những cam kết này Hà Nội, ngày 02 tháng 09 năm 2019 Người viết cam đoan NGUYỄN QUÝ LINH iii
MỤC LỤC DANH MỤC HÌNH DANH MỤC BẢNG ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................ 1 C n TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................................... 3 1.1. Tổng quan về un t p ổi ............................................................................ 3 1.1.1. Dịch tễ học ung thư phổi ............................................................................ 3 1.1.2. Các yếu tố nguy cơ ..................................................................................... 3 1.1.3. Đáp ứng miễn dịch trong ung thư phổi ...................................................... 6 1.2. Tổng quan về liệu pháp tế bào miễn dịch tự t ân γδT tách từ máu ngoại vi tron điều trị un t phổi ............................................................................. 10 1.2.1. Giám sát miễn dịch và sự né tránh đáp ứng miễn dịch trong ung thư. .... 10 1.2.2. Vi môi trường quanh khối u và tính sinh miễn dịch trong ung thư phổi. 12 1.2.3. Liệu pháp miễn dịch trong điều trị ung thư .............................................. 12 1.2.4. Các liệu pháp miễn dịch được dùng trong điều trị ung thư ...................... 15 1.2.5. Vai trò, đặc điểm và chức năng của tế bào γδT........................................ 20 1.2.6. Sự hoạt hoá và nhận diện tế bào ung thư của tế bào T ......................... 22 1.2.7. Cơ chế tác dụng kháng ung thư của tế bào T........................................ 24 1.2.8. Liệu pháp tế bào miễn dịch tự thân trong điều trị ung thư ....................... 26 1.2.9. Nuôi cấy hoạt hoá, biệt hoá và tăng sinh tế bào T ứng dụng trong liệu pháp tế bào miễn dịch tự thân điều trị ung thư ................................................... 28 1.2.10. Ứng dụng của tế bào T trong điều trị ung thư phổi ............................ 30 C n 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 33 2 Đối t ợng nghiên cứu ................................................................................... 33 2.1.1. Cỡ mẫu ..................................................................................................... 33 2.1.2. Tiêu chuẩn lựa chọn và tiêu chuẩn loại trừ đối tượng nghiên cứu ........... 33 22 P n p áp n iên cứu ............................................................................. 34 2.2.1. Thiết kế nghiên cứu .................................................................................. 34 2.2.2. Nội dung và các chỉ số nghiên cứu thu thập ban đầu ............................... 35 2.2.3. Phương pháp thu thập mẫu ....................................................................... 36 iv
2.2.4. Dụng cụ, trang thiết bị và hóa chất nghiên cứu ........................................ 36 2.2.5. Các phương pháp và kỹ thuật sử dụng ..................................................... 38 2.3. Xử lý số liệu .................................................................................................... 43 2.4. Đạo đức trong nghiên cứu .............................................................................. 44 C n 3 KẾT QUẢ ............................................................................................. 45 3.1. Chuẩn hóa quy trình phân lập, nuôi cấy tế bào γδT trên mẫu n ời khỏe mạnh ...................................................................................................................... 45 3.2. Số l ợng tế bào miễn dịc γδT t u đ ợc sau nuôi cấy .............................. 52 3.2.1. Số lượng tế bào miễn dịch γδT thu được sau nuôi cấy của người tình nguyện khỏe mạnh.............................................................................................. 52 3.2.2. Số lượng tế bào miễn dịch γδT thu được sau nuôi cấy của bệnh nhân ung thư phổi ............................................................................................................... 55 3 3 Xác định tỷ lệ tế bào γδT tron quần thể tế bào t u đ ợc sau nuôi cấy . 57 3.3.1. Xác định tỷ lệ tế bào γδT trong quần thể tế bào sau nuôi cấy của người khỏe mạnh .......................................................................................................... 58 3.3.2. Xác định tỷ lệ tế bào γδT trong quần thể tế bào sau nuôi cấy của bệnh nhân ung thư phổi ............................................................................................... 61 3 4 Đán iá mức độ hoạt hóa và hoạt tính của tế bào miễn dịc γδT sau nuôi cấy ................................................................................................................. 64 3.4.1. Khả năng tiết IFNγ của tế bào γδT vào môi trường nuôi cấy sau hoạt hóa, tăng sinh.............................................................................................................. 64 3.4.2. Hoạt tính gây độc cho tế bào của tế bào γδT sau nuôi cấy ...................... 70 KẾT LUẬN .............................................................................................................. 72 TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 73 v
DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Đáp ứng miễn dịch trong ung thư phổi ............................................... 7 Hình 1.2. Tác dụng của chemokine đối với TAMs và MDSCs .......................... 10 Hình 1.3: Quá trình hoạt hoá, nhận diện kháng nguyên và đáp ứng miễn dịch kháng ung thư của tế bào T. .......................................................................... 23 Hình 1.4: Cơ chế tác dụng kháng ung thư của tế bào γδT . ............................... 25 Hình 1.5: Minh hoạ các giai đoạn chính của quá trình sử dụng liệu pháp tế bào miễn dịch tự thân T trong điều trị ung thư. .................................................... 27 Hình 1.6: Minh hoạ khả năng ly giải tế bào ung thư phổi thực nghiệm của tế bào T tách từ máu ngoại vi của người, được nuôi cấy và hoạt hoá với kháng nguyên phosphor . ........................................................................................... 31 Hình 2.1. Sơ đồ nghiên cứu thực nghiệm mô tả tiến cứu ................................... 35 Hình 2.2. Liệu trình phân lập, nuôi cấy hoạt hóa tăng sinh tế bào γδT .............. 36 Hình 3.1: Đường cong sinh trưởng của tế bào miễn dịch ở các nồng độ zoledromate và IL-2 khác nhau ......................................................................... 45 Hình 3.2: Hình ảnh tế bào miễn dịch γδT sau nuôi cấy tại các nồng độ zoledronate/IL-2 khác nhau .............................................................................. 46 Hình 3.3: Hình ảnh xác định tỷ lệ tế bào γδT trong quần thể tế bào thu được sau nuôi cấy tại các nồng độ zoledronate và IL-2 khác nhau. .................................. 47 Hình 3.4: Hình ảnh tế bào của người khỏe mạnh C02 trước và sau nuôi cấy ..... 53 Hình 3.6: Hình ảnh tế bào của bệnh nhân ung thư BN01 trước và sau nuôi cấ. . 56 Hình 3.7: Hình ảnh tế bào của bệnh nhân ung thư BN05 trước và sau nuôi cấy. 57 Hình 3.8: Kết quả đếm dòng chảy tế bào xác định tỷ lệ tế bào γδT mẫu C02 .... 59 Hình 3.9: Kết quả đếm dòng chảy tế bào xác định tỷ lệ tế bào γδT mẫu BN06 . 62 Hình 3.10: Mức độ biểu hiện của mRNA IFNγ trên tế bào γδT trước và sau nuôi cấy .................................................................................................................... 66 Hình 3.11: Nồng độ IFNγ trong môi trường tế bào trước và sau nuôi cấy ......... 68 Hình 3.12: Hoạt tính gây độc tế bào của tế bào lympho γδT sau 14 ngày nuôi cấy.. .................................................................................................................. 71 vi
DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Đặc điểm của các loại tế bào lympho T............................................................... 20 Bảng 2.1. Thành phần phản ứng tổng hợp cDNA ............................................................... 41 Bảng 2.2. Trình tự mồi của gen IFNγ và Vγ9 ...................................................................... 41 Bảng 2.3. Thành phần phản ứng Realtime PCR .................................................................. 42 Bảng 3.1: Số lượng tế bào miễn dịch γδT nuôi cấy ở các nồng độ zoledronate và IL-2 khác nhau.................................................................................................................................. 45 Bảng 3.2: Tỷ lệ tế bào lympho T và γδT trong quần thể tế bào thu được sau nuôi cấy ... 48 Bảng 3.3: Số lượng tế bào của nhóm người tình nguyện khỏe mạnh sau nuôi cấy .......... 52 Bảng 3.4: Số lượng tế bào của nhóm bệnh nhân ung thư phổi thu được sau nuôi cấy..... 55 Bảng 3.5: Tỷ lệ tế bào γδT của người tình nguyện khỏe mạnh trước và sau nuôi cấy..... 58 Bảng 3.6: Tỷ lệ tế bào γδT của bệnh nhân ung thư phổi trước và sau nuôi cấy................ 61 Bảng 3.7: Kết quả đánh giá mức độ biểu hiện của mRNA IFNγ trước và sau nuôi cấy.. 64 Bảng 3.8: Nồng độ IFNγ trước và sau nuôi cấy hoạt hóa (pg/ml)...................................... 67 vii
ĐẶT VẤN ĐỀ Ung thư phổi là bệnh có tỷ lệ mắc và tử vong hàng đầu trong số các loại ung thư trên thế giới. Theo ghi nhận của Globocan năm 2018, số ca mới mắc ung thư phổi trên toàn thế giới là 2,1 triệu ca, chiếm 11,6% tổng số ca mắc do ung thư và số ca tử vong do ung thư phổi là 1,76 triệu ca, chiếm 18,4% tổng số ca tử vong do ung thư [11]. Tại Mỹ, nước có hệ thống y tế hiện đại và phát triển, theo ACS ước tính năm 2019 sẽ có 234.030 ca mắc mới, chiếm 13% tổng số ca mắc do ung thư và 142.670 ca tử vong [110]. Tại Việt Nam, theo Globocan năm 2018, tỷ lệ mới mắc ung thư phổi xếp thứ hai đối với nam giới (chiếm 18,4%, sau ung thư gan) và xếp thứ ba đối với nữ giới (chiếm 9,4%, sau ung thư vú, ung thư đại trực tràng), có 164.671 ca mới mắc ung thư phổi và 114.871 người tử vong vì căn bệnh này [38]. Từ đó, việc phát triển các phương pháp điều trị mới cũng như việc phối hợp các phương pháp điều trị nhằm nâng cao hiệu quả, cải thiện chất lượng sống, thời gian sống thêm không bệnh và sống thêm toàn thể với bệnh nhân ung thư phổi là điều hết sức có ý nghĩa. Trên thế giới hiện nay, liệu pháp tế bào miễn dịch tự thân được phát triển để điều trị nhiều loại ung thư, bao gồm cả ung thư phổi đã cho những kết quả ban đầu hứa hẹn [8,49,141]. Từ năm 2017, trường Đại học Y Hà Nội đã thiết lập được quy trình tách, nuôi cấy hoạt hóa, biệt hóa và tăng sinh tạo khối tế bào miễn dịch tự thân T-CD8 và đã được Bộ Y Tế cho ứng dụng liệu pháp tế bào miễn dịch tự thân T-CD8 điều trị thử nghiệm trên lâm sàng năm loại ung thư sau: ung thư phổi, ung thư gân, ung thư vú, ung thư dạ dày, ung thư đại trực tràng. Việc triển khai đề tài “Nghiên cứu sử dụng tế bào miễn dịch tự thân gamma delta ɣδT và diệt tự nhiên NK trong điều trị ung thư phổi” tại trường Đại học Y Hà Nội, Học viện Quân Y, Bệnh viện K Trung ương là thiết thực và cung cấp thêm một liệu pháp điều trị mới cho bệnh nhân ung thư nước ta. Với liệu pháp này, bệnh nhân chỉ cần đến cơ sở lấy một lượng máu nhất định, sau đó trở về nhà rồi quay lại cơ sở để truyền tế bào miễn dịch đã được nuôi cấy hoạt hóa, biệt hóa và tăng sinh sau 2 tuần. Hiệu quả của phương pháp này phụ thuộc nhiều vào việc tối ưu hóa môi trường 1
nuôi cấy tế bào miễn dịch, thúc đẩy sự biệt hóa và nhân lên của tế bào, đồng thời giữ được thẩm quyền miễn dịch, khả năng truyền ghép, di chuyển tới vị trí và thâm nhập được vào tổ chức khối u. Vì vậy, để thực hiện bước đầu tiên tìm hiểu về liệu pháp sử dụng tế bào gamma delta T (γδ) trong điều trị ung thư phổi, chúng tôi tiến hành nghiên cứu “Nuôi cấy hoạt hóa và đánh giá tính đáp ứng miễn dịch của tế bào γδT tách từ bệnh nhân ung thư phổi”, với 2 mục tiêu sau: Xây dựng quy trình phân lập và nuôi cấy hoạt hóa tế bào γδT tách từ bệnh nhân ung thư phổi. Bước đầu đánh giá tính đáp ứng miễn dịch của tế bào γδT tách từ bệnh nhân ung thư phổi đã hoạt hóa. 2
C n 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tổng quan về un t p ổi 1.1.1. Dịch tễ học un t p ổi Ung thư phổi là ung thư phổ biến nhất trên thế giới trong các thập niên vừa qua. Theo ghi nhận của Globocan, năm 2018, ước đoán số ca mới mắc trên toàn thế giới là 2,1 triệu ca, chiếm 11,6% tổng số ca mắc do ung thư. Châu Á, đặc biệt ở các nước Đông Á, là khu vực có tỷ lệ mới mắc cao nhất, chiếm 58,5% số trường hợp trên toàn thế giới. Điều này khác biệt so với năm 2012, khi mà tỷ lệ mới mắc cao nhất là ở các nước Bắc Mỹ, Bắc Âu[11,34]. Bên cạnh đó, tỷ lệ mới mắc thấp nhất ở châu Phi (1,9%), châu Đại Dương (0,81%), giống với thống kê Globocan 2012, tỷ lệ mới mắc thấp nhất cũng rơi vào hai châu lục này [11,34]. Tuy nhiên dù ở bất cứ khu vực nào, tỷ lệ mắc bệnh chuẩn hóa theo tuổi trên thế giới của nam đều cao hơn so với nữ (31,5 trên 100.000 nam giới và 14,6 trên 100.000 nữ giới) [11]. Ngoài ra,ung thư phổi cũng là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu do các bệnh ung thư trên thế giới . Cũng theo báo cáo Globocan, năm 2018 có 1,76 triệu ca tử vong do ung thư phổi, chiếm 18,4% tổng số ca tử vong do ung thư [11]. Ở Mỹ, theo ACS ước tính năm 2019 có 234.030 ca mắc mới (116.440 ca ở nam và 111.710 ca ở nữ), chiếm 13% tổng số ca mắc do ung thư và 142.670 ca tử vong (76.650 ca ở nam và 66.020 ca ở nữ). Trong giai đoạn từ năm 2008 - 2014, tỷ lệ sống thêm 5 năm của ung thư phổi tại Mỹ là 19%, thấp nhất so với các loại ung thư khác [110]. Theo ghi nhận của Globocan năm 2018, ở Việt Nam, tỷ lệ mới mắc ung thư phổi xếp thứ hai đối với nam giới (chiếm 18,4%, sau ung thư gan) và xếp thứ ba đối với nữ giới (chiếm 9,4%, sau ung thư vú, ung thư đại trực tràng), có 164.671 ca mới mắc ung thư phổi và 114.871 người tử vong vì căn bệnh này [38]. 1.1.2. Các yếu tố n uy c Yếu tố môi trường 3
- Hút thuốc lá 85% ung thư phổi gặp ở những bệnh nhân hút thuốc lá. Khói thuốc lá có chứa ít nhất 60 chất gây ung thư được biết đến. Đáng kể nhất là hydrocarbon thơm đa vòng (PAH), bao gồm benzo[a]pyrene, nitrates, nitrosamines... Ngoài ra, thành phần gây nghiện chủ yếu là nicotine. Dù không phải là chất gây ung thư, nhưng nó điều hòa các thụ thể nicotinic, tạo ra sự thay đổi trong biểu hiện gen thúc đẩy sự phụ thuộc thuốc lá và có liên quan đến sự tiến triển của khối u. Thêm vào đó, chất phụ gia như menthol (bạc hà) làm tăng nghiện và giảm khả năng bỏ thuốc. Thời gian hút thuốc và mức độ hút thuốc (chỉ số bao năm) có liên quan tới nguy cơ mắc ung thư phổi. Nguy cơ phát triển thành ung thư phổi ở người hút thuốc lá 1 bao/ ngày trong 40 năm cao gấp 20 lần người không hút thuốc lá. Thêm vào đó, hút thuốc lá thụ động cũng làm tăng nguy cơ ung thư phổi thêm 27% [42,125,121]. - Phơi nhiễm nghề nghiệp Phơi nhiễm nghề nghiệp với chất gây ung thư được ước tính chiếm 5-10% ung thư phổi. Các chất gây ung thư phổi nghề nghiệp quan trọng nhất được báo cáo là amiante, silica, radon, kim loại nặng (arsenic, chromium, nickel) và hydrocarbon thơm đa vòng. Trong số này, amiante là phổ biến nhất. Phơi nhiễm nghề nghiệp với amiante làm tăng nguy cơ ung thư phổi gấp 5 lần [4,46]. Yếu tố liên quan đến vật chủ - Tuổi Tuổi già có liên quan đến sự phát triển ung thư. Độ tuổi trung bình của chẩn đoán ung thư phổi là 70 tuổi đối với cả nam và nữ. Khoảng 53% trường hợp xảy ra ở những người từ 55 đến 74 tuổi và 37% xảy ra trên 75 tuổi [127]. Tuy nhiên, ung thư phổi gặp ở cả những lứa tuổi trẻ hơn. 10% các trường hợp xảy ra ở bệnh nhân dưới 55 tuổi. Các nghiên cứu về ung thư phổi không phải tế bào nhỏ (NSCLC) ở bệnh nhân 20-46 tuổi cho thấy bệnh nhân nữ chiếm tỷ lệ lớn, có mô bệnh học là ung thư tuyến, không hút thuốc lá, ít có bệnh đồng mắc và các yếu tố di truyền được cho là có vai trò lớn trong quần thể bệnh nhân này [109]. 4
- Giới Tỷ lệ mới mắc và tử vong của nam giới luôn lớn hơn nữ giới, điều này được giải thích do tỷ lệ hút thuốc lá ở nam nhiều hơn so với nữ. Tuy nhiên, có nhiều báo cáo về một số đột biến gen được tìm thấy phổ biến hơn ở những phụ nữ hút thuốc dẫn đến sự phát triển ung thư phổi, như biểu hiện quá mức của gen CYP1A1, đột biến của enzyme glutathione S-transferase M1, đột biến gen ức chế khối u p53 [58]. - Tính đa hình đơn gen Nhiều nghiên cứu đã cho thấy mối liên quan về nguy cơ của ung thư phổi với những biến đổi đa hình SNPs. Đáng kể đến, SNPs trên vùng 15q25.1 chứa vùng mã hóa cho 3 gen thụ thể nicotin cholinergic điều hòa quá trình phơi nhiễm với nicotin. SNPs trên vùng 5p15.33 chứa TERT, là gen phiên mã ngược của telomerase, cần thiết cho hoạt động của telomerase - một enzyme có chức năng duy trì các telomere để tế bào ung thư phân chia không giới hạn [128]. - Nhiễm trùng Ở bệnh nhân nhiễm HIV, ung thư phổi chiếm tỷ lệ tử vong gần 30% do ung thư và những người nhiễm HIV có nguy cơ mắc ung thư phổi cao gấp 2,5 lần[138]138. Tuy nhiên, virus HIV không liên quan đến sự phát sinh ung thư, mà là do sự ức chế miễn dịch đóng vai trò tăng nguy cơ bệnh, vì người nhiễm HIV và người được ghép tạng có tỷ lệ ung thư tăng tương tự nhau [43]. - Các bệnh ở phế quản - phổi Một phân tích tổng hợp đã chỉ ra nguy cơ ung thư phổi ở những người bị hen suyễn mà không bao giờ hút thuốc tăng 1,8 lần[104]. Ngoài ra, cũng có nghiên cứu cho thấy bệnh lao phổi làm tăng nguy cơ mắc ung thư phổi, nguy cơ mắc ở những đối tượng có tiền sử bệnh lao tăng 1,5 lần và 20 năm sau khi chẩn đoán bệnh lao là 2,0 lần [146]. 5
1.1.3. Đáp ứng miễn dịc tron un t p ổi Trong ung thư phổi, các tế bào miễn dịch xâm nhập vào tổ chức khối u tạo ra 2 loại đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu và đặc hiệu [130,93]. Theo nghiên cứu của Branislava Stankovic và cộng sự (2018) cho biết có mười ba loại tế bào miễn dịch khác biệt đã được xác định trong các khối u NSCLC. Các tế bào lympho T chiếm ưu thế (47%). T CD4+ là quần thể tế bào T phong phú nhất (26%), theo sát là tế bào T CD8 + (22%), tế bào CD4- CD8- chiếm một phần nhỏ (1,4%). Các tế bào B CD19 + là loại tế bào miễn dịch phổ biến thứ hai trong các khối u NSCLC (16%). Đại thực bào và NK lần lượt chiếm 4,7 và 4,5%. Ba loại tế bào tua (DC) đã được xác định chiếm 2,1%. Trong số các bạch cầu hạt, bạch cầu trung tính (8,6%), tế bào mast (1,4%), basophils (0,4%) và bạch cầu ái toan (0,3%) ít phổ biến hơn. Nghiên cứu cũng cho thấy chỉ có các tế bào B tăng lên đáng kể ,còn ngược lại, đại thực bào và tế bào NK trong khối u thì giảm đi [116]. Các tế bào miễn dịch xâm nhập thể hiện bởi sự xuất hiện các cấu trúc lympho bậc ba (TLS) trong khối u. Cấu trúc này chứa tế bào lympho B, T hỗ trợ, đại thực bào và mạng lưới tế bào tua trình diện kháng nguyên, vùng giàu tế bào lympho T và tế bào tua trưởng thành, được bao quanh bởi các mạch máu nội mô. Các thụ thể xuyên màng, phân tử bám dính và chemokine đóng vai trò quan trọng với sự xâm nhập tế bào T từ hệ thống tuần hoàn vào tổ chức khối u. Trong ung thư phổi, có mối tương quan thuận giữa mật độ cấu trúc lympho bậc ba với gia tăng tỷ lệ sống ở các bệnh nhân chứng tỏ vai trò đáp ứng miễn dịch bảo vệ của cấu trúc này [26,13] (Hình 1.1). 6
Hình 1.1. Đáp ứng miễn dịch trong ung thư phổi [93] Các tế bào lympho T xâm nhập khối u (TILs) đóng vai trò quan trọng trong miễn dịch chống khối u. Hầu hết các tế bào T CD8 + là tế bào lympho T gây độc tế bào.Tế bào này nhận diện phức hợp kháng nguyên liên quan đến khối u (TAA) được xử lý gắn với MHC trên bề mặt tế bào ung thư để tiêu diệt: diệt trực tiếp bởi TNF (yếu tố hoại tử u), perforin (chất gây thủng), diệt phụ thuộc kháng thể (ADCC), thông qua hoạt hóa chết theo chương trình apotosis [45]. Các tế bào T trợ giúp CD4 + phân loại thành Th1, Th2, Th17 và T điều hòa (Treg) dựa vào các cytokine tiết ra và các phân nhóm này cũng có chức năng khác nhau [29]. Các cytokine IL-2, IFN-γ,TNF- ɑ được tiết ra bởi các tế bào Th1 kích thích tế bào T độc, trong khi đó cytokine do Th2 tiết ra thì lại ức chế [100]. Bên cạnh đó, Th17 cũng có chức năng chống lại ung thư do các cytokine mà chúng tiết 7
ra, như IL-17A, IL-17F, IL-21, IL-22, IFN-γ và GM-CSF và đồng thời kích thích các tế bào Th1, Tc1 và NK74. Con đường phát triển của tế bào Th17 và Treg có liên quan chặt chẽ với nhau. Trong trường hợp không có cytokine tiền viêm như IL-6 hoặc IL-21 xuất hiện, TGF-β thúc đẩy quá trình biệt hóa tế bào Treg thay vì Th17 [149]. Treg điều hòa sự tăng trưởng và kích hoạt của các tế bào T CD4 +, ức chế sự xâm nhập các tế bào lympho T CD8 + trong các khối u. Tuy nhiên, chính điều đó cũng quan trọng để ức chế sự phát triển của khối u phổi, ngăn ngừa sự tự miễn dịch [149,148]. Tóm lại mô hình Th1 / Th2 / Th17 / Treg rất cần thiết để duy trì cân bằng nội môi miễn dịch, dựa trên việc sản xuất cytokine và môi trường cytokine mà chúng tạo ra quyết định số phận của khả năng chống ung thư. Ở cấu trúc lympho bậc ba, sau khi nhận biết kháng nguyên, tế bào lympho B tăng sinh, biệt hóa thành tương bào, sản xuất được kháng thể. Tác dụng kháng ung thư được chứng minh khi định lượng các IgG và IgA đặc hiệu với kháng nguyên ung thư phân lập từ các cấu trúc lympho này. Tế bào tua DC là các tế bào trình diện kháng nguyên chuyên nghiệp và có thể bộc lộ các phân tử MHC-I, MHC-II và các phân tử đồng kích thích trên bề mặt tế bào của chúng, tất cả đều kích hoạt tế bào T. Khi chưa trưởng thành trong mô ngoại biên, các DC biểu hiện các thụ thể chemokine khác nhau, chẳng hạn như thụ thể CCR1, CCR2, CCR4, CCR5, CCR6, CCR8 và thụ thể CXCR4. Khi gặp phải các kháng nguyên khối u, các DC bắt đầu trưởng thành để đáp ứng với các kích thích viêm như tín hiệu qua trung gian thụ thể. Các tế bào DC trưởng thành bắt đầu biểu hiện các thụ thể chemokine như CCR7 và nhờ hướng dẫn bởi chemokine, các tế bào DC xâm nhập vào khu vực tế bào T ở các cấu trúc bạch huyết [99]. NK không có thụ thể như tế bào lympho T hay B, nhưng có hạt chứa các perforin và granzyme. Với thụ thể hoạt hóa, NK sản xuất perforin để gây tan tế bào ung thư, khi những tế bào này không hoăc ít biểu lộ MHC lớp I. Ngoài ra, NK còn tham gia vào phức hợp gây độc tế bào phụ thuộc kháng thể [14]. 8
Cũng giống như nhiều loại ung thư khác, tế bào ung thư phổi đã phát triển cơ chế thoát miễn dịch.Tế bào ung thư phổi giảm biểu hiện phân tử MHC-I trong quá trình ung thư phát triển, điều chỉnh tính nhạy cảm của tế bào ung thư với sự ly giải của các tế bào T-CD8 và NK [115]. Thêm vào đó, tế bào ung thư phổi có khả năng tiết ra các yếu tố ức chế miễn dịch trong môi trường ung thư như thể hòa tan của phân tử kháng nguyên liên kết chuỗi MHC-I A (MICA), hay thúc đẩy sự giảm biểu hiện thụ thể NKG2D ở tế bào NK, do đó ức chế khả năng ly giải tế bào ung thư của lympho T và NK [102]. Không chỉ thế, tế bào ung thư phổi đã được chứng minh là tiết ra các cytokine ức chế miễn dịch như IL-10, TGF-β, enzym tổng hợp tryptophan indolamine 2,3-dioxygenase, là những yếu tố chủ chốt liên quan đến ức chế đáp ứng miễn dịch và thúc đẩy sự tăng trưởng của tế bào ung thư phổi [77]. Tế bào ung thư phổi biểu hiện các thụ thể chemokine và sản xuất các chemokine điều khiển sự di chuyển của tế bào miễn dịch và tế bào ung thư. Các chemokine được chia thành 4 nhóm nhỏ: CXC, CC, CX3C và C. Đặc biệt là việc thu hút các tế bào ức chế miễn dịch như TAMs, MDSCs. Các đại thực bào liên quan đến khối u (TAMs) thúc đẩy sự tiến triển của khối u do tăng sinh mạch, ức chế miễn dịch [76]. MDSCs (tế bào ức chế nguồn gốc tủy xương) đóng vai trò quan trọng trong ức chế miễn dịch, mất khả năng bảo vệ chống ung thư của cơ thể. Bằng việc sản xuất các yếu tố tăng trưởng nội mô , yếu tố tăng trưởng nguyên bào sợi, yếu tố tăng trưởng khối u..., MDSCs tạo môi trường thuận lợi cho khối u phát triển, xâm lấn , di căn và sinh mạch [83]. MDSCs hạn chế sự tăng trưởng tế bào T trong khối u bằng cách sử dụng hai enzyme liên quan đến chuyển hóa L-arginine: arginase-1 (ARG-1), làm cạn kiệt L-arginine và nitric oxide synthase 2 (iNOS2), tạo ra oxit nitric (NO) [88]. TAMs bị thu hút bởi các chemokine như CCL2, CCL5, CCL7, CCL8 và CXCL12 và yếu tố kích thích đại thực bào (M-CSF), trong đó CCL2 đóng vai trò quan trọng [108].Tế bào MDSCs biểu hiện CXCR2 thì được phát hiện rất nhiều trong NSCLC. Các phối tử của CXCR2 bao gồm CXCL1, CXCL2 và CXCL5, có nhiều trong mô ung thư phổi [66]. 9
Hình 1.2. Tác dụng của chemokine đối với TAMs và MDSCs [147] Một vấn đề quan trọng khác đối với đáp ứng miễn dịch trong ung thư phổi là sự tích lũy đột biến gen và hiện tượng methyl hóa ở các tế bào ung thư, như các gen có tần suất đột biến cao TP53, EGFR, KRAS... và hay bị methyl hóa p16, FHIT, RASSF1A. Các quá trình này làm thay đổi sự biểu hiện của phân tử bề mặt, chuyển dạng tế bào ung thư làm ảnh hưởng đến khả năng nhận diện và tác động của tế bào miễn dịch [48,120,67]. Như vậy, trong đáp ứng miễn dịch ở ung thư phổi, các tế bào ung thư phát triển cơ chế thoát khỏi miễn dịch để tránh tác động của tế bào miễn dịch, do đó khôi phục lại đáp ứng miễn dịch ở tổ chức ung thư đóng vai trò then chốt để cơ thể kiểm soát và ức chế sự phát triển của tế bào ung thư phổi. 1.2. Tổng quan về liệu pháp tế bào miễn dịch tự thân γδT tách từ máu ngoại vi tron điều trị un t phổi 1.2.1. Giám sát miễn dịch và sự né trán đáp ứng miễn dịc tron un t Khái niệm hệ miễn dịch giúp chống lại ung thư bắt nguồn từ rất lâu. Năm 1909, nhà khoa học người Đức Paul Ehrlich cho rằng tỉ lệ ung thư sẽ cao hơn rất nhiều nếu hệ miễn dịch không giúp nhận diện và tiêu diệt tế bào ung thư trong cơ thể [32]. Nửa thế kỷ sau, hai nhà khoa học Lewis Thomas và Frank Macfarlane Burnet dựa trên ý tưởng của Ehrlich để xây dựng nên một mô hình gọi là “sự giám sát của hệ miễn dịch” (Immunosurveillance), trong đó nhấn mạnh các tế bào miễn dịch đi tuần 10
tra khắp cơ thể tìm kiếm và tiêu diệt các tế bào ung thư ngay từ khi chúng bắt đầu hình thành [32]. Tuy nhiên, các tế bào ung thư được trang bị một số cơ chế giúp chúng điều chỉnh hệ thống miễn dịch và né tránh các tế bào miễn dịch hiệu ứng. Sự giảm biểu hiện các protein HLA (lớp I và II) và các phân tử tạo thuận lợi cho việc xử lý, trình diện kháng nguyên là một đặc điểm chung của các tế bào ung thư. Hơn nữa, các tế bào ung thư có thể biểu hiện các phối tử kiểm soát miễn dịch như PD-L1 thông qua sự tăng cường đáp ứng với IFN-γ tiết ra bởi các tế bào T ở vị trí khối u [132]. Chức năng giám sát miễn dịch thông qua cơ chế "immunoediting" có một vai trò không thể tách rời trong sinh học ung thư. Immunoediting đóng một vai trò kép trong ung thư bằng cách thúc đẩy tăng trưởng khối u và trung gian cho việc loại trừ bệnh [31]. Hiểu được vai trò mâu thuẫn này dường như đòi hỏi sự hiểu biết sâu sắc hơn về sự tương tác lẫn nhau giữa các tế bào miễn dịch khác nhau, tế bào ung thư, mô đệm khối u (các tế bào stroma) và các cytokine. Trong sinh học ung thư, toàn bộ quá trình immunoediting trải qua ba giai đoạn then chốt: loại bỏ, cân bằng và tránh thoát [31,105]. Trong giai đoạn loại bỏ, các tế bào u đang phát triển được phát hiện bởi các tế bào của hệ miễn dịch đặc hiệu và không đặc hiệu (các tế NK, các tế bào TCD8+ và TCD4+) nhận biết sự tái tạo của mô đệm và các thay đổi trong vi môi trường quanh khối u. Các tế bào miễn dịch tiết ra interferon gamma và cytokine ức chế sự hình thành mạch máu cũng như sự phát triển của tế bào u. Các tế bào tua (DCs) cũng được huy động đến khối u, giải phóng các cytokine và trình diện kháng nguyên cho các tế bào T. Cuối cùng, các tế bào TCD4+,TCD8+ nhận diện và tiêu diệt các tế bào ung thư. Các khối u tồn tại qua giai đoạn loại bỏ sẽ bước vào giai đoạn dài nhất trong ba giai đoạn, giai đoạn cân bằng- giai đoạn mà tế bào DC, tế bào ung thư và tế bào TCD8+ tồn tại trong một trạng thái cân bằng. Các tế bào khối u không phát triển mà chung sống dưới sự quản thúc của hệ thống miễn dịch. Trong quá trình này, các khối u không ổn định về mặt di truyền có thể tồn tại và có sức đề kháng, dẫn đến giai đoạn tránh thoát. Ở giai đoạn tránh thoát, tế bào T điều hòa (Treg) là trung gian gây ức chế miễn dịch và thúc đẩy các tế bào hiệu ứng của hệ miễn dịch trải qua apoptosis. Khả năng sinh miễn dịch chống 11