Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Tách chiết, phân lập Cephalotaxine và Homoharringtonine từ cây Cephalotaxus

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:65

Thêm vào BST

Báo xấu

15
lượt xem 2
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Nghiên cứu này nhằm mục đích để tách chiết, phân lập cephalotaxine và homoharingtonine từ cây Cephalotaxus harringtonia bằng cách sử dụng kết hợp các phương pháp sắc ký cột và phương pháp phân tích hiện đại HPLC. Mời các bạn cùng tham khảo nội dung chi tiết.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Tách chiết, phân lập Cephalotaxine và Homoharringtonine từ cây Cephalotaxus

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------- Trịnh Thái Hà TÁCH CHIẾT, PHÂN LẬP CEPHALOTAXINE VÀ HOMOHARRINGTONINE TỪ CÂY CEPHALOTAXUS LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2013
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------- Trịnh Thái Hà TÁCH CHIẾT, PHÂN LẬP CEPHALOTAXINE VÀ HOMOHARRINGTONINE TỪ CÂY CEPHALOTAXUS Chuyên ngành:Hóa hữu cơ Mã số: 60440114 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Cán bộ hƣớng dẫn: GS.TSKH. LƢU VĂN BÔI Hà Nội–2013
LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành chƣơng trình cao học và viết luận văn này, tôi đã nhận đƣợc sự hƣớng dẫn, giúp đỡ và góp ý nhiệt tình của quý thầy cô trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội và trƣờng Đại học Phủ Osaka (Nhật Bản). Trƣớc hết, tôi xin chân thành cảm ơn quý thầy cô đã tận tình dạy bảo cho tôi suốt thời gian học tập tại trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội. Tôi xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến GS. TSKH. Lƣu Văn Bôi đã dành rất nhiều thời gian và tâm huyết hƣớng dẫn nghiên cứu và giúp tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp. Tôi xin chân thành cảm ơn GS. Maeda Yasuaki, GS. Imamura Kiyoshi và GS. Yoshiaki Kitaya, trƣờng Đại học Phủ Osaka (Nhật Bản), đã giúp thu thập mẫu nguyên liệu thực vật, hỗ trợ phƣơng tiện nghiên cứu và hƣớng dẫn các kỹ năng thực nghiệm quý báu trong suốt thời gian tôi thực hiện đề tài nghiên cứu này. Bên cạnh đó, tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô và bạn bè trong Phòng thí nghiệm Tổng hợp Hữu cơ 3, Khoa Hóa học đã giúp đỡ, chia sẻ kinh nghiệm và tạo điều kiện để tôi có thể hoàn thành phần thực nghiệm của đề tài nghiên cứu với hiệu quả và chất lƣợng tốt. Đồng thời, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình vì đã luôn thông cảm, động viên và tạo động lực để tôi hoàn thành tốt chƣơng trình cao học và tiếp tục nghiên cứu chuyên sâu hơn nữa.
MỤC LỤC MỞ ĐẦU ......................................................................................................................... 1 Chƣơng 1 – TỔNG QUAN ............................................................................................. 3 1.1. Khái quát về chi Cephalotaxus ......................................................................................... 3 1.2. Khái quát về loài Cephalotaxus harringtonia ................................................................... 7 1.3. Hoạt tính sinh học và ứng dụng của các hợp chất alkaloid chiết xuất từ Cephalotaxus (Cephalotaxacaea) ............................................................................................. 9 1.3.1. Chất ức chế tổng hợp protein ................................................................................ 9 1.3.2. Điều trị bệnh bạch cầu........................................................................................... 10 1.3.3 Phƣơng pháp điều trị khác ..................................................................................... 10 1.3.4. Các este của cephalotaxine không tự nhiên và hoạt tính kháng u ........................ 10 1.4.Tách chiết, phân lập alkaloid từ cây C. harringtonia ....................................................... 13 CHƢƠNG II .................................................................................................................... 16 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM ............................................... 16 2.1. Phƣơng pháp nghiên cứu................................................................................................... 16 2.1.1. Phƣơng pháp xử lý mẫu ........................................................................................ 16 2.1.2. Phƣơng pháp chiết alkaloid từ bột C. harringtonia bằng dung môi ..................... 16 2.1.3. Các phƣơng pháp sắc ký phân tích, tách, và phân lập alkaloid ............................ 16 2.2. Phần thực nghiệm .............................................................................................................. 17 2.2.1. Thiết bị và hoá chất ............................................................................................... 17 2.2.2. Thu hoạch và xử lý nguyên liệu thực vật .............................................................. 19 2.2.3. Chiết cephalotaxine và homoharringtonine từ cây C. harringtonia ..................... 19 2.2.4. Khảo sát sơ bộ thành phần alkaloid thô bằng sắc ký lớp m ng (TLC) ................. 20 2.2.5. Phân lập các alkaloid bằng sắc ký cột ................................................................... 22 2.2.6. Xác định hàm lƣợng alkaloid bằng sắc ký HPLC ................................................. 28
CHƢƠNG III .................................................................................................................. 33 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................................................ 33 3.1. Thu hoạch và xử lý mẫu thực vật C. harringtonia.......................................................... 33 3.2. Chiết alkaloid từ C. harringtonia bằng dung môi methanol ........................................... 34 3.3. Tách và phân lập alkaloid bằng phƣơng pháp chiết axit-bazơ ........................................ 35 3.3.1. Loại b thành phần không phải alkaloid bằng dung dịch axit tartric.................... 35 3.3.2. Thu hồi alkaloid từ pha nƣớc bằng dung dịch amoniac ........................................ 36 3.4. Thuốc thử Dragendorff hiển thị sắc ký bản m ng ........................................................... 36 3.5. Khảo sát sơ bộ thành phần alkaloid thô bằng sắc ký lớp m ng (TLC) ........................... 37 3.6. Phân lập các alkaloid bằng sắc ký cột .............................................................................. 38 3.6.1. Quy trình A ( xem sơ đồ 4) ................................................................................... 38 3.6.2. Quy trình B ............................................................................................................ 39 3.6.3. Quy trình C (xem sơ đồ 6) .................................................................................... 40 3.6.4. Quy trình D (xem sơ đồ 7) .................................................................................... 40 3.7. Phân tích thành phần alkaloid bằng phƣơng pháp HPLC .............................................. 42 3.7.1. Lựa chọn nhiệt độ .................................................................................................. 42 3.7.2. Thể tích mẫu bơm ................................................................................................. 44 3.7.3. Lựa chọn dung môi ............................................................................................... 44 3.7.4. Tốc độ dòng và chƣơng trình gradient hỗn hợp dung môi.................................... 44 3.8. Xác định cấu trúc của cephalotaxine và homoharringtonine thu đƣợc ........................... 45 KẾT LUẬN ..................................................................................................................... 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................... 49 PHỤ LỤC ........................................................................................................................ 53
DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1.1: Hiệu suất alkaloid phân lập từ 445kg C. harringtonia khô ........................... 13 Bảng 1.2: Hiệu suất chiết các alkaloid trong mẫu thân cây C. harringtonia bằng phƣơng pháp chiết chất l ng siêu tới hạn ở 80°C và 34.0 MPa ...................................... 14 Bảng 2.1: Kết quả khảo sát các hệ dung môi trên bản m ng silicagel ........................... 21 Bảng 2.2: Kết quả khảo sát các hệ dung môi trên bản m ng nhôm oxit ........................ 22 Bảng 2.3: Chƣơng trình sắc ký gradient 1 ...................................................................... 29 Bảng 2.4: Chƣơng trình sắc ký gradient 2 ...................................................................... 29 Bảng 3.1: Tổng hợp hàm lƣợng cephalotaxine và homoharringtonine trong các mẫu chiết..... 43
DANH MỤC HÌNH VẼ Hình 1.1: Cây Cephalotaxus hainanensis tại xã Nam Động, huyện Quan Hóa, tỉnh Thanh Hóa ....................................................................................................................... 5 Hình 1.2: Cây Đỉnh tùng Cephalotaxus manniinon ở khu vực Pha Luông ................... 6 Hình 1.3: Cephalotaxus harringtonia ............................................................................ 7 Hình 1.4: Các loại alkaloid đƣợc tìm thấy trong cây C. harringtonia ........................... 8 H nh 2.1: Sắc ký đồ HPLC của cephalotaxine và homoharringtonine đối với chƣơng trình gradient dung môi 1 ................................................................................................ 30 H nh 2.2: Sắc ký đồ HPLC của cephalotaxine và homoharringtonine đối với chƣơng trình gradient dung môi 2 ................................................................................................ 30 Hình 2.3: Đƣờng chuẩn HPLC của homoharringtonine ................................................ 31 Hình 2.4: Đƣờng chuẩn HPLC của cephalotaxine ......................................................... 31 H nh 3.1: Phân tách alkaloid trên sắc ký bản m ng điều chế nhôm oxit ....................... 39 H nh 3.2. TLC của các mẫu dịch chiết alkaloid trên bản m ng nhôm oxit, dung môi rửa giải CHCl3 : MeOH : acetonitrile = 97 :2 :1 ............................................................. 42 H nh 3.3: Hai chƣơng trình gradient dung môi cho HPLC để tách cephalotaxine và homoharringtonine .......................................................................................................... 44 H nh 3.4: Phổ IR của cephalotaxine ............................................................................... 45 H nh 3.5: 1H-NMR của cephalotaxine .......................................................................... 46 Hình 3.6: Phổ IR của homoharringtonine thu đƣợc ....................................................... 47
DANH MỤC SƠ ĐỒ Sơ đồ 1.1: Tổng hợp (±)-cephalotaxine theo Weinreb ................................................... 11 Sơ đồ 1.2: Sơ đồ tổng hợp homoharringtonine .............................................................. 12 Sơ đồ 2.1: Quy trình ngâm chiết mẫu nguyên liệu thực vật C. harringtonia ................. 19 Sơ đồ 2.2 : Quy trình A để tách cephalotaxine từ phần chiết alkaloid thô ..................... 23 Sơ đồ 2.3 : Sử dụng sắc ký bản m ng điều chế nhôm oxit để phân tách alkaloid thô ............24 Sơ đồ 2.4: Sử dụng sắc ký cột nhôm oxit để phân tách alkaloid thô .............................. 25 Sơ đồ 2.5: Quy trình B để tách cephalotaxine từ phần chiết alkaloid thô ...................... 26 Sơ đồ 2.6: Phân lập alkaloid bằng than hoạt tính và cột nhôm oxit ............................... 27
MỞ ĐẦU Cephalotaxaceae là một họ các loài cây lá kim, với 3 chi và khoảng 20 loài. Cephalotaxaceae đƣợc phân bố nhiều ở các nƣớc Đông Á, Nhật Bản, Trung Quốc, Việt Nam, Thái Lan , ... Theo Sách đ Việt Nam, loài Cephalotaxaceae thƣờng đƣợc tìm thấy ở Việt Nam là các cây lâu năm, phân bố chủ yếu ở khu vực miền núi của tỉnh Hà Tây (Ba Vì), Thanh Hóa (Lũng Văn), …. Các nghiên cứu trên toàn thế giới đã chỉ ra một số alkaloid có hoạt tính chống ung thƣ đƣợc tìm thấy trong các cây thuộc họ này, Cephalotaxus harringtonia, Cephalotaxus hainanensis, Cephalotaxus wilsoniana ... Cephalotaxine là chất đứng đầu của nhóm alkaloid chiết xuất từ Cephalotaxus, đƣợc phân lập từ Cephalotaxus harringtonia. Nhóm này đƣợc quan tâm nhờ có hoạt tính sinh học đa dạng chống lại bệnh bạch cầu, kháng u và HIV. Các alkaloid tách từ cây Cephalotaxus, nhƣ là homoharringtonine và isohomo-harringtonine, đã đƣợc chứng minh rằng có tính chất ức chế sự khởi đầu của quá trình tổng hợp protein. Bên cạnh đó, homoharringtonine đã đƣợc nghiên cứu trong điều trị bệnh sốt rét và trong nhãn khoa. Một số quy trình tổng hợp các hợp chất này đã đƣợc đƣa ra, tuy nhiên, chúng có nhƣợc điểm là bao gồm nhiều bƣớc và hiệu suất thấp. Do đó, việc tách chiết và phân lập các hoạt chất nói trên từ nguyên liệu thực vật và bán tổng hợp có ý nghĩa khoa học và thực tiễn quan trọng. Nghiên cứu này nhằm mục đích để tách chiết, phân lập cephalotaxine và homoharingtonine từ cây Cephalotaxus harringtonia bằng cách sử dụng kết hợp các phƣơng pháp sắc ký cột và phƣơng pháp phân tích hiện đại HPLC. Thứ nhất, nghiên cứu để đƣa ra đƣợc quy trình tách chiết alkaloid thô và làm giàu các chất có hoạt tính sinh học từ cây Cephalotaxus harringtonia. Thứ hai, nghiên cứu để đƣa ra chƣơng trình HPLC để tách hiệu quả homoharringtonine và cephalotaxine trong mẫu thực vật. Thứ ba, nghiên cứu để định lƣợng đƣợc hàm lƣợng của các alkaloid nói trên trong thành phần của cây Cephalotaxus harringtonia. 1
Luận văn đƣợc hoàn thành tại Phòng thí nghiệm Hóa học hữu cơ III, Khoa Hóa học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội và khoa Công nghệ hóa học, Trƣờng Đại học Osaka Prefecture Nhật Bản). Công trình đƣợc sự hỗ trợ kinh phí từ đề tài Nghị định thƣ Việt – Pháp, mã số 42/2011/HĐ-NĐT của Bộ KH&CN. 2
Chƣơng 1 – TỔNG QUAN 1.1.Khái quát về chi Cephalotaxus Cephalotaxus, còn gọi là đỉnh tùng, là loại thực vật lá kim thƣờng mọc đơn lẻ hoặc mọc thành bụi, thuộc họ Cephalotaxaceae (đỉnh tùng). Trƣớc đây họ cây này đƣợc liệt vào họ Thanh tùng, hay còn gọi là họ Thông đ (Taxaceae). Chi Cephalotaxus thƣờng đƣợc coi là đại diện duy nhất của họ thực vật Cephalotaxaceae, đƣợc cấu thành từ 6-12 loài [26]. Một trong số đó, Cephalotaxus harringtonia (trƣớc đây đƣợc gọi là C. Drupacea (tiếng Nhật là Inukaya), đƣợc thu lƣợm ở Nhật Bản và giới thiệu tại châu Âu vào năm 1829 bởi nhà tự nhiên học Von Siebold, tác giả của Flora Japonica [25]. Chi Cephalotaxus đƣợc phân bố ở vùng Đông Á hoặc Nam Á: Trung Quốc, bao gồm cả Đài Loan và đảo Hải Nam, Ấn Độ, Nhật Bản, Hàn Quốc, Lào, Myanmar, Thái Lan và Việt Nam. Một số loài đã đƣợc coi là có nguy cơ tuyệt chủng, đặc biệt là ở Trung Quốc, do tác động quá mức của con ngƣời và thời gian trƣởng thành của hạt giống dài, hoặc tỷ lệ tái sinh thấp trong tự nhiên [25]. Cephalotaxus thƣờng đƣợc tìm thấy trên các vùng đất giàu mùn ở các khu rừng nhiệt đới hoặc cận nhiệt đới ấm ƣớt. Chúng chủ yếu phân bố ở các vùng núi thấp, hoặc trung bình, nhƣng có một vài loại biến thể đƣợc tìm thấy ở vùng núi cao và trên những vách đá vôi. Toàn bộ các loài thuộc chi Cephalotaxus phân bố rải rác kéo dài từ vùng nhiệt đới tới vùng khí hậu ôn đới, và sức chịu lạnh của từng loài tƣơng ứng với xuất xứ của chúng. Các loài Cephalotaxus thƣờng có đặc điểm hình thái chung dễ nhận thấy. Chúng là các loại cây bụi hay cây thân gỗ nh có nhiều cành. Lá của chúng thƣờng sắp xếp theo vòng xoắn, thƣờng vặn xoắn lại tại gân để xuất hiện theo kiểu hai hàng lá. Lá có hình dáng từ thẳng tới mũi mác, có màu xanh lục nhạt, có phấn trắng ở mặt dƣới. Các loài trong họ hoặc là đơn tính cùng gốc hoặc là đơn tính cận khác gốc hay đơn tính khác gốc. Các nón đực dài khoảng 4–25 mm và phát tán phấn vào đầu mùa xuân. Các nón cái bị thoái hóa, với 1 hoặc một số lá noãn, và một hạt trên một lá noãn. Khi hạt phát triển đầy đủ thì lá noãn cũng phát triển thành một dạng 3
v hạt nhiều xơ, bao phủ toàn bộ hạt. V hạt phát triển đầy đủ thuộc loại m ng thịt có màu lục, tía hay đ , mềm và có chứa nhựa. Mỗi lá noãn nằm rời rạc, vì thế nón cái phát triển thành một cọng ngắn với một hay vài hạt trông tựa nhƣ một loại quả mọng. Chúng có thể bị chim hay một số loài động vật khác ăn để sau đó phát tán phần hạt cứng không bị phân hủy, nhƣng cơ chế phát tán hạt hiện nay vẫn chƣa đƣợc nghiên cứu kỹ lƣỡng [26]. Các cá thể Cephalotaxus ngày càng khan hiếm và đang bị đe dọa tuyệt chủng trong khu vực phân bố của chúng [14].Thời gian trƣởng thành hạt giống dài, kết hợp với hình thức sinh sản đơn tính khác gốc và sự phân bố tự nhiên thƣa thớt trong một vùng địa lý, dẫn tới tần số tái sinh thực tế thấp của chi này trong tự nhiên. Ngoài ra sự thoái hóa của các loài Cephalotaxus còn do các hoạt động của con ngƣời gây ra. Các cây thuộc họ này đƣợc khai thác lấy gỗ, củi hoặc sử dụng nhƣ các phƣơng thuốc truyền thống. Đôi khi các nón cái đƣợc khai thác để lấy dầu. Phân bố của các loài Cephalotaxus ở Việt Nam Ở Việt Nam loài Cephalotaxus đƣợc biết chắc chắn có ở Hà Tây (Ba Vì), Thanh Hóa (Lũng văn), Quảng Trị (giữa Hòn Rao và A Dua), Thừa Thiên Huế, Kontum (Đắc Glây, Đắc Tô: Ngọc Pan, Sa Thầy), Gia Lai, Lâm Đồng (Di Linh: núi Braian)… Các cá thể đƣợc tìm thấy là cây gỗ mọc đứng, tƣơng đối chịu bóng râm với thân thẳng và tán hẹp, cao tới 20 ‐30 m và đƣờng kính (ngang ngực) 50‐110 cm. Cây mọc rải rác thành từng đám nh ở vùng núi đất, đất phong hoá từ silicát và trên cả núi đá vôi, ở độ cao 500‐2000 m so với mực nƣớc biển, trong các rừng nguyên sinh rậm, thƣờng có nhiều cây lá rộng. Khí hậu nhiệt đới gió mùa, nhiệt độ trung bình năm 13‐210C, lƣợng mƣa trên 1500 mm/năm). Họ Cephalotaxus thƣờng mọc cùng với Kim giao núi đất (Nageia wallichiana), Thông đỏ nam (Taxus wallichiana), Thông tre lá dài (Podocarpus neriifolius) và Thông nàng núi đá silicát (Dacrycarpus imbricatus), chủ yếu ở miền Trung và Nam Việt Nam. Cephlotaxus mọc với Thiết sam giả (Pseudotsuga sinensis), Thông Pà Cò (Pinus kwangtungensis), Kim giao núi đá (Nageia fleuryi), Thông tre lá ngắn (Podocarpus pilgeri), Pơ mu (Fokienia hodginsii), Thông đỏ bắc 4
(Taxus chinensis) và các loài Dẻ tùng (Amentotaxus spp) trên núi đá vôi ở miền Bắc Việt Nam [2]. Hình 1.1: Cây Cephalotaxus hainanensis tại xã Nam Động, huyện Quan Hóa, tỉnh Thanh Hóa [1] Họ Cephalotaxus đƣợc ghi nhận với các quần thể nh ở một loạt các Vƣờn Quốc Gia (VQG) và khu Bảo tồn thiên nhiên (BTTN) nhƣ VQG Ba Vì, VQG Bạch Mã, khu BTTN Pù Luông, khu BTTN Pù Huống, VQG Chƣ Mom Ray và phần lớn các khu bảo tồn quanh núi Bì Đúp ở Lâm Đồng. Thông tin từ VQG Tam Đảo cần đƣợc kiểm tra. Các quần thể lớn nhất ở Lâm Đồng (khoảng 100 cây) gặp trên các sƣờn của Núi Voi ‐ huyện Đức Trọng, là khu vực đƣợc xếp vào rừng phòng hộ đầu nguồn. Năm 1999, tại Cao nguyên đá Đồng Văn, TS. Lê Trần Chấn đã tìm thấy duy nhất một cá thể cây Họ Cephalotaxus tại xã Thài Phìn Tủng, huyện Đồng Văn, tỉnh Hà Giang [5] . 5
Hình 1.2: Cây Đỉnh tùng Cephalotaxus manniinon ở khu vực Pha Luông [7] Cuối tháng 11 năm 2011, hạt Kiểm lâm huyện Quan Hóa (tỉnh Thanh Hóa) mới phát hiện 4 loài cây hạt trần quý hiếm gồm Thông Pà cò, Cephalotaxus, thông Tre lá ngắn và Dẻ tùng sọc trắng. Các loài cây hạt trần này phân bố tập trung trên diện tích gần 500 ha ở địa bàn xã Nam Động (huyện Quan Hóa, tỉnh Thanh Hóa), trong đó họ Cephalotaxus hainanensis có 260 cây [3]. Giữa tháng 12/2012, nhóm các nhà nghiên cứu thuộc Trung tâm Con ngƣời và Thiên nhiên (Pan Nature) phát hiện một khu vực rừng dƣới chân đỉnh núi Pha Luông thuộc địa phận Khu Bảo tồn Thiên nhiên Xuân Nha (Sơn La) có các loài cây lá kim quí hiếm, trong đó gồm Cephalotaxus [6]. Quần thể Cephalotaxus (mannii Hook.f.) tại Pha Luông ƣớc tính có khoảng 10 cá thể trƣởng thành, một số cây cao 6
tới 25m, đƣờng kính ngang ngực tới 80 cm. Một số cây mọc trên vách đá thì kém phát triển hơn, thân chính bị gãy, mọc lên nhiều nhánh nh . Ngoài các cây trƣởng thành, nhóm nghiên cứu cũng bắt gặp nhiều cây Đỉnh tùng tái sinh tốt ở những nơi ẩm ƣớt, chúng mọc trên lớp mùn đƣợc tạo bởi xác thực vật của rừng. Thân cây Đỉnh tùng có v màu nâu đ , bong rời thành các lớp m ng. Lá có mặt trên màu xanh đậm, mặt dƣới có các dải lỗ khí khổng màu trắng xanh [6]. Qua phân tích ở trên cho thấy, Đỉnh tùng là loài cây lá kim quý hiếm, hiện đƣợc đánh giá ở mức Sẽ nguy cấp (VU) trong Sách Đ Việt Nam (2007) cũng nhƣ trong Danh lục đ của IUCN. Loài này cũng đƣợc liệt kê trong danh mục IIA của Nghị định 32 của Chính phủ về các loài Thực vật rừng, động vật rừng hạn chế khai thác, sử dụng vì mục đích thƣơng mại. 1.2. Khái quát về loài Cephalotaxus harringtonia Hình 1.3: Cephalotaxus harringtonia Cephalotaxus harringtonia (C. harringtonia), hay còn đƣợc gọi là Inugaya trong tiếng Nhật, là một loài thực vật điển hình thuộc chi Cephalotaxus. Đây là loài Đỉnh tùng đầu tiên đƣợc thu thập và đƣợc trồng lâu nhất ở các nƣớc phƣơng Tây. Loài này phổ biến ở Nhật Bản từ vùng bắc Kyushu tới Hokkaido và cũng đƣợc tìm thấy trong các khu vực đông bắc Trung Quốc và Hàn Quốc. Ở những nơi ấm áp, 7
chúng thƣờng đƣợc tìm thấy ở dạng các cây nh , trong khi đó tại khu vực lạnh hơn chúng thƣờng là loại cây bụi tròn, dáng thấp đến trung bình. Cũng vì đặc điểm phát triển phụ thuộc vào khí hậu đó mà chúng thƣờng đƣợc trồng ở châu Âu và Bắc Mỹ. O N O H OR H OCH 3 1 R=H Cephalotaxine (MW: 315) R1 R2 O 2 OH OH Cephalezomine C (MW: 547) H R2 4 OH H Harringtonine (MW:531) R= H3CO 6 H OH Isoharringtonine (MW: 531) OH 8 H H Deoxyharringtonine (MW: 515) R1 O O H R= R2 3 OH OH Cephalezomine E (MW: 561) H3CO 5 OH H Homoharringtonine (MW: 545) R1 9 H H Homodeoxyharringtonine (MW: 529) OH O O 7 Axit Deoxyharringtonic (MW:501) R= HO OH O Hình 1.4: Các loại alkaloid đƣợc tìm thấy trong cây C. harringtonia Xét về đặc điểm hình thái học, loài C. harringtonia thƣờng mọc thành các cây con hoặc các bụi cây nh . Chồi non của C. harringtonia có màu xanh lá cây, dạng hình cầu và chỉ dài khoảng 1 mm. Có một hàng lá xuất hiện ở hai bên của chồi, và những lá nh này lớn dần lên, hơi cong vào bên trong, tạo dáng hình chữ V hẹp. Hàng lá thƣờng mọc theo chiều thẳng đứng, nhƣng cũng có thể là nằm theo chiều ngang ở trong bóng râm. Lá có dạng phẳng, dài khoảng 5 cm và rộng khoảng 0,3 cm. Lá nhọn ở phần chóp, bề mặt trên của lá có màu xanh sáng bóng. Mặt dƣới của lá có hai dải lỗ khí khổng rộng và màu hơi trắng nhạt [6]. 8
Kết quả nghiên cứu trong nhiều năm qua đã cho thấy, alkaloid chiết xuất từ cây Cephalotaxus có hoạt tính kháng u tƣơng đối rõ rệt. Thành phần alkaloid đƣợc phân lập và xác định chủ yếu gồm cephalotaxine và các ester của cephalotaxine (xem hình 1.4). 1.3. Hoạt tính sinh học và ứng dụng của các hợp chất alkaloid chiết xuất từ Cephalotaxus (Cephalotaxacaea) Các nghiên cứu về hoạt tính và cơ chế tác động của các alkaloid phân lập từ cây Cephalotaxus đã đƣợc tiến hành trong hơn 20 năm qua, chủ yếu ở Hoa Kỳ và Trung Quốc. Hầu hết các nghiên cứu ở Mỹ tập trung vào homoharringtonine tinh khiết, trong khi Trung Quốc nghiên cứu trên cơ sở homoharringtonine ít tinh khiết hơn. Cephalotaxine không có hoạt tính sinh học, nhƣng đƣợc dùng làm chất đầu để điều chế các dẫn xuất este có hoạt tính sinh học cao. Các este của cephalotaxine đƣợc dùng để điều trị các bệnh liên quan tới suy giảm hệ miễn dịch. Homoharringtonine là dẫn xuất este quan trọng nhất của cephalotaxine, có hiệu quả cao trong điều trị nhiều loại bệnh ung thƣ, đặc biệt là ung thƣ bạch cầu. 1.3.1. Chất ức chế tổng hợp protein Gần đây, các nghiên cứu về tác động của harringtonnine và homoharringtonine với bệnh bạch cầu L-1210 bằng phƣơng pháp thử in-vitro và in vivo cho thấy khả năng gây độc của chúng tỷ lệ thuận với sự ức chế tổng hợp protein [15, 32]. Các nhà nghiên cứu Nga đã chỉ ra rằng homoharringtonine ức chế sự kéo dài chuỗi polypeptide ở bƣớc hình thành liên kết peptide. Họ đã quan sát thấy sự ức chế tổng hợp glycoprotein trong quá trình nghiên cứu sử dụng homoharringtonine. Các nghiên cứu liên quan đến các hoạt tính sinh học của homoharringtonine đã đƣợc tiến hành đồng thời với nghiên cứu cấu trúc. Nghiên cứu thử nghiệm gây độc tế bào của homoharringtonine cho thấy độc tính của homoharringtonine phụ thuộc vào chu kỳ tế bào đặc thù, nó ảnh hƣởng đến hầu hết các tế bào trong giai đoạn G1 và G2. Mặc dù điều này cho thấy vai trò của HHT chống lại những khối u 9
phát triển chậm, các nghiên cứu thử nghiệm cũng đã chứng minh hoạt tính cao hơn đối với những khối u phát triển nhanh [15]. 1.3.2. Điều trị bệnh bạch cầu Kết quả thử lâm sàng của harringtonine và homoharringtonine trong điều trị bệnh bạch cầu đƣợc công bố trong rất nhiều tài liệu [17]. Giai đoạn I nghiên cứu đã đƣợc hoàn thành, và thử nghiệm lâm sàng giai đoạn II/III đang đƣợc tiến hành. Những thử nghiệm này cho thấy homoharringtonine là một loại thuốc chống ung thƣ bạch cầu an toàn và hiệu quả cao với liều lƣợng rất thấp. Thử nghiệm ở Mỹ sử dụng truyền dịch HHT ngắn (3-4 mg/m2 trong 5 ngày) đã dẫn đến tỷ lệ cao các biến chứng tim mạch. Liều dùng đã đƣợc giảm bằng cách sử dụng lịch trình truyền liên tục 3-7 mg/m2 mỗi ngày trong 5-7 ngày đầu, và sau đó sử dụng liều thấp hơn 2,5 mg/m2 mỗi ngày trong 7-14 ngày [17,19]. 1.3.3 Phƣơng pháp điều trị khác Các ứng dụng của homoharringtonine trong nhãn khoa và bệnh sốt rét cũng đã đƣợc nghiên cứu. Homoharringtonine, 2-3,4 nM, có hiệu quả trong việc gây ra ức chế 50% sự tăng trƣởng của hai chủng sốt rét Plasmodium falciparum kháng chloroquine đối với thử nghiệm in vitro. Các thử nghiệm in vivo ở chuột bị nhiễm P. yoelii cho thấy chất này cũng có hiệu quả trong việc ức chế sự phát triển ký sinh trùng. Các tế bào phơi nhiễm thuốc giảm mức độ putrescine và spermidine và tăng nồng độ spermine. Các kết quả này đã chứng minh tiềm năng của homoharringtonine trong điều trị sốt rét kháng chloroquine [28]. 1.3.4. Các este của cephalotaxine không tự nhiên và hoạt tính kháng u Trong những năm 1970, một hỗn hợp của homoharringtonine và harringtonine lần đầu tiên đƣợc sử dụng để điều trị bệnh bạch cầu dòng tủy cấp tính (AML) và bệnh bạch cầu dòng tủy mãn tính (CML) ở Trung Quốc [11]. Homoharringtonine ức chế quá trình tổng hợp protein G1 và G2 gây ra sự phân ly 10
tế bào và thúc đẩy sự tự hủy diệt của tế bào [21]. Homoharringtonine có hoạt động hiệp lực với imatinib trong các dòng tế bào kháng imatinib và tế bào sơ cấp từ các bệnh nhân mắc bệnh CML. Nghiên cứu Giai đoạn I và II ở Hoa Kỳ đã khẳng định hiệu quả lâm sàng của homoharringtonine trong CML nhƣng cũng đồng thời cho thấy tỷ lệ cao các biến chứng tim mạch khi áp dụng tiêm tĩnh mạch [20]. Wang và cộng sự đã tổng hợp các este của cephalotaxine không phải nguồn gốc tự nhiên có các hoạt tính gây độc đối với tế bào bạch cầu P-388 [27]. Đáng chú ý là, hoạt tính chống ung thƣ bạch cầu của các hợp chất này có thể so sánh với homoharringtonine. Các nhà nghiên cứu ở Bắc Kinh đã điều chế các este của cephalotaxine và axit amin với cấu trúc khác nhau [33]. Thử hoạt tính chống tế bào ung thƣ bạch cầu HL-60 của chúng cho thấy rằng, hợp chất có hoạt tính mạnh nhất trong số đó vẫn chƣa bằng harringtonine [33]. Quy tr nh mẫu tổng hợp (±)-cephalotaxine Do hoạt tính đa dạng, các dẫn xuất este của cephalotaxine đã đƣợc nhiều nhà khoa học trên thế giới nghiên cứu tổng hợp. Sự khác nhau giữa các phƣơng pháp đã đƣợc công bố chủ yếu là sử dụng các nguyên liệu đầu. Một trong những quy trình tiêu biểu tổng hợp toàn phần (±)-cephalotaxine đã đƣợc Weinreb thực hiện [8]. O O O O CO2H 1- SOCl2 1- BF3.OEt2 N O O N CHO 2- LiAlH4 O 2- Prolinol, 82% 1 3- DCC, DMSO, 70% 3 85% 4 pyruvic acid O Mg(OMe)2 O O N N N ethyl chloroformate O MeOH, 58% O O NaHCO3, 73% O O HO 5 O Mg O 6 O MeO 5' (CH3)2C(OMe)2 O O NaBH4 O N + N N TsOH O O 85% O H H 15% 45% 7' MeO 7 O HO O OMe 8 OMe Cephalotaxine Sơ đồ 1.1: Tổng hợp (±)-cephalotaxine theo Weinreb 11
Quá trình tổng hợp đƣợc mô tả trên sơ đồ 1.1. Nguyên liệu đầu đƣợc Weinreb sử dụng là axit 3,4-methylene-dioxyphenylaxetic (1) đƣợc chuyển hóa thành dẫn xuất cloanhidrit axit tƣơng ứng bằng cách khuấy với thionyl clorua. Dẫn xuất clorua axit tác dung với prolinol tạo thành N-(3,4- methylenedioxyphenylacetyl)prolinol. Oxy hóa prolinol bằng carbodiimide thu đƣợc N-(3,4-Methylenedioxyphenylacetyl)-prolinal (3). Hợp chất 3 đƣợc đóng vòng bằng axit lewis BF3.Et2O tạo thành 5,8,9,10-Tetra-hydro-6H-1,3-dioxolo[4,5- b]pyrrol[2,1-b][3]benzazepin-6-on (4), hay còn đƣợc gọi là enamin Weinreb. Phản ứng của enamin Weinreb với axit pyruvic tạo thành hợp chất 2-oxo-1-(5,8,9,10)- tetrahydro-6H-1,3 dioxolo[4,5-h]pyrrolo[2,1-b] benzazepin-11-yl)-1-Propanone (5). Hợp chất 5 tác dụng với magie dimetoxyt, tạo phức trung gian 5’, sau đó chuyển hóa thành thành (RS)-5,6,8,9-Tetrahydro-1-hydroxy-4H- cyclopenta[a][1,3-]dioxolo(4,5-h]pyrrolo[2,1-b] [3]benzazepin-2(3H)-on (6). Metyl hóa rồi khử hợp chất 6 qua hợp chất trung gian 7 sẽ thu đƣợc sản phẩm cuối cùng là cephalotaxine (8). Bằng quy trình này, Weinreb đã tổng hợp (±)- cephalotaxine qua 17 bƣớc và hiệu suất toàn phần là 21%. Trên cơ sở cephalotaxine, ngƣời ta đã tiến hành ngƣng tụ với dẫn xuất ester của axit sucinic điều chế homoharringtonine. Một trong những phƣơng pháp đơn giản nhất để tổng hợp homoharrringtonine đƣợc mô tả tóm tắt trên Sơ đồ 1.2. O O 1, 2 3, 4 COOH 10 9 O CHO O O OH 5 6 COOCP COOCP HHT 11 12 COOCH3 1 = Ag2O; 2 = O3/Me2S; 3 = (COCl)2; 4 = Cephalotaxine/Py/CH2Cl2; V = Zn/BrCH2CO2Me/THF; 6 = MeMgI/-200C; Cp = Cephalotaxine Sơ đồ 1.2: Sơ đồ tổng hợp homoharringtonine 12