zunia.vn

Tuyển sinh 2024 dành cho Gen-Z

zunia.vn

» Luận Văn - Báo Cáo

» Thạc sĩ - Tiến sĩ - Cao học

Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Tách dòng và biểu hiện cecropin trong các hệ vector khác nhau

Chia sẻ: Na Na | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:82

Báo xấu

59
lượt xem 3
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Với mong muốn giảm chi phí và chủ động trong việc sản xuất cecropin được phân lập từ côn trùng ở Việt Nam cho các nghiên cứu tiếp theo, tác giả tiến hành đề tài “Tách dòng và biểu hiện cecropin trong các hệ vector khác nhau”. Mời các bạn cùng tham khảo nội dung chi tiết luận văn.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Tách dòng và biểu hiện cecropin trong các hệ vector khác nhau

Luận văn thạc sĩ khoa học 2009-2011 MỞ ĐẦU Nhân ngày Sức khỏe Thế giới 7/4/2011, tổ chức Y tế Thế giới WHO đã đưa ra chủ đề “Chống kháng kháng sinh: không hành động hôm nay, không còn thuốc chữa mai sau” nhằm thức tỉnh cộng đồng về vấn đề vi sinh vật kháng thuốc đang đe dọa toàn cầu. Chống kháng kháng sinh không phải là vấn đề mới, nhưng đã trở nên cấp bách, đòi hỏi nỗ lực tổng hợp giúp nhân loại tránh nguy cơ quay trở lại thời kỳ chưa có kháng sinh. Cho đến nay, các giải pháp đưa ra nhằm hạn chế tình trạng kháng kháng sinh chưa phát huy tác dụng như mong đợi. Trong khi hướng phát triển các loại kháng sinh mới đang trong tình trạng bế tắc, các nhà khoa học đã tìm ra một nguồn kháng sinh tự nhiên đầy tiềm năng, đó là các peptide kháng khuẩn (antimicrobial peptides, AMPs). Trong số các peptide này, cecropin chủ yếu được tách chiết từ côn trùng, có phổ kháng khuẩn rộng và có nhiều tiềm năng ứng dụng nên thu hút được rất nhiều sự quan tâm của các nhà khoa học. Để sản xuất AMPs nói chung và cecropin nói riêng, có ba con đường tiếp cận chính là (1) tách chiết từ tự nhiên (2) tổng hợp trực tiếp từ các axit amin theo con đường hóa học và (3) biểu hiện protein tái tổ hợp. Tuy nhiên, với yêu cầu thu được lượng lớn cecropin tinh khiết, hai phương pháp đầu đều có giá thành cao và khó áp dụng trong điều kiện phòng thí nghiệm ở các nước đang phát triển như Việt Nam. Vì vậy, với mong muốn giảm chi phí và chủ động trong việc sản xuất cecropin được phân lập từ côn trùng ở Việt Nam cho các nghiên cứu tiếp theo, chúng tôi tiến hành đề tài “Tách dòng và biểu hiện cecropin trong các hệ vector khác nhau”. Đây là một hướng nghiên cứu còn khá mới ở Việt Nam nhưng hứa hẹn nhiều triển vọng. Đề tài được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Sinh Y và Phòng Genomic, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội. Ngô Thị Hà 1 K18 Sinh học
Luận văn thạc sĩ khoa học 2009-2011 CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tổng quan về tình hình kháng kháng sinh 1.1.1. Thực trạng kháng kháng sinh Kháng kháng sinh là hiện tượng vi sinh vật (virus, vi khuẩn, nấm, ký sinh trùng) có khả năng vô hiệu hóa tác dụng của thuốc kháng sinh mà trước đó chúng vẫn mẫn cảm [63, 79]. Khi các loại thuốc mất tác dụng điều trị, vi sinh vật gây bệnh vẫn tồn tại và phát triển khiến bệnh lây lan nhanh ra cộng đồng thành dịch bệnh rất khó kiểm soát. Đặc biệt các nước nghèo và các nước đang phát triển phải đối mặt với hậu quả vô cùng nghiêm trọng do gánh nặng điều trị các bệnh nhiễm khuẩn và những chi phí bắt buộc cho việc thay thế các kháng sinh cũ bằng các kháng sinh mới đắt tiền. Thực trạng kháng kháng sinh đã, đang và sẽ là vấn đề mang tính toàn cầu, thách thức toàn nhân loại. Điều này đã được Tổng giám đốc WHO Margaret Chan nhận định nhân ngày Sức khỏe Thế giới 7/4/2011: “Một trong những mối quan ngại hàng đầu trong việc chăm sóc sức khỏe y tế hiện nay chính là tình trạng bệnh kháng thuốc kháng sinh. Đây chính là nguy cơ hàng đầu gây thách thức trong công tác chăm sóc y tế và kiểm soát các bệnh truyền nhiễm, đồng thời làm tăng chi phí chăm sóc sức khỏe cho cộng đồng”. Năm 1928 được coi là mốc quan trọng đầu tiên đánh dấu cho công cuộc tìm kiếm thuốc kháng sinh khi Alexander Fleming (1881-1955) phát hiện ra penicillin [72, 75]. Tuy nhiên, hơn 60 năm sau khi phát hiện và gần 50 năm sau khi penicillin được đưa vào sản xuất ở quy mô công nghiệp, trên thế giới đã xuất hiện hơn 95% chủng Staphylococcus aureus kháng lại penicillin và 60% kháng lại dạng dẫn xuất của nó là methicillin [7]. Ngày nay, vi khuẩn không chỉ kháng lại penicillin mà còn kháng nhiều loại kháng sinh khác và trở thành mối đe dọa thực sự đối với sức khoẻ nhân loại. Theo thống kê năm 2006 của WHO, 5 vi khuẩn có tỷ lệ kháng kháng sinh cao nhất hiện nay là Klebsiella (15.1%), E. coli (13.3%), P. aeruginosa (13.3%), Acinetobacter spp Ngô Thị Hà 2 K18 Sinh học
Luận văn thạc sĩ khoa học 2009-2011 (9.9%) và S. aureus (9.3%). Nhóm thuốc cephalosporin thế hệ thứ tư có tỷ lệ kháng cao đặc biệt từ 66-83%, tiếp theo là nhóm kháng sinh aminosid và fluoroquinolon có tỷ lệ kháng xấp xỉ trên 60%. Báo cáo của WHO cho biết, số quốc gia có bệnh lao kháng thuốc tăng từ 58 trong năm 2010 lên 69 trong năm 2011. Mỗi năm, thế giới có khoảng 440,000 ca mới nhiễm lao đa kháng thuốc, ít nhất 150,000 ca tử vong vì loại vi khuẩn này [79]. Tính riêng ở các nước thuộc liên minh châu Âu EU thì cứ mỗi năm có khoảng 25,000 người chết vì các loài vi khuẩn đa kháng thuốc [80]. Các kháng sinh thế hệ mới đắt tiền, thậm chí cả một số kháng sinh thuộc nhóm “lựa chọn cuối cùng” cũng đang mất dần hiệu lực [1]. Bằng chứng mới đây nhất là sự lây lan của chủng vi khuẩn kháng carbapenem (NDM-1) ở một số nước châu Âu và châu Á. Loại “siêu vi khuẩn kháng thuốc” này tiết ra enzyme NDM-1 có thể kháng lại hầu hết mọi loại thuốc kháng sinh, kể cả nhóm kháng sinh mạnh nhất là carbapenem [7, 79]. Các nhà khoa học lo ngại “siêu vi khuẩn” có thể lan ra khắp thế giới, đồng thời khẳng định trong tương lai gần chưa có loại thuốc nào có khả năng tiêu diệt được. Kháng kháng sinh không chỉ ảnh hưởng tới lĩnh vực y tế mà nó còn tác động sâu sắc đến nền kinh tế. Theo ước tính của WHO, ở Mỹ mỗi năm chi phí y tế cho thuốc điều trị nhiễm khuẩn xấp xỉ 20 tỉ $; còn với khối EU là 1.5 tỉ € [80]. Vì vậy, kháng kháng sinh giờ đã trở thành vấn đề mang tính toàn cầu. Hiện nay, tình hình kháng kháng sinh ở Việt Nam cũng diễn biến hết sức phức tạp. Theo báo cáo của Bộ Y tế trong năm 2008 thì nhiễm khuẩn chiếm tỷ lệ tử vong cao thứ hai (16.7%) chỉ sau bệnh về tim mạch (18.4%). Báo cáo kết quả nghiên cứu ở 19 bệnh viện ở Hà Nội, thành phố Hồ Chí Minh và Hải Phòng trong hai năm (2009- 2010) về tình trạng kháng kháng sinh cho thấy, có 4 chủng vi khuẩn kháng kháng sinh thường gặp là Acinetobacter spp, Pseudomonas spp, E. coli và Klebsiella. Hầu hết các kháng sinh thông thường như: penicillin, tetracycline, streptomycine, … đã bị kháng. Theo báo cáo “Phân tích thực trạng: sử dụng kháng sinh và kháng kháng sinh ở Việt Ngô Thị Hà 3 K18 Sinh học
Luận văn thạc sĩ khoa học 2009-2011 Nam” do nhóm nghiên cứu Quốc gia của Việt Nam thuộc tổ chức hiệp hội kháng kháng sinh toàn cầu (GARP, Global Antibiotic Resistance Partnership) vào tháng 10 năm 2010 thì tình trạng kháng kháng sinh ở nước ta đáng báo động [1]. Bằng chứng là tỷ lệ chủng Streptococcus pneumoniae, một trong những nguyên nhân chính gây nhiễm khuẩn hô hấp, kháng penicillin là 71.4%, kháng erythromycin là 92.1%. Đây là tỉ lệ kháng cao nhất trong số 11 nước trong mạng lưới giám sát các căn nguyên kháng thuốc Châu Á (ANSORP) năm 2000-2001. Năm 2009 tỷ lệ các chủng vi khuẩn Gram âm kháng với ceftazidime là 42%, kháng với gentamicin là 63% và kháng với axit nalidixic là 74% ở cả bệnh viện và trong cộng đồng. Xu hướng gia tăng của tình trạng kháng kháng sinh cũng thể hiện rõ rệt. Những năm 1990, tại thành phố Hồ Chí Minh, chỉ có 8% các chủng pneumococcus kháng với penicillin. Đến năm 1999-2000, tỉ lệ này đã tăng lên 56% [1]. Chính vì tình trạng kháng kháng sinh ngày càng có xu hướng tăng lên như vậy mà Việt Nam đã bị WHO xếp vào nhóm nước có tỷ lệ kháng kháng sinh cao nhất thế giới (WHO, 2008). Thực trạng phức tạp này không chỉ đặt ra cho ngành y tế Việt Nam nhiều thách thức mà còn đòi hỏi cả xã hội phải cùng nhau hành động để có thể làm giảm bớt tình trạng kháng kháng sinh. 1.1.2. Nguyên nhân và giải pháp cho tình trạng kháng kháng sinh Để hiểu rõ căn nguyên của tình trạng kháng kháng sinh, báo cáo của WHO trong ngày sức khỏe thế giới 7/4/2011 đã tổng kết 6 nguyên nhân chính dẫn đến tình trạng kháng kháng sinh cao như sau [79]: Thứ nhất, kháng thuốc là một hiện tượng tiến hóa tự nhiên. Khi vi sinh vật tiếp xúc với các chất có khả năng tiêu diệt chúng, những vi sinh vật “may mắn” sống sót sẽ tự tạo ra những cơ chế tự vệ tránh được tác dụng của các chất này. Từ đó các thế hệ vi sinh vật kháng thuốc được hình thành. Không những thế, gen kháng thuốc có thể được Ngô Thị Hà 4 K18 Sinh học
Luận văn thạc sĩ khoa học 2009-2011 truyền ngang từ cá thể này sang cá thể khác nên vi sinh vật kháng thuốc ngày càng nhiều. Nguyên nhân này là quy luật tự nhiên nên khó có giải pháp ngăn chặn. Tuy nhiên, 4 nguyên nhân tiếp theo lại xuất phát chủ yếu từ phía con người. Đó chính là: sử dụng thuốc không hợp lý; chất lượng thuốc kém; công tác phòng ngừa, kiểm soát bệnh lây truyền yếu và thiếu hệ thống giám sát. Chính những nguyên nhân này thúc đẩy nguyên nhân đầu tiên diễn ra nhanh hơn và góp phần không nhỏ dẫn đến tình trạng kháng kháng sinh hiện nay. Vì vậy, muốn tình trạng kháng kháng sinh giảm xuống thì chính chúng ta phải có những hành động tích cực ngay ngày hôm nay. Nguyên nhân cuối cùng dẫn tới tình trạng kháng kháng sinh ngày càng trầm trọng chính là các công cụ mới chống lại sự kháng thuốc ngày càng cạn kiệt. Các loại thuốc kháng sinh đang mất dần tác dụng. Trong khi đó, sự phát triển các loại kháng sinh thế hệ mới ngày càng thu hẹp. Hình 1. Lịch sử phát hiện thuốc kháng sinh. Nhìn vào Hình 1 chúng ta thấy hàng loạt các thuốc kháng sinh được tìm ra chủ yếu trong khoảng từ năm 1940 đến năm 1970. Có thể nói đây là thời đại hoàng kim của Ngô Thị Hà 5 K18 Sinh học
Luận văn thạc sĩ khoa học 2009-2011 thuốc kháng sinh. Tuy nhiên, từ những năm 1980 trở lại đây số lượng thuốc kháng sinh mới rất hiếm. Điều này đặt ra mối lo ngại có phải nguồn kháng sinh đã cạn kiệt? Thêm vào đó nếu tình trạng kháng kháng sinh ngày càng gia tăng như hiện nay thì liệu rằng những thế hệ tương lai sẽ còn được hưởng những lợi ích mà kháng sinh mang lại? Đây chính là mối băn khoăn chính được đưa ra trong Ngày sức khỏe thế giới năm nay. Một trong những giải pháp nhằm đáp ứng nguồn kháng sinh mới là khai thác các peptide kháng khuẩn AMPs (antimicrobial peptides) [7, 79]. Hàng loạt nghiên cứu đã chỉ ra rằng cơ thể của các sinh vật đều mang trong mình một hệ thống các peptide có khả năng kháng khuẩn [22, 30]. Chúng có đầy đủ tiềm năng để trở thành nguồn nguyên liệu quý giá mà con người có thể khai thác trong “thời đại kháng kháng sinh” hiện nay [28, 49]. 1.2. Peptide kháng khuẩn (AMPs) 1.2.1. Giới thiệu chung về AMPs Tất cả các cơ thể đa bào đều tiến hóa qua hàng triệu năm trong môi trường có nhiều loại vi sinh vật. Mặc dù thường xuyên tiếp xúc với các mầm bệnh qua những con đường khác nhau nhưng nhiều loài sinh vật vẫn không có sự bảo vệ của kháng thể hoặc các tế bào miễn dịch [30, 57]. Lý do mà chúng có thể tồn tại được là nhờ hệ miễn dịch bẩm sinh tạo ra bởi hàng loạt AMPs tham gia đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu [20, 28]. Một thực tế quan trọng là các mầm bệnh vi sinh vật dường như không hình thành tính kháng với các peptide này. Đây cũng chính là một trong những lý do để các nhà nghiên cứu và các hãng dược phẩm tin tưởng rằng AMPs sẽ trở thành liệu pháp chữa bệnh mới thay thế cho các loại thuốc kháng sinh dễ bị vi sinh vật gây bệnh kháng lại [22, 45, 70]. Ngô Thị Hà 6 K18 Sinh học
Luận văn thạc sĩ khoa học 2009-2011 1.2.1.1. Hoạt tính sinh học của AMPs AMPs có hoạt tính kháng lại vi sinh vật bao gồm vi khuẩn, vi rút, nấm, kí sinh trùng [20, 28, 37, 48]. Tùy thuộc vào loại AMPs mà có hoạt tính kháng mạnh hay yếu, phổ tác dụng rộng hay hẹp. Ngoài ra, một số loại AMPs còn có hoạt tính kháng viêm, diệt tế bào ung thư và đảm nhiệm các chức năng nhất định trong hệ thống miễn dịch bẩm sinh cũng như hệ thống miễn dịch tiếp thu [28, 30]. 1.2.1.2. Sự đa dạng của AMPs AMPs được tìm thấy trong nhiều mô và cơ quan khác nhau ở tất cả các giới, các ngành sinh vật, từ prokaryote cho đến con người [28, 60]. Tuy nhiên, hiện nay các nhà nghiên cứu chủ yếu tập trung phân tích AMPs có nguồn gốc từ sinh vật nhân chuẩn. Đến nay đã có khoảng 800 loại AMPs khác nhau được tìm thấy ở các sinh vật nhân chuẩn [37]. Dựa vào mức độ tương đồng về độ tích điện, trình tự, chức năng và cấu trúc không gian, AMPs được chia thành các nhóm như sau [4, 9]:  Nhóm peptide là phân đoạn của các protein lớn hơn: Các peptide này được tạo ra do protein lớn hơn bị phân cắt bởi enzyme. Trong số các peptide thuộc nhóm này, peptide được quan tâm nhiều nhất là lactoferricin được tạo ra khi lactoferrin (một protein có hoạt tính kháng khuẩn, được tiết chủ yếu ở các mô nhầy) bị phân cắt bởi enzyme pepsin. Các nghiên cứu cho thấy lactoferricin là peptide có hoạt tính kháng khuẩn phổ rộng [62].  Nhóm peptide tích điện âm: Lần đầu tiên vào năm 1992, các nhà khoa học đã phân lập được 3 peptide kích thước nhỏ (721.6 đến 823.8 Da) tích điện âm từ cừu có hoạt tính kháng lại Mannheimia haemolytica, Escherichia coli và Klebsiella pneumoniae [8]. Đến nay các nhà nghiên cứu đã tìm ra được rất nhiều loại peptide kháng khuẩn tích điện âm từ lưỡng cư (maximin H5), từ người (dermcidin) [9]. Ngô Thị Hà 7 K18 Sinh học
Luận văn thạc sĩ khoa học 2009-2011  Nhóm peptide tích điện dương: Đây là nhóm peptide đầu tiên được nghiên cứu và cũng là nhóm lớn nhất, có mặt ở cả động vật lẫn thực vật trong đó phần lớn được phân lập từ các loài côn trùng [5]. Một số loại peptide kháng khuẩn tích điện dương điển hình như cecropin, andropin, moricin, ceratotoxin, melittin từ côn trùng hay magainin, dermaseptin, brevinin-1, esculentins, buforin II từ lưỡng cư [9]. 1.2.1.3. Tiềm năng ứng dụng của AMPs Cho đến nay, bên cạnh việc phát triển để thay thế dần các loại kháng sinh đã bị kháng, AMPs còn hứa hẹn trở thành liệu pháp chữa trị ung thư mới đầy hiệu quả [42, 58, 64]. Hơn nữa, các gen mã cho AMPs là một nguồn gen quan trọng để tạo nên các sinh vật chuyển gen có khả năng kháng lại mầm bệnh. Thực tế cho thấy hàng loạt các loại thực vật và động vật chuyển gen mã cho AMPs đã được tạo ra [27, 47]. Riêng trong lĩnh vực phát triển thuốc kháng sinh thế hệ mới từ AMPs đã thu được những kết quả khả quan. Rất nhiều loại AMPs đã được các hãng dược phẩm đưa vào sản xuất, thử nghiệm và một số loại đã được thương mại hóa (Bảng 1) [22]. Ngô Thị Hà 8 K18 Sinh học
Luận văn thạc sĩ khoa học 2009-2011 Bảng 1. Các loại AMPs và tương tự AMPs được sản xuất thương mại [22]. Tên hãng Tên thuốc Giai đoạn Sử dụng trong y học sản xuất phát triển AM-Pharma hLF-1-11 (petide nhỏ có Phase II Các nhiễm trùng liên (Phần Lan) nguồn gốc từ lactoferrin quan đến cấy ghép tủy người) xương cùng loài Ceragenix CSA-13 (steroid tích điện Tiền thử nghiệm Chống nhiễm khuẩn (Denver) dương bắt chước các lâm sàng peptide thuộc hệ thống bảo vệ cơ thể) Helix HB-50 (peptide tổng hợp Tiền thử nghiệm Chống nhiễm khuẩn Biomedix tự nhiên bắt chước lâm sàng (USA) cecropin) HB-107 (đoạn dài 19 axit Tiền thử nghiệm Chữa lành vết thương amin của cecropin B) lâm sàng Inimex IMX942 (peptide dài 5 Trong quá trình Điều chỉnh hệ miễn dịch; (Canada) axit amin) tối ưu hóa điều trị sốt và giảm bạch cầu trung tính ở bệnh nhân hoá trị liệu Lytix Chưa công bố Phát minh Chống nhiễm khuẩn và Biopharma ung thư (Na Uy) Novacta Mersaxitin (bacteriocin) Tiền thử nghiệm Kháng vi khuẩn Gram Biosystems lâm sàng dương Ltd. (Anh) Novozymes Plectasin Tiền thử nghiệm Kháng các loại vi khuẩn A/S (defensin của nấm) lâm sàng Gram dương, đặc biệt (Đan Mạch) trong trường hợp nhiễm phế cầu khuẩn và khuẩn liên cầu Pacgen PAC113 (dựa trên đoạn Được phê chuẩn Thuốc uống điều trị (Canada) hoạt động của histatin 5- là loại thuốc mới chứng sưng tấy do nấm protein được tìm thấy nghiên cứu lan trong âm đạo, ruột, trong nước bọt của người) miệng hoặc da Ngô Thị Hà 9 K18 Sinh học
Luận văn thạc sĩ khoa học 2009-2011 1.2.2. Peptide kháng khuẩn tích điện dương (CAMPs) và cecropin 1.2.2.1. Giới thiệu chung về CAMPs CAMPs được định nghĩa là các peptide có từ 12-50 axit amin với điện tích +2 đến +9 do có đuôi lysine hoặc arginine và có tới 50% là các axit amin kỵ nước [11, 38]. Trong số 3 nhóm peptide kháng khuẩn đã trình bày ở trên thì đây là nhóm được quan tâm rất nhiều do các đặc điểm: (1) có mặt ở hầu hết các loài sinh vật; (2) có phổ kháng khuẩn rộng; (3) vi sinh vật khó hình thành tính kháng và (4) có mức độ đa dạng cao giữa các sinh vật. Đặc điểm này giúp CAMPs có tiềm năng phát triển thành các loại thuốc khác nhau [14, 28, 63]. Đến nay, đã có khoảng hơn 600 CAMPs được phát hiện từ vi sinh vật cho đến con người [38]. Từ những năm 1990, các hãng dược phẩm lớn trên thế giới như Magainin Pharmaceuticals (Plymouth Meeting, PA), XOMA (Santa Monica, CA), Demegen (Durham, NC), IntraBiotics Pharmaceuticals (Mountain View, CA), … đã nhận thấy nhóm CAMPs mang nhiều triển vọng và tập trung phát triển để sản xuất thành thuốc thương mại (Bảng 2) [7]. Bảng 2. Một số sản phẩm từ CAMPs được các công ty sản xuất phát triển phục vụ điều trị bệnh [7]. Công ty sản xuất Sản phẩm Giai đoạn phát triển Magainin Pharmaceuticals Pexiganan, 1 loại CAMPs có nguồn gốc Hoàn thành (Plymouth Meeting, PA) từ da ếch phase III Micrologix Biotech Đoạn 12 axit amin 1 loại CAMPs của Phase II (Vancouver, BC, Canada) loài động vật có vú có khả năng chống nhiễm khuẩn máu XOMA Corporation CAMPs BPI dùng để kháng Neisseria Phase III (Santa Monica, CA) meningitidis Dựa vào đặc điểm về cấu trúc cuộn gấp, CAMPs có thể được phân thành 4 lớp: lớp peptide dạng phiến gấp nếp  được làm bền bởi 2 đến 4 cầu disulfit (ví dụ như , Ngô Thị Hà 10 K18 Sinh học
Luận văn thạc sĩ khoa học 2009-2011 -defensin, plectasin, protegrins); lớp peptide dạng xoắn  (ví dụ như LL-37, cecropin, magainin); lớp peptide có cấu trúc giàu glycine, proline, tryptophan, arginine và hoặc histidine (ví dụ như indolicidin); lớp peptide dạng loop với 1 cầu disulfide (ví dụ như bactenecin) [22]. 1.2.2.2. Peptide kháng khuẩn cecropin Cecropin là peptide kháng khuẩn đầu tiên được phân lập và nghiên cứu một cách đầy đủ nhất [31, 45]. Cecropin được phân lập lần đầu tiên (năm 1981) từ loài bướm đêm Hyalophora cecropia sau khi bị nhiễm với vi khuẩn [55]. Kể từ đó, người ta nhận thấy cecropin hay các peptide tương tự cecropin cũng tồn tại ở các loài côn trùng khác, chủ yếu thuộc Bộ Cánh phấn và Bộ Hai cánh [14, 55]. Hàng loạt các loại cecropin đã được phân lập từ nhiều loài côn trùng ở các vùng địa lý khác nhau và được nghiên cứu chi tiết để có những hiểu biết đầy đủ trước khi đưa vào ứng dụng thực tế. 1.2.2.2.1. Các đặc trưng về cấu trúc của cecropin Kết quả so sánh trình tự axit amin cho thấy cecropin của các loài thuộc Bộ Hai cánh có độ tương đồng hơn 70%. Đặc biệt cecropin IA (sarcotoxin IA) của loài nhặng xanh Sarcophaga peregrina có độ tương đồng đến 100% với cecropin A của loài ruồi giấm Drosophila melanogaster. Trong khi đó, cecropin của các loài thuộc Bộ Cánh phấn lại có trình tự ít tương đồng với nhau hơn [13]. Trình tự axit amin của một số cecropin được trình bày trong Bảng 3. Ngô Thị Hà 11 K18 Sinh học
Luận văn thạc sĩ khoa học 2009-2011 Bảng 3. Trình tự axit amin của một số cecropin [13]. Loài Trình tự axit amin Cecropin A Drosophila melanogaster GWLKKIGKKIERVGQHTRDATIQGLGIAQQAANVAATAR Sarcotoxin IA Sarcophaga peregrina GWLKKIGKKIERVGQHTRDATIQGLGIAQQAANVAATAR Cecropin A Aedes aegypti GGLKKLGKKLEGAGKRVFNAAEKALPVVAGAKALRK Cecropin A1 Aedes albopictus GGLKKLGKKLEGVGKRVFKASEKALPVAVGIKALGK Cecropin A Hyalophora cecropia KWKLFKKIEKVGQNIRDGIIKAGPAVAVVGQATQIAK Cecropin D Bombyx mori GNFFKDLEKMGQRVRDAVISAAPAVDTLAKAKALGQ Các phân tích cho thấy cecropin ngay sau khi tổng hợp thường có từ 62-64 axit amin. Trong đó, 20-26 axit amin ở đầu tận cùng amino không xuất hiện trong phân tử cecropin trưởng thành. Chúng có thể đóng vai trò như trình tự peptide dẫn. Phân tử cecropin trưởng thành thường gồm khoảng 29-42 axit amin, không chứa cystein [5]. Cấu trúc bậc hai điển hình của cecropin là xoắn α-helix (Hình 2). Đặc biệt, hầu hết các phân tử cecropin đều mang tính lưỡng cực cho phép cecropin tương tác dễ dàng với màng tế bào [28]. Phân tích cấu trúc của cecropin A bằng phương pháp khối phổ cộng hưởng từ cho thấy peptide này có một đầu N-terminal dài, dạng xoắn  lưỡng cực (từ vị trí 5 đến 21) và một đuôi ngắn hơn nhưng kị nước ở đầu xoắn C-terminal (từ vị trí 24 đến 37); hai vùng này nối với nhau thông qua khớp nối Gly-Pro [23]. Hình ảnh về cấu trúc không gian của cecropin A được minh họa trên Hình 2. Ngô Thị Hà 12 K18 Sinh học
Luận văn thạc sĩ khoa học 2009-2011 Khớp nối Gly-Pro Hình 2. Cấu trúc cecropin A của Hyalophora cecropia phân tích bằng khối phổ cộng hưởng từ [23]. 1.2.2.2.2. Đặc điểm nổi bật của cecropin Là một peptide kháng khuẩn tích điện dương điển hình, cecropin mang nhiều đặc điểm nổi bật hứa hẹn nhiều tiềm năng ứng dụng. Cecropin có phổ hoạt tính kháng khuẩn rộng: Nhìn chung các nhà nghiên cứu đều thống nhất rằng cecropin có phổ hoạt tính rộng bao gồm vi khuẩn Gram âm, vi khuẩn Gram dương, nấm, một số virus và kí sinh trùng [14, 26, 32, 36, 60, 61, 66]. Trong khi đó, một số loại AMPs khác có phổ hoạt tính hẹp ví dụ như attacin và diptericin chỉ có hoạt tính kháng lại vi khuẩn Gram âm hay drosomycin chỉ có hoạt tính kháng lại nấm [57]. Đây là đặc điểm mà bất cứ nhà nghiên cứu hoặc các hãng dược phẩm nào cũng mong muốn thu được từ sản phẩm của mình. Nhìn chung, hoạt tính kháng khuẩn của cecropin đối với vi khuẩn Gram âm thường hiệu quả hơn so với vi khuẩn Gram dương [13]. Cấu trúc phù hợp với hoạt tính kháng khuẩn: Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng những đặc điểm như thành phần axit amin, cấu trúc không gian, độ tích điện và tính lưỡng cực của cecropin có đặc điểm hoàn hảo cho hoạt tính kháng khuẩn. Cụ thể là: Cecropin có cấu trúc lưỡng cực, dạng xoắn α-helix mà những peptide có cấu trúc dạng này thường có hoạt tính mạnh hơn các peptide có cấu trúc bậc 2 không rõ ràng khác. Mặt khác, cấu trúc dạng xoắn α-helix giúp peptide bền, ít bị các tác động Ngô Thị Hà 13 K18 Sinh học
Luận văn thạc sĩ khoa học 2009-2011 làm ảnh hưởng đến hoạt tính [35]. Thực nghiệm cho thấy nhờ cấu trúc này mà cecropin vẫn giữ được hoạt tính sau khi ủ ở 1000C tới 10 phút hoặc lâu hơn nữa [41]. Không những thế, do có cấu trúc lưỡng cực nên cecropin có khả năng tan trong nước hoặc trong lớp màng lipit kép rất tốt. Nhờ vậy, cecropin có thể dễ dàng tương tác với các thành phần ưa nước và kị nước của vi sinh vật hơn [35]. Cecropin là peptide tích điện dương nên thường có hoạt tính kháng khuẩn cao hơn hẳn so với các peptide trung hòa khác [9, 39]. Hơn nữa, trong khi các peptide tích điện âm cần cofactor kẽm để hoạt động thì các peptide tích điện dương như cecropin không cần đến. Đặc biệt, cecropin còn đảm nhiệm nhiều chức năng khác của hệ miễn dịch bẩm sinh [4, 10]. Do tích điện dương nên cecropin có khả năng cô lập cấu tử Lipopolysacharite (LPS) của vi khuẩn Gram âm. Chính những cấu tử này hoạt động như nội độc tố gây ra hiện tượng nhiễm trùng. Ngoài ra nhờ tích điện dương, cecropin còn có tính hóa ứng động cao giúp thu hút và tập trung các tế bào trình diện kháng nguyên, nhờ đó làm thúc đẩy các phản ứng của hệ miễn dịch tiếp thu [19, 30, 70]. Như vậy, ngoài hoạt tính kháng khuẩn, cecropin còn đóng vai trò quan trọng trong hệ thống miễn dịch bẩm sinh và hệ thống miễn dịch tiếp thu. Đích tác động của cecropin làm vi sinh vật khó hình thành tính kháng: Khác với các thuốc kháng sinh truyền thống, các AMPs nói chung và cecropin nói riêng có đích tác động chủ yếu là cấu trúc màng tế bào vi sinh vật. Chúng sẽ tuơng tác, phá vỡ cấu trúc màng, qua đó làm dung giải tế bào [12]. Với những đặc điểm về thành phần axit amin, tính lưỡng cực, độ tích điện và kích thước, cecropin có thể tương tác với màng tế bào của vi sinh vật theo bốn mô hình như mô tả ở Hình 3 [28]. Ngô Thị Hà 14 K18 Sinh học
Luận văn thạc sĩ khoa học 2009-2011 Hình 3. Một số mô hình tương tác của cecropin với màng tế bào vi sinh vật. Trong hình, lớp kép lipit của màng tế bào: màu vàng; peptide cecropin: hình trụ; vùng ưa nước của cecropin: màu đỏ; vùng kị nước: màu xanh; A: mô hình “tập hợp”; B: mô hình “lỗ hình xuyến”; C: mô hình “thùng thủng lỗ”; D: mô hình “tấm thảm” [28]. Trong mô hình “tập hợp” (A), các phân tử cecropin tạo thành cầu qua màng như một tập hợp giống phức mixen của các peptide và lipit. Đối với mô hình “lỗ hình xuyến” (B), cecropin dạng xoắn chèn vào màng, lớp đơn lipit bị uốn cong liên tục làm cho vùng trung tâm chứa nước bị đầy bởi các peptide chèn vào và các đầu lipit. Trong mô hình “thùng thủng lỗ” (C), cecropin xoắn hình thành một bó trong màng với lỗ hổng ở giữa giống như một cái thùng. Với mô hình “tấm thảm” (D), cecropin tập hợp ở bề mặt lớp kép và có xu hướng song song với bề mặt màng. Do tích điện dương nên cecropin hấp dẫn các nhóm phospholipit tích điện âm ở nhiều vị trí rồi bao lấy màng tế bào theo kiểu trải thảm. Ngô Thị Hà 15 K18 Sinh học
Luận văn thạc sĩ khoa học 2009-2011 Trong nhiều thập kỷ, các nhà khoa học đã tập trung nghiên cứu hoạt tính phá vỡ thành và màng tế bào vi khuẩn của cecropin A. Năm 2003, nghiên cứu của Hong và cs. thuộc trường đại học Y Pennsylvania chỉ ra rằng, ở liều lượng thấp cecropin A không đủ để giết tế bào vi khuẩn thông qua cơ chế tác động màng, nhưng đủ để tác động đến phiên mã của các gen. Trong số 26 gen chịu tác động có 11 gen mã cho các protein mang chức năng quan trọng của vi khuẩn [24]. Vi khuẩn không có khả năng thay đổi bộ máy di truyền của chúng; điều này giải thích tại sao vi khuẩn rất khó hình thành tính kháng lại với cecropin A. Không những thế, nghiên cứu của Wachinger và cs. đã chỉ ra rằng một số loại cecropin tác động tới chu kì nhiễm bệnh của virus HIV bằng cách ức chế biểu hiện gen HIV-1, qua đó làm ảnh hưởng tới quá trình nhân lên của virus HIV [61]. Vì vậy, đến nay các nhà khoa học đã khẳng định rằng màng tế bào không phải là đích tác động duy nhất để cecropin giết vi sinh vật. Cecropin có thể tác động tới vi sinh vật bằng cách thay đổi hình dạng vách ngăn màng tế bào chất, ức chế tổng hợp thành tế bào, ức chế tổng hợp axit nucleic, ức chế tổng hợp protein và ức chế hoạt động enzyme như minh họa ở Hình 4 [28]. Tổng hợp Tổng hợp Tái bản mARN protein ADN Tổng hợp thành tế bào Gấp nếp protein Các enzyme biến đổi aminoglycoside Hình 4. Các đích tác động khác của cecropin ngoài màng tế bào [28]. Không gây hại đến tế bào thực vật, động vật và con người: Với nhiều tiềm năng phát triển thành một liệu pháp chữa trị lí tưởng thì một câu hỏi quan trọng được Ngô Thị Hà 16 K18 Sinh học
Luận văn thạc sĩ khoa học 2009-2011 đặt ra là liệu cecropin có gây độc đối với tế bào nhân chuẩn không và cách thức mà chúng chọn lọc đích tác động như thế nào? Kết quả các nghiên cứu kiểm tra tính an toàn của cecropin đã đưa ra câu trả lời đầy khả quan là phần lớn các cecropin không gây độc đối với tế bào nhân chuẩn [43, 70]. Ví dụ như năm 1996, Moore và cs. đã kiểm tra khả năng làm tan hồng cầu người của cecropin B có nguồn gốc từ bướm đêm Hyalophora cecropia (một trong số các loại cecropin có hoạt tính mạnh nhất). Kết quả thu được cho thấy ở nồng độ cecropin B rất cao là 500 M (cao hơn hàng triệu lần so với nồng độ diệt các vi sinh vật khác) vẫn không quan sát thấy hiện tượng hồng cầu người bị tan [43]. Ngoài ra, cecropin không gây ảnh hưởng đến hình thái, tốc độ tăng sinh và đặc tính biệt hóa của các dòng tế bào nuôi cấy [42, 58, 64]. Một trong những giả thuyết giải thích cơ chế chọn lọc đích tác động của AMPs nói chung và của cecropin nói riêng là dựa vào sự khác biệt về cấu trúc màng tế bào [21]. Không giống như màng tế bào nhân sơ, màng tế bào nhân chuẩn có thành phần cholesterol giúp cho các phân tử phospholipit kép co đặc hơn, do đó màng tế bào trở nên bền vững khiến cecropin rất khó tạo ra lỗ hổng trên bề mặt màng. Ngoài ra, chính sự phân bố một cách bất đối xứng các phân tử phospholipit tích điện âm và trung hòa tại hai lớp màng đơn cũng là nguyên nhân giúp màng tế bào nhân chuẩn không nhạy cảm với cecropin. Khả năng giết tế bào ung thư một cách chọn lọc: Hoạt tính kháng ung thư của cecropin đã được quan tâm rất sớm với những nghiên cứu của Moore và cs. (1994). Trong điều kiện in vivo, cecropin B giúp kéo dài thời gian sống sót của những con chuột bị ung thư cổ trướng ác tính. Trong thử nghiệm in vitro, cecropin B có hoạt tính làm tan bào đối với các dòng tế bào ung thư vú và ung thư buồng trứng ở người [42]. Tiếp đó, năm 2008 nghiên cứu của Suttmann và cs. cho thấy cecropin B có khả năng ức chế sự tăng sinh của các tế bào ung thư bàng quang, phá hủy cấu trúc màng tế bào và gây chết đối với các tế bào ung thư (Hình 5) [58]. Ngô Thị Hà 17 K18 Sinh học
Luận văn thạc sĩ khoa học 2009-2011 Hình 5. Hoạt tính của cecropin B lên tế bào ung thư bàng quang. A: tế bào ung thư bàng quang 486P không bị xử lý với cecropin B; B: tế bào ung thư bàng quang 486P bị xử lý với cecropin B ở nồng độ 65 µM [58]. Kết quả nghiên cứu mới nhất được công bố năm 2010 của Xiaobao và cs. cho thấy cecropin của Musca domestica có khả năng ức chế sự phát triển của dòng tế bào gan ung thư biểu mô BEL-7402. Đặc biệt, cecropin không làm ảnh hưởng tới sự phát triển của các tế bào gan lành xung quanh [64]. Kết quả ở Hình 6 cho thấy khi xử lý tế bào ung thư với cecropin ở nồng độ càng cao (từ 25 µM đến 100 µM) thì số lượng tế bào ung thư bị tiêu diệt càng nhiều. Hình 6. Hình thái học của các tế bào BEL-7402 khi xử lý với cecropin ở các nồng độ khác nhau được phân tích bằng kính hiển vi điện tử (A) và bằng phương pháp TUNEL (B) [64]. Ngô Thị Hà 18 K18 Sinh học
Luận văn thạc sĩ khoa học 2009-2011 Cecropin có khả năng giết các tế bào ung thư một cách chọn lọc do màng tế bào ung thư có hàm lượng phosphatidylserin cao hơn so với tế bào bình thường. Phosphatidylserin tích điện âm nên có ái lực cao với cecropin tích điện dương [26, 30]. Đồng thời, tế bào ung thư có độ nhớt cao giúp cho các phân tử cecropin dễ dàng tấn công vào bên trong tế bào. Các vi nhung mao trên bề mặt của các tế bào ung thư có số lượng lớn, đa dạng về kích cỡ và hình dạng, giữ vai trò quan trọng giúp cecropin chọn lọc đích tác động [58]. 1.2.2.2.3. Tiềm năng ứng dụng và tình hình nghiên cứu cecropin Với những đặc điểm nổi bật như trên, cecropin đã trở thành đối tượng quan tâm nghiên cứu hàng đầu trong số AMPs hiện nay [36]. Đã có nhiều loại cecropin được phân lập từ nhiều nguồn côn trùng khác nhau, thậm chí cecropin còn được cải biến hoặc lai với AMPs khác để làm tăng hoạt tính [25, 54]. Tuy nhiên, con đường để có thể biến cecropin trở thành thuốc kháng sinh thế hệ mới thay thế cho các loại kháng sinh hiện nay vẫn còn đòi hỏi nhiều nghiên cứu về cách thức thu nhận cecropin và tinh sạch chúng. Đầu tiên, các nhà khoa học mong muốn chủ động tổng hợp cecropin in vivo và in vitro. Chính vì vậy, hướng nghiên cứu phân lập gen mã cho cecropin để tạo nên động vật, thực vật chuyển gen có khả năng kháng lại mầm bệnh đã được quan tâm [27, 47]. Những sinh vật mang gen cecropin có khả năng đề kháng tốt với các mầm bệnh trong điều kiện in vivo. Kết quả nghiên cứu của Sarmasik và cs. cho thấy chỉ 10% cá Medaka có gen cecropin chết khi lây nhiễm với Pseudomonas fluorescens và 10-30% chết khi lây nhiễm với Vibrio anguillarum so với tỉ lệ chết lên tới trên 40% của cá Medaka không mang gen cecropin [47]. Việc chuyển gen cecropin B vào cây cà chua Solanum lycopersicum làm tăng khả năng kháng Ralstonia solanasearum, Xanthomonas campestris [27]. Điều này đã mở ra một hướng đi đầy hứa hẹn ứng dụng Ngô Thị Hà 19 K18 Sinh học
Luận văn thạc sĩ khoa học 2009-2011 cecropin vào công nghệ sinh học trong chăn nuôi và trồng trọt [27]. Hướng sản xuất cecropin tái tổ hợp cũng được tiến hành trong các hệ thống biểu hiện khác nhau như vi khuẩn [16, 31, 34, 66], nấm men [29, 32] và côn trùng [67]. Đặc biệt hệ thống biểu hiện trong tế bào vi khuẩn E. coli được rất nhiều nhà nghiên cứu lựa chọn. Năm 2006, Liang và cs. đã tách dòng gen cecropin phân lập từ ruồi nhà Musca domestica trong vector pGEX-4T-1; biểu hiện và tinh sạch thành công cecropin có hoạt tính từ hệ thống biểu hiện E. coli [34]. Tương tự, hinnavinII-38-Asn (một loại AMP thuộc họ cecropin) được sản xuất tái tổ hợp trong chủng E. coli BL21 (DE3) pLysS có hoạt tính kháng lại Escherichia coli, Enterobacter cloacae, Bacillus megaterium và Staphyloccus aureus [31]. Có thể nói, nghiên cứu cecropin để có thể biến tiềm năng của nó trở thành nguồn kháng sinh thế hệ mới cần cho cuộc chiến chống kháng kháng sinh đã và đang được công nghệ sinh học quan tâm đặc biệt. 1.2.2.2.4. Các phương pháp thu nhận cecropin Để thu nhận được lượng lớn cecropin, có ba con đường tiếp cận chính như sau: (1) tách chiết từ tự nhiên; (2) tổng hợp trực tiếp theo con đường hóa học và (3) biểu hiện cecropin tái tổ hợp trong vi khuẩn hay các hệ thống biểu hiện khác. Tách chiết cecropin từ tự nhiên phải qua nhiều công đoạn phức tạp, khó đảm bảo về mặt sinh khối, mức độ tinh khiết và không chủ động được nguồn nguyên liệu. Việc tổng hợp cecropin nhân tạo bằng con đường hóa học thì lại có giá thành sản xuất cao [33]. Điều này càng trở nên khó khăn hơn trong điều kiện của các nước đang phát triển như Việt Nam. Vì vậy, sử dụng “nhà máy vi khuẩn toàn năng” để sản xuất cecropin tái tổ hợp là lựa chọn phù hợp nhất. Rất nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng sản xuất cecropin tái tổ hợp vừa đảm bảo có sinh khối cao, mức độ tinh khiết, hoạt tính của sản phẩm tốt, cũng như giảm chi phí và chủ động nguồn peptide để sử dụng cho các nghiên cứu khác nhau [33, 34, 66]. Đây cũng chính là con đường sản xuất ở quy mô công nghiệp của hầu hết các kháng sinh đang dùng hiện nay. Ngô Thị Hà 20 K18 Sinh học

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

LV.09: Bộ Luận Văn Tốt Nghiệp Chuyên Ngành Quản Trị Kinh Doanh

81 tài liệu

1643 lượt tải

THÔNG TIN

TRỢ GIÚP

HỖ TRỢ KHÁCH HÀNG

Theo dõi chúng tôi

Chịu trách nhiệm nội dung:

Nguyễn Công Hà - Giám đốc Công ty TNHH TÀI LIỆU TRỰC TUYẾN VI NA

LIÊN HỆ

Địa chỉ: P402, 54A Nơ Trang Long, Phường 14, Q.Bình Thạnh, TP.HCM

Hotline: 093 303 0098

Email: support@tailieu.vn

Giấy phép Mạng Xã Hội số: 670/GP-BTTTT cấp ngày 30/11/2015 Copyright © 2022-2032 TaiLieu.VN. All rights reserved.