Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Thiết kế thang chuẩn ADN

Chia sẻ: Na Na | Ngày: | Loại File: DOC | Số trang:55

Thêm vào BST

Báo xấu

39
lượt xem 3
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu của đề tài là thiết kế được thang chuẩn ADN 100 bp đảm bảo chất lượng tốt, giá cả hợp lí, đáp ứng nhu cầu sử dụng cũng như phù hợp với điều kiện các phòng thí nghiệm trong nước.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Thiết kế thang chuẩn ADN

MỞ ĐẦU Công nghệ sinh học được định nghĩa là “sự sản xuất hàng hóa và dịch vụ ở quy mô công nghiệp nhờ việc sử dụng sinh vật, các hệ thống sinh học và các quá trình sinh học”. Hơn một thế kỷ qua, công nghệ sinh học được chú trọng phát triển tại hầu hết các quốc gia trên thế giới với nhiều thành tựu đáng kinh ngạc. Để thúc đẩy sự phát triển công nghệ sinh học ở Việt Nam, các phòng thí nghiệm sinh học ngày càng được trang bị máy móc hiện đại, nguồn nhân lực trình độ chuyên môn tốt. Do đó, các chế phẩm sinh học phục vụ cho lĩnh vực nghiên cứu này đòi hỏi phải đảm bảo chất lượng và độ chính xác cao. Một chế phẩm sinh học thường dùng trong nghiên cứu sinh học là thang chuẩn ADN. Đây là công cụ hữu ích được sử dụng để đánh giá kích thước và nồng độ các đoạn ADN. Tuy nhiên, thang chuẩn hiện nay đều phải nhập khẩu với giá thành cao, thiếu tính chủ động trong nguồn cung cấp. Nhược điểm này đã gây nhiều khó khăn trong quá trình triển khai nghiên cứu tại các phòng thí nghiệm ở Việt Nam. Một trong những mặt hàng thang chuẩn có nhu cầu sử dụng cao và thuận tiện trong các phòng thí nghiệm sinh học phân tử là thang chuẩn ADN 100 bp, thường gồm dải băng có kích thước từ 100 bp đến 3000 bp. Mặc dù sản phẩm này có nhu cầu sử dụng lớn, nhưng lại phải nhập khẩu với giá thành cao, phụ thuộc thời gian đặt hàng và vận chuyển đã phần nhiều ảnh hưởng tới tính chủ động trong các thí nghiệm. Để khắc phục những khó khăn này chúng tôi thực hiện đề tài “Thiết Kế Thang Chuẩn ADN”. Mục tiêu của đề tài là: thiết kế được thang chuẩn ADN 100 bp đảm bảo chất lượng tốt, giá cả hợp lí, đáp ứng nhu cầu sử dụng cũng như phù hợp với điều kiện các phòng thí nghiệm trong nước. Đề tài được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Sinh Y Khoa Sinh học, Phòng Genomic thuộc Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Enzyme Protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội. 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. THANG CHUẨN ADN 1.1.1. Thang chuẩn ADN o Định nghĩa thang chuẩn ADN Thang chuẩn ADN được định nghĩa là một hỗn hợp các phân tử ADN có kích thước khác nhau, được sử dụng trong điện di nhằm đánh giá kích thước và nồng độ đoạn ADN chưa biết [26]. o Phân loại thang chuẩn ADN Có nhiều cách gọi tên và phân chia các nhóm thang chuẩn ADN khác nhau như: dựa trên bước nhảy của thang chuẩn (thang chuẩn ADN 5 bp, 10 bp, hay 50 bp,…); dựa vào kỹ thuật sản xuất (thang chuẩn PCR, thang chuẩn tái tổ hợp,…) [1]. Tuy nhiên, phân biệt giữa ADN ladder và ADN marker cho đến nay vẫn là cách phân chia thang chuẩn thông dụng và thuận tiện nhất, dựa trên bản chất nguyên liệu ADN được sử dụng trong quá trình sản xuất: ADN Ladder: Để tạo ra ADN ladder người ta thường sử dụng các enzyme giới hạn có vị trí nhận biết đặc hiệu trên một phân tử ADN kích thước lớn, không có nguồn gốc tự nhiên (ví dụ như các plasmid đã bị biến đổi bằng kỹ thuật di truyền, đoạn ADN kích thước lớn). ADN ladder gồm các đoạn ADN có kích thước đặc trưng, với bước nhảy mong muốn (Hình 1) [16]. 2
Hình 1. Ảnh ADN ladder 500 bp (Takara) [45]; ADN ladder 200 bp (Fermentas) [33] và ADN ladder 10 bp (Invitrogen) [35]. ADN Marker: Cũng như ADN ladder, để sản xuất ADN marker người ta sử dụng các enzyme cắt giới hạn có vị trí nhận biết đặc hiệu trên một phân tử ADN kích thước lớn, nhưng phân tử ADN này có sẵn trong tự nhiên như: ADN genome của thực khuẩn thể lambda, plasmid pBR322, hay ΦX174... (Hình 2) [16]. Thang chuẩn loại này gồm các đoạn ADN có kích thước khác nhau với bước nhảy ngẫu nhiên. Hình 2. ADN marker thương mại được tạo ra từ ΦX174; pBR322 và pUC19 [33]. 1.1.2. Vai trò của thang chuẩn ADN trong nghiên cứu sinh học phân tử 3
Trong lĩnh vực nghiên cứu sinh học phân tử việc tiến hành xác định nồng độ và kích thước các đoạn ADN luôn rất cần thiết trong các thí nghiệm như: sử dụng kít tinh sạch, tách chiết ADN hay nhân dòng gen… Thông thường để xác định chính xác kích thước và nồng độ ADN cần phải sử dụng đến phương pháp giải trình tự và xác định nồng độ ADN bằng máy đo quang phổ. Cả hai phương pháp này đều cần nhiều thời gian, thao tác thí nghiệm tương đối phức tạp, đặc biệt giá thành để giải trình tự một mẫu ADN khá cao, lại không phải lúc nào cũng cần thiết. Cách đơn giản, nhanh chóng để xác định nồng độ và kích thước đoạn ADN nghiên cứu là so sánh với một đoạn ADN đã biết nồng độ và kích thước [24]. Để thực hiện mục đích này kỹ thuật điện di đã được sử dụng một cách thường xuyên. Với mục đích phân tách các đoạn ADN trên gel agarose hoặc polyacrylamide, thang chuẩn ADN đã trở thành một công cụ rất hữu ích để đánh giá chất lượng, kích thước và nồng độ của mẫu ADN. Thang chuẩn thường chạy cùng một lúc trên gel với các mẫu ADN, sự so sánh giữa các băng ADN mẫu với các băng ADN thang chuẩn cho phép ước tính kích thước và nồng độ các đoạn ADN chưa biết [16]. Để thang chuẩn có thể thực hiện vai trò quan trọng này thì mỗi băng trong thang chuẩn ADN thương mại luôn được mô tả chính xác kích thước và nồng độ ADN tương ứng với lượng thể tích [40]. 1.1.3. Sản xuất thang chuẩn ADN 1.1.3.1. Cung ứng và sản xuất thang chuẩn ADN trên thế giới Thị trường thang chuẩn ADN trên thế giới hiện có sự góp mặt của nhiều hãng sản xuất và cung ứng danh tiếng như Fermentas Đức [33]; Takara Nhật Bản [46]; Invitrogen Mỹ [35]… Kích thước những đoạn ADN trong các thí nghiệm là khác nhau, chính vì thế mà thang chuẩn ADN bán trên thị trường cũng phân thành nhiều loại, tùy thuộc số lượng băng, kích thước băng ở từng hãng sản xuất [38, 47]. Những khác biệt đó đã góp phần tạo ra một thị trường thang chuẩn đa dạng 4
và phong phú (Hình 3). Các thang chuẩn hiện có mặt trên thị trường thường gồm các băng trong khoảng từ 5 bp đến 50.000 bp [43, 44]. Hình 3. Một số thang chuẩn ADN thương mại bán trên thị trường [33, 34]. 1.1.3.2. Tiềm năng sản xuất thang chuẩn ADN tại Việt Nam 5
Sự phát triển của các phòng thí nghiệm sinh học phân tử tại Việt Nam góp phần làm tăng nhu cầu sử dụng thang chuẩn ADN. Tuy nhiên, cho đến nay vẫn chưa có một cơ sở trong nước nào đăng ký cung ứng sản phẩm này. Thang chuẩn hiện vẫn phải nhập khẩu từ các hãng sản xuất lớn trên thế giới với giá thành cao, phụ thuộc thời gian đóng gói và vận chuyển đã ảnh hưởng đến tính chủ động trong các thí nghiệm và nguồn cung cấp. Trong những năm gần đây, chúng tôi được biết Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học Đại học Quốc gia Hà Nội đã thực hiện đề tài thiết kế thang chuẩn [2, 6]. Tại Phòng thí nghiệm Sinh Y, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội cũng đã sản xuất thành công thang chuẩn ADN 4,6 kb với bước nhảy 500 bp và hiện đang trong quá trình dùng thử [1]. Tuy nhiên, các sản phẩm thang chuẩn này vẫn chưa được thương mại hóa. Chính vì vậy, mặc dù cho đến nay thang chuẩn ở Việt Nam có nhu cầu sử dụng rất lớn, nhưng vẫn chưa có sự góp mặt của một nhà sản xuất trong nước. 1.1.3.3. Phương pháp sản xuất thang chuẩn ADN Thang chuẩn ADN là một sản phẩm mang tính chất thương mại. Vì vậy, mặc dù mặt hàng này được bán rất rộng rãi trên thị trường nhưng các kỹ thuật liên quan đến thiết kế và sản xuất lại không được công bố. Do đó, rất khó để có được một tài liệu tham khảo về quy trình sản xuất thang chuẩn ADN. Từ những tài liệu hiếm hoi mà chúng tôi tổng hợp được cho thấy có bốn phương pháp chủ yếu được áp dụng để thiết kế thang chuẩn ADN với những ưu và nhược điểm riêng [1, 2]. o Phương pháp hóa tổng hợp Oligonucleotide là một polymer ngắn của acid nucleic, thông thường dài khoảng 50 base trở xuống. Mặc dù các oligonucleotide có thể được tạo ra bằng cách cắt liên kết của các phân tử dài, nhưng hiện nay chúng thường được tổng hợp với trình tự đặc hiệu từ các nucleoside phosphoramidite [30]. Các 6
oligonucleotide được sử dụng trong nhiều nghiên cứu khác nhau của di truyền học phân tử, chẳng hạn như: sử dụng làm mồi trong các phản ứng PCR; dùng làm mẫu dò trong các phương pháp lai phân tử; trong nghiên cứu tạo đột biến điểm xác định vị trí hay giải mã trình tự ADN... [5]. Phản ứng kéo dài chuỗi oligonucleotide diễn ra bằng việc gắn thêm tiền chất nucleotide mới vào phía đầu 5’, như vậy ngược chiều với phản ứng kéo dài chuỗi ADN sử dụng enzyme ADN polymerase [4]. Phương pháp tổng hợp hóa học sử dụng các thiết bị hiện đại, dễ thực hiện, nhanh chóng tổng hợp được bất cứ một trình tự ADN ngắn nào với độ tinh sạch và chính xác cao (thông thường đạt độ chính xác cao khi tiến hành tổng hợp các phân tử ADN mạch đơn có độ dài tới 30 nucleotide [15]). Tuy nhiên, mặt hạn chế của phương pháp này là khó có thể tổng hợp được trình tự dài hơn 100 nucleotide mà đảm bảo được số lượng và chất lượng mong muốn. Máy móc và các hóa chất tổng hợp có giá thành cao, thang chuẩn tạo ra phải qua bước tạo cặp bổ sung để chuyển ADN sợi đơn thành dạng sợi kép. Do đó, phương pháp này thường áp dụng để tạo thang chuẩn có kích thước nhỏ, như thang chuẩn 5 bp hay 10 bp với nhu cầu sử dụng không cao (Hình 4) [1]. 7
Hình 4. Ảnh ADN ladder 5 bp (Fermentas) điện di trên agarose 5% và gel polyacrylamide 10% [33]. o Phương pháp áp dụng kỹ thuật PCR Một phương pháp nhân dòng gen in vitro đơn giản, hiệu quả, được sử dụng phổ biến hiện nay ở hầu hết các phòng thí nghiệm sinh học phân tử là phản ứng chuỗi trùng hợp PCR (polymerase chain reaction). Kỹ thuật này được Kary Mullis tìm ra vào năm 1983, nhờ đó việc khuếch đại một đoạn ADN mong muốn đã trở nên dễ dàng, nhanh chóng và chính xác hơn [8]. Kỹ thuật này còn được sử dụng để phát hiện một trình tự nucleotide đặc hiệu trong một mẫu sinh học, thu nhận số lượng lớn một đoạn ADN đích cho quá trình nhân dòng, hoặc các phân đoạn kết thúc dideoxynucleotide trong phương pháp giải trình tự, hay lắp ráp một gen tổng hợp. Một phản ứng PCR đặc trưng bao gồm nhiều chu kỳ, mỗi chu kỳ gồm ba bước [15]: Bước biến tính: ADN khuôn dạng sợi đôi được biến tính bằng nhiệt độ để tách thành hai sợi đơn [3]. Bước hồi tính: Nhiệt độ của hỗn hợp phản ứng sẽ được làm nguội dần xuống, cho phép các mồi liên kết bắt cặp bổ sung với hai sợi đơn ADN khuôn. Bước tổng hợp: Nhiệt độ hỗn hợp phản ứng sẽ được tăng lên đến nhiệt độ tối ưu cho sự hoạt động của enzyme ADN polymerase. Quá trình tổng hợp ADN sẽ được diễn ra theo chiều từ 3’ đến 5’ (Hình 5) [4, 8]. 8
Hình 5. Kéo dài mồi bởi Taq ADN polymerase. Mồi được gắn vào trình tự bổ sung trên sợi khuôn và Taq ADN polymerase kéo dài mồi bằng cách gắn chính xác các deoxynucleotide (dNTP) theo nguyên tắc bắt cặp bổ sung với sợi ADN khuôn, quá trình tổng hợp diễn ra theo chiều 3’ 5’. Các ADN polymerase bền nhiệt sử dụng trong phản ứng PCR được tách chiết từ một số loại vi khuẩn chịu nhiệt như Sulfolobus solfataricus, Bacillus steriotherphilus, Pyrococus fumaricus. Tuy nhiên loại enzyme sử dụng phổ biến nhất hiện nay là Taq ADN polymerase được tách chiết từ một loại vi khuẩn suối nước nóng Thermus aquaticus [8, 23]. Các mồi được thiết kế phải tuân thủ một số nguyên tắc sau: (1) Có tỷ lệ GC chiếm từ 40 75%, khoảng cách giữa hai mồi thường không dài quá 3 kb, các mồi không được tạo cấu trúc bậc hai do liên kết giữa các nucleotide ngay trong một mồi [3]. Nhiệt độ gắn mồi (Tm) cũng đóng vai trò quan trọng trong phản ứng PCR. Dựa trên trình tự đã biết của một phân tử ADN kích thước lớn, các cặp mồi khác nhau đã được thiết kế tùy thuộc kích thước băng, số lượng băng và bước nhảy giữa các băng ADN trong thang chuẩn sản xuất. Thông qua phản ứng PCR hay Multiplex PCR sử dụng các cặp mồi này sẽ khuếch đại các đoạn ADN kích thước mong muốn. Các đoạn ADN sẽ được tinh sạch và phối trộn theo tỷ lệ nồng độ nhất định tạo thang chuẩn ADN. Loại thang chuẩn này có kích thước 9
băng và bước nhảy mong muốn, phương pháp thực hiện đơn giản, dễ ứng dụng trong điều kiện của nhiều phòng thí nghiệm. Tuy nhiên, mặt hạn chế của phương pháp này là các hóa chất đi kèm có giá thành cao, các băng thang chuẩn thường không rõ nét [1, 7]. o Phương pháp sử dụng các enzyme cắt giới hạn Các endonuclease hay các enzyme cắt giới hạn là những phần của hệ thống cải biến giới hạn (restriction modification RM được sử dụng bởi vi khuẩn và có thể ở một số sinh vật nhân sơ khác để bảo vệ chúng khỏi ADN ngoại lai) [27]. Các enzyme này nhận biết những trình tự đặc hiệu trong phân tử ADN và cắt đối xứng liên kết phosphodieste của mỗi sợi tại các vị trí nhận biết. Đồng thời đóng vai trò quan trọng trong việc bảo vệ các tế bào vi khuẩn chống lại sự xâm nhiễm của virus (bacteriophage) [13, 15]. Dựa vào cấu tạo và nhu cầu cofactor mà các enzyme cắt giới hạn có thể được phân chia thành ba loại khác nhau là type I, II và III [32, 39]. Trong đó, những enzyme có vị trí cắt tại trình tự nhận biết đặc hiệu gọi là enzyme cắt giới hạn type II. Đây là nhóm enzyme cắt giới hạn được sử dụng phổ biến nhất trong các nghiên cứu về sinh học phân tử [18]. Các enzyme cắt giới hạn type II đóng vai trò quan trọng trong quy trình nhân dòng gen. Khi một mẫu ADN được xử lý với một trong những enzyme này ở một điều kiện, thành phần phản ứng không đổi sẽ luôn tạo ra cùng một tổ hợp các đoạn ADN trong những lần cắt khác nhau. Do đó, enzyme cắt giới hạn type II trở thành một công cụ hữu hiệu trong sản xuất thang chuẩn ADN [15]. Thang chuẩn loại này chủ yếu sử dụng các phân tử ADN kích thước lớn có sẵn trong tự nhiên, thao tác đơn giản dễ thực hiện, giá thành rẻ. Tuy nhiên chính việc sử dụng các phân tử ADN có sẵn trong tự nhiên lại trở thành một nhược điểm lớn của phương pháp này, vì vị trí nhận biết của enzyme cắt giới hạn là ngẫu nhiên, nên các băng của thang chuẩn loại này có bước nhảy không xác định [16]. 10
o Kỹ thuật ADN tái tổ hợp ADN tái tổ hợp là phân tử ADN được tạo thành từ hai hay nhiều trình tự ADN của các loài sinh vật khác nhau. Trong kỹ thuật di truyền, ADN tái tổ hợp thường được tạo ra từ việc gắn những đoạn ADN có nguồn gốc khác nhau vào trong vector tách dòng. Những vector tái tổ hợp sau đó thường được biến nạp vào Escherichia Coli. Một thí nghiệm tái tổ hợp ADN cơ bản thường tuân thủ theo bốn bước sau [15]: Bước 1: Đoạn ADN chèn mong muốn sẽ được xử lý bằng enzyme cắt giới hạn, tạo đầu tận cùng 3’ và 5’ phù hợp. Bước 2: Vector tách dòng cũng được xử lý bằng enzyme cắt giới hạn tương ứng với đoạn ADN chèn. Bước 3: Thực hiện phản ứng nối đoạn ADN đích vào vector tách dòng tạo vector tái tổ hợp. Vector tái tổ hợp sau đó được biến nạp vào tế bào chủ và nuôi cấy trong điều kiện thích hợp để nhân lên số lượng lớn. Bước 4: Chọn lọc các tế bào vi khuẩn nhận vector tái tổ hợp. Vector tái tổ hợp sẽ được cắt bằng enzyme cắt giới hạn để tạo ra thang chuẩn. Thang chuẩn loại này có giá thành rẻ, đơn giản, dễ thực hiện, thời gian bảo quản lâu, lại có thể chủ động được kích thước của các băng trong thang chuẩn. Đây là phương pháp được áp dụng nhiều nhất trong sản xuất thang chuẩn tại các trung tâm sản xuất chế phẩm sinh học lớn hiện nay [6]. Cũng chính từ những ưu điểm của phương pháp ADN tái tổ hợp có thể khắc phục những nhược điểm của phương pháp PCR, chúng tôi đã kết hợp hai phương pháp này một cách linh hoạt trong nghiên cứu của mình với mục tiêu thiết kế thang chuẩn ADN 100 bp. 1.1.3.4. Những thuận lợi và khó khăn trong sản xuất thang chuẩn ADN bước nhảy nhỏ 11
o Thuận lợi Thang chuẩn 5 bp đến không quá 200 bp là những thang chuẩn ADN bước nhảy nhỏ, với dải băng ADN phổ biến trong khoảng từ 5 bp đến 4000 bp dễ dàng sử dụng trong nhiều mục đích thí nghiệm khác nhau như: nghiên cứu các đoạn ADN kích thước bé (ADN satellite,...); kiểm tra sản phẩm phản ứng PCR; kiểm tra sản phẩm phản ứng cắt ADN bằng enzyme giới hạn; kiểm tra kích thước đoạn chèn trong nhân dòng;... [33]. Để có được một con số thống kê cụ thể về mức độ tiêu thụ các sản phẩm này của những công ty sản xuất là rất khó khăn, có thể do đây là thông tin nội bộ nên đã không được công bố rộng rãi. Tuy nhiên, nhìn vào thị trường giá cả phong phú của nhóm thang chuẩn này có thể thấy đây là bộ sản phẩm được nhiều công ty đầu tư sản xuất, cung ứng với tiềm năng kinh tế cao [43, 44]. o Khó khăn Sản xuất thang chuẩn bước nhảy nhỏ hầu hết áp dụng phương pháp hóa tổng hợp cho các đoạn ADN có kích thước không quá 100 bp [4] và phương pháp PCR cho các đoạn ADN kích thước lớn hơn [7, 24]. Các đoạn ADN kích thước mong muốn sau khi được tổng hợp, phải trải qua bước tinh sạch, xác định nồng độ và phối trộn theo tỷ lệ xác định để tạo thang chuẩn hoàn chỉnh. Như vậy, việc sản xuất bộ thang chuẩn này không chỉ gặp nhiều khó khăn trong thao tác thí nghiệm, qua nhiều công đoạn, mà còn đòi hỏi hóa chất, trang thiết bị hiện đại có giá thành cao. Giá bán các loại thang chuẩn này vì thế cũng cao hơn (Bảng 1). Bảng 1. Giá thành thang chuẩn ADN bước nhảy nhỏ năm 2011 của một số hãng sản xuất, chưa bao gồm thuế nhập khẩu tham khảo trên website: www.uoftmedstore.com. Hãng sản xuất ADN ladder Số đường chạy Giá thành 5 bp 152,96 $ Fermentas Đức 10 bp 100 135,85 $ 20 bp 128,25 $ 10 bp 173,80 $ Invitrogen Mỹ 100 25 bp 163,90 $ Takara Nhật Bản 20 bp 100 21,00 ¥ 12
Nghiên cứu thiết kế thang chuẩn bước nhảy nhỏ gặp khá nhiều khó khăn trong lựa chọn phương pháp sản xuất, các bước thí nghiệm, chi phí sản phẩm. Đây là một bài toán khó cho các nhà sản xuất khi muốn thương mại hóa bộ sản phẩm này. 1.2. THANG CHUẨN 100 bp 1.2.1. Thị trường ADN ladder 100 bp ADN ladder 100 bp thường gồm dải băng có kích thước từ 100 bp đến 3000 bp, được sản xuất và cung ứng bởi nhiều hãng sản xuất danh tiếng trên thế giới như: Fermentas Đức; Takara Nhật Bản; Invitrogen Mỹ; New England Biolab Anh; Roche Thụy Sỹ; Promega Mỹ. ADN ladder 100 bp c ủa từng hãng sản xuất lại có số lượng băng và giá thành sản phẩm khác nhau (Hình 6 A, Bảng 2). Một số hãng thương mại còn kết hợp sử dụng ADN ladder 100 bp với loại thang chuẩn ADN khác (ADN ladder 500 bp; High Range ADN ladder,…), nhằm tăng dải kích thước băng ADN cũng như tăng tính ứng dụng của loại sản phẩm này (Hình 6 B) [33, 36]. Chính những điều đó đã góp phần tạo ra một thị trường thang chuẩn 100 bp đa dạng và phong phú, đáp ứng mọi nhu cầu của người sử dụng [41, 42]. Bảng 2. Giá thành ADN ladder 100 bp năm 2010 của một số hãng thương mại chưa bao gồm thuế nhập khẩu, tham khảo trên webside: www.lablife.org. Số đường Giá bán sản phẩm Hãng sản xuất chạy điện di chưa bao gồm thuế Fermentas Đức 100 62 $ Invitrogen Mỹ 100 198 $ New England Biolabs Anh 100 53 $ Promega Thụy Sỹ 100 148 € Roche Mỹ 100 218 $ 13
Hình 6. (A): ADN ladder 100 bp của một số hãng sản xuất thương mại [41]; (B): Ảnh ADN ladder 100 bp kết hợp với ADN ladder 500 bp (Fermentas) [33]. 1.2.2. Sản xuất ADN ladder 100 bp ADN ladder 100 bp thương mại hiện bán trên thị trường thường gồm dải băng kích thước rộng, bước nhảy giữa hai băng kế tiếp là 100 bp giúp thang chuẩn ADN loại này được sử dụng rộng rãi trong nhiều nghiên cứu khác nhau. ADN ladder 100 bp được đầu tư, sản xuất và cung ứng bởi nhiều hãng sản xuất trên thế giới [37, 47]. Từ những tài liệu mà chúng tôi có được cho thấy hầu hết thang chuẩn loại này được sản xuất nhờ áp dụng kỹ thuật PCR [7], Multiplex PCR [24], kỹ thuật ADN tái tổ hợp [17]. Giá thành ADN ladder 100 bp thương mại tương đối cao [7, 24]. Tại phòng thí nghiệm của chúng tôi thang chuẩn ADN 100 bp có nhu cầu sử dụng hàng ngày. Chúng tôi đặt mua thang chuẩn từ nước ngoài nên không chủ động được nguồn cung cấp, phụ thuộc thời gian vận chuyển, giá thành cao do phải chịu thêm thuế nhập khẩu và chi phí vận chuyển. Xuất phát từ nhu cầu sử 14
dụng và những khó khăn khi đặt hàng chúng tôi tiến hành đề tài “Thiết kế thang chuẩn ADN” bước nhảy 100 bp. CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. NGUYÊN LIỆU 2.1.1. Hệ Vector 1. Vector pJET1.2 là vector tách dòng sản phẩm PCR, nằm trong bộ kit “CloneJETTM PCR Cloning Kit” của hãng Fermentas Đức [12] (Phụ lục 01). 2. Vector pGEX4T1Bre là vector pGEX4T1 (Phụ lục 02) mang đoạn ADN kích thước 114 bp, được cung cấp bởi Phòng thí nghiệm Sinh Y, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội. 3. Vector pJET1.28×100 là vector pJET1.2 mang các đoạn ADN kích thước 100 bp tự nối. 2.1.2. Các cặp mồi cho phản ứng PCR Cặp mồi BreF1/BreR1 được thiết kế để nhân bản đoạn ADN kích thước 108 bp từ đoạn ADN 114 bp trong vector pGEX4T1Bre. Cặp mồi pJET1.2F/pJET1.2R thiết kế dựa trên trình tự của vector pJET1.2, cung cấp theo “CloneJETTM PCR Cloning Kit” [12]. Cặp mồi pJET800F/pJET800R được thiết kế để khuếch đại đoạn ADN kích thước 1000 bp từ vector pJET1.28×100. Các mồi được cung cấp bởi hãng Bioneer Hàn Quốc và IDT Mỹ. Trình tự các cặp mồi được thể hiện trong Bảng 3. Bảng 3. Trình tự các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu. Cặp mồi Trình tự (5’3’) BreF1 ccg gaa ttc atg atc gag ggt agg aag ctt aaa aat ttt g BreR1 ccg gaa ttc aca ctg gcc act gag ttt gc 15
Trong đó: gaa ttc là vị trí cắt của enzyme giới hạn EcoRI pJET1.2F cga ctc act ata ggg aga gcg gc pJET1.2R aag aac atc gat ttt cca tgg cag pJET800F aac act tgt gcc tga aca cca tat c pJET800R gaa aat ctt gag aga ata aaa gaa gaa cat cg 2.1.3. Chủng vi sinh vật o Chủng E.coli DH5α Chủng E.coli DH5α được tạo ra từ chủng E.coli DH5 bởi Doug Hanahan vào năm 1985. Chủng vi khuẩn này được sử dụng phổ biến trong kỹ thuật ADN tái tổ hợp do nó mang một vài đặc điểm đặc trưng sau [25]: Đột biến bất hoạt gen mã cho endonuclease nội bào, giúp bảo vệ plasmid. Đột biến loại bỏ gen mã cho enzyme EcoKI sẽ bảo vệ các vị trí cắt của enzyme này trên phân tử ADN khi chúng không được methyl hóa. Mang gen Δ(lacZ)M15 mã cho thụ thể nhận alpha (alpha acceptor) cần thiết cho quá trình sàng lọc xanh trắng trên nhiều hệ vector. Chủng E.coli DH5α được chúng tôi sử dụng trong biến nạp vector pJET1.2 8×100. o Chủng E.coli BL21(DE3) Chủng E.coli BL21 (DE3) được cải biến từ chủng E.coli tự nhiên và sử dụng làm vật chủ biểu hiện thông dụng với hầu hết các promoter (như lac, tac, …). Chủng vi khuẩn này mang hai đặc điểm cơ bản [31]: Đột biến gen mã cho protease ngoài màng tế bào, giúp bảo vệ các protein được biểu hiện khỏi sự phân giải protein. 16
Loại bỏ gen mã cho protease lon một enzyme làm giảm sút protein vi khuẩn và ức chế sự phân chia tế bào cho tới khi quá trình sửa chữa nhiễm sắc thể được hoàn thành. Nghiên cứu của chúng tôi sử dụng nguyên liệu ban đầu là chủng E.coli BL21 (DE3) mang vector pGEX4T1Bre. 2.1.4. Hóa chất và trang thiết bị o Hóa chất Taq ADN polymerase (Fermentas Đức); dNTP mix 2 mM (Sigma Mỹ, Takara Nhật Bản); Các enzyme cắt giới hạn (Fermentas Đức, New England Biolabs Anh); Môi trường nuôi cấy vi khuẩn Lubertini broth (LB) gồm các thành phần: 1% trypton; 0,5% cao nấm men ; 0,5% NaCl; 1,2% agar (môi trường đặc) [23]; Các kit tách dòng gen của Fermentas Đức [12, 14], tinh sạch sản phẩm PCR và tinh sạch ADN của Bioneer Hàn Quốc [9, 10], tinh sạch plasmid và ADN của Qiagen Đức [19, 20]; Thang chu ẩn 100 bp và 1 kb c ủa Takara Nh ật B ản, Fermentas Đứ c, New England Biolabs Anh; Các hóa chất khác đều đạt độ tinh sạch cao dùng trong nghiên cứu sinh học phân tử. o Trang thiết bị Các thiết bị và máy móc phục vụ cho nghiên cứu thuộc Phòng thí nghiệm Sinh Y Khoa Sinh học; Phòng Genomic thuộc Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Enzyme Protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội. 17
18
2.2. SƠ ĐỒ THÍ NGHIỆM Toàn bộ quá trình nghiên cứu được tóm tắt trong Hình 7. Hình 7. Sơ đồ nghiên cứu thiết kế thang chuẩn ADN SY 100. 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1. Phương pháp tách chiết plasmid từ vi khuẩn Plasmid tách chiết từ tế bào vi khuẩn theo hai phương pháp: o Tách chiết plasmid sử dụng môi trường kiềm có SDS [21] + 1,5 ml dịch vi khuẩn bão hòa được đem ly tâm 8000 vòng/phút ở 4 0C trong 10 phút, thu cặn, để khô + Thêm 100 µl dung dịch I (50 mM TrisHCl, pH 8, glucose 50 mM, 10 mM EDTA pH 8), vortex tan cặn, ủ nhiệt độ phòng 10 phút + Thêm 200 µl dung dịch II (0,2 N NaOH, 1% SDS), đảo đều, ủ đá 3 phút + Thêm 150 µl dung dịch III (3 M potassium acetate, pH 5), đảo đều, ủ đá 5 phút 19
+ Ly tâm 13000 vòng/phút ở 40C trong 20 phút, thu dịch trong + Bổ sung 1 thể tích Phenol : Chloroform : Isoamyl (25 : 24 : 1), vortex đều + Ly tâm 13000 vòng/phút ở nhiệt độ phòng trong 5 phút, thu dịch pha trên + Bổ sung thêm 0,6 lần thể tích Isopropanol, ủ nhiệt độ phòng 20 phút + Ly tâm 13000 vòng/phút ở 40C trong 20 phút, thu tủa + Để khô tủa hoàn toàn, hòa với nước khử trùng hoặc TE 1X, pH 8 Mẫu plasmid được bảo quản ở 200C. o Tinh sạch plasmid sử dụng Kit của Qiagen [19] Plasmid sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR được tinh sạch bằng QIAprep Spin Miniprep Kit với quy trình được hướng dẫn cụ thể trong “QIAprep® Miniprep Handbook” [19]. 2.3.2. Kỹ thuật nối các đoạn ADN Một phản ứng nối các đoạn ADN thường diễn ra trong tổng thể tích từ 10 20 µl ở 40C đến 370C, sử dụng enzyme T4 ADN ligase, dung dịch đệm chứa Mg 2+ và ATP [11, 14]. T4 ADN ligase tham gia xúc tác hình thành liên kết phosphodiester giữa các đầu tận cùng (có thể là đầu bằng hoặc đầu so le) của các đoạn ADN [11]. Trong nghiên cứu của chúng tôi, đoạn ADN kích thước 108 bp khuếch đại từ phản ứng PCR sử dụng cặp mồi BreF1/R1 sẽ được cắt hoàn toàn với EcoRI (GˇAA TTC) tạo đầu so le. Sản phẩm phản ứng cắt là các đoạn 100 bp sẽ tham gia phản ứng tự nối diễn ra ở 140C qua đêm. Các bước làm được chúng tôi tuân thủ theo quy trình phản ứng nối tham khảo trong “CloneJETTM PCR Cloning Kit” [12], “Gene JETTM PCR Cloning Kit procedure” [14] và “FastDigest® & Conventional Restriction Enzymes” [13]. 2.3.3. Biến nạp theo phương pháp sốc nhiệt Vector pJET1.2 mang đoạn chèn được biến nạp vào tế bào E.coli DH5α theo phương pháp sốc nhiệt. Tế bào khả biến DH5α đã được xử lý với CaCl2 20