Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Thiết kế vector biểu hiện mang gen scFv kháng CD47 và biểu hiện protein trong vi khuẩn E.coli

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:49

Thêm vào BST

Báo xấu

17
lượt xem 7
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Đề tài được nghiên cứu với mục tiêu thiết kế thành công vector biểu hiện mang gen scFv đặc hiệu CD47 và biểu hiện được protein trong vi khuẩn E.coli. Mời các bạn cùng tham khảo nội dung chi tiết.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Thiết kế vector biểu hiện mang gen scFv kháng CD47 và biểu hiện protein trong vi khuẩn E.coli

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Nguyễn Thị Vân Anh THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN MANG GEN scFv KHÁNG CD47 VÀ BIỂU HIỆN PROTEIN TRONG VI KHUẨN E. coli LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2019
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Nguyễn Thị Vân Anh THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN MANG GEN scFv KHÁNG CD47 VÀ BIỂU HIỆN PROTEIN TRONG VI KHUẨN E. coli Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 8420101.14 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: 1. PGS. TS Nguyễn Quang Huy 2. TS. Lã Thị Huyền Hà Nội - 2019
LỜI CẢM ƠN Không có sự thành công của một học viên nào mà không có sự hỗ trợ, giúp đỡ và đóng góp của các Thầy cô. Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu tại trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, em đã nhận đƣợc sự hƣớng dẫn và giúp đỡ của các Thầy cô trong Trƣờng và đặc biệt là các Thầy cô trong Khoa Sau đại học. Lời đầu tiên em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới PGS. TS Nguyễn Quang Huy – Trƣởng khoa Hoá sinh Trƣờng Đại học Khoa học Tự Nhiên Hà Nội, TS. Lã Thị Huyền – Phòng công nghệ động vật viện hàn lâm khoa học công nghệ Việt Nam đã tận tình hƣớng dẫn và dìu dắt em trong suốt thời gian em học tập và hoàn thành luận văn. Tiếp theo, em xin đƣợc gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy, cô của Khoa Sinh học – Đại học Khoa học Tự nhiên đã nhiệt tình giảng dạy và tạo điều kiện giúp đỡ để em có thể hoàn thành luận văn. Em cũng xin chân thành cảm ơn toàn thể các GS, TS, cán bộ nghiên cứu của Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện, luôn tận tình sát sao chỉ bảo, chia sẻ những kinh nghiệm và cho em những lời khuyên quý báu trong công việc cung nhƣ cuộc sống. Và cuối cùng, bằng tình cảm chân thành và yêu mến em xin đƣợc gửi lời biết ơn sâu sắc tới gia đình và ngƣời thân, những ngƣời luôn ủng hộ, động viên và tạo cho em những điều kiện tốt nhất về tinh thần cũng nhƣ vật chất trong suốt thời gian học tập và thực tập. Hà Nội, ngày tháng năm 2019 Học viên Nguyễn Thị Vân Anh
MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................. 1 MỞ ĐẦU ..................................................................................................................... 1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................... 3 1.1. Tổng quan về bệnh ung thƣ ....................................................................................... 3 1.1.1. Ung thư ........................................................................................................... 3 1.1.2. Ảnh hưởng của bệnh ung thư ......................................................................... 5 1.1.3. Nguyên nhân gây ung thư .............................................................................. 5 1.2. Protein kháng nguyên CD47 và kháng thể kháng CD47...................................... 7 1.2.1. Protein kháng nguyên CD47- đích trong điều trị ung thư ........................... 7 1.3.3. Các thành tựu sử dụng kháng thể kháng CD47 trong điều trị ung thư .................. 9 1.3. Kháng thể và kháng thể đơn chuỗi ứng dụng trong điều trị bệnh ung thƣ..... 10 1.4. Mảnh kháng thể đơn chuỗi (scFv).................................................................. 11 CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................... 13 2.1. Vật liệu ........................................................................................................................ 13 2.1.1. Hóa chất và sinh phẩm ................................................................................ 13 2.2. Thiết bị ........................................................................................................................ 13 2.3.1. Nhân gen mã hóa scFv kháng CD47 bằng phản ứng PCR ....................... 14 2.3.2. Điện di trên gel agarose............................................................................... 14 2.3.5. Gắn nối sản phẩm PCR vào vector pET22b+ ............................................ 16 2.3.6. Biến nạp sản phẩm gắn nối vào tế bào khả biến E.coli DH5α bằng phương pháp sốc nhiệt ........................................................................................... 16 2.3.7. Tách plasmid từ vi khuẩn E.coli theo phương pháp mini-prep của Sambrook................................................................................................................. 17 2.3.8. Chọn dòng plasmid tái tổ hợp mang gen antiHer2 bằng phương pháp PCR ................................................................................................................ 17 2.3.9. Quy trình biểu hiện kháng thể kháng CD47 ở hệ thống biểu hiện E.coli ........................................................................................................................ 18
2.3.10. Quy trình điện di protein SDS-PAGE ....................................................... 18 2.3.11. Tinh sạch kháng thể anti-CD47 tái tổ hợp bằng phương pháp sắc ký ái lực với Ni-NTA resin .......................................................................................... 19 2.3.12. Nuôi cấy dòng tế bào Jurkat ...................................................................... 19 2.3.13. Phương pháp miễn dịch huỳnh quang ...................................................... 20 3.1. Kết quả nhân gen mã hóa kháng thể kháng CD47 .............................................. 22 3.2. Kết quả thiết kế vector biểu hiện tái tổ hợp pET22b+ mang gen anti-CD47... 22 3.2.1. Cắt vector pET22b+ và sản phẩm PCR bằng enzyme cắt giới hạn.......... 22 3.2.2. Kết quả gắn tạo thành công vector tái tổ hợp mang gen anti-CD47 ........ 23 3.3. Kết quả biểu hiện gen mã hóa kháng thể kháng CD47 ở hệ thống biểu hiện E. coli................................................................................................................................... 28 3.4. Kết quả tinh sạch kháng thể anti-CD47 ................................................................ 29 3.5. Xác định khả năng liên kết đặc hiệu của kháng thể anti-CD47 với kháng nguyên CD47 ..................................................................................................................... 30 KẾT LUẬN ............................................................................................................... 33 TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................... 34
DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Liệu pháp nhắm đích CD47/SIRPα ............................................................ 9 Bảng 1.2. Các kháng thể nhắm đích CD47/SIRPα .......................................................... 10
DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Bản đồ ung thƣ thế giới .............................................................................. 3 Hình 1.2. Bản đồ ung thƣ tại Việt Nam ............................................................................. 4 Hình 1.3: Đột biến bất hoạt gen ức chế khối u gây ung thƣ ............................................. 6 Hình 1.5: Mô hình cấu trúc thụ thể CD47 .......................................................................... 7 Hình 1.6. Các cơ chế nhắm trúng đích con đƣờng CD47- SIRPα trong ung thƣ ............ 8 Hình 3.1. Kết quả nhân gen anti-CD47 bằng phản ứng PCR. .................................. 22 Hình 3.2. Cắt vector pET22b+ bằng enzyme cắt giới hạn............................................... 23 Hình 3.3. Kết quả biến nạp sản phẩm gắn nối gen giữa sản phẩm PCR (khuếch đại gen antiCD47). ................................................................................................................... 24 Hình 3.4. Kiểm tra sơ bộ các dòng plasmid tái tổ hợp mang gen anti-CD47 .............. 25 Hình 3.5. Kiểm tra các dòng plasmid mang gen anti-CD47............................................ 26 Hình 3.7. Kiểm tra sự biểu hiện của kháng thể kháng CD47 ở tế bào vi khuẩn E.coli 28 Hình 3.8. Kiểm tra độ tinh sạch của kháng thể anti-CD47. ............................................. 30 Hình 3.9. Khả năng liên kết đặc hiệu của kháng thể anti-CD47 với kháng nguyên CD47 biểu hiện trên bề mặt tế bào Jurkat.. ....................................................................... 31
DANH SÁCH CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Amp Ampicillin AML Tế bào ung thƣ máu Bp Base pair (cặp bazơ) CD47 Cluster of Differentiation 47 DNA Deoxyribonucleic acid E. coli Escherichia coli EDTA Ethylenediaminetraacetic acid EtBr Ethidium bromide HEK Tế bào thận phôi thai ở ngƣời HSC Tế bào gốc tạo máu IPTG Isopropyl-β-D-l-thiogalactopyranoside MCS Mutiple cloning site LB Luria-betani medium LSC Tế bào gốc ung thƣ máu NHL Non-Hodgkin’s lymphoma OKT3 OrthocloneTM PEG Polyethylen glycol RNA Ribonucleic acid V/p Vòng / phút Fc Kháng thể đơn miền và mảnh kết tinh SIRPα Signal regulatory protein alpha. ScFv Mảnh kháng thể đơn chuỗi Fab Fragment of antigen binding
MỞ ĐẦU CD47 là glycoprotein chuyển màng thuộc siêu họ globulin miễn dịch. CD47 có khối lƣợng phân tử 50 kDa bao gồm vùng IgV ngoại bào chứa đầu N, 5 vùng chuyển màng và đuôi nội bào ngắn chứa đầu C. CD47 liên kết đặc hiệu với một số protein bao gồm integrins, thrombospondin-1, và liên quan đến các quá trình sinh lý tế bào nhƣ di chú tế bào, hoạt hóa tế bào T và tế bào tua, và sự phát triển của sợi trục thần kinh [16]. Ngoài ra, CD47 còn là phối tử đặc hiệu của SIRPα . Protein này biểu hiện trên bề mặt của các tế bào đại thực bào. Tƣơng tác CD47-SIRPα ức chế quá trình thực bào bởi đại thực bào và tế bào tua [44]. CD47 đƣợc xác định là kháng nguyên ung thƣ buồng trứng ngƣời lần đầu tiên vào những năm 1980 [17]. Sau đó, CD47 đƣợc xác định biểu hiện ở nhiều loại khối u ngƣời bao gồm AML, CML [11], ALL [7], bạch cầu không liêu quan đến lympho bào NHL [8], đa uy tủy [21], ung thƣ bàng quang [32] và các khối u rắn khác [11]. Điều đặc biệt là, CD47 biểu hiện yếu ở các tế bào bình thƣờng và biểu hiện mạnh ở các tế bào khối u. Xác định mức độ biểu hiện CD47 ở hai mẫu tế bào HSC và tế bào LSC bằng phƣơng pháp flow cytometry cho thấy mật độ kháng nguyên CD47 ở tế bào LSC cao hơn ở tế bào HSC [10; 7]. Định lƣợng CD47 mRNA trong mẫu máu ngoại vi của một nhóm gồm 132 bệnh nhân AML bằng phƣơng pháp real-time PCR cho thấy hàm lƣợng CD47 mRNA của bệnh nhân AML cao hơn so với nhóm chứng [40]. Các kết quả đã công bố cho thấy CD47 không những là marker hữu dụng để nhận dạng LSC, AML và một số tế bào khối u khác mà còn là đích để phát triển các loại thuốc đặc hiệu và liệu pháp miễn dịch tiêu diệt tế bào ung thƣ biểu hiện kháng nguyên CD47. Ung thƣ máu cấp tính có tốc độ phát triển rất nhanh ở tủy xƣơng cùng với sự biểu hiện của một số kháng nguyên bề mặt bao gồm CD19, CD22, CD33, CD123, và CD47. Trong đó, CD47 biểu hiện mạnh ở cả tế bào ung thƣ máu và tế bào gốc ung thƣ máu. Tế bào gốc ung thƣ máu là một trong những nhân tố tiềm tàng khiến cho bệnh ung thƣ máu dai dẳng, khó điều trị dứt điểm và dễ tái phát. Do đó, CD47 1
là một trong các đích để tấn công nhằm tiêu diệt tận gốc bệnh ung thƣ bạch cầu cấp tính. Mảnh kháng thể scFv là một trong những định dạng phổ biến nhất của mảnh kháng thể tái tổ hợp. Mặc dù chúng là những đại diện khá nhỏ của dạng kháng thể tái tổ hợp (26-28 kDa) nhƣng chúng cung cấp đầy đủ các đặc tính của kháng thể và vị trí gắn kết kháng nguyên không bị thay đổi. So với các kháng thể đầy đủ chúng ít phức tạp hơn, bao gồm chỉ các miền biến đổi của chuỗi nặng kháng thể (VH) và vùng biến đổi của chuỗi nhẹ kháng thể (VL), các VH và VL đƣợc liên kết bởi một polypeptide linh hoạt. Với sự ra đời của công nghệ DNA tái tổ hợp từ những năm 1970, protein bắt đầu đƣợc biểu hiện nhiều ở dạng tái tổ hợp trong các tế bào vi sinh vật một cách nhanh hơn và thuận tiện hơn so với nguồn tự nhiên. Trong những năm gần đây, kỹ thuật sản xuất protein tái tổ hợp trong các hệ thống sinh học ngày càng đƣợc ứng dụng rộng rãi. Trong đó, các ―nhà máy‖ vi khuẩn đƣợc lựa chọn sử dụng nhiều do các ƣu điểm nhƣ chi phí thấp, sinh khối lớn và tốc độ sản xuất nhanh. Chủng biểu hiện Escherichia coli là chủng đƣợc sử dụng rộng rãi nhất trong nghiên cứu cũng nhƣ trong sản xuất protein tái tổ hợp. Do đó, tác giả lựa chọn đề tài: ―Thiết kế vector biểu hiện mang gen scFv kháng CD47 và biểu hiện protein trong vi khuẩn E.coli‖ với mục tiêu: Thiết kế thành công vector biểu hiện mang gen scFv đặc hiệu CD47 và biểu hiện đƣợc protein trong vi khuẩn E.coli. 2
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tổng quan về bệnh ung thƣ 1.1.1. Ung thƣ Ung thƣ là một thuật ngữ trong y học để chỉ khối u ác tính. Đây là một loại bệnh mà một nhóm tế bào biểu thị sự tăng sinh không kiểm soát (các tế bào có sự phân chia vƣợt quá giới hạn bình thƣờng), sau đó xâm nhập và tiêu diệt các mô liền kề nó, đôi khi tế bào di căn (xâm nhập vào các vùng khác trên cơ thể theo đƣờng bạch huyết hoặc máu) [1; 2]. Có khoảng 200 loại bệnh ung thƣ đã đƣợc khoa học tìm ra. Tổ chức Y tế thế giới (WHO) năm 2018 công bố tình hình ung thƣ hiệu chỉnh theo độ tuổi tại 185 quốc gia và vùng lãnh thổ. Hình 1.1. Bản đồ ung thƣ thế giới [18] Trong đó, 10 quốc gia có tỉ lệ ung thƣ cao nhất đều là những nƣớc phát triển: Úc đứng số 1 với tỉ lệ mắc ung thƣ cả 2 giới ở mức 468/100.000 dân; New Zealand (438); Ireland (373); Hungary (368); Mỹ đứng thứ 5 với tỉ lệ 352, kế đó là Bỉ, Pháp, Đan Mạch, Na Uy, Hà Lan... Trong khu vực Đông Nam Á, Singapore có tỉ lệ mắc ung thƣ cao nhất, kế đó là Philippines (163, vị trí 89 thế giới); Thái Lan vị trí 92 thế giới (152); thứ 4 khu vực là Lào (154, vị trí 97 thế giới). Việt Nam xếp vị trí 99/185 quốc gia và vùng lãnh thổ với tỉ lệ mắc ung thƣ 151,4/100.000 dân, xếp 19 châu Á và thứ 5 tại khu vực Đông Nam Á. Vào năm 2015, Việt Nam xếp vị trí 107 và thời điểm 2013 xếp ở vị trí 108. 3
Theo thống kê của WHO, số ca mắc mới ung thƣ tại Việt Nam không ngừng tăng, từ 68.000 ca năm 2000 lên 126.000 năm 2010. Năm 2018, số ca mắc mới tăng lên gần 165.000 ca/96,5 triệu dân, trong đó gần 70% trƣờng hợp tử vong, tƣơng đƣơng 115.000 ca. Nhìn tổng quan trên bản đồ ung thƣ thế giới, tỉ lệ mắc của Việt Nam không cao, tuy nhiên tỉ lệ tử vong tƣơng đối lớn, xếp vị 56/185 quốc gia và vùng lãnh thổ với tỉ lệ 104,4/100.000 dân. Vào năm 2016, tỉ lệ tử vong của Việt Nam ở mức 110/100.000 dân. Hình 1.2. Bản đồ ung thƣ tại Việt Nam [18] Tính chung cả 2 giới, 5 loại ung thƣ có tỉ lệ mắc nhiều nhất tại Việt Nam gồm: Ung thƣ gan, hơn 25.000 ca (15,4%), kế đó là ung thƣ phổi (14,4%), ung thƣ dạ dày (10,6%), ung thƣ vú, ung thƣ đại tràng. 5 loại ung thƣ phổ biến nhất ở nam giới Việt gồm: Ung thƣ phổi (21,5%), ung thƣ gan (18,4%), ung thƣ dạ dày, ung thƣ đại tràng; ung thƣ hầu họng. Ở nữ giới, hàng đầu vẫn là ung thƣ vú, ung thƣ đại tràng, ung thƣ phổi, ung thƣ gan. Tổ chức sáng kiến toàn cầu về ung thƣ (GICR, thuộc WHO) cho biết, các số liệu có đƣợc dựa trên những nguồn tốt nhất đƣợc cung cấp tại mỗi nƣớc. 4
WHO cho biết, ung thƣ đang là một trong những thách thức sức khoẻ cộng đồng quan trọng nhất của thế kỷ 21. Khoảng 40% trƣờng hợp ung thƣ có thể đƣợc ngăn ngừa bằng cách giảm tiếp xúc với các yếu tố nguy cơ bao gồm chế độ ăn uống, dinh dƣỡng, hoạt động thể chất. 1.1.2. Ảnh hƣởng của bệnh ung thƣ Bệnh ung thƣ gây ảnh hƣởng nghiêm trọng đến đời sống và kinh tế ở mỗi quốc gia. Không những dẫn đầu về nguyên nhân gây tử vong trên thế giới, bệnh ung thƣ vẫn là một căn bệnh mà cho đến nay vẫn chƣa có biện pháp điều trị triệt để. Đối với một nƣớc phát triển nhƣ Mỹ, mỗi năm có khoảng 0,5% dân số đƣợc chẩn đoán ung thƣ. Hiện nay, vẫn đang còn rất nhiều ngƣời phải sống và chống chọi với căn bệnh này với chi phí điều trị rất lớn. Các nhà khoa học, bác sĩ trên toàn thế giới đang nỗ lực không ngừng để tìm ra các biện pháp phát hiện sớm, phòng ngừa và chữa trị ung thƣ. Đây là một vấn đề rất quan trọng đối với mỗi quốc gia và thế giới, đòi hỏi tập trung nguồn nhân lực trình độ cao và tài chính lớn. 1.1.3. Nguyên nhân gây ung thƣ Có rất nhiều nguyên nhân dẫn đến bệnh ung thƣ. Các nhà khoa học xác định rằng các dạng ung thƣ đều có nguyên nhân từ những bất thƣờng trong gen của các tế bào bị biến đổi. Sự bất thƣờng này do ảnh hƣởng của các chất sinh ung thƣ nhƣ khói thuốc lá, chất phóng xạ, chất hóa học,… Một số nguyên nhân ung thƣ khác có thể là do sai sót mang tính di truyền trong quá trình tự sao của ADN, do đó tất cả các tế bào đều tăng sinh bất thƣờng. Sự di truyền của ung thƣ đƣợc xác định do ảnh hƣởng của các yếu tố gây ung thƣ và hệ gen chủ. Một số yếu tố di truyền khác ảnh hƣởng đến ung thƣ là sự methyl hóa ADN và ARNs micro [1;2;4]. Bình thƣờng sự cân bằng giữa tốc độ của quá trình sinh sản và quá trình chết của tế bào đƣợc điều hòa để đảm bảo tính toàn vẹn của cơ quan và mô. Tuy nhiên khi các gen đột biến gây ung thƣ trong tế bào đƣợc hoạt hóa thì tế bào tránh đƣợc sự chết theo chƣơng trình (apoptosis) và phân chia không kiểm soát, có khả năng hình thành các khối u lành hoặc ác tính (ung thƣ) [4]. 5
Hai yếu tố quan trọng trong hệ gen dẫn đến ung thƣ là sự tích lũy các đột biến soma và tăng cƣờng tính bất ổn di truyền. Số lƣợng đột biến ở tế bào ung thƣ nhiều hơn tế bào bình thƣờng. Khi các đột biến diễn ra ở các gen sửa chữa ADN, các gen ức chế khối u hay đột biến gen tiền ung thƣ thành gen ung thƣ đƣợc kết hợp với nhau thì gây ra sự tăng sinh một cách không kiểm soát của các tế bào [2; 4]. Hình 1.3: Đột biến bất hoạt gen ức chế khối u gây ung thƣ [3] Sự có mặt của các đột biến khác nhau dẫn đến nguy cơ chọn lọc không mong muốn trong quần thể tế bào. Trong trƣờng hợp ung thƣ, tế bào nào mang đột biến tăng cƣờng sinh trƣởng sẽ có ƣu thế đƣợc chọn lọc [2; 4]. 6
1.2. Protein kháng nguyên CD47 và kháng thể kháng CD47 1.2.1. Protein kháng nguyên CD47- đích trong điều trị ung thư Hình 1.5: Mô hình cấu trúc thụ thể CD47 [16] Gần đây, protein bề mặt tế bào CD47 đã đƣợc phát hiện biểu hiện quá mức ở nhiều loại tế bào ung thƣ khác nhau[43]. Biểu hiện CD47 tăng cao trong 57 trên 115 (49,5%) mẫu ung thƣ dạ dày giai đoạn đầu (T1b). Hơn nữa, họ phát hiện ra rằng tỷ lệ sống sót sau 5 năm đối với các trƣờng hợp dƣơng tính với CD47 thấp hơn đáng kể so với các trƣờng hợp âm tính với CD47 (54,8 so với 79,9%; p = 0,0067), cho thấy sự biểu hiện quá mức của CD47 có thể là một yếu tố tiên lƣợng xấu độc lập cho ung thƣ dạ dày. Tƣơng tự, một nghiên cứu gần đây [44] tiết lộ rằng CD47 thƣờng đƣợc biểu hiện quá mức trong khối u của bệnh nhân ung thƣ buồng trứng và có liên quan đến các đặc điểm lâm sàng bất lợi và tiên lƣợng xấu. Các bệnh ung thƣ khác ở ngƣời cũng đã đƣợc báo cáo, một số trong đó bao gồm ung thƣ bạch cầu tủy cấp tính, ung thƣ hạch không Hodgkin (NHL), ung thƣ dạ dày, ung thƣ gan, ung thƣ phổi tế bào nhỏ và ung thƣ vú [17]. Trong hầu hết các trƣờng hợp, biểu hiện CD47 cao có liên quan đến di căn xa và tiên lƣợng xấu, cho thấy rằng liệu pháp chống CD47 là một chiến lƣợc đầy hứa hẹn để chống ung thƣ. Điều hòa tăng biểu hiện CD47 là một cơ chế đặc biệt quan trọng đƣợc các tế bào gốc ung thƣ sử dụng để vƣợt qua hệ thống miễn dịch, điều này dẫn tới sự tái phát của bệnh ung thƣ [6]. Các nghiên cứu trƣớc đây cho thấy sự gia tăng biểu hiện protein CD47 trên các tế bào tạo máu ở ngƣời, đặc biệt là trong bệnh ung thƣ bạch 7
cầu tủy bào cấp tính (AML) và trong bệnh bạch cầu tủy mãn tính, các tế bào chống lại quá trình thực bào thông qua tƣơng tác CD47-Sirpα [7; 9]. 1.2.2. Kháng thể kháng CD47 và liệu pháp điều trị đích CD47 trong điều trị ung thư Nhiều hƣớng nghiên cứu đã đƣợc xây dựng nhằm vô hiệu hóa tƣơng tác CD47-SIRPα theo các cơ chế khác nhau [37]. Cơ chế thứ nhất, kháng thể kháng CD47 có thể khóa tƣơng tác giữa CD47 trên tế bào khối u và SIRPα trên các tế bào thực bào cho phép quá trình thực bào diễn ra. Cơ chế thứ hai, kháng thể kháng CD47 có thể loại bỏ các khối u thông qua cơ chế phụ thuộc vào Fc bao gồm gây độc tế bào phụ thuộc kháng thể và gây độc tề bào phụ thuộc bổ thể.Một kháng thể kháng CD47 đã đƣợc chứng minh có tác dụng kích thích gây độc tế bào qua trung gian NK để kháng lại dòng tế bào ung thƣ ở ngƣời [39]. Cơ chế thứ ba, kháng thể kháng CD47 loại bỏ khối u bằng cách kích hoạt trực tiếp quá trình apoptosis.Kết quả của một số nghiên cứu đã công bố cho thấy, một vài kháng thể kháng CD47 kích thích các tế bào ung thƣ chết theo chƣơng trình thông qua cơ chế không phụ thuộc caspase [38; 41; 24; 42]. Cơ chế thứ tƣ , kháng thể kháng CD47 có khả năng bất hoạt tƣơng tác CD47-SIRPα dẫn đến tế bào tua có khả năng tóm bắt khối u và trình diện kháng nguyên cho tế bào T-CD4 và T- CD8, kích thích cơ thể đáp ứng miễn dịch kháng lại khối u [15]. Hình 1.6. Các cơ chế nhắm trúng đích con đƣờng CD47- SIRPα trong ung thƣ [10]. 8
1.3.3. Các thành tựu sử dụng kháng thể kháng CD47 trong điều trị ung thư Hiện nay, một số các liệu pháp nhắm đích CD47/ SIRPα đang đƣợc nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng và tiền lâm sàng, bao gồm các kháng thể thông thƣờng, polypeptide tái tổ hợp và các phân tử bispecific (Bảng 1.1). Bảng 1.1. Liệu pháp nhắm đích CD47/SIRPa [8,9,35] Điều trị nhắm mục tiêu CD47/ SIRPα theo phát triển lâm sàng Công ty Kháng thể Giai đoạn Mô tả kháng CD47 thử nghiệm Forty Seven Inc Hu5F9-G4 Giai đoạn 1 Kháng thể kháng CD47 đƣợc nhân hóa, phân lớp IgG4 của ngƣời Celgen CC-90002 Giai đoạn 1 Kháng thể kháng CD47 đƣợc nhân hóa Trillium TTI – 621 Giai đoạn 1 Protein SIRPα-Fc, phân lớp IgG1 của ngƣời Therapeutics Inc ALX148 Giai đoạn 1 Biến thể SIRPα có ái lực cao Alexo Therapeutics NI-1701 Tiền lâm sàng Kháng thể lƣỡng tính kháng đầy đủ CD47/CD19 Novimmune NI-1801 Tiền lâm sàng Kháng thể đầy đủ kháng CD47/ mesothelin Tioma Therapeutics Undisclosed Tiền lâm sàng Kháng thể kháng CD47 Surface Oncology Tiền lâm sàng Kháng thể kháng CD47 đầy đủ OSE Effi-DEM Tiền lâm sàng Kháng thể kháng SIRPα Immunotherapeutics 9
Các kháng thể kháng CD47 là các liệu pháp đặc hiệu tốt nhất nhắm tới phức hệ CD47/ SIRPα. Chúng đã đƣợc chứng minh hiệu quả in vitro và in vivo và các kháng thể kháng CD47 đã đƣợc thử nghiệm chống lại nhiều khối u máu ác tính và bệnh lý khối u rắn, và chúng đã bắt đầu đƣợc thử nghiệm lâm sàng (Bảng 1.2). Bảng 1.2. Các kháng thể nhắm đích CD47/SIRPa [8,9,35] Thử nghiệm lâm sàng trị liệu nhắm mục tiêu CD47/SIRPa Ngày bắt đầu Tên Kháng thể Thử nghiệm trên các bệnh Giai đoạn thử nghiệm 8/2014 Hu5F9-G4 Khối u ác tính, ung thƣ hạch Giai đoạn I 3/2015 CC-90002 Khối u rắn, đa u tủy, hoặc u Giai đoạn I lympho non-hodgkin 11/2015 Hu5F9-G4 Bệnh bạch cầu tủy cấp tính Giai đoạn I 01/2016 TTI - 621 Khối u ác tính Giai đoạn I 03/2016 CC-90002 Bệnh bạch cầu tủy cấp tính, Giai đoạn I hội chứng myelodysplastic có nguy cơ cao 09/2016 TTI - 621 Khối u rắn, nấm mycosis Giai đoạn I 11/2016 Hu5F9-G4 U lympho không Hodgkin tế Giai đoạn I/II bào B 11/2016 Hu5F9-G4 Khối u ác tính Giai đoạn I/II 02/2017 ALX148 Khối u rắn, u lympho Giai đoạn I Hiện nay các nghiên cứu về kháng thể kháng CD47 vẫn đang phát triển trên thế giới. 1.3. Kháng thể và kháng thể đơn chuỗi ứng dụng trong điều trị bệnh ung thƣ Kể từ khi cấp phép cho liệu pháp kháng thể đơn dòng (mAb) đầu tiên OKT3 vào năm 1986, tính đặc hiệu, tính linh hoạt và tính đa dạng của kháng thể và dẫn xuất kháng thể đã trở thành nhóm dƣợc phẩm sinh học lớn nhất [27]. Kháng thể đơn dòng có tiền sử sử dụng an toàn, cơ sở khoa học rõ ràng. Tính đến tháng 10 năm 2018, hơn 80 kháng thể đã đƣợc EMA/FDA đƣa ra thị trƣờng hoặc phê duyệt cho nhiều chỉ định bệnh bao gồm ung thƣ, viêm/tự miễn dịch, cấy ghép, bệnh truyền nhiễm và tim mạch, huyết học, dị ứng và nhãn khoa. Hơn 500 sản phẩm, bao gồm các sản phẩm thế hệ 2 10
và các định dạng kháng thể mới, hiện đang đƣợc thử nghiệm lâm sàng trên toàn thế giới [27; 28; 29]. Dựa trên bản chất mô hình tự nhiên của kháng thể, cả về cấu trúc và chức năng, cho phép tạo ra các mảnh liên kết kháng nguyên nhỏ hơn, chẳng hạn nhƣ mảnh Fab, mảnh đơn chuỗi (scFv), kháng thể đơn miền và mảnh kết tinh (Fc), thông qua tách dòng phân tử, kỹ thuật kháng thể và thậm chí các phƣơng pháp enzyme. Các mảnh kháng thể sau đó có thể đƣợc sử dụng một mình hoặc liên kết với các phân tử hoặc mảnh khác để tạo ra các phân tử lƣỡng tính, đa đặc hiệu, đa liên kết hoặc đa chức năng để đạt đƣợc nhiều hiệu ứng sinh học [4]. Các mảnh kháng thể có thể cung cấp một số lợi thế so với việc sử dụng các kháng thể thông thƣờng. 1.4. Mảnh kháng thể đơn chuỗi (scFv) Mảnh kháng thể đơn chuỗi (scFv) tạo ra một protein đơn chuỗi có ái lực với kháng nguyên tƣơng đƣơng với kháng thể gốc. Trình tự và độ dài peptide liên kết có thể khác nhau giữa các scFv để tối ƣu ái lực đối với kháng nguyên và tăng sự bền nhiệt. Chiều dài của peptide liên kết có thể tạo ra khoảng cách ~ 3,5nm giữa VL và VH mà không làm gián đoạn sự hình thành vị trí liên kết kháng nguyên [34]. Hình 1.5. Cấu trúc của scFv ScFv có một số lợi thế so với mAb thông thƣờng. Đầu tiên, kích thƣớc nhỏ lý tƣởng cho sản xuất quy mô lớn trong các hệ thống vi sinh vật [35]. Ngoài ra, vì các chuỗi mã hóa VL và VH đƣợc mã hóa trên cùng 1 gen, không cần phải cân bằng 11
vùng hằng định chuỗi nhẹ (CL) và chuỗi nặng (CH). Điều này cho phép các mảnh đƣợc sản xuất nhanh hơn, với năng suất cao hơn và với chi phí thấp hơn so với mAbs kích thƣớc đầy đủ, thƣờng yêu cầu hệ thống biểu hiện động vật có vú [36]. Kích thƣớc nhỏ cũng tạo điều kiện cho sự xâm nhập của mô và gắn kết với các epitopes, đặc biệt hữu ích cho sự thâm nhập khối u trong liệu pháp miễn dịch ung thƣ [37; 38]. Việc thiếu vùng Fc sẽ loại bỏ nguy cơ kích hoạt tế bào miễn dịch và các kháng thể nhƣ gây độc tế bào phụ thuộc kháng thể (ADCC), thực bào tế bào phụ thuộc kháng thể (ADCP), hoặc gây độc tế bào phụ thuộc kháng thể (CDC) [32]. 12