Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Ứng dụng bộ kít nhuộm hóa học tế bào để phân loại bệnh bạch cầu cấp theo tiêu chuẩn FAB

Chia sẻ: Na Na | Ngày: | Loại File: DOCX | Số trang:95

Thêm vào BST

Báo xấu

91
lượt xem 12
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu của đề tài là: Đánh giá sự phù hợp của bộ kít nhuộm hóa học tế bào trong phân loại dòng tế bào so với phương pháp hình thái học, miễn dịch học và di truyền trên những bệnh nhân bạch cầu cấp đã được chẩn đoán thể bệnh theo tiêu chuẩn FAB.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Ứng dụng bộ kít nhuộm hóa học tế bào để phân loại bệnh bạch cầu cấp theo tiêu chuẩn FAB

MỤC LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Tên TT Tên Tiếng Việt Tên Tiếng Anh viết tắt Bệnh bạch cầu cấp dòng Acute lymphoblastic 1 ALL lympho leukemia 2 AML Bệnh bạch cầu cấp dòng tủy Acute myeloid leukemia 3 BCC Bạch cầu cấp Leukemia 4 CE Cacboxyl esteraza Carboxyl esterase 5 CS Cộng sự et al 6 CD Dấu ấn miễn dịch Cluster of Differenciation Hội các nhà huyết học Pháp 7 FAB French American British Mỹ Anh 8 HHTB Nhuộm Hóa học tế bào Cytochemistry 9 HLA DR Kháng nguyên bạch cầu người Human Leukocyte antigen 10 LA Bệnh bạch cầu cấp Acute leukemia
Bệnh bạch cầu cấp dòng 11 L1 Homogenous small blast type lympho đã biệt hóa Bệnh bạch cầu cấp dòng 12 L2 Heterogenous blast type lympho chưa biệt hóa Bệnh bạch cầu cấp dòng 13 L3 Homogenous lager blast type lympho loại Burkitt Bệnh bạch cầu cấp dòng tủy Minimally differentiated 14 M0 biệt hóa tối thiếu acute myeloid Bệnh bạch cầu cấp dòng tủy Acute myeloblastic leukemia, 15 M1 không có tế bào trưởng thành without maturation Bệnh bạch cầu cấp dòng tủy Acute myeloblastic leukemia, 16 M2 có tế bào trưởng thành with granulocytic maturation Bệnh bạch cầu cấp dòng tiền Acute promyelocytic 17 M3 tủy leukemia Bệnh bạch cầu cấp dòng tủy Acute myelomonocytic 18 M4 mono leukemia Bệnh bạch cầu cấp dòng 19 M5 Acute mono mono Bệnh bạch cầu cấp dòng 20 M6 Acute erythroid leukemia hồng cầu Bệnh bạch cầu cấp dòng Acute megakaryoblastic 21 M7 tiểu cầu leukemia 22 NE Esteraza không đặc hiệu Nonspecific esterase
Esteraza không đặc hiệu ức Nonspecific esteraza NaF 23 NE NaF chế bằng NaF inhibitor 24 PA Photphataza axit Acid photphatase 25 PAL Photphataza kiềm Alkaline photphatase 26 PAS Periodic Axit Schiff Periodic Acid Schiff 27 PER Peroxydaza Peroxidase 28 SD Sudan đen Sudan black 29 SLTBT Số lượng tế bào tủy The number of myeloid cells 30 WHO Tổ chức Y tế thế giới World Heath Organization
DANH MỤC HÌNH
DANH MỤC BẢNG
MỞ ĐẦU Bệnh bạch cầu cấp là nhóm bệnh máu ác tính của hệ thống tạo máu với đặc trưng bởi sự tăng sinh và tích tụ tế bào non trong máu và tủy xương. Bạch cầu cấp được chia thành 2 nhóm là bạch cầu cấp dòng tủy và bạch cầu cấp dòng lympho. Bạch cầu cấp dòng tủy là kết quả của sự tích lũy tế bào non bất thường trong tủy xương. Bạch cầu cấp dòng lympho là bệnh tăng sinh ác tính trong quá trình tạo máu dòng lympho. Những tế bào này lấn át sự sinh máu bình thường trong tủy xương, chúng có thể thoát ra ngoài máu ngoại vi và thâm nhiễm vào các cơ quan nội tạng [23]. Bệnh có các hội chứng: Thiếu máu, xuất huyết, nhiễm trùng và dẫn tới tử vong nếu không được phát hiện và điều trị kịp thời. Vì vậy, việc xác định chính xác thể bệnh cũng như dòng tế bào bị ung thư có vai trò quyết định trong điều trị. Hiện nay, việc phân loại dòng tế bào và thể bệnh bạch cầu cấp dựa trên một trong hai tiêu chuẩn là FAB và WHO. Tiêu chuẩn FAB do các nhà Huyết học PhápAnhMỹ đưa ra năm 1976 là tổng hợp kết quả hình thái học và hóa học tế bào, năm 1986 tiêu chuẩn này đã bổ sung thêm kết quả miễn dịch và di truyền [15, 17]. Nhuộm hóa học tế bào gồm 8 kỹ thuật: PeriodicAcid Schiff (PAS), sudan black (SD), peroxidaza (PER), esteraza đặc hiệu, esteraza không đặc hiệu ức chế bằng NaF và không ức chế, photphataza kiềm và axit. Ưu điểm của phương pháp nhuộm hóa học tế bào: Rẻ tiền, giá thành chỉ bằng 1/4 so với phương pháp miễn dịch và bằng 1/10 so với phương pháp di truyền, không cần máy móc hiện đại, dễ triển khai. Hiện nay, các bộ kít nhuộm có bán trên thị trường là các kít đơn, giá thành cao và có những nhược điểm: kỹ thuật nhuộm nằm nên có nhiều cặn, quy trình nhuộm khác nhau về thời gian, số bước nhuộm, hóa chất cố định khác nhau, bước tẩy màu của kỹ thuật nhuộm Sudan và Periodic Acid Schiff khó đồng nhất, nhuộm nền thiếu tương phản, chất màu dễ hòa tan trong dầu soi kính nên khó hội chẩn tiêu bản nhiều lần. Tại Việt Nam, các thuốc thử hầu hết là tự 6
pha kết hợp với các yếu điểm trên nên độ nhạy, độ đặc hiệu còn thấp. Theo Trần Ngọc Vũ và cộng sự (2014) tỷ lệ phù hợp chẩn đoán giữa hình thái họchóa học tế bào và miễn dịch là 89,1%, giá trị dự báo đối với bệnh bạch cầu cấp dòng lympho là 88,88% và độ đặc hiệu là 73,77% [25]. Theo tác giả Nguyễn Hữu Toàn thì việc phân loại dòng tế bào theo tiêu chuẩn FAB dựa trên phương pháp nhuộm hóa học vẫn cần phải có sự điều chỉnh tới 29,7% nhờ vào kỹ thuật miễn dịch và di truyền [19]. Hiên nay, tác gi ̣ ả Trần Văn Tính, Trung tâm Huyết học Truyền máu, Bộ Công an đã nghiên cứu và chế tạo thành công kít nhuộm hóa học tế bào đồng bộ HICYTEC gồm 10 kỹ thuật: Giemsa, PeriodicAxit Schiff (PAS), Peroxidaza, Sudan B, Esteraza đặc hiệu, Esteraza không đặc hiệu, Esteraza không đặc hiệu ức chế bằng NaF, Photphataza kiềm, Photphataza axit, Perls. Bộ kít đã cơ bản khắc phục được các yếu điểm ở trên . Nhằm đánh giá giá trị sử dụng của bộ kít, tiến tới có thể thay thế hàng nhập ngoại, đề tài “Ứng dụng bộ kít nhuộm hóa học tế bào để phân loại bệnh bạch cầu cấp theo tiêu chuẩn FAB” là đề tài có ý nghĩa khoa học, thực tiễn, kinh tế xã hội cấp thiết. Mục tiêu của đề tài là: Đánh giá sự phù hợp của bộ kít nhuộm hóa học tế bào trong phân loại dòng tế bào so với phương pháp hình thái học, miễn dịch học và di truyền trên những bệnh nhân bạch cầu cấp đã được chẩn đoán thể bệnh theo tiêu chuẩn FAB (1986). Nội dung nghiên cứu: Thống kê đặc điểm bệnh bạch cầu cấp trên các bệnh nhân được chọc tủy lần đầu tại Viện Huyết họcTruyền máu trung ương. Đánh giá tính phù hợp của phương pháp nhuộm hóa học tế bào đồng bộ HICYTEC 10 kỹ thuật so với phương pháp hình thái học, miễn dịch và di truyền trên các bệnh nhân đã được chẩn đoán thể bệnh theo tiêu chuẩn FAB. 7
Đánh giá giá trị của kít nhuộm hóa học tế bào đồng bộ HICYTEC, khi nhuộm photphataza kiềm, nhuộm photphataza axit bạch cầu, nhuộm Perls trên bệnh nhân bạch cầu cấp. 8
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Quá trình sinh máu 1.1.1. Cơ quan sinh máu Cơ quan tạo máu bao gồm: tủy xương, tổ chức lympho (lách, hạch, tuyến ức) và tổ chức võng mô. Thời kì phôi thai, cơ quan tạo máu gồm có gan, lách, hạch. Sau khi sinh, quá trình tạo máu (hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu) chỉ xảy ra ở tủy đỏ của các xương. Đến tuổi trưởng thành, quá trình sinh máu chỉ còn diễn ra tại đầu các xương dẹt, đầu xương đùi, xương cánh tay và một vài khu vực sinh máu ngoài tủy biệt hóa các dòng lympho T và B [6]. 1.1.2. Quá trình sinh máu Hiện nay nhiều công trình đã chứng minh, các dòng tế bào máu được sinh ra từ tế bào gốc vạn năng. Quá trình biệt hóa qua nhiều giai đoạn và tùy theo sự kích thích đặc hiệu mà tế bào gốc vạn năng biệt hóa để tạo thành những tế bào có chức năng cần thiết [11]. Ba kích thích tố chính tạo máu gồm: Erythropoietin tạo hồng cầu, thrombopoietin tạo tiểu cầu và colonystimulating factors cùng với interleukin (IL) kích thích tạo bạch cầu. Quá trình sinh máu được điều hòa bởi yếu tố di truyền đặc biệt là các tế bào bị chết theo chương trình [13]. 1.2. Bệnh bạch cầu cấp 1.2.1. Khái niệm chung Bệnh bạch cầu cấp là tình trạng bệnh lý cấp tính của tế bào sinh máu với đặc điểm chính là tăng số lượng bạch cầu bất thường ở cả trong tủy xương và ở ngoài máu ngoại vi, tủy xương có trên 30% tế bào non (blast) trong tổng số tế bào có nhân, phá hủy quá trình sinh máu bình thường trong tủy và xâm nhiễm vào các cơ quan [12]. 1.2.2. Dịch tễ học Theo công bố của Rebecca Siegel MPH và cộng sự (2015) trong năm 2014, ở Mỹ ghi nhận 6.250 ca mắc mới bệnh bạch cầu cấp dòng lympho. Tỷ lệ 9
nam (3.100) và nữ (3.150) gần bằng nhau, số tử vong gây ra bởi bệnh này là 1.450 người [52]; Tại Mỹ, hàng năm xuất hiện mới khoảng 2,2 trường hợp bạch cầu cấp dòng tủy trên 100.000 dân và có khoảng 3.000 trường hợp bạch cầu cấp dòng lympho mới trên toàn quốc [44]; Tại Việt Nam, tuy chưa có nghiên cứu nào tiến hành đầy đủ về dịch tễ học của bệnh bạch cầu cấp trên toàn quốc nhưng theo tổng kết tại Viện Huyết họcTruyền máu, Bệnh viện Bạch Mai thì thấy bệnh bạch cầu cấp gặp tỷ lệ cao nhất (32.1%) trong số các bệnh máu đến khám và điều trị tại Bệnh viện Bạch Mai [7]. 1.2.3.Các nguyên nhân gây bệnh Cho tới nay nguyên nhân gây bệnh chưa được sáng tỏ. Tuy nhiên qua nhiều nghiên cứu cho thấy có nhiều yếu tố liên quan tới phát sinh bệnh: Tia xạ: Những người tiếp xúc nhiều với tia ion hóa hay tia xạ thường có nguy cơ bị bạch cầu cấp; Hóa chất: Những người nhiễm mạn tính benzen hay sử dụng hóa chất để chữa bệnh ác tính dễ mắc bệnh bạch cầu cấp; Virus: Human Tcell lymphotropic virus gây bạch cầu cấp dòng lympho, EpsteinBarr virus (EBV) gây ung thư vòm... Yếu tố di truyền: Những bệnh nhân bị một số bệnh di truyền như hội chứng Down, hội chứng Bloom, thiếu máu Fanconi có nguy cơ cao bị bạch cầu cấp [12]. 1.2.4. Cơ chế bệnh sinh Sự hoạt động của các gen ung thư (oncogene): Các gen bình thường do yếu tố nào đó tác động trở thành các gen bất thường gây ung thư gọi là gen ung thư. Sản phẩm của các gen ung thư là các protein bất thường, có hoạt tính mạnh, gây rối loạn quá trình sinh sản và biệt hóa của tế bào; 10
Gen ức chế ung thư: Các công trình nghiên cứu gần đây đã chứng minh được trong tế bào bình thường có những gen kiểm soát sự tăng sinh, nếu mất các gen này sẽ dẫn đến mất kiểm soát phân chia tế bào, gây ra u; Hoạt hóa các oncogen trong bệnh bạch cầu cấp: Một số gen hoạt hóa và kích thích tăng sinh tế bào. Khi các gen này được giải phóng và kết hợp với gen ức chế bị kìm hãm sẽ làm tăng trưởng mạnh sự phát triển khối u và làm các tế bào bình thường trở thành ác tính [2, 21, 37]. Một số biến đổi gen thường gặp trong bạch cầu cấp dòng lympho được thể hiện trên Bảng 1.1 [10]. Bang 1.. ̉ Biến đổi di truyền và tiên lượng trong bạch cầu cấp dòng lympho. Tiên lượng Loại bất thường Tốt Trên lưỡng bội: >50 NST; Chuyển đoạn t(12;21) Trên lưỡng bội từ 4750 NST; 46XX/XY (bộ NST bình Trung bình thường); Chuyển đoạn t(1;19) Thiểu bội, mất NST; Chuyển đoạn t(9;22); Chuyển đoạn Xấu t(11q23), t(4;11); Chuyển đoạn t(5;14). 1.2.5. Phân loại Xếp loại bạch cầu cấp dòng tủy: Trong Bảng xếp loại bạch cầu cấp dòng tủy theo FAB 1976. Bạch cầu cấp dòng tủy được chia làm các thể từ M1 đến M7: Thể M1: lơ xê mi cấp nguyên tủy bào kém biệt hóa; Thể M2: lơ xê mi cấp nguyên tủy bào biệt hóa; Thể M3: lơ xê mi cấp tiền tủy bào tăng hạt đặc hiệu và chia làm 2 nhóm: M3h: chứa các hạt đặc hiệu lớn; M3v: chứa các hạt đặc hiệu nhỏ. Thể M4: lơ xê mi cấp hỗn hợp chia làm 2 nhóm: M4: lơ xê mi cấp tủy mono; 11
M4eo: lơ xê mi cấp tủy mono có tăng bạch cầu ái toan. Thể M5: lơ xê mi cấp dòng mono: M5a: ≥80% tế bào mono là monoblast; M5b:
Hội chứng thiếu máu: xảy ra nhanh, nặng dần với các biểu hiện da xanh, mệt mỏi, hoa mắt chóng mặt, nhịp tim nhanh. Thường không cân xứng với tình trạng xuất huyết; Hội chứng xuất huyết: xuất huyết tự nhiên, hay ở da niêm mạc (chấm nột đám mảng xuất huyết, chảy máu mũi, chảy máu chân răng...) có thể ở các tạng (xuất huyết đường tiêu hoá, tiết niệu, tử cung, não màng não...); Hội chứng nhiễm trùng: Sốt, viêm loét miệng họng, viêm phổi, nhiễm trùng da; Hội chứng thâm nhiễm: Gan to, lách to, hạch to, phì đại lợi , thâm nhiễm da, đau xương, cơ khớp... Toàn trạng chung: mệt mỏi gầy sút, suy sụp nhanh. 1.2.7. Đặc điểm xét nghiệm Huyết đồ: Thiếu máu bình sắc, hồng cầu bình thường, hồng cầu lưới giảm; Bạch cầu: số lượng bạch cầu thường tăng, nhưng có thể bình thường hoặc giảm. Công thức bạch cầu thường gặp một tỷ lệ tế bào blast. Tuy nhiên một số trường hợp số lượng bạch cầu giảm nặng có thể không gặp tế bào blast ở máu ngoại vi; Tiểu cầu: số lượng giảm. Tuỷ đồ: Số lượng tế bào tuỷ: thường tăng, tủy giàu tế bào. Trong một số trường hợp tủy nghèo hoặc có mật độ bình thường; Tăng sinh tế bào blast trên 30% tế bào có nhân trong tuỷ xương; Các dòng hồng cầu, bạch cầu hạt và mẫu tiểu cầu bị lấn át. Sinh thiết tuỷ xương: Chỉ định khi chọc hút tuỷ nghèo tế bào. Các khoang sinh máu có nhiều tế bào ác tính, có thể có tình trạng xơ. 13
Nhuộm hoá học tế bào: Sử dụng hóa chất nhuộm một số enzym và các chất có trong tế bào, qua đó xác định được dòng tế bào, kết hợp với kết quả hình thái học trên tiêu bản nhuộm giemsa có thể phân loại thể bệnh bạch cầu cấp theo tiêu chuẩn FAB. Xét nghiệm miễn dịch: Bằng kỹ thuật miễn dịch phát hiện các kháng nguyên dấu ấn trên màng các tế bào blast (CDCluster of Differentiation) và đối chiếu với sự xuất hiện các CD này trong quá trình biệt hóa và trưởng thành tế bào máu bình thường để biết bản chất dòng và giai đoạn biệt hóa của tế bào trong bệnh bạch cầu cấp. Nhóm dấu ấn CD thay đổi trong quá trình biệt hóa bạch cầu dòng t ủy: Các tế bào non thuộc dòng tủy sẽ phản ứng dương tính với các kháng nguyên CD33 hoặc CD14. Nhóm dấu ấn CD thay đổi trong quá trình biệt hóa bạch cầu lympho B: Tế bào nguồn đầu dòng B: CD10, CD19; Tế bào tiền lympho B: CD10, CD19, CD20; Lympho B trưởng thành: CD19, CD20, CD21, CD22, CD23; Tương bào: CD38. Nhóm dấu ấn CD thay đổi trong quá trình biệt hóa bạch cầu lympho T: Tế bào nguồn đầu dòng T: TdT, HLA; Tế bào tiền lympho T: TdT, CD7, CD2, CD3; Tế bào lympho T4: CD2, CD3, CD4; Tế bào lympho T8: CD2, CD3, CD8. Xét nghiệm về di truyền NST: Xét nghiệm di truyền thường được dùng để chẩn đoán và tiên lượng bệnh. Có một số bất thường nhiễm sắc thể phổ biến trong một số thể bạch cầu cấp (chuyển đoạn, đảo đoạn,…), cụ thể như sau: t(8;12) trong bạch cầu cấp M2; 14
t(15;17) trong bạch cầu cấp M3; Inversion (inv) 16 trong bạch cầu cấp M4Eo; t(9;22) trong bạch cầu cấp dòng lympho. 1.3. Tình hình nghiên cứu trên thế giới về nhuộm hóa học tế bào Nhuộm hóa học tế bào từ lâu đã trở thành đối tượng được các nhà khoa học tập trung nghiên cứu phát triển các kỹ thuật nhằm phát hiện các enzym cũng như các chất chuyển hóa có trong nội bào tế bào. Năm 1885, Ehrlich là người đầu tiên nhuộm enzym cytochrom oxidaza trong các mô tươi bằng phản ứng "Nadi" giữa naphtol và dimethylpphenylethylendiamine và có thể quan sát được trên kính hiển vi. Neukirch (1910) giới thiệu kỹ thuật nhuộm phát hiện các glycogen trong các bạch cầu trung tính bằng phẩm màu carmin theo phương pháp Best [ 31, 40]. Năm 1947, Bailllif và Kimbrough ứng dụng dùng Sudan B nhuộm hạt mỡ bạch cầu để phân biệt dòng tuỷ và các dòng khác [31, 40]. Đầu những năm 50 của thế kỷ XX, sự phát triển mạnh mẽ của các loại phẩm màu azo đã giúp các nhà nghiên cứu đưa các tiến bộ trong ngành hóa màu vào ứng dụng nhuộm hóa học tế bào [30, 32, 51]. Năm 1953, Gomori là người đầu tiên phát triển kỹ thuật nhuộm esteraza đặc hiệu bạch cầu người sử dụng naphtol ASD cloaxetat làm cơ chất [55]. Việc phối hợp với các công nghệ khác như kỹ thuật kháng thể đơn dòng và các phương pháp phân tích dòng chảy đã cho phép tự động hóa đạt kết quả tin cậy cao [45]. Phương pháp hình thái họcnhuộm hóa học tế bào cùng với miễn dịch và di truyền được ứng dụng rộng rãi trong chuyên ngành Huyết học để phân loại thể bệnh bạch cầu cấp theo tiêu chuẩn FAB và tiêu chuẩn WHO [28, 32, 34, 49]. Hiện nay, trên thế giới thường sử dụng phổ biến 8 kỹ thuật nhuộm hóa học tế bào như sau: 1.3.1. Kỹ thuật nhuộm PeriodicAxit Schiff (PAS) Phương pháp dựa trên nguyên lý của phản ứng hóa học gồm hai giai đoạn: Giai đoạn 1: Axit periodic oxi hóa glycogen trong tế bào thành diandehit theo hình 1.1: 15
12 Glycol Diandehit Hình 1.. Glycogen bị oxi hóa bởi axit periodic thành diandehit Ghi chú: R1, R2 là các gốc: amin (RNH2) hoặc alkyl amino thế (RNHR') Giai đoạn 2: Diandehit tạo thành tham gia vào phản ứng nhuộm hoàn nguyên bằng thuốc thử Schiff thể hiện trên hình 1.2: Thuốc thử Schiff Phẩm màu quinoit Hình 1.. Diandehit tác dụng với thuốc thử Schiff tạo phẩm màu Quinoit Như vậy, về mặt bản chất đây là một phản ứng nhuộm hoàn nguyên nhằm bộc lộ glycogen có trong nguyên sinh chất của tế bào. Kết quả dương tính khi có màu đỏ trên nguyên sinh chất của tế bào nghĩa là có glycogen và ngược lại. Phản ứng PAS thường dương tính đối với bạch cầu ung thư dòng lympho, tế bào càng trưởng thành thì mức độ dương tính càng mạnh. Các tế bào monoxit và lymphoxít bình thường có độ dương tính rất thấp. Các dòng tế bào khác như dòng tủy, mẫu tiểu cầu, tiểu cầu, tương bào dương tính dạng lan tỏa, còn tế bào bạch cầu ưa axit, bazơ và dòng hồng cầu thì gần như âm tính. Những tính chất khác nhau đó là cơ sở của kỹ thuật nhuộm hóa học bạch cầu để phân biệt các dòng tế bào và xếp loai th ̣ ể bệnh bạch cầu cấp theo tiêu chuẩn FAB [27, 28]. 1.3.2. Kỹ thuật nhuộm peroxidaza (PER) Cơ chế của phản ứng nhuộm peroxidaza đi qua hai giai đoạn thể hiện trên hình 1.3 và 1.4 [29, 46]: H2 O2 H2O + O: Hình 1.3. H2O2 bị khử do xúc tác của peroxidaza tạo oxi nguyên tử Benzidin Diimin diphenyl 16
Hình 1.4. Oxi nguyên tử ôxi hóa benzidin thành diimin diphenyl. Dưới xúc tác của peroxidaza là một enzym oxi hóa khử, nước ôxi già bị khử thành nước và oxi nguyên tử, oxi nguyên tử có tính oxi hóa mạnh đã oxi hóa benzidin thành 2diimin diphenyl có màu vàng nâu. Nếu trên nguyên sinh chất của tế bào có màu vàng nâu chứng tỏ có mặt của peroxidaza. Peroxidaza dương tính đối với các tế bào dòng tủy, dương tính nhẹ với dòng mono; âm tính với dòng lymphoxít, dòng hồng cầu và tiểu cầu. 1.3.3. Kỹ thuật nhuộm sudan B Cơ chế của các phản ứng nhuộm rất khác nhau gồm khuếch tán vật lí đơn thuần hoặc liên kết hóa học trực tiếp. Trong các loại thuốc nhuộm, sudan là một nhóm phẩm nhuộm đượ c ưa chuộng nhuộm lipit từ vàng (Sudan III) đến đen (Sudan B). Đối với máu ngoại vi, phản ứng nhuộm sudan B cho kết quả bạch cầu hạt dương tính mạnh, monoxit dương tính yếu, lymphoxit và hồng cầu âm tính. Trong tủy xương bình thường, các tế bào dòng tủy dương tính từ tiền tủy bào đến tế bào trưởng thành, dòng mono chỉ dương tính ở các tế bào trưởng thành; mẫu tiểu cầu và tiểu cầu âm tính. Trong nhiều trường hợp của bệnh bạch cầu cấp có thể phân biệt tương đối rõ dòng tủy và các dòng tế bào khác bằng kết quả nhuộm Sudan B. Kết quả dương tính Sudan B của mẫu bệnh phẩm thường cũng cho kết quả dương tính với kỹ thuật nhuộm Peroxidaza. Chính vì vậy kết quả nhuộm Sudan B là một trong những tiêu chuẩn được ứng dụng phân loại thể bệnh trong bệnh bạch cầu cấp theo tiêu chuẩn FAB [28]. 1.3.4. Kỹ thuật nhuộm esteraza a) Nhuộm esteraza đặc hiệu [54] Cơ chế phản ứng nhuộm esteraza đặc hiệu gồm hai giai đoạn: 17
Giai đoạn 1: Esteraza bạch cầu người thủy phân cơ chất là các este tạo thành dẫn xuất của naphtol như hình 1.5: Naphtol ASD Cloaxetat Naphtol ASD Hình 1.5. Thủy phân cơ chất este thành naphtol Giai đoạn 2: dẫn xuất naphtol tác dụng với muối điazo tạo thành chất màu azo theo hình 1.6 Hình 1.6. Naphtol tác dụng với muối điazo thành phẩm màu azo Cơ chất nhuộm esteraza đặc hiệu gồm nhiều loại: naphtol ASD cloaxetat, Naphtol ASOL 2clopropionat... Trong giai đoạn 1, phân tử cơ chất dưới xúc tác của enzym tạo thành napthol theo cơ chế của hình 1. 5 và 1.6. Giai đoạn 2 là giai đoạn ghép đôi giữa naphtol và muối điazo. Về mặt bản chất đây là phản ứng thế electrophin của nhóm azo cho nguyên tử proton ở nguyên tử cacbon C 4 trên vòng naphtol. Tùy theo loại muối điazo mà phẩm màu azo có màu đỏ hoặc màu đen. Nếu xuất hiện màu trên nguyên sinh chất của tế bào có nghĩa là có esteraza. Tốc độ của quá trình nhuộm màu phụ thuộc vào nhiều yếu tố như nồng độ cơ chất, muối điazo, thành phần dung môi, nhiệt độ và pH môi trường... các hóa chất sử dụng luôn đòi hỏi độ tinh khiết cao, giá thành đắt [3, 14, 40, 47, 55]. 18
b) Kỹ thuật nhuộm esteraza không đặc hiệu ức chế và không ức chế bằng NaF Nhuộm phát hiện esteraza không đặc hiệu bạch cầu người lần đầu tiên được công bố vào năm 1959 bởi Braunstein. Esteraza không đặc hiệu dương tính trong tất cả các dòng tế bào máu vì thế nên được gọi là không đặc hiệu. Cơ chế phản ứng thủy phân dựa trên cơ chế hình thành phẩm màu azo giống như nhuộm esteraza đặc hiệu (hình 1.4, 1.5 và 1.6). Cơ chất thường sử dụng là naphtol AS axetat, naphtyl axetat, naphtyl butyrat và naphtol ASD axetat. Chất ghép đôi thường sử dụng là muối điazo và tùy theo loại muối điazo mà phẩm màu azo có phổ màu khác nhau từ đen đến đỏ. Các cơ chất cua ̉ naphtyl axetat, naphtyl butyrat thường cho phản ứng dương tính mạnh đối với dòng mono, dòng tiểu cầu; các dòng khác lên màu dưới dạng hạt và yếu. Riêng tế bào lymphoxít B cho kết quả âm tính. Đối với cơ chất naphtol ASD axetat và naphtol AS Axetat thì dương tính mạnh ở tất cả các dòng trừ dòng tế bào lymphoxit B. Tuy có mức độ dương tính khác nhau nhưng chỉ có dòng mono bị ức chế bởi NaF với nồng độ 1,5 mg/1 ml. Chính nhờ tính chất này mà kỹ thuật nhuộm với chất ức chế NaF thường dùng để phân biệt dòng mono với các dòng tế bào khác trong bệnh bạch cầu cấp và là tiêu chuẩn để phân loại dòng tế bào theo tiêu chuẩn FAB [27, 28]. 1.3.5. Kỹ thuật nhuộm photphataza Photphataza bạch cầu thuộc nhóm Hidrolaza (EC 3.1.3.2) là một enzym xúc tác cho phản ứng thủy phân nhóm photphat từ nhiều loại phân tử, bao gồm các nucleotide, protein, và ancaloit [3, 30]. Photphataza có mặt chủ yếu trong lysosom và được giải phóng qua hệ thống lưới nội nguyên sinh chất. Photphataza là một hệ enzym không đồng nhất gồm nhiều iso enzym có thể hoạt động ở pH tối ưu khác nhau và được gọi tên gắn liền với điều kiện pH hoạt động tối ưu như: photphataza kiềm (pH=89), photphataza axit (pH=56,5) [35, 38]. Trong các phương pháp nhuộm hóa học tế 19
bào có hai kỹ thuật nhuộm photphataza là: Kỹ thuật nhuộm photphataza kiềm và photphataza axit Với sự phát triển mạnh của kỹ thuật hóa màu đặc biệt là phát hiện phẩm màu azo đã được ứng dụng vào để nhuộm photphataza kiềm và axit. Nguyên lý của kỹ thuật đi qua hai giai đoạn [40, 43]. Giai đoạn 1: Thủy phân cơ chất naphtyl photphat thành các naphtol tương ứng dưới sự xúc tác của photphataza kiềm (ALP) hoặc axít (AP) theo hình 1.7: Natri naphtyl photphate Naphtyl Hình 1.7. Thủy phân naphtyl photphat thành naphtol. Giai đoạn 2: Naphtol tác dụng với muối điazo tạo thành chất màu azo theo hình 1.6 như ở phần nhuộm esteraza. Photphataza kiềm bạch cầu dương tính đối với dòng tủy từ hậu tủy bào đến bạch cầu hạt. Tế bào càng trưởng thành thì mức độ dương tính càng mạnh. Ngoài ra các tế bào tạo cốt bào cũng cho phản ứng dương tính trong kỹ thuật nhuộm này. Trong bệnh bạch cầu kinh, hoạt tính của photphataza kiềm bạch cầu giảm trong bệnh thiếu máu do tan máu; hoạt tính của photphataza kiềm bạch cầu tăng trong các bệnh nhiễm khuẩn cấp, lách to sinh tủy, phản ứng giả bạch cầu [3, 25, 30, 40, 43]. Photphataza axit dương tính mạnh trong bệnh bạch cầu cấp dòng lympho loại tế bào B, tế bào liên võng, hủy cốt bào và các nguyên mẫu tiểu cầu. Dòng hồng cầu, mono, lympho (trừ bệnh bạch cầu tế bào tóc tế bào B hay còn gọi là Hairy cell) và dòng tủy từ nguyên tủy bào đến tiền tủy bào cho kết quả âm tính [40, 56]. 1.4. Ứng dụng phương pháp nhuộm hóa học tế bào trong y học Nhuộm hóa học tế bào được ứng dụng rộng rãi trong y học, nghiên cứu sinh học và đặc biệt trong chuyên ngành Huyết họcTruyền máu. Trong bệnh bạch cầu cấp, kết quả của phương pháp hình thái họcnhuộm hóa học tế bào, phương pháp marker và di truyền là tiêu chuẩn để phân loại dòng tế bào bệnh bạch cầu 20