Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Ứng dụng kỹ thuật di truyền nhằm tăng khả năng sinh tổng hợp rapamycin của Streptomyces rapamycinicus

Chia sẻ: Trương Yến | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:65

Thêm vào BST

Báo xấu

70
lượt xem 5
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Ứng dụng kỹ thuật di truyền nhằm tăng khả năng sinh tổng hợp rapamycin của Streptomyces rapamycinicus được thực hiện với mục tiêu nhằm tạo chủng xạ khuẩn Streptomyces rapamycinicus đột biến có khả năng sinh lượng rapamycin cao hơn chủng xạ khuẩn hoang dại, tối ưu hóa môi trường nuôi cấy để thu lượng rapamycin lớn nhất. Mời các bạn cùng tham khảo.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Ứng dụng kỹ thuật di truyền nhằm tăng khả năng sinh tổng hợp rapamycin của Streptomyces rapamycinicus

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------- LÃ THỊ HƯƠNG HUYỀN ỨNG DỤNG KỸ THUẬT DI TRUYỀN NHẰM TĂNG KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP RAPAMYCIN CỦA STREPTOMYCES RAPAMYCINICUS LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – Năm 2020
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------- LÃ THỊ HƯƠNG HUYỀN ỨNG DỤNG KỸ THUẬT DI TRUYỀN NHẰM TĂNG KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP RAPAMYCIN CỦA STREPTOMYCES RAPAMYCINICUS Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 8420101.07 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. NGUYỄN HỒNG MINH TS. PHẠM THẾ HẢI Hà Nội – Năm 2020
LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Hồng Minh, Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học, Đại học Quốc Gia Hà Nội đã trực tiếp hướng dẫn em rất tận tình trong cả quá trình thực hiện đề tài và động viên, quan tâm, giúp đỡ em vượt qua khó khăn để hoàn thành tốt luận văn này. Em xin cảm ơn tới TS. Phạm Thế Hải – Bộ môn Vi sinh vật học, Khoa Sinh học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã chỉ bảo, giúp đỡ để em có thể làm tốt công việc và hoàn thành đề tài. Em xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô giáo trong Khoa Sinh học, trường Đại Học Khoa học Tự nhiên đã nhiệt tình giảng dạy, hướng dẫn và cung cấp cho em những kiến thức bổ ích trong suốt hai năm học vừa qua và giúp đỡ em rất nhiều trong việc nắm bắt kiến thức cũng như động viên em rất lớn về mặt tinh thần. Em cũng xin cảm ơn Ban lãnh đạo, các anh chị em Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học, Đại học Quốc Gia Hà Nội đã luôn chia sẻ, giúp đỡ và tạo điều kiện rất lớn trong suốt quá trình em thực hiện luận văn. Em xin cảm ơn TS. Vittorio Venturi và Th.S Iris Bertani, Trung tâm Quốc tế về Kỹ thuật di truyền và Công nghệ sinh học, Ý đã giúp đỡ em trong thực hiện thí nghiệm lai Southern Blot. Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình và tất cả bạn bè, những người đã luôn ở bên động viên, giúp đỡ em trong suốt thời gian học tập và thực hiện luận văn. Hà Nội, ngày 05 tháng 02 năm 2020 Học viên Lã Thị Hương Huyền
MỤC LỤC MỞ ĐẦU .....................................................................................................................1 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU........................................................................................3 Chương 1 - TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU ...............................................4 1.1. Xạ khuẩn ........................................................................................................4 1.1.1. Giới thiệu chung về xạ khuẩn ......................................................................4 1.1.2. Ứng dụng của xạ khuẩn ...............................................................................5 1.1.3. Vai trò của xạ khuẩn trong sản xuất các chất trong y học ...........................6 1.1.4. Streptomyces rapamycinicus........................................................................9 1.2. Rapamycin ...................................................................................................10 1.2.1. Tính chất và cấu trúc hóa học ....................................................................10 1.2.2. Vai trò của rapamycin trong đáp ứng miễn dịch .......................................10 1.2.3. Sinh tổng hợp rapamycin và cơ chế điều hòa ............................................11 1.3. Kỹ thuật di truyền ........................................................................................13 1.3.1. Giới thiệu chung ........................................................................................13 1.3.2. Một số phương pháp thường sử dụng trong kỹ thuật di truyền .................14 1.3.3. Ứng dụng ...................................................................................................14 1.4. Tình hình nghiên cứu tăng hiệu suất tổng hợp rapamycin ...........................15 1.4.1. Các nghiên cứu nhằm tối ưu điều kiện nuôi cấy chủng xạ khuẩn .............15 1.4.2. Các nghiên cứu tạo chủng xạ khuẩn đột biến làm tăng lượng rapamycin .18 Chương 2 - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...............................20 2.1. Vật liệu .........................................................................................................20 2.1.1. Chủng vi sinh vật và môi trường nuôi cấy .................................................20 2.1.2. Vector và oligonucleotide ..........................................................................21 2.1.3. Hóa chất và thiết bị ....................................................................................22 2.2. Phương pháp nghiên cứu .............................................................................22 2.2.1. Phương pháp nghiên cứu chung ................................................................22 2.2.2. Phương pháp tách ADN .............................................................................24 2.2.3. Phương pháp biến nạp ...............................................................................25
2.2.4. Phương pháp tạo dòng vector pSET152/ rapG .........................................26 2.2.5. Phương pháp tiếp hợp ................................................................................27 2.2.5. Phương pháp sàng lọc chủng xạ khuẩn chuyển gen ..................................28 2.2.6. Phương pháp đánh giá hoạt tính rapamycin ..............................................30 Chương 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...............................................................33 3.1. Tạo dòng vector pSET 152/rapG ..................................................................33 3.2. Tạo chủng Streptomyces rapamycinicus chuyển gen ....................................37 3.2.1. Sàng lọc chủng xạ khuẩn chuyển gen trên môi trường chọn lọc ................37 3.2.2. Kiểm tra chủng xạ khuẩn chuyển gen bằng phương pháp lai Southern Blot 38 3.3. Tối ưu hóa điều kiện sinh rapamycin ............................................................39 3.3.1. Ảnh hưởng của axit shikimic đến khả năng sinh rapamycin ......................42 3.3.2. Ảnh hưởng của glycerol đến khả năng sinh rapamycin .............................44 3.3.3. Ảnh hưởng của hàm lượng axit shikimic đến khả năng sinh rapamycin ...46 KẾT LUẬN ...............................................................................................................48 TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................................50 PHỤ LỤC ..................................................................................................................56
DANH MỤC HÌNH Chương 1 Hình 1.1. Streptomyces rapamycinicus trên môi trường thạch ISP2 . ........................9 Hình 1.2. Cấu trúc rapamycin ..................................................................................10 Hình 1.3. Con đường sinh tổng hợp rapamycin ........................................................12 Chương 2 Hình 2.1. Phương pháp tạo chủng đột biến ...............................................................23 Hình 2.2. Phương pháp định lượng khả năng sinh rapamycin ..................................23 Hình 2.3. Sơ đồ thiết kế vector pSET152/rapG ........................................................26 Hình 2.4. Chuyển ADN biến tính lên màng ..............................................................30 Chương 3 Hình 3.1. Sản phẩm PCR gen rapG trên agarose......................................................33 Hình 3.2. Các khuẩn lạc xanh-trắng mang vector pGEM/rapG ...............................34 Hình 3.3. Sản phẩm PCR bằng mồi M13F và M13R các khuẩn lạc trắng ...............34 Hình 3.4. Sản phẩm cắt plasmid pGEM/rapG (A) và pSET152 (B) ........................35 Hình 3.5. (A) Ảnh chụp khuẩn lạc trắng mang vector pSET152/rapG và khuẩn lạc xanh mang vector pSET 152 đóng vòng trên môi trường thạch LB/apramycin/X-gal. (B) Sản phẩm PCR vùng liên gen của 04 khuẩn lạc trắng ........................................36 Hình 3.6. Sản phẩm cắt plasmid pSET152/rapG ......................................................37 Hình 3.7. Khuẩn lạc chủng xạ khuẩn chuyển gen trên môi trường có kháng sinh ...38 Hình 3.8. ADN tổng số trên bản gel sau khi điện di .................................................38 Hình 3.9. Kết quả lai Southern blot của các chủng xạ khuẩn chuyển gen ................39 Hình 3.10. Đường chuẩn rapamycin .........................................................................40 Hình 3.11. Vòng kháng nấm C. albicans của các chủng xạ khuẩn WT và WT/rapG trong các môi trường nuôi cấy khác nhau .................................................................41 Hình 3.12. Biểu đồ thể hiện lượng rapamycin thu được trong môi trường gốc........41 Hình 3.13. Biểu đồ thể hiện lượng rapamycin thu được trong môi trường bổ sung acid shikimic .............................................................................................................43
Hình 3.14. Biểu đồ thể hiện lượng rapamycin thu được trong môi trường bổ sung Glycerol .....................................................................................................................45 Hình 3.15. Biểu đồ thể hiện lượng rapamycin thu được trong môi trường bổ sung lượng axit shikimic khác nhau ..................................................................................47
DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1. Các môi trường nuôi cấy vi sinh vật .........................................................20 Bảng 2.2. Trình tự các oligonucleotide sử dụng trong nghiên cứu ...........................21 Bảng 2. 3. Tỉ lệ hai pha dung môi qua cột HPLC .....................................................31 Bảng 3.1. Các giá trị dựng đường chuẩn rapamycin .................................................40
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ADN : axit deoxyribonucleic DHCHC : 4,5- dihydroxycyclohex- 1- ene carboxylic acid HPLC: hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao IPTG : Isopropyl β- D- 1- thiogalactopyranoside PCR: Phản ứng khuếch đại gen X-gal : 5- bromo- 4- chloro- 3- indodyl- β- galactosidase WT: chủng xạ khuẩn Streptomyces rapamycinicus hoang dại WT/rapG: chủng xạ khuẩn Streptomyces rapamycinicus mang hai bản sao gen rapG
MỞ ĐẦU Xạ khuẩn là nhóm vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp nhiều chất chuyển hóa thứ cấp khác nhau, đặc biệt là các chất có hoạt tính sinh học như chất kháng khuẩn, kháng nấm, kháng virus, chống ung thư, ức chế miễn dịch hoặc enzyme. Đến nay, có khoảng 23000 chất chuyển hóa thứ cấp có hoạt tính sinh học đã được tìm thấy và có 10000 hoạt chất thu được từ xạ khuẩn. Trong đó, các chất chuyển hóa thứ cấp từ các loài xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces chiếm 68%, còn lại thuộc nhóm xạ khuẩn hiếm- non-Streptomyces. Streptomyces rapamycinicus là loài xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces, trước đây được định danh là Streptomyces hygroscopicus, được phân lập từ mẫu đất trên đảo Phục Sinh, Chile. Đây là loài xạ khuẩn có khả năng sinh rapamycin – hợp chất có khả năng kháng nấm và ức chế miễn dịch mạnh. Rapamycin là một trong 31 macrolide trong tự nhiên có chứa vòng lacton lớn trong phân tử, được chứng minh có hoạt tính chống nấm, chống u, bảo vệ thần kinh và đặc biệt hữu ích trong ngăn chặn việc thải ghép thận [17]. Rapamycin ban đầu được nghiên cứu như một hoạt chất chống nấm và chống u. Tuy nhiên, đặc tính giảm bạch cầu lymphô làm cho rapamycin có vai trò như là một ức chế miễn dịch. Khả năng ức chế miễn dịch của rapamycin đã được ứng dụng để sản xuất thuốc chống thải ghép dưới tên thương mại là Sirolimus và thường được sử dụng điều trị cho các bệnh nhân ghép tạng. Đây là một trong số ít kháng sinh được Cục quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA, Food and Drug Administration) chấp nhận sử dụng (tháng 9/1999) trong bệnh viện cho các trường hợp ghép tạng. Rapamycin có nhiều ứng dụng trong y khoa nhưng hiệu quả sản sinh rapamycin của các chủng hoang dại còn nhiều hạn chế. Do đó, nghiên cứu làm tăng khả năng sinh rapamycin của các chủng này có tính thực tiễn, ứng dụng cao và trong tương lai có thể áp dụng cho sản xuất rapamycin lượng lớn trong công nghiệp. Với mục tiêu đó, chúng tôi đã thực hiện đề tài “Ứng dụng kỹ thuật di truyền nhằm tăng khả năng sinh tổng hợp rapamycin của Streptomyces rapamycinicus”. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng các kỹ thuật di truyền để chèn thêm một phiên bản của gen điều hòa dương rapG vào hệ gen của chủng Streptomyces rapamycinicus 1
DSM 41530 hoang dại. Từ đó, chúng tôi đã nghiên cứu sâu hơn các điều kiện nuôi cấy cũng như các yếu tố khác nhằm thu được lượng rapamycin lớn nhất từ chủng xạ khuẩn chuyển gen. 2
MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU Nghiên cứu nhằm thực hiện các mục tiêu cụ thể sau: 1. Tạo chủng xạ khuẩn Streptomyces rapamycinicus đột biến có khả năng sinh lượng rapamycin cao hơn chủng xạ khuẩn hoang dại. 2. Tối ưu hóa môi trường nuôi cấy để thu lượng rapamycin lớn nhất. 3
Chương 1 - TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1. Xạ khuẩn 1.1.1. Giới thiệu chung về xạ khuẩn Xạ khuẩn (Actinomycetes) là một nhóm vi sinh vật nhân sơ thuộc lớp Actinobacteria, bộ Actinomycestales, thuộc nhóm Gram dương [13]. Thuật ngữ “actinomyces” xuất phát từ tiếng Hy Lạp, có nghĩa là mang cả đặc điểm của vi khuẩn và nấm [4]. Xạ khuẩn có khoảng 100 chi với hơn 1000 loài. Chúng là những vi sinh vật đơn bào, rất đa dạng trong đó đa số sinh trưởng hiếu khí và tạo khuẩn ty phân nhánh tương tự như nấm mốc. Mạng lưới phân nhánh của hệ sợi thường phát triển ở cả bề mặt cơ chất rắn (tạo thành hệ sợi khí sinh) lẫn bên trong tạo thành hệ sợi cơ chất [23]. Khuẩn lạc xạ khuẩn thường rắn chắc, thô ráp, phát triển sâu vào bề mặt thạch, kích thước khuẩn lạc khác nhau tùy thuộc vào loài xạ khuẩn và điều kiện nuôi cấy. Phần lớn xạ khuẩn sinh bào tử, bào tử được hình thành trên các nhánh phân hóa của khuẩn ty khí sinh- gọi là cuống sinh bào tử, bào tử có dạng hình cầu, hình que hoặc hình oval. Xạ khuẩn có khả năng tiết sắc tố vào môi trường nuôi với nhiều màu đa dạng như đỏ, da cam, vàng, nâu, đen. Nhiệt độ để xạ khuẩn phát triển tốt nhất là 25- 35°C, tuy vậy nhiều loài xạ khuẩn đã được phân lập từ các môi trường khắc nghiệt; ví dụ như Nocardiopsis alkaliphila được phân lập từ đất sa mạc ở Ai Cập có thể sống ở pH 9.5-10, tồn tại trong trầm tích biển sâu như rãnh Mariana hoặc Nam Cực [4, 19]. Xạ khuẩn nhạy cảm với độ axit (pH thấp), chúng phát triển tốt trong môi trường pH trung tính (6.5-8.0). Xạ khuẩn là nhóm vi sinh vật phân bố rộng rãi trong tự nhiên, được tìm thấy chủ yếu trong đất, phù sa và thảm thực vật mục nát, ước tính có 104-108 CFU trong 1 gram đất [4]. Xạ khuẩn đóng vai trò về mặt sinh thái quan trọng trong vòng tuần hoàn tự nhiên. Chúng tham gia vào quá trình phân giải và sử dụng các chất hữu cơ khó phân hủy như humic acid trong đất, cellulose, tinh bột. Nhiều chủng xạ khuẩn có khả năng hòa tan lignin và phân hủy các hợp chất liên quan đến lignin bằng cách sinh các enzyme thủy phân cellulose, hemicellulose và các peroxidase ngoại bào [34]. Ngoài 4
ra, nhiều chủng xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces có khả năng kiểm soát bệnh cây trồng. Xạ khuẩn được chia thành 2 loại: Streptomyces và non-Streptomyces. Chi xạ khuẩn được biết đến nhiều nhất là Streptomyces với khoảng 500 loài đã được mô tả [3]. Các loài xạ khuẩn thuộc chi này đóng góp hơn 70% trong số hơn 5000 chất kháng sinh thu được từ vi khuẩn và nấm sợi. 1.1.2. Ứng dụng của xạ khuẩn Xạ khuẩn được biết đến với nhiều ứng dụng liên quan tới nhiều lĩnh vực khác nhau trong cuộc sống như sản xuất thuốc, sản xuất chế phẩm kháng bệnh, ứng dụng bảo vệ thực vật. Trong nông nghiệp, sử dụng các chế phẩm sinh học có nguồn gốc từ xạ khuẩn nhằm mục đích chống bệnh do nấm, do vi khuẩn gây ra trên rau quả và cây trồng, kiềm chế các bệnh thực vật sinh ra từ đất. Các loài xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces và Micromonospora sử dụng hợp chất giàu carbon và ni-tơ như cellulose, hemicellulose, protein và lignin trong đất, phân hủy chúng thành mùn [4]. Một số khác sản xuất enzyme ngoại bào như chitinase, gelatinase và catalase có khả năng phân giải các chất hữu cơ phức tạp. Dịch lên men của các chủng xạ khuẩn còn được dùng để xử lý hạt giống với mục đích tiêu diệt nguồn bệnh ở bên ngoài và trong hạt. Một số loài xạ khuẩn như S. albviridis, S. griseoviridis có khả năng sinh chất kích thích tăng trưởng thực vật – gibberellin, auxin và cytokinin, kích thích sự phát triển của cây trồng [32]. Trong công nghiệp, xạ khuẩn có khả năng sản xuất nhiều loại enzyme như amylase, cellulase, protease, xylanase ứng dụng trong các ngành công nghiệp như thực phẩm, dệt may, y sinh và sản xuất chất tẩy rửa. Cellulase phân giải cellulose thành đường và vì vậy là enzyme công nghiệp quan trọng trong sản xuất nhiên liệu sinh học. Các loài S. ruber, S. lividans, S. rutgersensis sinh cellulase có khả năng chịu nhiệt cao và được ứng dụng làm chất bổ sung trong chất tẩy rửa, phụ gia, bột giấy [37]. Protease được tìm thấy từ dịch nuôi các loài thuộc chi Streptomyces, Nocardia, Nocardiopsis được sử dụng để xử lý các chất thải công nghiệp, làm chất 5
tẩy rửa và khử mùi [37]. Streptomyces spp. và Actinomadura keratinilytica có khả năng sinh enzyme keratinase, phân hủy rác thải có nguồn gốc từ lông, móng, len [4]. Hiện nay, các nhà khoa học đang nghiên cứu về tiềm năng vi sinh vật trong môi trường khắc nghiệt để có thể sản xuất các enzyme mới, thân thiện với môi trường theo xu hướng công nghệ sinh học xanh. Ngoài ra, xạ khuẩn được ứng dụng để cung cấp phần lớn các loại kháng sinh, chất kháng nấm, chất ức chế miễn dịch, chất chống ung thư mà con người đang sử dụng hiện nay. Kháng sinh đầu tiên được biết đến là penicillin (1928) được phát hiện bởi nhà khoa học A. Fleming, khi ông vô tình thấy rằng nấm Penicillin notatum tạo vùng kháng khuẩn trên đĩa Staphylococcus [33].Từ đó, việc tìm kiếm các chất kháng sinh từ vi sinh vật được chú ý đến nhiều hơn. Các chất có hoạt tính kháng nấm như nystatin có nguồn gốc từ xạ khuẩn S. noursei, được phát hiện lần đầu vào năm 1950 và được sử dụng điều trị nhiễm nấm Candida trên da [44]. Amphotericin B, sản xuất bởi S. nodosus phân lập từ mẫu đất Venezuela (1955) là một chất chống nấm mạnh, được sử dụng để điều trị nhiều chứng nhiễm nấm nghiêm trọng [43]. Hiện nay, các nhà khoa học đang hướng tới nghiên cứu nhiều loài xạ khuẩn khác, đặc biệt là nhóm xạ khuẩn hiếm để tìm ra các chất có hoạt tính sinh học mới, có tính ứng dụng cao trong y học. 1.1.3. Vai trò của xạ khuẩn trong sản xuất các chất trong y học Từ lâu, xạ khuẩn được biết đến nhiều với khả năng sản xuất các chất thứ cấp có hoạt tính sinh học. Trong số 22500 hợp chất có hoạt tính sinh học từ vi sinh vật, số chất thu từ xạ khuẩn chiếm 45%, 38% từ nấm sợi và 17% từ các loại vi sinh vật khác [3]. Các chất thứ cấp có ứng dụng rất lớn trong sản xuất thuốc chống nấm (nystatin), chống vi khuẩn (streptomycin, chloramphenicol, tetracycline), thuốc kháng virut (tunicamycin), thuốc ức chế miễn dịch (rapamycin), thuộc hạ sốt (avermectin), thuốc chống ung thư (actinomycin, mitomycin C, anthracyclines), enzyme ức chế (axit clavulanic). Năm 1914-1939, Selman A. Waksman đã liên tục phân lập và sàng lọc vi khuẩn và nấm sợi từ đất để tìm các loại kháng sinh mới. Trong những năm 1940, Waksman cùng các cộng sự đã phát hiện ra hơn 15 loại kháng sinh như actinomycin, 6
clavacin, grisein. Đáng chú ý nhất là nhóm nghiên cứu của ông đã tìm ra streptomycin từ loài Streptomyces griseus (1944). Đây là kháng sinh điều trị hiệu quả đầu tiên cho bệnh lao và neomycin từ loài Streptomyces fradiae (1949) – kháng sinh điều trị nhiễm trùng sau phẫu thuật đường ruột [47]. Sau đó, nhiều nghiên cứu khác đã phát hiện ra nhiều hoạt chất mới được tách từ xạ khuẩn có ứng dụng lớn trong y học. Ví dụ, nystatin từ Streptomyces noursei đã được chứng minh khả năng kháng nấm Candida albicans, còn tetracyclin, được tách chiết từ một số chủng xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces (S. aureofaciens, S.rimosus, S. viridifaciens), là loại kháng sinh có phổ rộng, chống lại được cả vi khuẩn Gram dương và Gram âm [2]. Bên cạnh các chất kháng sinh, các chất có hoạt tính sinh học giữ vai trò quan trọng trong việc điều trị bệnh và ảnh hưởng trực tiếp tới sức khỏe và cuộc sống của con người. Trong khi hầu hết các hoạt chất phức tạp như các hợp chất có nguồn gốc từ vòng cacbon thơm hoặc các gốc ankyl khó có thể tổng hợp bằng con đường hóa học, thu một hợp chất từ chủng xạ khuẩn có khả năng tổng hợp chất đó được coi là giải pháp hữu ích và hiệu quả. Xạ khuẩn là một trong những nguồn quan trọng nhất để cung cấp lượng thuốc ra thị trường và khám phá ra các hợp chất sinh học mới. Năm 2011, maklamicin – một polyketide mới được tìm thấy từ dịch tách chiết chủng nội sinh Micromonospora sp. GMKU326 phân lập tại Thái Lan [21]. Maklamicin là hợp chất đa vòng có khả năng kháng khuẩn mạnh, đặc biệt kháng mạnh các vi khuẩn Gram dương như Micrococcus luteus, Bacillus subtilis, kháng nấm C. alibicans và có khả năng gây độc tế bào ung thư. Bên cạnh đó, nhiều hợp chất chống nấm, chống virut đã được tìm thấy. Sceliphrolactam là chất chuyển hóa thứ cấp sản xuất từ xạ khuẩn Streptomyces sp. sống liên kết với loài côn trùng cánh màng Sceliphron caementarium. Sceliphrolactam đã được chứng minh hoạt tính kháng nấm mạnh đối với chủng nấm C. alibicans kháng amphotericin [39]. 15-glycidylfilipin III là hợp chất ức chế mạnh mẽ nấm C. albicans với giá trị MIC là 6,25 µg/mL, gấp 2 lần so với giá trị MIC của nystatin là 3,13 µg/mL [50]. 15-glycidylfilipin III được tìm thấy từ chủng xạ khuẩn đất S. lavenduligawnus. Sáu loại thuốc khử trùng mới – enduspeptide A-F, được sản xuất từ chủng Streptomyces sp. phân lập từ mẫu đất lấy 7
từ mỏ than ở độ sâu 20 cm, Trung Quốc [9]. Trong đó, enduspeptide A và C có khả năng kháng chủng C. glabrata ATCC 90030 mạnh nhất. Nghiên cứu về chủng xạ khuẩn Streptomyces kaviengensis phân lập từ bờ biển New Ireland thuộc Papua New Guinea đã xác định một chất chuyển hóa mới là antimycin A1a có hoạt tính chống virut đáng kể [45]. Hợp chất antimycin A1a là dẫn xuất của antimycin A, có tiềm năng chống lại virus viêm não ngựa miền Tây. Phân tích cơ chế hoạt động của antimycin A1a cho thấy hợp chất làm gián đoạn vận chuyển điện tử của ty thể và quá trình sinh tổng hợp pyrimidine. Hơn nữa, antimycin A đã được biết đến với khả năng kháng ARN virut, hoạt động phổ rộng trên các họ Togaviridae, Flaviridae, Bynyaviridae, Picornaviridae và Paramyxoviridae. Gần đây nhất vào năm 2018, ahmpatinin iBu đã được chứng minh khả năng ức chế chống lại protease HIV-1, đây là hợp chất được tìm thấy từ chủng xạ khuẩn Streptomyces sp. CPCC 202950 nuôi trên môi trường gạo ngâm vô trùng [6]. Nhìn chung, đa số các loài xạ khuẩn có khả năng sinh các chất có hoạt tính sinh học mạnh và được ứng dụng nhiều trong thực tế. Nhiều chủng xạ khuẩn có khả năng tổng hợp đồng thời hai hay nhiều chất, phụ thuộc vào cơ chế biểu hiện gen, ảnh hưởng của enzyme. Việc tìm kiếm các hợp chất mới có hoạt tính sinh học mới có khả năng chống lại các vi khuẩn, virut gây bệnh kháng thuốc đang là một lĩnh vực quan trọng của nghiên cứu hợp chất. Hiện nay, tình trạng đa kháng thuốc là một trong những khó khăn trong việc điều trị các bệnh truyền nhiễm cộng đồng, đặc biệt là ở bệnh viện. Hầu hết, các nghiên cứu nhiều năm gần đây tập trung vào kháng các vi khuẩn Gram dương như Staphylococcus aureus MRSA, tuy nhiên những kháng sinh có khả năng kháng khuẩn kháng thuốc là rất ít. Do đó, các hoạt chất mới từ xạ khuẩn có khả năng trị bệnh hiệu quả cao, ít tác dụng phụ được quan tâm nghiên cứu. Tháng 9/ 1999, chất chống nấm rapamycin (sản xuất bởi chủng S. rapamycinicus) dưới tên thương mại là Sirolimus đã được Cục quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) chấp nhận sử dụng để điều trị trong bệnh viện. Đây là một trong những loại thuốc được dùng chống thải ghép cho các bệnh nhân ghép tạng mà gây ra ít tác dụng phụ. 8
1.1.4. Streptomyces rapamycinicus Streptomyces rapamycinicus thuộc chi Streptomyces, là vi khuẩn Gram dương, sống hiếu khí. S. rapamycinicus được các nhà khoa học Brazil phân lập vào những năm 1960 từ mẫu đất thu được ở vùng núi Rapa Nui, Đảo Phục Sinh, Chile [31]. Đây là chủng xạ khuẩn có khả năng sinh hợp chất có hoạt tính sinh học rapamycin. Trên môi trường ISP2, chủng Streptomyces rapamycinicus có màu vàng nhạt đến trắng, khuẩn lạc tròn, bề mặt nhăn, thô, xù xì, đường kính khuẩn lạc từ 4-7 mm, không sinh sắc tố (Hình 1.1). Hệ sợi cơ chất bám sâu vào bề mặt thạch, hệ sợi khí sinh màu trắng. Sau 8-10 ngày nuôi, hệ sợi trắng chuyển màu xám dần và hình thành bào tử màu đen. Nhiệt độ thích hợp để nuôi chủng xạ khuẩn là 25-30°C trong điều kiện hiếu khí. Hình 1.1. Streptomyces rapamycinicus trên môi trường thạch ISP2 [54]. 9
1.2. Rapamycin 1.2.1. Tính chất và cấu trúc hóa học Rapamycin (sirolimus, rapamune) có công thức phân tử là C51H79NO13, trọng lượng phân tử 914,2 g/mol. Rapamycin là chất rắn màu trắng hoặc vàng nhạt, điểm nóng chảy 183-185°C, hòa tan tốt trong DMSO (25 mg/ml), methanol (25 mg/ml), chloroform (5 mg/ml) và một số dung môi khác như ethanol, ether, acetone, không tan trong nước, tan rất ít trong hexan. Phổ hấp phụ UV tương ứng tại bước sóng 272 nm. Rapamycin là kháng sinh thuộc nhóm macrolide, có nhiều vòng lactone trong cấu trúc phân tử (Hình 1.2.). Cấu trúc rapamycin gồm 29 vòng chứa 4 liên kết đôi dạng tran, ¾ liên kết này dạng liên hợp. Hình 1.2. Cấu trúc rapamycin [42] 1.2.2. Vai trò của rapamycin trong đáp ứng miễn dịch Rapamycin được báo cáo lần đầu tiên vào năm 1975 từ loài Streptomyces hygroscopicus và được biết đến như một kháng sinh có khả năng kháng nấm (chi Candida – gây bệnh phổ biến ở người). Rapamycin có độ đặc hiệu và độc tính tương đối thấp và hấp thu tốt ở chuột và chó [41]. Tuy nhiên, tính kháng nấm của rapamycin không được ứng dụng nhiều vì những tác dụng phụ khi thử nghiệm lâm sàng trên chuột và cơ chế kháng nấm chưa rõ ràng. Sau đó, rapamycin trở nên nổi bật hơn với các nghiên cứu về khả năng kháng khối u, ức chế miễn dịch, bảo vệ thần kinh và chống lão hóa [35]. Đặc biệt, khả năng ức chế miễn dịch của rapamycin đã được ứng dụng để sản xuất thuốc chống thải ghép dưới tên thương mại là Sirolimus và thường 10
được sử dụng điều trị cho các bệnh nhân ghép tạng. Đây là một trong số ít kháng sinh được Cục quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA, Food and Drug Administration) chấp nhận sử dụng (T9/1999) trong bệnh viện cho các trường hợp ghép tạng [31]. Trước đây, các bệnh viện thường sử dụng tacrolimus hoặc mycophenolate mofetil để điều trị cho các bệnh nhân ghép thận. Tuy nhiên, bệnh nhân sử dụng các loại thuốc này trong thời gian dài sẽ làm chức năng thận bị suy yếu, thậm chí suy thận mãn tính. Sirolimus là loại thuốc thay thế có thể khắc phục những tác dụng phụ đó. Một thử nghiệm lâm sàng khác sử dụng rapamycin cho bệnh nhân ghép thận không gây ra bệnh tiểu đường ở những bệnh nhân này trong 3 năm theo dõi. Đối với bệnh nhân ghép tạng đã bị tiểu đường từ trước và được điều trị thành công bằng rapamycin, việc sử dụng rapamycin không làm bệnh tiểu đường của họ nặng hơn [5]. Hiện nay, sirolimus có thể được sử dụng một mình hoặc sử dụng kết hợp (tacrolimus) để điều trị cho bệnh nhân ghép tạng. 1.2.3. Sinh tổng hợp rapamycin và cơ chế điều hòa Quá trình sinh tổng hợp polyketide - rapamycin bắt đầu với đơn vị khởi động là 4,5- dihydroxycyclohex- 1- ene carboxylic acid (DHCHC) [16]. Dưới tác động của cụm enzyme đa chức năng gồm RapA, RapB và RapC (vùng PKS), DHCHC được kéo dài qua 14 bước trùng ngưng tạo chuỗi polyketide. Cụm enzyme đa chức năng gồm 14 cấu phần (modules), mỗi cấu phần đảm nhiệm một chức năng khác nhau [42]. RapA gồm modules 1-4, liên quan đến quá trình bắt đầu và kéo dài chuỗi polyketide, RapB gồm modules 5-10 phụ trách kéo dài chuỗi đến C16 và RapC gồm modules 11- 14 chịu trách nhiệm kết thúc polyketide của vòng macrolactone. Ngoài vùng PKS, có các gen khác liên quan tới quá trình sinh tổng hợp rapamycin như gen rapL mã hóa cho enzyme lysine cyclodeaminase, xúc tác tổng hợp pipecolate từ lysine, pipecolate là tiền chất tạo vòng trong cấu trúc phân tử rapamycin [20,30]. Gen rapP mã hóa cho một protein chuyên biệt, enzyme này gắn với pipecolate, đưa phức hợp này vào khung polyketide và xúc tác đóng vòng tạo tiền chất rapamycin [42]. Ngoài ra, quá trình hình thành phân tử rapamycin từ tiền chất rapamycin phụ thuộc vào một số gen khác như rapJ và rapN mã hóa cho enzyme cytochrome P450, xúc tác cho bước oxi hóa 11