Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Xác định đồng thời dư lượng kháng sinh nhóm nitrofuran trong một số loại thực phẩm tươi sống trên địa bàn Hà Nội bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ LC/MS/MS

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:77

Thêm vào BST

Báo xấu

39
lượt xem 7
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Nội dung chính của luận văn này là nghiên cứu và xác định đồng thời dư lượng kháng sinh nhóm nitrofuran trong một số loại thực phẩm tươi sống trên địa bàn Hà Nội bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ LC/MS/MS. Mời các bạn tham khảo!

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Xác định đồng thời dư lượng kháng sinh nhóm nitrofuran trong một số loại thực phẩm tươi sống trên địa bàn Hà Nội bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ LC/MS/MS

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------- TRẦN THỊ HỒNG XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI DƢ LƢỢNG KHÁNG SINH NHÓM NITROFURAN TRONG MỘT SỐ LOẠI THỰC PHẨM TƢƠI SỐNG TRÊN ĐỊA BÀN HÀ NỘI BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ LC/MS/MS LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2012
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------- TRẦN THỊ HỒNG XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI DƢ LƢỢNG KHÁNG SINH NHÓM NITROFURAN TRONG MỘT SỐ LOẠI THỰC PHẨM TƢƠI SỐNG TRÊN ĐỊA BÀN HÀ NỘI BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ LC/MS/MS Chuyên ngành: Hóa phân tích Mã số: 60 44 29 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. LÊ THỊ HỒNG HẢO Hà Nội – 2012
MỤC LỤC MỞ ĐẦU ..................................................................................................................... 1 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN ....................................................................................... 3 1.1. Giới thiệu về kháng sinh nhóm nitrofuran ....................................................... 3 1.1.1. Nhóm nitrofuran là gì? ...................................................................................... 3 1.1.2. Các chất nhóm nitrofuran ................................................................................. 3 1.2. Tác dụng của các chất kháng sinh nhóm nitrofuran……………………… …….6 1.3. Dƣ lƣợng kháng sinh nhóm nitrofuran trong thực phẩm ..................................... 6 1.4.1. Phƣơng pháp sắc ký lỏng với detector UV ....................................................... 6 1.4.2. Phƣơng pháp phân tích vi sinh (enzyme-linked immunosorbent assay- ELISA) ........................................................................................................................ 7 1.4.3. Phƣơng pháp sắc ký lỏng khối phổ LC/MS/MS .............................................. 8 CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 11 2.1. Đối tƣợng, mục tiêu và nội dung nghiên cứu..................................................... 11 2.1.1. Đối tƣợng, mục tiêu nghiên cứu...................................................................... 11 2.1.2. Nội dung nghiên cứu ....................................................................................... 11 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu.................................................................................... 12 2.2.1. Phƣơng pháp sắc ký lỏng khối phổ ................................................................. 12 2.2.2. Phƣơng pháp xử lý mẫu .................................................................................. 18 2.3. Hóa chất và dụng cụ nghiên cứu ........................................................................ 23 2.3.1. Dụng cụ, thiết bị .............................................................................................. 23 2.3.2 Hóa chất, chất chuẩn ........................................................................................ 24 2.3.3 Pha chế chất chuẩn ........................................................................................... 25 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................ 27 3.1. Khảo sát điều kiện xác định các chất nhóm nitrofuran bằng LC/MS/MS ......... 27 3.1.1. Khảo sát các điều kiện khối phổ ..................................................................... 27
3.1.2. Lựa chọn cột tách ............................................................................................ 29 3.1.3. Khảo sát chƣơng trình gradient ....................................................................... 30 3.1.4. Khảo sát quy trình chiết mẫu .......................................................................... 33 3.2. Thẩ m đinh ̣ phƣơng pháp .................................................................................... 38 3.2.1 Tính đặc hiệu .................................................................................................... 38 3.2.1. Khảo sát lập đƣờng chuẩn ............................................................................... 38 3.2.2. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng của phƣơng pháp ......................... 43 3.2.3. Độ lặp lại và độ thu hồi ................................................................................... 46 KẾT LUẬN ............................................................................................................... 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................... 56
DANH MỤC CÁC BẢNG STT Nội dung Trang Bảng 1.1 Cấ u trúc hóa ho ̣c của mô ̣t số chấ t nhóm nitrofuran 4 đƣơ ̣c xác đinh ̣ trong đề tai Bảng 3.1 Điều kiện chạy nguồn ion hóa ESI 27 Bảng 3.2 Kết quả bắn phá các ion mẹ 28 Năng lƣợng bắn phá và các ion con của các chất 29 Bảng 3.3 chuyển hóa nitrofuran Độ thu hồi mẫu thịt lợn thêm chuẩn 20 ng/g sử dụng 35 Bảng 3.4 chiết lỏng – lỏng Độ thu hồi mẫu thịt lợn thêm chuẩn 20 ng/g sử dụng 37 Bảng 3.5 chiết pha rắn Bảng 3.6 So sánh độ thu hồi của 2 quá trình chiết 37 Bảng 3.7 Phƣơng trình hồi quy 4 nitrofuran sử dụng nội chuẩn 41 Bảng 3.8 Phƣơng trình hồi quy 4 nitrofuran không sử dụng nội 43 chuẩn Bảng 3.9 Giới hạn phát hiện của AOZ trên nền mẫu thịt 44 Bảng 3.10 Giới hạn phát hiện của AMOZ trên nền mẫu thịt 45 Bảng 3.11 Giới hạn phát hiện của AHD trên nền mẫu thịt 45 Bảng 3.12 Giới hạn phát hiện của SEM trên nền mẫu thịt 46 Độ lặp lại và độ thu hồi của các nitrofuran trên nền 47 Bảng 3.13 mẫu thịt lợn tại 1 ppb Độ lặp lại và độ thu hồi của các nitrofuran trên nền 48 Bảng 3.14 mẫu thịt lợn tại 1,5 ppb Độ lặp lại và độ thu hồi của các nitrofuran trên nền 49 Bảng 3.15 mẫu thịt lợn tại 2 ppb
Bảng 3.16 Kết quả phân tích trên mẫu thực 51 DANH MỤC CÁC HÌNH STT Nội dung Trang Hình 2.1 Sơ đồ cấu tạo thiết bị khối phổ 13 Hình 2.2 Sơ đồ phân tích khối phổ 3 tứ cực 16 Hình 2.3 Các bƣớc của quá trình chiết pha rắn 19 Hình 3.1 Sắ c đồ hỗn hơ ̣p chuẩ n khi cha ̣y chế đô ̣ gradient 30 1 ở nồng đồ 20 ng/ml Hình 3.2 Sắ c đồ hỗn hơ ̣p chuẩ n khi cha ̣y chế đô ̣ gradient 31 2 ở nồng đồ 20 ng/ml Hình 3.3 Sắ c đồ hỗn hơ ̣p chuẩ n khi cha ̣y chế đô ̣ gradient 31 3 ở nồng đồ 20 ng/ml Hình 3.4 Sắ c đồ hỗn hơ ̣p chuẩ n khi cha ̣y chế đô ̣ gradient 32 4 ở nồng đồ 20 ng/ml Hình 3.5 Sắ c đồ hỗn hơ ̣p chuẩ n khi cha ̣y chế đô ̣ gradient 32 5 ở nồng đồ 20 ng/ml Hình 3.6 Sắ c đồ mẫu thiṭ lơ ̣n thêm chuẩ n hỗn hơ ̣p 35 nitrofuran ta ̣i mƣ́c nồ ng đô ̣ 20 ng/ml sƣ̉ du ̣ng quy triǹ h chiế t lỏng - lỏng Hình 3.7 Sắ c đồ mẫu thiṭ lơ ̣n thêm chuẩ n hỗn hơ ̣p 38 nitrofuran ta ̣i mƣ́c nồ ng đô ̣ 20 ng/ml sƣ̉ du ̣ng quy trình chiế t pha rắ n Hình 3.8 Đƣờng chuẩn AOZ sử dụng nội chuẩn 39 Hình 3.9 Đƣờng chuẩn AMOZ sử dụng nội chuẩn 39 Hình 3.10 Đƣờng chuẩn SEM sử dụng nội chuẩn 40
Hình 3.11 Đƣờng chuẩn AHD sử dụng nội chuẩn 40 Hình 3.12 Đƣờng chuẩn AOZ không sử dụng nội chuẩn 41 Hình 3.13 Đƣờng chuẩn AMOZ không sử dụng nội chuẩn 42 Hình 3.14 Đƣờng chuẩn AHD không sử dụng nội chuẩn 42 Hình 3.15 Đƣờng chuẩn SEM không sử dụng nội chuẩn 43 Hình 3.16 Sắ c đồ mẫu thiṭ lơ ̣n thêm chuẩ n hỗn hơ ̣p 47 nitrofuran ta ̣i mƣ́c nồ ng đô ̣ 1 ng/g Hình 3.17 Sắ c đồ mẫu thiṭ lơ ̣n thêm chuẩ n hỗn hơ ̣p 48 nitrofuran ta ̣i mƣ́c nồ ng đô ̣ 1,5 ng/g Hình 3.18 Sắ c đồ mẫu thiṭ lơ ̣n thêm chuẩ n hỗn hơ ̣p 49 nitrofuran ta ̣i mƣ́c nồ ng đô ̣ 2 ng/g
DANH MỤC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt CAD Collision Gas Presure Áp suất khí mang trong tứ cực Q2 CE Collision Energy Thế áp vào tứ cực Q CUR Curtain Gas Khí mang CXP Collision Cell Exit Potential Thế áp giữa tứ cực Q2 và Q3 DP Declustering Potential Thế đầu vào áp vào màn chắn EP Entrance Potential Thế áp vào nguồn ion mẹ ESI Electrospray Ionization Ion hóa phun điện tử EU European Union Liên minh châu Âu GS1 Ion Source Gas 1 Áp suất khí hai bên đầu phun GS2 Ion Source Gas 2 Áp suất của luồng khí nóng High performance liquid HPLC Sắc kí lỏng hiệu năng cao chromatography IP Identification point Điể m nhâ ̣n da ̣ng IS IonSpray Voltage Thế ion hóa Liquid chromatography – LC – MS Sắc kí lỏng khối phổ mass spectrometry LOD Limit of detection Giới hạn phát hiện LOQ Limit of quality Giới hạn định lƣợng MeOH Methanol Methanol Minimum required Yêu cầu giới hạn hiệu năng nhỏ nhất MRPL performance limit của phƣơng pháp RSD% Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tƣơng đối
SPE Solid phase extraction Chiết pha rắn TEM Temperature Nhiệt độ của nguồn khí nóng thổi vào
MỞ ĐẦU An toàn vệ sinh thực phẩm là vấn đề đang đƣợc cả xã hội quan tâm, đặc biệt là ở đô thị và các khu công nghiệp, khi ngày càng có nhiều tác nhân độc hại bị phát hiện trong thực phẩm khiến dƣ luận lo ngại. Tuy nhiên trong lĩnh vực sản xuất kinh doanh nói chung và trong chăn nuôi gia súc, gia cầm nói riêng còn nhiều vấn đề đáng lo ngại, nhƣ việc quản lý sử dụng thuốc kháng sinh còn lỏng lẻo, tình trạng sử dụng các chất bổ trợ trong chăn nuôi khá tùy tiện. Từ đó đã để lại tồn dƣ các hóa chất, kháng sinh trong sản phẩm chăn nuôi, gây nguy hại nghiêm trọng đến sức khỏe ngƣời tiêu dùng. Nitrofuran là một nhóm kháng sinh tổng hợp thƣờng đƣợc sử dụng cho vào thức ăn gia súc để kích thích tăng trƣởng và là phƣơng pháp điều trị dự phòng, điều trị các bệnh nhiễm trùng đƣờng tiêu hóa gây ra bởi Escherichia và Salmonella trong chăn nuôi gia súc, gia cầm. Chúng cũng đã đƣợc sử dụng để điều trị nhiễm trùng do vi khuẩn và sinh vật đơn bào trong nuôi trồng thủy sản...Vì vậy sự tồn dƣ của chúng gây tác hại cho sức khỏe con ngƣời, đặc biệt là gây ung thƣ và đột biến ở ngƣời. Năm 2002 – 2003 phát hiện dƣ lƣợng chất chuyển hóa của nitrofuran trong số lƣợng lớn các mẫu từ gia cầm và nuôi trồng thủy sản các sản phẩm nhập khẩu vào Châu Âu từ một số khu vực Đông Nam Á và các nƣớc Nam Mỹ. Từ đó đã dẫn đến lệnh cấm sử dụng nitrofuran trong sản xuất thực phẩm động vật tại nhiều quốc gia bao gồm Mỹ, Canada và EU... Các nƣớc này đã đặt lệnh cấm trên tất cả các loại thực phẩm nhập khẩu có chứa dƣ lƣợng nitrofuran. Tháng 3 năm 2003 EU đã quy định yêu cầu giới hạn nhỏ nhất cần thực hiện phƣơng pháp (MRPL) đối với các chất chuyển hóa nhóm nitrofuran là 1 µg/kg [29]. Năm 2002, ở Việt Nam, Bộ nông nghiệp và phát triển nông thôn đã quyết định cấm sản xuất, nhập khẩu, lƣu thông và sử dụng một số loại kháng sinh hóa chất trong sản xuất và kinh doanh TACN trong đó có nitrofuran [9]. Hiện nay việc sử dụng dƣ lƣợng kháng sinh sai mục đích đang ở mức báo động ảnh hƣởng tới sức khỏe con ngƣời và động vật. Vì vậy với nhu cầu bức thiết về vấn 1
đề đảm bảo VSATTP, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu phát triển phƣơng pháp “Xác định đồng thời dƣ lƣợng kháng sinh nhóm nitrofuran trong một số loại thực phẩm tƣơi sống trên địa bàn Hà Nội bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng khối phổ LC/MS/MS”. 2
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Giới thiệu về kháng sinh nhóm nitrofuran 1.1.1. Nhóm nitrofuran là gì? Nitrofuran là một nhóm kháng sinh tổng hợp có chứa nhóm 5-nitro, thƣờng đƣợc sử dụng làm thức ăn gia súc kích thích sự tăng trƣởng, chủ yếu đối với gia súc (nhƣ gia cầm, lợn), nuôi trồng thủy sản (cá, tôm) và nuôi ong để điều trị các vi khuẩn và sinh vật đơn bào nhiễm trùng nhƣ viêm ruột tiêu hóa gây ra bởi Escherichia coli và Salmonella spp, gia cầm bệnh tả và bênh cầu trùng màu đen đầu [12]. 1.1.2. Các chất nhóm nitrofuran Các chất nhóm n itrofuran bao gồ m Furazolidone, furaltadone, furazolidone, nitrofurazone, khi đi vào cơ thể sinh vâ ̣t nó tạo thành các chất chuyển hóa tƣơng ứng (AOZ, AMOZ, AHD, SEM) liên kế t trong các mô tồ n ta ̣i trong nhiề u tuầ n sau khi sƣ̉ du ̣ng [12]. Ví dụ nhƣ quá trình chuyển hóa của nitrofurazone nhƣ sau : 3
Bảng 1.1: Cấ u trúc hóa ho ̣c của mô ̣t số chấ t nhóm nitrofuran đƣơ ̣c xác đinh ̣ trong đề tài Khố i lƣơ ̣ng Công thƣ́c STT Các chất nitrofuran phân Công thƣ́c cấ u ta ̣o phân tƣ̉ tƣ̉ (g/mol) AOZ 1 C3H6N2O2 102,09 3-amoni-2-oxazolidinone NPAOZ 3-(2-nitrobenzylidenamino)- 2 C10H9N3O4 235,2 2-oxazolidinone) AMOZ 3 3-amoni-5-morpholinomethyl C8H15N3O3 201,22 -1,3-oxazolidinone NPAMOZ 5-(morpholinomethyl)-3-(2- 4 nitrobenzylidenamino)-2- C15H18N4O5 334,33 oxazolidinone AHD 5 C3H5N3O2 116,05 1-aminohydantoin NPAHD 6 [3-(2-nitrobenzylidenamino) C10H8N4O4 248,19 -2,4-imidazolidinedione] 4
SEM CH5N3O 7 75,08 semicarbazide NPSEM 3[(2-nitrophenyl)methylene]- C8H8N4O3 208,174 8 hydrazinecarboxamide 1.2. Tác dụng của các chất kháng sinh nhóm nitrofuran McCracken và các cô ̣ng sƣ̣ 1995, Nouws và Laurensen 1990 chỉ ra rằng các hợp chất nhóm nitrofuran sau khi vào cơ thể tạo thành các chất chuyển hóa tƣơng ứng liên kết trong các mô. Về mặt cơ chế tác dụng, các chất chuyển hóa tƣ̀ nitrofuran đã kìm hãm hoặc phá hủy các hệ thống men điều hòa trao đổi chất ở vi khuẩn. Do đó vi khuẩn không phát triển và không sinh sản đƣợc nữa. Tác dụng tốt với vi khuẩn gram âm và gram dƣơng. Đồng thời còn tác dụng cả với nguyên sinh động vật, một số chất có tác dụng tố t trong viê ̣c giê ̣t trƣ̀ giun đũa [7]. Với n ồng độ thấp, nitrofuran có tác dụng kháng sinh, nồng độ cao có tác dụng diệt khuẩn. Theo nhiều báo cáo, nitrofuran tác dụng rất tốt trong viê ̣c diê ̣t khuẩ n salmonellosis, colisepticeamia. Nitrofuran còn có tác dụng kích thích dinh dƣỡng. Trộn nitrofuran với thức ăn, theo tỉ lệ thích hợp sẽ giúp cho gà và lợn còn tăng trọng nhanh. Nitrofuran ảnh hƣởng đến sức khỏe con ngƣời nhƣ gây ung thƣ và đột biến [7], khi thƣ̣c phẩ m có tồ n dƣ nitrofuran và các dẫn xuấ t của nó . Do đó hầ u hế t các nƣớc trên thế giới đã cấ m sƣ̉ du ̣ng kháng sinh nhóm nitrofuran trong chăn nuôi. Ở Việt Nam, bô ̣ Nông nghiê ̣p và phát triể n nông thôn đã quyế t đinh ̣ cấ m sƣ̉ du ̣ng ni trofuran cho vào trong thƣ́c ăn chăn nuôi [9]. EU đã quy 5
định yêu cầu giới hạn nhỏ nhất cần thực hiện phƣơng pháp (MRPL) đối với các chất chuyển hóa nhóm nitrofuran là 1 µg/kg [29]. 1.3. Dƣ lƣợng kháng sinh nhóm nitrofuran trong thực phẩm Từ năm 2002 – 2003 nitrofuran thƣờng xuyên đƣơ ̣c phát hiện thấ y trong thịt gia cầm và các sản phẩm nuôi trồng thủy sản nhập khẩu vào các nƣớc EU từ Thái Lan, Trung Quốc, Đài Loan, Ấn Độ, Việt Nam, Ecuador và Brazil [25]. Hơn nữa, dƣ lƣợng nitrofuran cũng đƣợc tìm thấy trong sản phẩm gia súc và gia cầm ở Châu Âu nhƣ: Bồ Đào Nha, Ý, Hy Lạp, Romania và Bulgari. Sau đó EU đã kiểm tra và cho thấy nitrofuran ô nhiễm trong các sản phẩm có nguồn gốc từ hơn 9 quốc gia trong năm 2007, tỷ lệ mắc cao nhất là từ Ấn Độ (37%), Trung Quốc (37%), Bangladesh (10%) và Thái Lan (5%) trong một loạt cá sản phẩm bao gồm tôm, mật ong và thịt hộp [25]. Từ tháng 10/2006 đến tháng 5/2007, FDA liên tục phát hiện thủy sản nhập khẩu từ Trung Quốc có nhiễm nitrofuran. Kết quả lấy trên các sản phẩm tôm, cá trê, cá ba sa..cho thấy, 22/89 mẫu (chiếm 22%) bị phát hiện có chất cấm nitrofuran trong tôm [11]. Ở Việt Nam theo kết quả khảo sát của TS . Nguyễn Quố c Ân , phó trƣởng phòng quản lý thuốc , cục thú y vào năm 2007 đã phát hiện 5 mẫu thủy sản nuôi lấ y tại ao nuôi nhiễm SEM (3 mẫu tôm, 1 mẫu cá và 1 mẫu cua lô ̣t) với hàm lƣơ ̣ng tƣ̀ 0 – 3,55 ng/g. Năm 2008 phát hiện 1 mẫu tôm thẻ chân trắ ng ta ̣i Phú Mỹ – Bình Định nhiễm AOZ với hàm lƣơ ̣ng 12,6 ng/g; 2/754 mẫu cua lô ̣t ta ̣i Cầ n Guô ̣c – Long An nhiễm SEM với hàm lƣơ ̣ng tƣ̀ 2 – 2,2 ng/g [1]. 1.4. Các phƣơng pháp xác định kháng sinh nhóm nitrofuran Hiê ̣n nay có nhiề u phƣơng pháp để xác đinh ̣ kháng sinh nhóm nitrofuran , bao gồ m: phƣơng pháp sắ c ký lỏng v ới detector UV , phƣơng pháp vi sinh (kỹ thuật Elisa), phƣơng pháp sắ c ký lỏng với detector MS/MS. 1.4.1. Phƣơng pháp sắc ký lỏng với detector UV Một số tác giả đã sử dụng phƣơng pháp sắc ký lỏng với detector tử ngoại khả kiến (HPLC-UV-VIS) để phân tích kháng sinh nhóm nitrofuran và các dẫn xuất của 6
nó trong một số đối tƣợng thực phẩm. Horne và cộng sự, đã xây dựng phƣơng pháp xác định AOZ, AMOZ trong gan lợn sử dụng HPLC – UV. Phƣơng pháp dựa trên sự dẫn xuất các nitrofuran với 2-nitrobenzaldehyde, sau đó chiết với ethyl acetate, làm sạch bằng n-hexan và phân tích bằng HPLC-UV sử dụng cột C18 kế t hơ ̣p với detector UV ở bƣớc sóng 275nm. Giới hạn phát hiện của phƣơng pháp là 5 và 10 µg/kg tƣơng ứng cho AOZ và AMOZ với độ thu hồi trong khoảng 71-101% [18]. Tác giả Cooper và cộng sự cũng giới thiệu phƣơng pháp xác định AOZ, AMOZ, AHD, SEM trong gan và thận của lợn dùng HPLC-UV đã tách đƣợc 4 chất chuyển hóa nhóm nitrofuran. Giới hạn phát hiện của phƣơng pháp là từ 2 – 5 µg/kg [21]. Phƣơng pháp HPLC -UV có ƣu điể m là dễ thực hiện , và có thể ứng dụng phân tić h rô ̣ng raĩ . Tuy nhiên phƣơng pháp la ̣i không đáp ƣ́ng đƣơ ̣c yêu cầ u về đô ̣ nhạy để phân tích các nitrofuran trong thực phẩm vì hiện nay giới hạn cần phải đạ t tới (MRPL) là 1 µg/kg. 1.4.2. Phƣơng pháp phân tích vi sinh (enzyme-linked immunosorbent assay- ELISA) Hiện nay, ELISA đƣợc sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu nhƣ y học, nông nghiệp và đặc biệt là trong các quy trình kiểm tra an toàn chất lƣợng các sản phẩm sinh học. Nguyên tắc chung đều dựa trên sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể, trong đó kháng thể đƣợc gắn với một enzyme, enzyme sẽ thủy phân thành một chất có màu . Phòng thí nghiệm randox của Anh đã nghiên cứu xác định các chất chuyển hóa nhóm nitrofuran sử dụng phƣơng pháp Elisa: mẫu đƣợc đồng nhất, thủy phân và dẫn xuất bằng o-NBA trong môi trƣờng axit HCl , trung hòa axit bằng NaOH, chiết và làm sạch mẫu bằng ethyl acetate và n-hexane. Giới hạn phát hiện của phƣơng pháp từ 0,2 – 0,6 ng/g [28]. Vass và cộng sự (2008) sử dụng kỹ thuật Elisa trực tiếp sử dụng kháng thể đặc hiệu cho NPSEM, kháng thể đƣợc gắn 1 enzym HRP xác định SEM trong trứng với quy trình xử lý mẫu: mẫu đƣợc đồng nhất, thủy phân và dẫn xuất bằng o-NBA 7
trong môi trƣờng axit HCl , sau đó trung hòa bằng NaOH, chiết và làm sạch mẫu bằng ethyl acetate và n-hexane. Giới hạn phát hiện của phƣơng pháp là 0,13 µg/kg, CCα = 0,3 µg/kg [25]. Diblikova và cộng sự (2005) giới thiê ̣u kỹ thuật Elisa trực tiếp, sử dụng kháng thể đặc hiệu cho NPAOZ, kháng thể đƣợc gắn 1 enzym HRP xác định AOZ trong tôm, thịt gà, thịt lợn, thịt bò với CCβ là 0,4 µg/kg, độ thu hồi từ 66 – 119% [20]. Lui và cộng sự (2007) giới thiê ̣u kỹ thuật Elisa gián tiếp, sử dụng kháng thể NFT, kháng thể đƣợc gắn 1 enzym HRP xác định AHD trong nƣớc. Giới hạn phát hiện là 0,2 µg/l, độ thu hồi từ 88 – 103% [31]. Tƣơng tự Chang và cộng sự (2008) xác định trong gan lợn, gan gà và cá với giới hạn phát hiện lần lƣợt là 0,19; 0,24; 0,18 µg/kg [15]. Phƣơng pháp Elisa đáp ƣ́ ng đƣơ ̣c yêu cầ u về đô ̣ nha ̣y , đơn giản dễ thƣ̣c hiê ̣n , tuy nhiên đô ̣ đă ̣c hiê ̣u bi ̣giới ha ̣n vì phải đánh dấ u cho tƣ̀ng kháng thể chuyên biê ̣t cho tƣ̀ng đố i tƣơ ̣ng. 1.4.3. Phƣơng pháp sắc ký lỏng khối phổ LC/MS/MS Đây là một phƣơng pháp nhanh, nhạy để xác định đồng thời dƣ lƣơ ̣ng nitrofuran. Sau khi qua cột tách, chất phân tích đƣợc hóa hơi, các hợp chất hữu cơ trung hoà bị ion hoá thành các ion phân tử hay ion mảnh của phân tử mang điện dƣơng hoặc âm, các gốc tự do. Sau đó, các ion đựơc đƣa sang bộ phận tách theo khối lƣợng. Từ các tín hiệu thu đƣợc, dựa vào khối lƣợng ion phân tử, dựa vào đồng vị, dựa vào các mảnh ion phân tử, dựa vào cơ chế tách và dựa vào ngân hàng dữ liệu các ion và mảnh ion, ngƣời ta định tính và định lƣợng đƣợc chất phân tích một cách chính xác. Ở Việt Nam năm 2004, Bộ Thủy sản (nay là Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn) đã ban hành TCN 194:2004 xác định các chất chuyển hóa thuộc nhóm nitrofuran trong thủy sản và sản phẩm thủy sản bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng khối phổ phân tích dƣ lƣợng liên kết với mô của các chất chuyển hóa nhóm nitrofuran trong sản phẩm thủy sản đƣợc thủy phân bằng axit clohydric loãng để thu đƣợc 8
mạch nhánh của các chất nhóm nitrofuran. Các mạch nhánh này đƣợc dẫn xuất bằng 2-nitrobenzaldehyde, sau đó đƣa pH đến 7 và đƣợc chiết bằng ethyl axetat. Dịch chiết đƣợc thổi khô bằng N2 đến cạn, hòa tan cặn, sau đó đo dung dich ̣ mẫu này bằ ng hệ thống LC/MS/MS với pha đô ̣ng kênh A là axit acetic , kênh B là acetonitril . Giới hạn phát hiện của phƣơng pháp là 1 µg/kg [10]. Năm 2002 phòng thử nghiệm thức ăn chăn nuôi của Thái Lan đƣa ra quy trình phân tích 4 chất chuyển hóa nhóm nitrofuran (AOZ, AMOZ, AHD, SEM) bằng LC/MS/MS giới hạn phát hiện lần lƣợt của từng chất là AHD 0,1 µg/kg; AOZ 0,04 µg/kg; SEM 0,15 µg/kg; AMOZ 0,02 µg/kg [29]. Tác giả Pascal Mottier và cộng sự, xác định 4 chất chuyển hóa nhóm nitrofuran trong thịt bằng LC/MS/MS với pha đô ̣ng kênh A là axit acetic 0,025%, kênh B là acetonitril , sƣ̉ du ̣ng quy trin ̀ h làm sạch bằng cột chiết pha rắn polymeric trƣớc khi phân tích bằ ng LC/MS/MS và thu đƣợc CCα từ 0,11 – 0,21 µg/kg, CCβ từ 0,19 – 0,36 µg/kg [26]. Trong tài liê ̣u [25] của tác giả M.Vass, tác giả Boket và cộng sự (2007) xác định các chất chuyển hóa nitrofuran trong trứng bằng LC/MS/MS, CCα lần lƣợt của từng chất AOZ, AMOZ, AHD, SEM là 0,03; 0,05; 0,22; 0,2. Độ thu hồi từ 95,2 – 102,1 %. Leitner và cộng sự xác định các chất chuyển hóa nhóm nitrofuran trong thịt gia súc, gia cầm bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng khối phổ LC/MS/MS với pha đô ̣ng kênh A là amoniacetat 10mM, kênh B là methanol, sƣ̉ du ̣ng quá trình làm sa ̣ch bằng cột chiết pha rắn SPE với chất hấp thụ polystyrene đƣợc kết hợp bằng cách thủy phân các chất chuyển hóa hình thành liên kết trong các mô và đƣợc dẫn xuất bằng 2-nitrobenzaldehyde. Giới hạn phát hiện của phƣơng pháp là 0,5 – 5 ng/g; giới hạn định lƣợng từ 2,5 – 10 ng/g [12]. Verdon và cộng sự năm 2007 cũng giới thiệu phƣơng pháp xác định các chất chuyển hóa nhóm nitrofuran trong thịt lợn bằng LC/MS/MS với cô ̣t C 18, pha đô ̣ng kênh A là amonifomiat 1mM, kênh B là methanol, sử dụng phƣơng pháp chiế t lỏng – lỏng thu đƣơ ̣c CCα = 0,08 – 0,54 µg/kg và CCβ = 0,10 – 0,66 µg/kg [19]. 9
Tác giả C.Bock và cộng sự đã thẩm định phƣơng pháp xác định dƣ lƣợng 4 chất chuyển hóa nhóm nitrofuran trong trứng bằng LC/MS/MS với CCα từ 0,03 – 0,22 µg/kg [14]. Các t ác giả Chung-Wei Tsai, Chuan-ho Tang và Wei-Hsien Wang đã xác định các chất chuyển hóa nitrofuran trên LC/MS/MS với pha đô ̣ng kênh A là amoniacetat 20mM, kênh B là methanol có giới hạn định lƣợng 1 µg/kg với CCα = 0,19 – 0,43 µg/kg. Khoảng tuyến tính từ 1 – 10 µg/kg [16]. Tác giả Lech Rodziewicz (2008), xác định các chất chuyển hóa nitrofuran trong sữa bằng LC/MS/MS với pha đô ̣ng kênh A là amoniacet at 0,5mM, kênh B là methanol. Phƣơng pháp có hê ̣ số biế n thiên nhỏ hơn 9,3%, độ tái lập nội bộ nhỏ hơn 13%, CCα từ 0,12 – 0,29 µg/kg, CCβ từ 0,15 – 0,37 µg/kg [22]. Tác giả Caroline Douny và cộng sự (2012), đã xác định các chất chuyển hóa nhóm nitrofuran, nghiên cứu ứng dụng để đánh giá furanzolidone trong tôm sú ở Việt Nam. Mẫu đƣợc đồng nhất, thủy phân và dẫn xuất bằng 2-nitrobenzaldehyte, chiết lỏng – lỏng bằng etylacetat trƣớc khi xác định bằ ng hệ thống LC/MS/MS với pha đô ̣ng kênh A là axit acet ic 0,1%, kênh B là acetonitril thu đƣơ ̣c CCα từ 0,08 – 0,36 µg/kg, CCβ từ 0,12 – 0,61 µg/kg [13]. Tóm lại: Các phƣơng pháp (phƣơng pháp sắ c ký lỏng với detector UV -VIS, phƣơng pháp hóa sinh Elisa , phƣơng pháp s ắc ký lỏng với detector MS /MS) đều có điểm chung là thủy phân để đƣa các chất chuyển hóa nitrofuran liên kết trong các mô thành dạng tự do sau đó sử dụng 2-nitrobenzaldehyde để chuyển nitrofuran thành các dẫn xuất tƣơng ứng. Các dẫn xuất này sau đó đƣợc chiết lỏng lỏng hoặc chiết pha rắn và phân tích bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng khối phổ. Phƣơng pháp này có ƣu điểm là có độ nhạy rất tốt, thƣờng từ 0,1 µg/kg có độ chọn lọc cao và có độ chính xác đáp ứng để xác định nitrofuran trong thực phẩm. Do đó trong nghiên cứu đề tài chúng tôi thống nhất lựa chọn phƣơng pháp LC-MS/MS với quá trình thủy phân bằng axit clohydric và dẫn xuất với 2-nitrobenzaldehyde để xác định các chất chuyển hóa của nitrofuran. 10
CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tƣợng, mục tiêu và nội dung nghiên cứu 2.1.1. Đối tƣợng, mục tiêu nghiên cứu Đối tƣợng nghiên cứu là các chất chuyển hóa của nitrofuran, bao gồm: AOZ, AMOZ, SEM và AHD. Vật liệu nghiên cứu là sản phẩm thực phẩm tƣơi sống bao gồm thịt và gan của gia súc gia cầm. Mục tiêu chung của đề tài là nghiên cứu xây dƣ̣ng phƣơng pháp xác định đồng thời 4 chất chuyển hóa nhóm nitrofuran: AOZ, AMOZ, AHD, SEM trong thực phẩm tƣơi sống bằng kỹ thuật sắc ký lỏng khối phổ LC/MS/MS. Các mục tiêu cụ thể nhƣ sau: - Xây dựng phƣơng pháp xác định đồng thời 4 chất chuyển hóa của nitrofuran trong thực phẩm tƣơi sống bằng LC-MS/MS. - Ứng dụng phƣơng pháp để xác định các chất chuyển hóa của nitrofuran trong thực phẩm tƣơi sống cụ thể trong thịt lợn, thịt bò, thịt gà, gan. 2.1.2. Nội dung nghiên cứu 2.1.2.1. Xây dựng phƣơng pháp  Khảo sát phƣơng pháp bao gồm:  Điều kiện và thông số vận hành máy LC/MS/MS,  Điều kiện tách chiết lấ y chấ t phân tić h.  Thẩm định phƣơng pháp:  Giới hạn phát hiện LOD, giới hạn định lƣợng LOQ,  Khoảng tuyến tính,  Độ chụm (độ lặp lại),  Độ đúng (độ thu hồi, độ chệch). 2.1.2.2. Ứng dụng phƣơng pháp Áp dụng phƣơng pháp mới xây dựng để xác định dƣ lƣợng kháng sinh nhóm nitrofuran cụ thể là các chất chuyển hóa nhóm nitrofuran trong thực phẩm tƣơi sống đang bán trên địa bàn Hà Nội. 11