Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Xác định đồng thời hàm lượng Nisin A và Nisin Z trong các sản phẩm dinh dưỡng bằng sắc kí lỏng khối phổ hai lần (LC – MS/MS)

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:96

Thêm vào BST

Báo xấu

61
lượt xem 4
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu nghiên cứu của Luận văn nhằm xây dựng phương pháp xác định đồng thời Nisin A và Nisin Z bằng sắc kí lỏng khối phổ hai lần (LC – MS/MS). Ứng dụng phương pháp để xác định hàm lượng Nisin A và Nisin Z trong một số sản phẩm dinh dưỡng. Mời các bạn cùng tham khảo!

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Xác định đồng thời hàm lượng Nisin A và Nisin Z trong các sản phẩm dinh dưỡng bằng sắc kí lỏng khối phổ hai lần (LC – MS/MS)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN 9ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI --------------------- TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------- Trần Thị Hƣờng Trần Thị Hƣờng XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI NISIN A VÀ NISIN Z TRONG SẢN PHẨM DINH DƢỠNG XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI BẰNG SẮC KÍ LỎNG KHỐI PHỔ NISIN A VÀ NISIN Z TRONG SẢN PHẨM DINH DƢỠNG BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÍ LỎNG KHỐI PHỔ Chuyên ngành: Hóa phân tích Mã số: 8440112.03 LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC Hà Nội - 2020 Hà Nội - 2020
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------- Trần Thị Hƣờng XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI NISIN A VÀ NISIN Z TRONG SẢN PHẨM DINH DƢỠNG BẰNG SẮC KÍ LỎNG KHỐI PHỔ Chuyên ngành: Hóa phân tích Mã số: 8440112.03 LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. Lê Thị Hồng Hảo PGS.TS. Nguyễn Thị Ánh Hƣờng Hà Nội - 2020
LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên cho em gửi lời cảm ơn sâu sắc tới cô PGS.TS. Lê Thị Hồng Hảo, Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia – Bộ Y tế, và cô PGS.TS Nguyễn Thị Ánh Hƣờng, Trường Đại học Khoa học tự nhiên – ĐHQGHN đã tận tình hướng dẫn, đóng góp những ý kiến quý báu, tạo mọi điều kiện giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện đề tài và viết luận văn. Em xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy cô giáo giảng dạy tại khoa Hoá học, đặc biệt là các thầy cô trong bộ môn Hoá Phân Tích, đã cho em những kiến thức quý giá, tạo điều kiện cho em được học tập và nghiên cứu trong môi trường hiện đại. Tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới ban lãnh đạo Trung tâm kiểm soát Bệnh tật tỉnh Nam Định đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi được học tập và hoàn thành đề tài này. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới TS.Vũ Thị Trang và ThS. Lê Thị Thúy cùng các đồng nghiệp tại khoa Dinh dưỡng và phụ gia thực phẩm – Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia, các đồng nghiệp tại labo Hóa – Trung tâm kiểm soát Bệnh tật tỉnh Nam Định đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình làm thực nghiệm. Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và bạn bè đã luôn động viên, chia sẻ mọi khó khăn cùng tôi.
MỤC LỤC MỞ ĐẦU ......................................................................................................................... 1 CHƢƠNG 1 : TỔNG QUAN ........................................................................................ 3 1.1. Giới thiệu chung về chất bảo quản ........................................................................ 3 1.1.1. Định nghĩa chất bảo quản ...................................................................................... 3 1.1.2. Phân loại chất bảo quản......................................................................................... 3 1.2. Giới thiệu về chất bảo quản nhóm Nisin (E234) .................................................. 3 1.2.1. Lịch sử phát hiện ................................................................................................... 3 1.2.2. Giới thiệu Nisin ..................................................................................................... 4 1.2.3. Tính chất của Nisin ............................................................................................... 8 1.2.4. Phân loại Nisin ...................................................................................................... 9 1.2.5. Cơ chế hoạt động của Nisin ................................................................................ 10 1.2.6. Độc tính và những ứng dụng của nisin trong bảo quản thực phẩm .................... 12 1.2.7. Giới hạn cho phép của Nisin trong thực phẩm.................................................... 14 1.3. Các phƣơng pháp xác định Nisin A và Nisin Z .................................................. 16 1.3.1. Phương pháp ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) ............................ 16 1.3.2. Phương pháp sắc kí lỏng kết nối với detector UV .............................................. 18 1.3.3. Phương pháp điện di mao quản ........................................................................... 19 1.3.4. Phương pháp sắc kí lỏng với detector khối phổ LC – MS/MS ........................... 20 CHƢƠNG 2 : NỘI DUNG VÀ CÁC PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................ 26 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu............................................................................................ 26 2.2. Nội dung nghiên cứu ............................................................................................. 26 2.2.1. Khảo sát điều kiện phân tích trên thiết bị LC-MS/MS ....................................... 26 2.2.2. Khảo sát quy trình xử lý mẫu .............................................................................. 26 2.2.3. Thẩm định phương pháp ..................................................................................... 27
2.2.4. Phân tích hàm lượng Nisin A và Nisin Z trong một số mẫu sản phẩm dinh dưỡng ............................................................................................................................. 27 2.3. Thiết bị, dụng cụ .................................................................................................... 27 2.3.1. Thiết bị ................................................................................................................ 27 2.3.2. Dụng cụ ............................................................................................................... 28 2.4. Hóa chất, chất chuẩn............................................................................................. 29 2.4.1. Chất chuẩn ........................................................................................................... 29 2.4.2. Các loại hóa chất, dung môi khác ....................................................................... 30 2.5. Phƣơng pháp nghiên cứu...................................................................................... 30 2.5.1. Phương pháp lấy mẫu .......................................................................................... 30 2.5.2. Phương pháp xử lý mẫu .................................................................................. 3031 2.5.3. Phương pháp phân tích ........................................................................................ 32 2.5.4. Phương pháp xử lý số liệu ................................................................................... 34 2.5.5. Phương pháp thẩm định: theo quy định của ISO 17025, AOAC ........................ 34 2.5.6. Phương pháp định lượng ................................................................................. 3738 CHƢƠNG 3 : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................. 39 3.1. Tối ƣu hóa điều kiện phân tích Nisin A và Nisin Z trên thiết bị LC-MS/MS.. 39 3.1.1. Tối ưu các thông số của detector (MS/MS) ........................................................ 39 3.1.2. Tối ưu hóa các điều kiện của sắc kí lỏng ............................................................ 40 3.2. Khảo sát quá trình xử lý mẫu .............................................................................. 46 3.2.1. Khảo sát nồng độ dung dịch amoni acetate - NaCl trong dung môi chiết .......... 47 3.2.2. Lựa chọn pH trong dung dịch đệm...................................................................... 48 3.2.3. Khảo sát tỷ lệ dung môi chiết .............................................................................. 49 3.2.4. Khảo sát thời gian rung siêu âm .......................................................................... 50 3.2.5. Khảo sát số lần chiết mẫu.................................................................................... 51 3.2.6. Tối ưu hóa quy trình làm sạch mẫu ..................................................................... 52 3.2.7. Khảo sát tốc độ rửa giải qua cột chiết pha rắn .................................................... 53
3.2.8. Khảo sát thể tích dung môi rửa giải qua cột chiết pha rắn .................................. 54 3.3. Đánh giá phƣơng pháp phân tích ........................................................................ 56 3.3.1. Độ đặc hiệu của phương pháp ............................................................................. 56 3.3.2. Xây dựng đường chuẩn ................................................................................... 5758 3.3.3. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) của phương pháp ..... 59 3.3.4. Độ lặp lại ......................................................................................................... 5960 3.3.5. Độ đúng (độ thu hồi) ........................................................................................... 61 3.4. Phân tích mẫu thực tế ....................................................................................... 6364 KẾT LUẬN ................................................................................................................... 66 TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................... 67 TIẾNG VIỆT ................................................................................................................ 67 TIẾNG ANH ............................................................................................................. 6768 PHỤ LỤC ...................................................................................................................... 74
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Ký hiệu Tiếng Anh Tiếng Việt Association of Official Hiệp hội các nhà phân tích chính AOAC Analytical Chemmist thức ACN Acetonitrile Acetonitril CE Collision energy Năng lượng va chạm ESI Eelectrospray ionization Chế độ ion hóa phun điện tử IP Identification point Điểm nhận dạng IPA Isopropanol Isopropanol International Union of Pure Liên minh quốc tế về hóa học cơ IUPAC and Applied Chemistry bản và ứng dụng LOD Limit of Detection Giới hạn phát hiện LOQ Limit of Quantitative Giới hạn định lượng MRL Maximum Residue Limit Giới hạn dư lượng tối đa MeOH Methanol Metanol Ultra high performance UHPLC Sắc ký lỏng siêu hiệu năng cao liquid chromatography SD Standard deviation Độ lệch chuẩn RSD Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tương đối TFA Acid Triflouroacetic Acid Triflouroacetic Ultra high performance Sắc ký lỏng siêu hiệu năng kết UHPLC-MS/MS liquid chromatography nối khối phổ hai lần tandem mass spectrometry
DANH MỤC HÌNH VẼ Hình 1.1. Cấu tạo chung Nisin ......................................................................................... 5 Hình 1.2. Cấu trúc phân tử Nisin A ................................................................................. 6 Hình 1.3. Cấu trúc phân tử Nisin Z .................................................................................. 6 Hình 1.4. Cơ chế hoạt động Nisin lên tế bào chất.......................................................... 12 Hình 2.1. Hệ thống thiết bị UPLC – MS/MS ................................................................. 28 Hình 2.2. Sơ đồ quy trình phân tích mẫu dự kiến để xác định Nisin A và Nisin Z ....... 32 Hình 3.1. Ảnh hưởng nồng độ acid formic .................................................................... 43 Hình 3.2. Sắc đồ chương trình gradient 1 ...................................................................... 45 Hình 3.3. Sắc đồ chương trình gradient 2 ...................................................................... 45 Hình 3.4. Sắc đồ chương trình gradient 3 ...................................................................... 45 Hình 3.5. Đồ thị ảnh hưởng của nồng độ dung dịch chiết mẫu ..................................... 47 Hình 3.6. Đồ thị khảo sát sự ảnh hưởng của pH dung dịch đệm ................................... 48 Hình 3.7. Đồ thị khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ dung dịch đệm và MeOH ....................... 4950 Hình 3.8. Đồ thị khảo sát ảnh hưởng thời gian chiết ................................................. 5051 Hình 3.9. Đồ thị khảo sát ảnh hưởng của số lần chiết ............................................... 5152 Hình 3.10. Ảnh hưởng của quy trình làm sạch .......................................................... 5253 Hình 3.11. Ảnh hưởng của tốc độ rửa giải ................................................................. 5354 Hình 3.12. Đồ thị khảo sát thể tích dung dịch rửa giải ............................................. 5455 Hình 3.13. Sơ đồ quy trình tối ưu phân tích Nisin ..................................................... 5556 Hình 3.14. Phổ khối Nisin A và Nisin Z của mẫu trắng ............................................ 5657 Hình 3.15. Phổ khối Nisin A và Nisin Z của mẫu chuẩn ........................................... 5657 Hình 3.16. Phổ khối Nisin A và Nisin Z của mẫu trắng thêm chuẩn......................... 5657 Hình 3.17. Đường chuẩn Nisin A .................................................................................. 58 Hình 3.18. Đường chuẩn Nisin Z ............................................................................... 5859
DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Giới hạn tối đa cho phép đối với Nisin trong thực phẩm .............................. 15 Bảng 1.2. Bảng tóm tắt một số nghiên cứu xác định Nisin A và Nisin Z bằng các phương pháp khác nhau. ................................................................................................ 23 Bảng 2.1. Yêu cầu về số điểm IP đạt được đối với các kỹ thuật khối phổ khác nhau ... 35 Bảng 3.1. Các thông số tối ưu hóa điều kiện phân mảnh ............................................... 40 Bảng 3.2. Chương trình gradient được lựa chọn ............................................................ 42 Bảng 3.3. Chương trình rửa giải gradient ...................................................................... 44 Bảng 3.4. Điều kiện tách, định lượng Nisin A và Nisin Z trên thiết bị LC-MS/MS ..... 45 Bảng 3.5. Số điểm IP của Nisin A và Nisin Z ........................................................... 5657 Bảng 3.6. Phương trình đường chuẩn của Nisin A và Nisin Z .................................. 5758 Bảng 3.7. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của Nisin A và Nisin Z .............. 59 Bảng 3.8. Kết quả đánh giá độ lặp lại của phương pháp ............................................... 60 Bảng 3.9. Độ thu hồi của Nisin A trên các nền mẫu khác nhau .................................... 61 Bảng 3.10. Độ thu hồi của phương pháp với Nisin Z trên các nền mẫu khác nhau ...... 62 Bảng 3.11. Kết quả phân tích ......................................................................................... 64
MỞ ĐẦU Trong những năm gần đây, vấn đề vệ sinh an toàn thực phẩm luôn thu hút được sự quan tâm của toàn xã hội, của mọi quốc gia trên thế giới. Cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, nhiều kỹ thuật mới, hiện đại đã và đang được áp dụng để tạo ra những sản phẩm mới với chất lượng đáp ứng nhu cầu ngày càng cao của người tiêu dùng. Tuy nhiên để tạo ra nhiều sản phẩm phù hợp với sở thích và khẩu vị của người tiêu dùng mà vẫn giữ được chất lượng toàn vẹn của thực phẩm cho đến khi sử dụng, trong quá trình chế biến, nhà sản xuất đã sử dụng các nhóm chất bảo quản để tăng giá trị thương phẩm và kéo dài thời gian sử dụng của thực phẩm. Trên thị trường hiện nay, có rất nhiều loại chất bảo quản dùng để kéo dài thời gian sử dụng thực phẩm, nhưng đa số các chất này được tổng hợp nhân tạo đã gây ra nhiều tác dụng phụ không mong muốn do khó bị phân huỷ, để lại dư lượng trong thực phẩm. Gây ngộ độc cấp tính nếu liều lượng dùng quá giới hạn cho phép, gây ngộ độc mãn tính nếu dùng với thời gian kéo dài, liên tục, nguy cơ gây hình thành khối u, đột biến gen… [21, 22, 62]. Do đó, các nhà nghiên cứu cũng như các nhà sản xuất ngày càng có xu hướng sử dụng các chất bảo quản có nguồn gốc sinh học, tự nhiên để dần thay thế chất bảo quản có nguồn gốc hóa học, mà vẫn đáp ứng được nhu cầu tiêu dùng các loại thực phẩm an toàn, đảm bảo chất lượng, kéo dài được thời gian sử dụng. Việc sử dụng các chất kháng khuẩn có nguồn gốc sinh học như bacteriocin, đặc biệt là Nisin A và Nisin Z trong bảo quản, chế biến thực phẩm đang được quan tâm nhiều. Ngoài khắc phục được những nhược điểm của phương pháp sử dụng hoá chất, nhiệt độ, chiếu xạ,... Nisin còn có nhiều ưu điểm khác như phạm vi ứng dụng rộng, giảm thời gian và nhiệt độ thanh trùng của sản phẩm, đảm bảo chất lượng, giá trị dinh dưỡng, cảm quan vị sản phẩm. Mặc dù nhóm chất bảo quản Nisin được coi là khá an toàn đối với sức khỏe con người và không gây ảnh hưởng đến môi trường, nhưng cần tuân thủ theo các quy định khác nhau của mỗi quốc gia về mức cho phép Nisin trong thực phẩm. Hiện nay trên thế 1
giới và trong nước đã có một số nghiên cứu được công bố về phương pháp xác định riêng rẽ hoặc đồng thời Nisin A và Nisin Z bao gồm: phương pháp sinh học [48] [63], sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với detector UV-Vis [41], điện di mao quản (CE) [58] [59], sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS/MS) [3] [25] [38] [57]. Tuy nhiên, phương pháp HPLC, CE hay sinh học thường khá phức tạp và kém chính xác do ảnh hưởng của nền mẫu cũng như kích thước lớn của phân tử Nisin. Phương pháp LC-MS/MS có ưu điểm phân tích nhanh, tiết kiệm thời gian và dung môi, độ nhạy cao và nhận diện được đồng thời các hợp chất có tính chất và cấu trúc tương đồng nhau nên đã được lựa chọn để xác định đồng thời Nisin A và Nisin Z trong nghiên cứu này. Trên cơ sở đó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Xác định đồng thời hàm lượng Nisin A và Nisin Z trong các sản phẩm dinh dưỡng bằng sắc kí lỏng khối phổ hai lần (LC – MS/MS)” với các mục tiêu như sau:  Xây dựng phương pháp xác định đồng thời Nisin A và Nisin Z bằng sắc kí lỏng khối phổ hai lần (LC – MS/MS).  Ứng dụng phương pháp để xác định hàm lượng Nisin A và Nisin Z trong một số sản phẩm dinh dưỡng. 2
CHƢƠNG 1 : TỔNG QUAN 1.1. Giới thiệu chung về chất bảo quản 1.1.1. Định nghĩa chất bảo quản Chất bảo quản là các hóa chất tự nhiên hay tổng hợp được thêm vào sản phẩm như thực phẩm, dược phẩm, sơn, các mẫu phẩm sinh học v.v.. để ngăn ngừa hoặc làm chậm lại sự thối rữa, hư hỏng gây ra bởi sự phát triển của các vi sinh vật hay do các thay đổi không mong muốn về mặt hóa học. Chúng có thể được sử dụng như là một hóa chất duy nhất mà cũng có thể trong tổ hợp với nhiều loại hóa chất có các tác dụng khác. 1.1.2. Phân loại chất bảo quản Theo mục đích của quá trình, có thể phân loại chất bảo quản thành hai nhóm: - Nhóm chất bảo quản (preservative) thường được gọi là chất bảo quản: Ngăn ngừa vi sinh vật, nấm nem, nấm mốc phát triển. - Các chất kháng sinh: Steptomixin, các loại penixilin... - Nhóm chất ngăn chặn quá trình oxi hóa các thành phần dinh dưỡng của sản phẩm, thường được gọi là chất chống oxi-hóa (antioxidant): acid scorbic, acid citric, acid tactric, dẫn xuất tocopherol… Có tác dụng làm chậm sự biến chất, ôi khét, biến màu của thực phẩm. Theo nguồn gốc của chất bảo quản có thể chia chúng thành: - Chất bảo quản có nguồn gốc tự nhiên: Là những chất chiết xuất từ tự nhiên, có khả năng kéo dài thời gian sử dụng của sản phẩm. - Chất bảo quản tổng hợp: Được tổng hợp nhân tạo bằng phương pháp hóa học. 1.2. Giới thiệu về chất bảo quản nhóm Nisin (E234) 1.2.1. Lịch sử phát hiện Nisin được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1928 từ hiện tượng Streptococcus lactis gây ức chế Lactobacillus bulgaricus [51]. 3
Năm 1985, theo khoá phân loại của Schleifert và cộng sự, phân loại chủng sinh tổng hợp Nisin thuộc loài Lactococcus lactis [56]. Năm 1947, Mattick và Hirsch đã nghiên cứu thành công đặc tính của phân tử và tên thuật ngữ đầu tiên được đặt là “ chất ức chế Nisaplin” [42]. Năm 1951, Hirsch đã chứng minh việc sử dụng chủng vi khuẩn Lactococcus Lactic sinh Nisin làm giống khởi động có thể ngăn chặn sự hư hỏng phomat gây ra bởi Clostridium butulium [33]. Năm 1957, Apilin và Barrett đã đưa ra chế phẩm thương mại đầu tiên. Dạng chế phẩm Nisin sẵn có nhất hiện nay trên thị trường đó là NisaplinTM, với thành phần 2,5% Nisin. Năm 1959, Nisin được chấp thuận để sử dụng làm chất bảo quản ở Anh [65]. Năm 1969, tổ chức Nông nghiệp và Thực phẩm thế giới (FAO/WHO) đã chính thức công nhận Nisin là an toàn và cho phép sử dụng như chất bảo quản thực phẩm với liều lượng 400IU/g [6] [16] [36] [37] [50] [54]. Năm 1971, Gross và Morell đưa ra cấu trúc hoàn chỉnh của phân tử Nisin [27]. Năm 1988, Nisin chính thức được Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Mỹ (FDA) công nhận là an toàn và coi là chất bảo quản có nguồn gốc sinh học [36] [46] [50] [54]. Năm 1995, Cơ quan an toàn thực phẩm châu Âu (EFSA) đã phê duyệt cho một số sản phẩm thực phẩm với việc sử dụng Nisin (E234) làm chất bảo quản cho ngành công nghiệp theo Chỉ thị 95/2/EC [5]. Hiện nay, Nisin được sử dụng ở trên hơn 50 quốc gia bao gồm các nước trong liên minh Châu Âu và một số nước ở Châu Á, Châu Phi [4] [6] [16] [17] [35] [50]. 1.2.2. Giới thiệu Nisin Nisin là một bacteriocin, có bản chất là một peptid đa vòng có tính kháng khuẩn mạnh, chứa 34 acid amin, được sản xuất bằng cách lên men sử dụng nhóm vi khuẩn Gram (+) thuộc loài Lactococcus, Streptococcus [19] [39]. Nó là bacteriocin duy nhất 4
đã được Tổ chức Y tế Thế giới cho phép sử dụng làm chất bảo quản thực phẩm và nó được thương mại hóa dưới dạng bột cô đặc khô. Hoạt chất này chứa các acid amin không thông dụng như Lanthionin (Lan), Methyllanthionin (Melan), Didehydroalanin (Dha) và Didehydroalaninbutyric (Dhb). Cho tới nay, các nhà khoa học đã phát hiện được 6 biến thể Nisin khác nhau từ A đến Z và U. Trong khuôn khổ luận văn này chỉ nghiên cứu hai biến thể tự nhiên là Nisin A và Nisin Z. Công thức phân tử Nisin A: C143H230N42O37S7, khối lượng phân tử: 3358,53 (Da), pI 8,52 Công thức phân tử Nisin Z: C141H245N41O46S7, khối lượng phân tử: 3335,91 (Da), pI 8,51 Công thức cấu tạo chung của Nisin trong hình 1.1. Hình 1.1. Cấu tạo chung Nisin 5
Cấu trúc phân tử của Nisin A và Nisin Z được thể hiện trong hình 1.2 và 1.3. Hình 1.2. Cấu trúc phân tử Nisin A Hình 1.3. Cấu trúc phân tử Nisin Z Cấu trúc của Nisin được Gross và Morell làm sáng tỏ năm 1971 [27]. Hợp chất Nisin là một bacteriocin thuộc nhóm I- còn gọi là nhóm Lantibiotic trong hệ thống phân loại 4 nhóm. Nisin được cấu tạo bởi 34 acid amin, trong đó có một số acid amin dị thường như: sự khử nước ở acid amin serine và threonine tạo acid amin Dehydroalanine (Dha) và Dehydrobutyrine (Dhb). Các acid amin liên kết nhau qua cầu nối lưu huỳnh tạo 5 vòng 6
cấu trúc đặc trưng A, B, C, D, E, (hình 1.2 và hình 1.3) [27] và được tổng hợp bởi một số chủng thuộc dưới loài L.lactis subsp. lactis, thường được viết là L. Lactis [12] [34] [64]. Nisin có cấu trúc xoắn α tương tự colixin, khoảng cách của cầu nối C – S là 1,83 A0 và góc C – S – C là 103 A0. Phân tử Nisin có gốc amin và cacboxyl ở cuối nhóm, năm vòng bên trong được tạo bởi liên kết thioether. Vòng đầu tiên Ala-S-Ala là Lanthionine, 4 vòng còn lại Abu-S-Ala là các β-methyllanthionine. Ngoài cầu nối disulfide giữa dạng Lanthionine với methyllanthionine, mạch peptide còn nối với nhau bằng –NH− tạo ra dạng polymer hay nhiều monomer [34]. Nisin không hấp phụ ở bước sóng 260 nm hay 280 nm do trong cấu trúc phân tử của nó không chứa các acid amin thơm. Các acid amin dị thường đóng vai trò như một nhóm ái nhân (nucleophile), được xác định thông qua khả năng phản ứng với các mercaptan. Có thể vì các nhóm này rất quan trọng để đảm bảo Nisin có khả năng xâm nhập vào màng tế bào đích. Cấu trúc gồm 5 vòng của Nisin giúp cho nó có độ vững chắc, đồng thời góp phần đề kháng lại các tác dụng của enzym proteinase và sự biến tính do nhiệt. Nisin có thể tồn tại ở dạng monomer với khối lượng phân tử 3500 Da (3.5Kda). Do các phân tử Nisin có thể tương tác liên kết với nhau thông qua các nhóm acid Dehydroamin và các nhóm amin nên Nisin có thể tồn tại ở dạng dimer ổn định hơn hay tetramer với khối lượng phân tử tương ứng là 7000Da và 14000 Da [7]. Những thành tựu nghiên cứu sinh học phân tử gần đây chứng minh Nisin bao gồm một số peptide có tính kháng khuẩn, một sản phẩm dị gen, bao gồm 11 gen như sau: Nis A, Nis B, Nis T, Nis C, Nis I, Nis P, Nis R, Nis K, Nis F, Nis E và Nis Z. Trong tự nhiên, một số loại Nisin đã được xác định. Các biến thể chính được gọi là Nisin A, Z và Q với các hoạt tính sinh học khác nhau, tuy nhiên Nisin là A và Z là hai biến thể được ứng dụng nhiều nhất. Cấu tạo của Nisin A và Z chỉ khác nhau bởi một acid amin ở vị trí thứ 27, histidine trong cấu trúc của Nisin A, trong khi asparagine ở 7
Nisin Z. Các nghiên cứu cuối cùng đã chỉ ra rằng Nisin Z dễ hòa tan hơn Nisin A ở độ pH gần trung tính vì asparagin có chuỗi bên phân cực nhiều hơn so với histidine. Sự khác biệt về cấu trúc này không ảnh hưởng đến hoạt động kháng khuẩn nhưng nó làm thay đổi một số tính chất: Nisin Z dễ hòa tan hơn và sự phân bố của nó trong thực phẩm được chứng minh là cao hơn [9]. 1.2.3. Tính chất của Nisin Nisin là một bacteriocin tương đối bền nhiệt. Hoạt tính kháng khuẩn của Nisin được giữ lại hoàn toàn ở pH = 2,0 sau khi hấp tiệt trùng ở 121°C nhưng mất hoàn toàn sau 30 phút ở 63°C ở pH = 11[30]. Độ bền nhiệt của Nisin phụ thuộc vào pH, pH càng thấp thì độ bền nhiệt càng cao [52]. So với các bacteriocin khác, Nisin có độ bền nhiệt hơn hẳn. Nisin là một hợp chất tan trong nước và không tan được trong dung môi không phân cực. Khả năng hoà tan của Nisin cũng phụ thuộc nhiều vào môi trường pH. Nó hòa tan tốt nhất ở pH = 2,0, tại pH = 2,5 giảm xuống còn 60%, tại pH = 5,0 giảm xuống còn 4% và hầu như không tan ở pH trung tính và kiềm. Nisin hòa tan ở pH = 2,0 nhiều hơn 228 lần so với ở pH = 8,0 [40]. Khi hoà tan Nisin trong HCl pH = 2,5 (hoặc thấp hơn) tại nhiệt độ sôi mà không mất hoạt tính và thậm chí khi thanh trùng cũng không mất hoạt tính. Nisin có độ hoà tan thấp ở pH trung tính [34]. Khi pH >7 xảy ra hiện tượng mất hoạt tính không thể khắc phục kể cả ở nhiệt độ thường [34]. Nồng độ muối cũng ảnh hưởng đến độ bền của Nisin. Hoạt tính Nisin tăng lên khi có mặt NaCl từ 0% đến 4%. Trong dung dịch 4 – 10% NaCl, hoạt tính Nisin còn giữ được 80% [2]. Tính chất này cho thấy tiềm năng áp dụng Nisin trong bảo quản các sản phẩm thực phẩm có nồng độ muối cao. Theo Linda J. Harris và cộng sự (1992) [31], H. Chen và D.G. Hoover năm 2003 [6] Nisin rất nhạy cảm với enzym α – Chymotrypsin và không bị phân hủy bởi enzym trypsin, elastase, carboxypeptidase A, pepsin. 8
Nisin bị phá huỷ bởi một số protease nhóm enzym thủy phân như α- chymotripsin, proteinase K của Bacillus cereus, Nisin thường bị hạn chế bởi một số protease đặc biệt là protease của dạ dày và của tuyến tuỵ. Nisin không được tìm thấy trong nước bọt của con người sau hơn 10 phút ăn thực phẩm có chứa Nisin. Đây là yếu tố quan trọng giúp Nisin trở thành một trong những chất bảo quản thực phẩm an toàn đối với con người được tin tưởng sử dụng hiện nay. 1.2.4. Phân loại Nisin Có ít nhất 6 dạng Nisin đã được phát hiện, ký hiệu từ A, Z, Q, F, H, và U. Nisin A [27], Nisin Z [43], Nisin Q [68] và Nisin F [14]. Nisin U [66], Nisin H [45]. Nisin A và Nisin Z khác nhau ở vị trí acid amin thứ 27 (Nisin A - histidin; Nisin Z –asparagin). Nisin A và Nisin F khác nhau ở 2 vị trí acid amin thứ 27 (Nisin A histidin; Nisin F- asparagin) và vị trí 30 (Nisin A- isoleucine và Nisin F- valine). Nisin Q khác biệt hơn cả, khác Nisin A ở 4 acid amin (ở vị trí thứ tự 15, 21, 27 và 30) và khác Nisin Z ở 3 acid amin (ở vị trí thứ tự 15, 21 và 30). Cho đến nay, bốn biến thể Nisin tự nhiên đã được nghiên cứu đặc tính là Nisin A, Z, Q và Nisin U. Trừ trường hợp Nisin U được tổng hợp bởi loài Streptococcus uberis, tất cả các biến thể Nisin khác đều do Lactococcus lactis sản xuất. Nisin A, Z và Q bao gồm 34 acid amin, trong đó 8 acid được biến đổi sau chuyển dịch. Mỗi phân tử trưởng thành này chứa một Lanthionine, bốn Methyllanthionin, hai Didehydroalanines và một Didehydrobutyrine [27] [43] [68]. Các Lanthionine tạo thành năm cấu trúc vòng (được ký hiệu là vòng A, B, C, D và E), và hai trong số các vòng này (D và E) được hợp nhất với nhau để tạo ra cấu trúc vòng kép. Cấu trúc của Nisin U về cơ bản giống nhau, mặc dù nó được cấu tạo bởi 31 acid amin và chỉ có một Didehydroalanin thay vào đó là hai Didehydrobutyrines [66]. Trong khuôn khổ luận văn chúng tôi quan tâm nghiên cứu đến hai chất là Nisin A và Nisin Z. Vì Nisin A và Nisin Z khá bền vững, phần đặc tính tương tự như kháng sinh được sử dụng làm chất bảo quản trong thực phẩm. 9
1.2.5. Cơ chế hoạt động của Nisin Nisin thuộc bacteriocin nhóm I-, có tác dụng diệt những vi khuẩn Gram (+) gồm những loài vi khuẩn có quan hệ họ hàng, các vi sinh vật gây bệnh như B. cereus, Enterococus, Lactobaccillus, Lactococcus, Leuconostoc, Pediococus, L. monocytogens, L. innocua, L.grayi, L.ivanovii, L.murayi, L.seeligeri, L.welchimeri, Staphylococus spp. Giá trị quan trọng của Nisin đối với việc bảo quản thực phẩm được thể hiện ở tác động của nó lên các vi khuẩn sinh bào tử như là Clostridium và Bacillus là tác nhân chính gây thối thực phẩm đặc biệt là các vi khuẩn gây bệnh, gây hỏng thực phẩm như Clostridium butiricum và Cl.Tyrobutiricum, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus [12] [19] [20] [34] [49]. Nisin có khả năng ức chế sự nảy mầm của chúng. Mặc dù không có khả năng ức chế và tiêu diệt vi khuẩn Gram (-) nhưng khi kết hợp với EDTA hoặc một vài nhân tố khác như nhiệt độ, acid ...thì Nisin có khả năng ức chế sự phát triển của vài loại vi khuẩn này [8]. Nisin cũng như phần lớn các bacteriocin khác không có khả năng ức chế và tiêu diệt vi khuẩn Gram (-), trừ Salmonella typhimurium, E. coli bị ức chế khi có mặt của EDTA. Ngoài ra bất kỳ sự ức chế nào của vi khuẩn lactic đối với vi khuẩn Gram (-) đều do các nguyên nhân khác chẳng hạn như pH thấp, H2O2, cạnh tranh về dinh dưỡng, hay do tính kỵ nước của chúng. Điều này được giải thích là do sự khác nhau của thành tế bào của vi khuẩn Gram (+) và Gram (-). Bacteriocin chỉ tạo được lỗ thủng trên thành tế bào Gram (+) mà không tạo được lỗ thủng trên thành tế bào Gram (-)[19]. Tác dụng của Nisin lên vi sinh vật nhạy cảm bao gồm 2 kiểu hình.  Kiểu tác dụng không đặc trưng: Nisin bám dính lên bề mặt của tế bào nhạy cảm của vi khuẩn mà không cần phải có bất kỳ một thụ thể đặc biệt nào của vi khuẩn Gram (+) và phá thủng màng tế bào, tại các lỗ thủng làm mất áp suất thẩm thấu các ion di chuyển qua màng tế bào một cách tự do dẫn đến sự rối loạn trong việc vận chuyển các chất dinh dưỡng qua màng tế bào làm thất thoát các ion tự do như kali, magie ra ngoài, ảnh hưởng đến sự tổng hợp ATP dẫn đến tiêu diệt vi khuẩn [20]. Một số nghiên cứu chỉ ra rằng khi bổ sung Nisin 10
vào các tế bào nhạy cảm (Staphylococcus cohnii, Bacillus subtilis, Micrococcus luteus, Streptococcus zymogenes) số lượng acid amin cũng như số lượng các ion RB+ và K+ trong tế bảo giảm mạnh, ngăn cản việc hấp thu proline và glutamin của các túi màng ở các tế bào này. Sự mất mát các ion này dẫn đến việc giảm nhanh chóng chênh lệch hiệu điện thế màng Δ. Những ảnh hưởng của Nisin đến thành phần proton, Δ, ΔpH, đã được kiểm chứng trên L.monocytogenes. Ngoài ra, làm giảm lượng ATP dự trữ của tế bào làm thoát các thành phần nội bào dẫn đến tiêu diệt vi khuẩn [20]. Năm 1993 Garriga và cộng sự [26] cho rằng Nisin tạo thành lỗ hổng trên màng giống như các kênh ngăn chặn (barrel-stave ) theo 3 bước: (1) các monome Nisin tạo liên kết với một màng mục tiêu, (2) Nisin chèn vào màng, (3) các phân tử Nisin tổng hợp để tạo thành lỗ hỏng trên màng tế bào chất. Các phân tử Nisin cũng có thể tổng hợp trước khi chèn vào màng tế bào.  Kiểu hình thứ 2: Nisin tương tác đặc hiệu với lipid II tiền tố peptidoglucan để phá thủng màng tế bào đích và sự tương tác đặc hiệu có sự tham gia của 2 peptide và lipid II tiền tố thành tế bào [28] được mô tả như Hình 1.4. Mức độ tác động của Nisin lên các loại vi khuẩn rất khác nhau, phụ thuộc vào thành phần của màng phospholipid của tế bào vi khuẩn [53]. Ở vi khuẩn Gram (+), peptidoglycan chiếm 90% khối lượng thành tế bào, số lớp peptidoglycan có thể lên tới 25 lớp. Trong khi đó ở vi khuẩn Gram (-) lượng peptidoglycan chỉ chiếm 10% tổng khối lượng thành tế bào, ngoài ra chúng còn có một lớp màng ngoài quan trọng (outer membrane – OM). Lớp màng ngoài này có cấu tạo lipid kép tương tự màng nguyên sinh chất nhưng không chỉ có phospholipids hình thành nên cấu trúc mà còn có polysaccharide và protein. Lipid và polysaccharide liên kết chặt chẽ với nhau tạo thành một cấu trúc lipopolysaccharide đặc biệt bên ngoài thành tế bào. Vi khuẩn Gram (-) có thể chống chịu lại nhiều tác nhân gây hại đối với tế bào là nhờ vào lớp màng ngoài OM có khả năng ngăn chặn các tác nhân đó một cách có hiệu quả. Lớp màng OM không cho phép các phân tử lượng lớn thẩm thấu qua mà 11