Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Xác định đồng thời một số kháng sinh nhóm quinolon trong tôm và nước nuôi tôm bằng phương pháp sắc lỏng hiệu năng cao

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:91

Thêm vào BST

Báo xấu

28
lượt xem 6
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu nghiên cứu của luận văn là sử dụng thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector huỳnh quang nhằm xác định đồng thời một số kháng sinh nhóm quinolon trong tôm và nước nuôi tôm bằng phương pháp sắc lỏng hiệu năng cao. Để hiểu rõ hơn, mơi các bạn tham khảo chi tiết nội dung luận văn này.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Xác định đồng thời một số kháng sinh nhóm quinolon trong tôm và nước nuôi tôm bằng phương pháp sắc lỏng hiệu năng cao

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ĐÀO THỊ VÂN KHÁNH XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI MỘT SỐ KHÁNG SINH QUINOLON TRONG TÔM VÀ NƢỚC NUÔI TÔM BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HÀ NỘI, 2015
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ĐÀO THỊ VÂN KHÁNH XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI MỘT SỐ KHÁNG SINH QUINOLON TRONG TÔM VÀ NƢỚC NUÔI TÔM BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) CHUYÊN NGÀNH: HÓA PHÂN TÍCH MÃ SỐ: 60440118 NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS. TS. LÊ THỊ HỒNG HẢO HÀ NỘI, 2015
LỜI CẢM ƠN Sau một thời gian nghiên cứu và học tập tôi đã hoàn thành luận văn cao học của mình với đề tài: “Xác định đồng thời một số kháng sinh quinolone trong tôm và nước nuôi tôm bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)” dưới sự hướng dẫn chỉ bảo của PGS. TS Lê Thị Hồng Hảo và các thầy cô, anh chị, các bạn trong bộ môn Hóa phân tích. Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tôi xin chân thành cảm ơn PGS. TS Lê Thị Hồng Hảo người đã giao đề tài và tận tình chỉ dẫn tôi trong quá trình hoàn thành luận văn. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới PGS. TS Kazuo HARADA khoa Dược Trường ĐH OSAKA Nhật Bản Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy cô trong Bộ môn hóa phân tích, các ban học viên lớp cao học K24 đã tạo điều kiện, giúp đỡ tôi trong thời gian thực hiện đề tài. Đồng thời tôi cũng xin được cảm ơn tới Ban Giám đốc Viện Pasteur Nha Trang, Giám đốc Trung tâm Kiểm nghiệm An toàn Vệ sinh Thực phẩm khu vực miền Trung cùng các bạn đồng nghiệp. Xin được cám ơn lãnh đạo và nhân viên chi Cục Nuôi trồng và Bảo vệ nguồn lợi thủy sản Khánh Hòa đã giúp tôi thực hiện việc thu thập mẫu thực hiện đề tài. Trong quá trình thực hiện khóa luận, tuy đã nỗ lực và cố gắng hết sức nhưng không tránh khỏi những thiếu sót kính mong ý kiến chỉ bảo, phê bình của quí thầy cô. Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng 11 năm 2015 Học viên Đào Thị Vân Khánh i
MỤC LỤC MỞ ĐẦU ---------------------------------------------------------------------------------------1 Chƣơng I. TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU -----------------------------------------------3 1. 1 Tổng quan về kháng sinh nhóm quinolon ------------------------------------------3 1.1.1 Cấu tạo của kháng sinh nhóm quinolon -----------------------------------------3 1.1.2 Cơ chế tác dụng và độc tính ------------------------------------------------------5 1.2 Tình hình sử dụng và tồn dƣ kháng sinh nhóm quinolon ----------------------6 1.2.1 Tình hình sử dụng và tồn dư kháng sinh nhóm quinolon trong nước-------6 1.2.2 Tình hình sử dụng và tồn dư kháng sinh nhóm quinolon trên thế giới ------8 1.3 Các phƣơng pháp xác định hàm lƣợng các chất nhóm quinolon ------------ 10 1.3.1 Phương pháp miễn dịch enzym (ELISA) --------------------------------------- 10 1.3.2 Phương pháp vi sinh vật---------------------------------------------------------- 11 1.3.3 Phương pháp hóa lý -------------------------------------------------------------- 13 2.1. Mục tiêu nghiên cứu ------------------------------------------------------------------ 21 2.2 Đối tƣợng và nội dung nghiên cứu ------------------------------------------------- 22 2.2.1 Đối tượng nghiên cứu ------------------------------------------------------------ 22 2.2.2 Nội dung nghiên cứu -------------------------------------------------------------- 22 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu ------------------------------------------------------------ 21 2.3.1 Khảo sát quy trình tối ưu phân tích đồng thời 7 quinolon ------------------- 21 2.3.2 Phương pháp lấy mẫu ------------------------------------------------------------ 23 2.3.3 Xử lý số liệu ------------------------------------------------------------------------ 23 2.4 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất dùng trong nghiên cứu -------------------------- 23 2.4.1. Thiết bị và dụng cụ --------------------------------------------------------------- 23 2.4.2 Hóa chất, chất chuẩn ------------------------------------------------------------- 24 ii
CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ---------------------------------------- 25 3.1 Tối ƣu các điều kiện trên thiết bị HPLC ------------------------------------------ 25 3.1.1 Khảo sát bước sóng kích thích và phát xạ của các chất --------------------- 27 3.1.2 Khảo sát pha động ------------------------------------------------------------------29 3.1.3 Khảo sát khoảng tuyến tính của các chất chuẩn -------------------------------36 3.2. Khảo sát các điều kiện xử lý mẫu phân tích ------------------------------------ 36 3.2.1 Giai đoạn làm sạch mẫu sử dụng cột chiết pha rắn (SPE) ----------------- 36 3.2.2 Khảo sát giai đoạn chiết mẫu --------------------------------------------------- 42 3.3 Thẩm định phƣơng pháp ------------------------------------------------------------- 45 3.3.1 Độ đặc hiệu------------------------------------------------------------------------ 46 3.3.2 Giới hạn phát hiện(LOD), giới hạn định lượng (LOQ) ---------------------- 48 3.3.3 Độ lặp lại, độ thu hồi ------------------------------------------------------------ 50 3.4. Kết quả phân tích đánh giá dƣ lƣợng kháng sinh ------------------------------ 52 3.4.1. Thu thập mẫu tôm nuôi và nước nuôi tôm ------------------------------------ 52 3.4.2 Kết quả phân tích mẫu ----------------------------------------------------------- 53 CHƢƠNG IV: KẾT LUẬN-------------------------------------------------------------- 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO ---------------------------------------------------------------- 57 iii
DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Công thức cấu tạo và pKa của các chất ...............................................4 Bảng 1.2: Giới hạn cho phép kháng sinh nhóm quinolon theo EEC No.2377/1990 .......................................................................................................6 Bảng 1.3: Giới hạn hàm lượng kháng sinh quinolon theo Thông tư 08/VBHN- BNNPTNT ............................................................................................................6 Bảng 1.4: Giới hạn hàm lượng kháng sinh quinolon theo Quyết định số 46/2007/QĐ-BYT .................................................................................................6 Bảng 1.5: Lượng kháng sinh tiêu thụ và sản phẩm thịt phát hiện có chứa kháng sinh quinolon ........................................................................................................9 Bảng 3.6: Bước sóng kích thích và phát xạ 07 chất phân tích ...........................29 Bảng 3.7: Chương trình gradient dung môi pha động tối ưu .............................36 Bảng 3.8: Phương trình hồi qui và hệ số tương quan của các chất phân tích ....37 Bảng 3.9 : So sánh diện tích píc dung dịch chuẩn bay hơi và không bay hơi ....39 Bảng 3.10: So sánh độ thu hồi giữa cột SPE C18 và cột HLB ..........................40 Bảng 3.11: Độ thu hồi theo thể tích mẫu nước ban đầu .....................................43 Bảng 3.12: Kết quả xác định giới hạn phát hiện đối với nền mẫu nước ............51 Hình 3.13: Sơ đồ chiết mẫu dự kiến ...................................................................52 Bảng 3.14 : Độ thu hồi, độ lặp lại của mẫu nước thêm chuẩn ...........................53 Bảng 3.15: Độ thu hồi, độ lặp lại của mẫu tôm thêm chuẩn .............................54 Bảng 3.16: Danh sách mẫu nước phát hiện chứa tồn dư kháng sinh .................55 iv
DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Công thức cấu tạo chung của quinolon .......................................................................... 3 Hình 1.2: Cân bằng acid - base của nhóm acidic quinolon ........................................... 3 Hình 1.3: Cân bằng acid base của nhóm piperazinyl quinolon .................................... 4 Hình 2.4: Sơ đồ quy trình xác định quinolon trong nước và trong tôm .................. 23 Hình 3.5: Phổ hấp thu và phát xạ của 07 chất phân tích........................................28 Hình 3.6: Kết quả khảo sát với 3 hệ dung môi ......................................................30 Hình 3.7: Sắc ký đồ OA và FMQ tại tốc độ dòng: 1,0; 1,5; 2,0mL/phút ..............32 Hình 3.8: Sự phụ thuộc của diện tích píc sắc ký theo pH của dung dịch đệm pha động .......................................................................................................................33 Hình 3.9: Sắc ký đồ 07 chất phân tích ở 3 nồng độ đệm .......................................34 Hình 3.10: Sắc ký đồ tách 07 chất nhóm quinolon ................................................35 Hình 3.11: So sánh diện tích pic các chất khi dùng các dung dịch rửa cột SPE ...41 Hình 3.12: Độ thu hồi theo thể tích rửa giải ..........................................................42 Hình 3.13: Sơ đồ chiết mẫu dự kiến ......................................................................44 Hình 3.14: Sắc ký đồ nền mẫu trắng chiết bằng 3 loại dung môi ..........................45 Hình 3.15: Biểu đồ so sánh 3 dung dịch chiết ......................................................45 Hình 3.16: Khảo sát pH của dung dịch chiết .........................................................46 Hình 3.17: Mẫu trắng nước nuôi tôm và nước nuôi tôm thêm chuẩn ...................49 Hình 3.18: Nền mẫu tôm thêm chuẩn và mẫu tôm ................................................49 Hình 3.19: Sắc ký đồ mẫu nước xác định LOD.....................................................51 Hình 3.20: Sắc ký đồ mẫu tôm xác định LOD ......................................................52 Hình 3.21: Sắc ký đồ mẫu tôm có phát hiện nhiễm ERFX ...................................56 v
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT AOAC Hiệp hội các nhà phân tích hóa học (Association of Official Analytical Chemists) ATVSTP An toàn vệ sinh thực phẩm BYT Bộ Y tế CPFX Ciprofloxacin DFLX Difloxacin DNFX Danofloxacin DAD Diot Array Detector DNA Deoxyribo Nucleic Acid EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid ELISA Phương pháp miễn dịch enzym (enzyme-linked immunosorbent assay) ERFX Enrofloxacin HLB Hydrophilic Lipophilic Balanced (cột cân bằng ưa nước ưa dầu) FMQ Flumequine FDA Hiệp hội thuốc và thực phẩm (Food and Drug Administration) FLD Deetecor huỳnh quang (Fluorescence detector) HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High-pressure liquid chromatography) LOD Giới hạn phát hiện (Limit of detection) LOQ Giới hạn định lượng (Limit of quantitaion) MPC Chiết cation hỗn hợp (Mixed-phase cation) NRFX Norfloxacin vi
MRL Mức dư lượng tối đa (Maximum Residue Levels) MeOH Methanol MeCN Acetonitrile MS Khối phổ (Mass Spectrophotometer) MBFX Marbofloxacin OFLX Ofloxacin OA Oxolinic acid SRFX Sarafloxacin SDS Sodium Dodecyl Sulfate SPE Chiết pha rắn (Solid Phase Extraction) QuEChERS Đơn giản, Dễ dàng, Rẻ, Hiệu quả, Ổn định, An toàn (Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged and Safe) RT Thời gian lưu (Retention Time) UPLC Sắc ký lỏng siêu hiệu năng (Ultra performance liquid chromatography) WHO Tổ chức Y tế thế giới (World Health Organisation) Ex Bước sóng kích thích (ExcitationWavelenght) Em Bước sóng phát xạ (EmissionWavelenght) vii
MỞ ĐẦU Vệ sinh an toàn thực phẩm luôn là vấn đề được quan tâm của toàn xã hội, của mọi quốc gia trên toàn thế giới. Thực phẩm không đảm bảo vệ sinh không những ảnh hưởng đến sức khỏe con người mà còn liên quan chặt chẽ đến năng suất lao động, hiệu quả phát triển kinh tế, thương mại, du lịch và an sinh xã hội... Trong những năm gần đây sự xuất hiện dư lượng kháng sinh trong thủy hải sản và thịt gia súc, gia cầm đã ít nhiều ảnh hưởng đến sức khỏe của người dân. Tác hại của thực phẩm có tồn dư kháng sinh đối với sức khỏe con người đã được nhiều nghiên cứu chỉ ra như: tạo ra vi khuẩn kháng kháng sinh, gây dị ứng, gây quái thai, gây rối loạn nội tiết và gây ung thư ở người. Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), Việt Nam nằm trong danh sách các nước có có tỷ lệ sử dụng kháng sinh cao nhất thế giới hiện nay, không chỉ sử dụng cho con người, các chất kháng sinh còn được sử dụng rộng rãi trong ngành chăn nuôi. Quinolon (hay còn được gọi là fluoroquinolone) là một họ kháng sinh có phổ tác dụng diệt khuẩn rộng, hiệu quả cao nên chúng được sử dụng rộng rãi không chỉ để chữa bệnh cho người mà còn được dùng để chữa bệnh cho gia cầm và thủy sản trong công nghiệp. Hậu quả là giảm hiệu quả của các kháng sinh quinolon đối với các chủng vi khuẩn gây khó khăn và tốn kém trong điều trị cho người bệnh. Theo thông báo của WHO năm 1999 có tới 11.000 người bị nhiễm khuẩn Campylobacter đã kháng quinolon do ăn thịt gà có chứa quinolon (năm 1998 là 8.000 người). Có nhiều phương pháp để xác định tồn dư kháng sinh nhóm quinolon như: phương pháp miễn dịch enzym (ELISA); phương pháp vi sinh vật (test vi sinh vật), phương pháp lý hóa. Phương pháp lý hóa sử dụng nhiều kỹ thuật khác nhau như sắc ký lỏng, điện hóa hòa tan, điện di mao quản, các phương pháp đều có độ chính xác, độ chọn lọc cao, phát hiện được một lượng nhỏ kháng sinh tồn dư trong thực phẩm. Phương pháp được sử dụng nhiều nhất là phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) sử dụng các loại detector như detector UV, detector huỳnh quang (FLD) và detector khối phổ (MS). Việc ứng dụng phương pháp HPLC phân tích nhóm quinlon trong các mẫu 1
môi trường và thực phẩm đã được làm nhiều trên thế giới nhưng ở Việt Nam sử dụng phương pháp HPLC với detector huỳnh quang vẫn còn hạn chế đặc biệt là tách đồng thời nhiều chất với Việt Nam hiện nay chưa có quy trình chính thống nào. Xuất phát từ tình hình thực tế, trên cơ sở các nghiên cứu khoa học trong và ngoài nước đã được công bố, với mục đích gia tăng số lượng chất xác định, sử dụng thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector huỳnh quang chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài: “Xác định đồng thời một số kháng sinh nhóm quinolon trong tôm và nước nuôi tôm bằng phương pháp sắc lỏng hiệu năng cao”. 2
Chƣơng I. TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 1. 1 Tổng quan về kháng sinh nhóm quinolon 1.1.1 Cấu tạo của kháng sinh nhóm quinolon Công thức cấu tạo chung của nhóm quinolon là hợp chất vòng thơm có chứa nitơ, vị trí thứ 4 có gắn nhóm keton, vị trí thứ 3 có gắn nhóm carboxylic. Các dẫn xuất của quinolon gồm những hợp chất ở các vị trí 1, 2, 6, 8 được gắn thêm các nhóm thế. Vị trí 1: có thể gắn thêm nhóm alkyl hoặc aryl; Vị trí 6: có thể gắn thêm F; Vị trí 2, 6, 8 có thể gắn thêm một nguyên tử N [38, 39, 47, 52, 54]. Hình 1.1: Công thức cấu tạo chung của quinolon Do có nhóm carboxylic ở vị trí số 3 nên các chất nhóm quinolon mang tính acid. Một số quinolon có thêm nhóm amin khác nên có thêm tính base. Chúng tan trong lipid và thấm được qua màng tế bào. Có thể chia nhóm quinolon thành hai loại dựa trên pKa: acidic quinolon (AQ) và piperazinyl quinolon (PQ) - Acidic quinolon: chỉ có một giá trị pKa trong khoảng 6,0 đến 6,9. Trong nước chúng tồn tại ở dạng trung hòa hoặc dạng anion. Thường AQ gồm những quinolon thuộc thế hệ thứ nhất. - Piperazinyl quinolon: có hai giá trị pKa, pKa1 khoảng 5,5–6,6 và pKa2 khoảng 7,2–8,9. Trong nước chúng có thể tồn tại ở ba dạng khác nhau: dạng cation, dạng trung hòa và dạng anion; một số PQ là danofloxacin, difloxacin, norfloxacin, ofloxacin, benofloxacin, marbofloxacin, acid pipemidic. Hình 1.2: Cân bằng acid - base của nhóm acidic quinolon 3
Hình 1.3: Cân bằng acid base của nhóm piperazinyl quinolon Bảng 1.1: Công thức cấu tạo và pKa của các chất STT Tên chất Công thức cấu tạo pKa 1 Ciprofloxacin pKa1: 6,09 pKa2: 8,62 2 Danofloxacin pKa1: 6,20 pKa2: 9,40 3 Erofloxacin pKa1: 6,1 pKa2: 7,7 4 Sarafloxacin pKa1: 5,6 pKa2: 8,2 5 Difloxacin pKa1: 5,7 – 6,1 pKa2: 7,2 – 7.6 6 Oxolinic acid pKa: 6,9 7 Flumequine pKa: 6,5 4
1.1.2 Cơ chế tác dụng và độc tính Kháng sinh nhóm này phân bố đồng đều cả trong dịch nội và ngoại bào, phân bố hầu hết các cơ quan: phổi, gan, mật, xương, tiền liệt tuyến, tử cung, dịch não tủy... và qua được hàng rào nhau thai. Fluoroquinolon đào thải chủ yếu qua đường tiết niệu ở dạng còn nguyên hoạt chất và tái hấp thu thụ động ở thận [16, 52]. Cơ chế tác động của fluoroquinolon lên vi khuẩn là ức chế tổng hợp acid nucleic. Sự nhân đôi DNA bắt đầu bằng phản ứng tách chuỗi DNA ra làm hai, mỗi bên là một khuôn để gắn nucleotid thích hợp theo nguyên tắc bổ sung. Enzym DNA polymeras xúc tác sự tổng hợp các liên kết giữa các nucleotid; enzym DNA gyrase nối các DNA trong quá trình tổng hợp và tạo thành các vòng xoắn. Các quinolon (nalidixic acid và các fluoroquinolon) ức chế mạnh sự tổng hợp DNA trong giai đoạn nhân đôi do ức chế enzym DNA gyrase. Cơ chế tác động này hiệu quả trên cả vi khuẩn gram dương và gram âm. Nhưng cũng có thể do cơ chế ức chế tổng hợp acid nucleic này mà kháng sinh nhóm fluoroquinolon được cho là có nguy cơ gây đột biến gen, gây sẩy thai khi sử dụng cho động vật mang thai do đó khuyến cáo là không nên sử dụng kháng sinh nhóm fluoroquinolon cho động vật mang thai, động vật sinh sản và làm giống. Ngoài ra các nghiên cứu trên động vật còn non cho thấy các kháng sinh thuộc nhóm này gây hủy hoại các khớp sụn [34, 54] do đó các kháng sinh nhóm quinolon không được sử dụng trong điều trị bệnh cho trẻ em. 1.1.3 Giới hạn cho phép kháng sinh nhóm quinolon Ngày 26/6/1990 Uỷ ban An toàn thực phẩm Châu Âu chính thức ban hành Quyết định 2377/1990[26] trong đó qui định mức giới hạn tối đa các chất kháng sinh trong thực phẩm có nguồn gốc động vật trong đó giới hạn nhóm quinolon trong các sản phẩm có nguồn gốc động vật bao gồm: 5
Bảng 1.2: Giới hạn cho phép kháng sinh nhóm quinolon theo EEC No.2377/1990 Tên kháng sinh Lợn (ppb) Bò, dê, cừu(ppb) Gà(ppb) Danofloxacin 100 200 200 Difloxacin 400 400 300 Enrofloxacin 100 100 100 Flumequin 200 200 400 Marbofloxacin 150 150 Oxolinic acid (*) 100 100 (*) Giới hạn cho phép trong cá 100ppb Tại Việt Nam, Thông tư số 08/VBHN-BNNPTNT ngày 25 tháng 02năm 2014 quy định Danh mục các loại kháng sinh cấm sử dụng và hạn chế sử dụng [1], theo đó các kháng sinh fluoroquinolon bị cấm sử trong sản xuất, kinh doanh thuỷ sản xuất khẩu vào thị trường Mỹ và Bắc Mỹ, ciproxacin và ofloxacin bị cấm sử dụng trong chăn nuôi thú y, các chất nằm trong danh mục hạn chế sử dụng bao gồm: Bảng 1.3: Giới hạn hàm lượng kháng sinh quinolon theo Thông tư 08/VBHN-BNNPTNT Tên kháng sinh MRL (ppb) Tên kháng sinh MRL (ppb) Danofloxacin 100 Ciprofloxacin 100 Difloxacin 300 Oxolinic Acid 100 Flumequin 600 Sarafloxacin 30 Hiện nay, theo Quyết định số 46/2007/QĐ-BYT ngày 19 tháng 12 năm 2007 về quy định mức giới hạn ô nhiễm hóa học và vi sinh vật trong thực phẩm, Bộ Y tế cũng đã đưa ra mức giới hạn của 4 kháng sinh nhóm quinolon là danofloxacin, enrofloxacin, flumequine, sarafloxacin. Bảng 1.4: Giới hạn hàm lượng kháng sinh quinolon theo Quyết định số 46/2007/QĐ-BYT Tên kháng sinh ADI (μg/kg thể trọng/ngày) MRL (μg/kg) Danofloxacin 0 - 20 50 (gan lợn); 100 (thịt) Enrofloxacin 0-3 100 Flumequine 0 - 30 500 (thịt, gan, cá) Sarafloxacin 0 - 0,3 10 (thịt); 80 (gan, thận) 1.2 Tình hình sử dụng và tồn dƣ kháng sinh nhóm quinolon 1.2.1 Tình hình sử dụng và tồn dư kháng sinh nhóm quinolon trong nước Mặc dù các kháng sinh nhóm quinolon đã được các cơ quan chức năng quản lý chặt nhưng nhiều nghiên cứu đã chỉ ra thực phẩm trong nước và ngay cả thực 6
phẩm xuất khẩu vẫn bị phát hiện có chứa tồn dư loại kháng sinh này. Việc tồn dư kháng sinh ở hàm lượng cao cho thấy thực trạng sử dụng kháng sinh trong thời gian dài với hàm lượng lớn đồng thời người chăn nuôi không đảm bảo thời gian cách ly hợp lý đối với vật nuôi trước khi thu hoạch. Nhiều nghiên cứu trong nước đã khảo sát tình hình sử dụng các loại kháng sinh trong chăn nuôi, hầu hết các nghiên cứu đều cho thấy sự lạm dụng kháng sinh là rất phổ biến và tồn dư trong thực phẩm (kể cả đối với những chất đã bị cấm sử dụng) vẫn chiếm tỷ lệ đáng kể [4, 5, 6, 8, 9]. Người chăn nuôi sử dụng nó dưới nhiều hình thức khác nhau hoặc phối trộn trực tiếp vào trong thành phần của thức ăn hoặc đưa vào môi trường nuôi như một hình thức phòng bệnh. Theo nghiên cứu của Takahiro Yamaguchi đối với các mẫu lợn, bò, gà, tôm và cá nuôi thu thập tại các tỉnh Thái Bình, Hà Nội, Khánh Hòa, TP. HCM năm 2012-2013 của cho thấy có tới 7,7% số mẫu được kiểm nghiệm phát hiện nhiễm enrofloxacin (ERFX) với hàm lượng từ 12–77ppb điều này cho thấy mặc dù đã bị cấm nhưng bằng con đường nào đó các kháng sinh này vẫn đi vào mẫu thực phẩm để đến với người tiêu dùng [57]. Theo báo cáo của chính phủ Úc năm 2008, thủy sản nhập khẩu của Việt Nam vào thị trường nước này được giám sát rất chặt chẽ và đã phát hiện những lô hàng nhiễm kháng sinh quinolon bao gồm ERFX và ciprofloxacin (CPFX) với mức nhiễm lần lượt là 8,5 – 35 và 2,0 – 33ppb [12]. Các nghiên cứu trên cho thấy thực trạng sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi và tồn dư các chất này trong sản phẩm thực phẩm không có dấu hiệu cải thiện, theo báo cáo kết quả công tác quản lý chất lượng an toàn thực phẩm 9 tháng đầu năm 2015 của Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn có tới 1,01% mẫu thủy sản nhiễm dư lượng hóa chất, kháng sinh cấm sử dụng vượt ngưỡng cho phép và 7,6% mẫu thịt có dư lượng hóa chất, kháng sinh vượt ngưỡng. Đối với các mẫu môi trường, tại Việt Nam có rất ít nghiên cứu đánh giá thực trạng tồn dư kháng sinh nhóm quinolon trong môi trường. Theo nghiên cứu năm 2006 của TS. Dương Thị Hồng Anh về phân tích đánh giá sự có mặt của các kháng sinh họ fluoroquionolon trong nước thải bệnh viện, đã phát hiện thấy hàm lượng kháng sinh ciproxacin và norfloxacin trong nước thải chưa xử lí và đã xử lí tại bệnh 7
viện Hữu Nghị với nồng độ từ 3,5 tới 50,3 µg/L trong đó nồng độ ciproxacin cao hơn norfloxacin từ 3-5 lần [2]. Năm 2014, cũng theo nghiên cứu của TS. Dương Thị Hồng Anh và cộng sự, đối với các mẫu nước, bùn, tôm được lấy tại các điểm trong ao nuôi, dọc kênh và rừng ngập mặn tiếp giáp ở khu vực nuôi tôm quảng canh thuộc xã Giao An, Giao Thủy, Nam Định vào hai thời điểm thả tôm giống và thu hoạch. Dư lượng kháng sinh CPFX và norfloxacin (NRFX) được phân tích trong các mẫu sử dụng phương pháp chiết pha rắn, chiết lỏng áp suất cao và xác định bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector huỳnh quang. Chỉ có dư lượng ciprofloxacin được tìm thấy trong nước và bùn ở các khoảng nồng độ lần lượt là 0,06 – 0,35 µg/L và 0,22 – 0,40 µg/g. Kết quả phân tích tại thời điểm đầu vụ nuôi tôm cho thấy người nuôi trồng đã sử dụng CPFX để khử trùng nước và môi trường. Trong mẫu tôm sản phẩm thu tại khu vực này không phát hiện thấy CPFX và NRFX [3]. 1.2.2 Tình hình sử dụng và tồn dư kháng sinh nhóm quinolon trên thế giới Nhiều nghiên cứu trên thế giới cũng cho thấy tình hình sử dụng và tồn dư kháng sinh nhóm quinolon ở mức độ báo động. Theo báo cáo năm 2006 của Tổ chức đánh giá dược phẩm Châu Âu (European Medicines Evaluation Agency), tổng lượng kháng sinh quinolon tiêu thụ và khối lượng sản phẩm thịt có chứa kháng sinh nhóm quinolon tại một số quốc gia được thống kê như sau [27]: Bảng 1.5: Lượng kháng sinh tiêu thụ và sản phẩm thịt phát hiện có chứa kháng sinh quinolon Tên nƣớc Tổng lƣợng kháng sinh Tổng lƣợng sản phẩm thịt (tấn) tiêu thụ (tấn) Fluoro Nhóm Bò Lợn Gia cầm Tổng -quinolon quinolon cộng Cộng hòa Séc 0,8 1 103775 409102 215802 728679 Đan Mạch 0,1 0,1 147600 1762000 199994 2109595 Phần Lan
Khảo sát của tác giả Pavlína Navrátilová năm 2011 tại Cộng hòa Séc trong sữa bò nguyên liệu cho thấy có tới 87,3% số mẫu (n=150) được nghiên cứu phát hiện nhiễm kháng sinh nhóm này [46]. Hoặc tại vùng Ankara Thổ Nhĩ Kỳ năm 2013 cũng phát hiện tới 118 mẫu/231 mẫu phát hiện dương tính với kháng sinh nhóm quinolon trong đó thịt gà là 58 mẫu chiếm 45,7% và thịt gà là 60 mẫu chiếm 57,7% [15]. Tại Hàn Quốc khảo sát với 388 mẫu thực phẩm cho thấy có 3,1% số mẫu phát hiện tồn dư ERFX, CPFX và NRFX với hàm lượng cao: đối với ERFX từ 0,01 đến 0,73 mg/kg, đối với CPFX từ 0,01 đến 0,03 mg/kg; NRFX phát hiện trong một mẫu ở mức 0,12 mg/kg [19]. Cũng theo nghiên cứu năm 2013 của Silfrany và cộng sự tại Santiago đối với 135 mẫu thịt gà thu thập tại 9 thành phố đã phát hiện tỷ lệ mẫu nhiễm kháng sinh nhóm quinolon từ 6,25 đên 50% đối với 4/9 địa điểm thu thập mẫu. Nghiên cứu sử dụng phương pháp ức chế sự phát triển của vi khuẩn E.Coli để phát hiện sự có mặt của kháng sinh nhóm quinolon trong mẫu [48]. Theo nghiên cứu mới nhất của Omotoso Adekunbi năm 2015 tại Nigeria, đối với 320 mẫu thịt xác định các chất CPFX, NRFX, ofloxacin (OFLX) cho thấy có tới 50% mẫu thịt bò, 55% mẫu thịt gà, 40% thịt lợn và 40% mẫu thịt dê phát hiện có chứa kháng sinh nhóm quinolon [45]. Như vậy có thể thấy rõ tình hình sử dụng kháng sinh quinolon trong chăn nuôi rất phổ biến và tồn dư của nó trong thực phẩm là điều đáng lo ngại ảnh hưởng lớn đến sức khỏe người tiêu dùng. Các nghiên cứu về kháng sinh trong môi trường cho thấy sự có mặt của các chất này ở rất nhiều các khu vực khác nhau, nhiều quốc gia trên thế giới. Ở Trung Quốc nguồn nước cấp cho sinh hoạt [56], nước vùng cảng, nước sông [53], nước thải bệnh viện đã qua xử lý [55] đều thấy có sự hiện hiện ở hàm lượng cao kháng sinh nhóm quinolon. Ngay tại Mỹ, một quốc gia phát triển có sự quản lý chặt chẽ về nguy cơ ô nhiễm môi trường, nghiên cứu của H. Nakata và cộng sự năm 2004 cũng phát hiện có ofloxacin trong mẫu với hàm lượng cao nhất là 204ppb. Trong nghiên cứu của mình, tác giả cũng đã so sánh kết quả phát hiện với một số quốc gia Châu Âu trong 9
các nghiên cứu tương tự. Theo đó mức phát hiện OFLX và lomefloxacin (LMFX) ở các quốc gia như Pháp (330–510ppb; 180–290ppb), ở Ý (290–580ppb; 180– 320ppb), ở Hy Lạp (460ppb; 290ppb) [33]. Tại Canada, kết quả khảo sát tại 8 hồ xử lý nước thải cho thấy chỉ có 40% lượng kháng sinh nhóm quinolon giảm xuống sau khi xử lý. Mẫu sau xử lý được thải trực tiếp ra môi trường vẫn chứa hàm lượng trung bình của CPFX và OFLX lần lượt là 146 và 179ng/L [32]. 1.3 Các phƣơng pháp xác định hàm lƣợng các chất nhóm quinolon Nhiều phương pháp được sử dụng để xác định các chất nhóm quinolon như: phương pháp miễn dịch enzym (ELISA); phương pháp vi sinh vật (test vi sinh vật học), phương pháp lý hóa. Mỗi phương pháp có ưu nhược điểm riêng. 1.3.1 Phương pháp miễn dịch enzym (ELISA) Với ưu thế thời gian phân tích ngắn, các thao tác thí nghiệm đơn giản, có thể thực hiện tại hiện trường, phương pháp phân tích dựa trên phản ứng giữa kháng nguyên-kháng thể đã trở thành một công cụ khá hiệu quả và được các cơ quan thẩm quyền chấp thuận cho phép sử dụng với lục đích sàng lọc. Liên minh Châu Âu (tại Chỉ thị 657/EC/2002) cho phép sử dụng phương pháp ELISA trong phân tích sàng lọc dư lượng các hóa chất kháng sinh cấm. Với mục đích đưa việc xác hàm lượng sparfloxacin vào xét nghiệm cận lâm sàng, nghiên cứu của Hua-Jin Zeng và cộng sự năm 2011 đã sử dụng kháng thể thu được từ việc tạo miễn dịch với sparfloxacin trên thỏ kết hợp với huyết tương bò. Sau khi tối ưu hóa, phương pháp xác định hàm lượng sparfloxacin từ 5ng/mL đến 2mg/mL với độ thu hồi từ 87,7 đến 106,2% [31]. Các nghiên cứu của Jiang Jinqing năm 2011, sử dụng phương pháp ELISA gián tiếp để xác định SRFX, difloxacin (DFLX), NRFX và pefloxacin trên nền mẫu cá dựa vào phản ứng của kháng thể SRFX. Khoảng xác định đối với SRFX trong dịch chiết từ 0,004 đến 18 ng/mL giới hạn phát hiện 0,002 ng/mL [35]. Đối với nền mẫu gan gà tác giả cũng đã xác định được hàm lượng NRFX với khoảng xác định từ 0,006 đến 38 ng/mL giới hạn phát hiện 0,04 ng/mL độ thu hồi đạt 90-117,8% [35]. Năm 2012, cũng với kỹ thuật ELISA gián tiếp, tác giả đã tiếp tục phát triển phương 10
pháp cho việc xác định CPFX trong mẫu sữa bò với khoảng xác định từ 0,036 đến 92,5 ng/mL với giới hạn phát hiện là 0,019 ng/mL, hệ số tương quan đạt 0,9844 [36]. Tại Việt Nam, Phạm Kim Đăng và cộng sự đã sử dụng kít ELISA do CER Vương Quốc Bỉ sản xuất để phân tích tồn dư kháng sinh quinolon trong tôm tại một số tỉnh ven biển khu vực phía Bắc. Phương pháp được khẳng định lại bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC/MS/MS). Kết quả cho thấy, bộ kít rất ổn định để phân tích các quinolon được thử và trong tôm với giới hạn nồng độ phát hiện là 0,07ppb. Tác giả cũng cho rằng khả năng phát hiện, hiệu lực của kít trong điều kiện phòng thí nghiệm ở Việt Nam đáp ứng được yêu cầu của một phương pháp bán định lượng qui định trong Quyết định số 2002/657/CE Uỷ ban Châu Âu (CE, 2002). Tuy nhiên, muốn định danh loại kháng sinh quinolon và xác định nồng độ chính xác cần phải khẳng định lại bằng các phương pháp lý hoá khác [4] . 1.3.2 Phương pháp vi sinh vật Phương pháp dựa vào sự biến đổi màu sắc của chất chỉ thị được bổ sung vào môi trường trước và sau khi thêm mẫu phân tích. Những mẫu có chứa kháng sinh sẽ ức chế sự phát triển của vi khuẩn và không làm đổi màu chất chỉ thị. Ngược lại đối với mẫu không chứa kháng sinh hoặc chứa với lượng nhỏ hơn giới hạn phát hiện, sau thời gian ủ vi khuẩn phát triển làm thay đổi điều kiện môi trường khi đó màu của chất chỉ thị sẽ khác so với màu sắc ban đầu. Tùy thuộc vào loại vi khuẩn sử dụng mà thời gian phát hiện nhanh hay chậm. Nghiên cứu của David Sanz [23] sử dụng test Explorer (ZEULAB, Zaragoza, Spain) ức chế vi khuẩn G. stearothermophilus để định tính các kháng sinh có mặt trong các mẫu thịt. Trong test này, mỗi giếng sẽ chứa môi trường thạch aga và vi khuẩn đích trong sự có mặt của chất chỉ thị pH. Khi test được ủ trong điều kiện 650C các bào tử sẽ phát triển sinh ra môi trường axit và làm đổi màu chất chỉ thị từ xanh sang vàng. Khi mẫu có chứa các chất ức chế vi khuẩn (các kháng sinh chẳng hạn) vi khuẩn sẽ không phát triển được do đó môi trường pH không thay đổi. Nghiên cứu cũng sử dụng test Equinox (ZEULAB, Zaragoza, Spain) đặc hiệu đối với kháng sinh nhóm quinolon trong nền mẫu thực phẩm. Khác với test Explorer, 11