Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Xây dựng phương pháp định tính, định lượng flavonoid trong nụ và lá vối

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:89

Thêm vào BST

Báo xấu

56
lượt xem 4
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Nội dung chính của đề tài là phân lập được một flavonoid chính trong nụ vối dùng làm chất đối chiếu trong việc định tính, định lượng flavonoid. Xây dựng được quy trình định tính và định lượng flavonoid trong dược liệu nụ và lá vối. Mời các bạn cùng tham khảo!

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Xây dựng phương pháp định tính, định lượng flavonoid trong nụ và lá vối

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN -------------------------------- NGUYỄN QUỐC TUẤN XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƢỢNG FLAVONOID TRONG NỤ VÀ LÁ VỐI LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC Hà Nội – 2012 1
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN -------------------------------- NGUYỄN QUỐC TUẤN XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƢỢNG FLAVONOID TRONG NỤ VÀ LÁ VỐI Chuyên ngành: Hóa phân tích Mã số: 60 44 29 LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC CÁN BỘ HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. PHƢƠNG THIỆN THƢƠNG Hà Nội – 2012 2
Mục lục Trang MỞ ĐẦU………………………….……….……………...…………………….…1 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN…………..…………….……………………….…..3 1.1 Tổng quan cây vối………………………….….……………………………..3 1.1.1 Tên gọi ……………………………..……………………………………3 1.1.2 Đặc điểm thực vật………………………………………………..………3 1.1.3 Phân bố, sinh thái………………………………………………….……..3 1.1.4 Thu hái và chế biến…………………………………………...………….4 1.1.5 Thành phần hóa học……………………………………………..……….5 1.1.6 Flavonoid trong cây vối………………………………………………….7 1.1.7 Tác dụng sinh học………………………………...…………………….13 1.1.8 Ứng dụng…………………………………………...…………………..16 1.2 Các phƣơng pháp định tính, định lƣợng flavonoid ……………………...…17 1.2.1 Phƣơng pháp định tính………………………………………….………17 1.2.2 Phƣơng pháp định lƣợng……………………………….……………….20 CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU………………………………………………………………………………26 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu……………………………………...……………….26 2.2 Nội dung nghiên cứu …………………………………………..…………..27 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu……………………………………..…………….27 2.3.1 Chiết xuất, phân lập flavonoid chính………….………………………..27 2.3.2 Xác định cấu trúc chất phân lập………………………………….……..28 2.4 Xây dựng phƣơng pháp định tính trong nụ và lá vối…………………...…..28 2.4.1 Định tính bằng phƣơng pháp hóa học…………………….…………….28 3
2.4.2 Định tính bằng phƣơng pháp sắc ký………………………..…………..28 2.5 Xây dựng phƣơng pháp định lƣợng flavonoid trong nụ và lá vối…….…….30 2.5.1 Định lƣợng flavonoid toàn phần bằng phƣơng pháp trắc quang…….…30 2.5.2 Định lƣợng flavonoid chính bằng phƣơng pháp HPLC……….…..........30 2.6 Một số đặc trƣng thống kê để xử lý và đánh giá kết quả……...……………31 2.7 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất, dung môi……………………………………32 2.7.1 Thiết bị, dụng cụ………………………………………………………..32 2.7.2 Hóa chất, dung môi……………………………………………………..32 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN…………………………………...33 3.1 Chiết xuất và phân lập một flavonoid chính từ nụ cây vối………………....33 3.1.1 Chiết xuất dƣợc liệu và phân đoạn…..………………………………….33 3.1.2 Phân lập flavonoid chính trong cao phân đoạn ethyl acetat…………….34 3.1.3 Xác định cấu trúc chất phân lập………………...………………………37 3.2 Xây dựng phƣơng pháp định tính flavonoid trong lá và nụ vối……...……..41 3.2.1 Định tính bằng phản ứng hóa học………………………...…………….41 3.2.2 Định tính bằng TLC………………………………………...…………..42 3.2.3 Định tính bằng HPLC……………………………………………..……46 3.3 Xây dựng phƣơng pháp định lƣợng flavonoid trong lá và nụ vối…………..48 3.3.1 Xây dựng bằng phƣơng pháp trắc quang………………...……………..48 3.3.2 Xây dựng phƣơng pháp định lƣợng CO-1 bằng HPLC………...………61 KẾT LUẬN……………………………….…………………………………...…74 TÀI LIỆU THAM KHẢO……………………………………………………....76 PHỤ LỤC 4
DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Các thành phần chính trong tinh dầu vối ………………………... 6 Bảng 1.2. Thành phần flavonoid trong nụ vối………………………………. 8 Bảng 1.3. Một số hệ dung môi khai triển để phân tích flavonoid bằng TLC.. 19 Bảng 2.1. Bảng chi tiết mẫu nụ và lá vối……………………………………. 26 Bảng 3.1. Kết quả định tính sơ bộ flavonoid ở cao H và cao E…………….. 35 Bảng 3.2. Số liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất CO-1………… 40 Bảng 3.3. Kết quả SKLM cao phân đoạn ETOAC…………………………. 46 Bảng 3.4. Kết quả độ lặp lại của phƣơng pháp trắc quang………………….. 49 Bảng 3.5. Kết quả xây dựng đƣờng chuẩn theo chất đối chiếu CO-1………. 50 Bảng 3.6. Kết quả xây dựng đƣờng chuẩn theo chất Catechin……………… 51 Bảng 3.7. Kết quả xác định độ lệch chuẩn của mẫu trắng……………........... 52 Bảng 3.8. Kết quả xác định nồng độ giới hạn LOL của chất chuẩn CO-1….. 53 Bảng 3.9. Kết quả xác định nồng độ giới hạn LOL của chất Catechin……... 53 Bảng 3.10. Kết quả xác định độ đúng của phƣơng pháp…………………..... 54 Bảng 3.11A. Kết quả đánh giá độ ổn định của phƣơng pháp theo cách 1….. 55 Bảng 3.11B. Kết quả đánh giá độ ổn định của phƣơng pháp theoc cách 2..... 56 5
Bảng 3.12. Kết quả xác định flavonoid toàn…………………………….….. 58 Bảng 3.13. Kết quả khảo sát pha động ……………………………………... 62 Bảng 3.14. Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống………………...… 63 Bảng 3.15. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính…………………………….. 64 Bảng 3.16. Giá trị hệ số bi ……………………………………………...…… 65 Bảng 3.17. Các đại lƣợng thống kê……………………………………….… 65 Bảng 3.18A. Kết quả khảo sát độ lặp lại của phƣơng pháp bằng mẫu CO-1.. 66 Bảng 3.18B. Kết quả khảo sát độ lặp lại của phƣơng pháp bằng mẫu thực… 66 Bảng 3.19. Kết quả khảo sát độ đứng của phƣơng pháp……………………. 67 Bảng 3.20. Kết quả xác định nồng độ giới hạn LOD……………………….. 69 Bảng 3.21. Kết quả xác định nồng độ giới hạn LOL………………………... 69 Bảng 3.22. Kết quả đánh giá sai số của phƣơng pháp………………………. 71 Bảng 3.23. Kết quả định lƣợng hoạt chất trong một số mẫu nụ và lá vối…... 72 6
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ SƠ ĐỒ Hình 1.1. Hình ảnh cây vối………………………..…………………………..4 Hình 1.2. Sắc ký đồ hai chất và các thông số đặc trƣng…………….……….23 Hình 3.1. Hình ảnh SKLM và chất CO-1 phân lập từ nụ vối………………..37 Hình 3.2. Sắc ký đồ HPLC chất CO-1…………………………………...…..37 Hình 3.3. Phổ tử ngoại UV chất CO-1……………………………………….38 Hình 3.4. Công thức cấu tạo chất CO-1………………………………….…..41 Hình 3.5A. Sắc ký đồ định tính flavonoid trong nụ và lá vối…………….….44 Hình 3.5B. Sắc ký đồ định tính flavonoid trong cao ETOAC……………….45 Hình 3.6. Sắc ký đồ của mẫu đối chiếu CO-1 và nụ, lá vối………………….48 Hình 3.7. Đƣờng chuẩn xác định flavonoid toàn phần theo CO-1………..…50 Hình 3.8. Đƣờng chuẩn xác định flavonoid toàn phần theo Catechin……….51 Hình 3.9. Đồ thị xác định nồng độ giới hạn LOL của CO-1……………...…53 Hình 3.10. Đồ thị xác định nồng độ giới hạn LOL của Catechin…………....54 Hình 3.11. Đƣờng chuẩn xác định hàm lƣợng CO-1 trong nụ và lá vối……..64 Hình 3.12. Chiều cao tín hiệu phát hiện LOD…………………………….....69 Hình 3.13. Đồ thị xác định nồng độ giới hạn LOL………………………….70 Sơ đồ 3.1: Sơ đồ chiết xuất và phân đoạn cao nụ vối………………………..34 Sơ đồ 3.2: Quy trình định lƣợng flavonoid toàn phần ……………………….57 7
DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT CTPT : Công thức phân tử EtOAC : Ethyl acetat EtOH : Ethanol KLPT : Khối lƣợng phân tử MeOH : Methanol SKLM : Sắc ký lớp mỏng Rf : Hệ số lƣu UV : Ultra violet IR : Infrared Spectroscopy MS : Mass Spectroscopy NMR : Cộng hƣởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance) TLC : Sắc lớp mỏng (Thin Layer Chromatography) HPLC : Sắc kí lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography) SD : Độ lệch chuẩn (Standard deviation) RSD : Độ lệch chuẩn tƣơng đối (Relative standard devition) LOD : Giới hạn phát hiện (Limit of Detection) LOQ : Giới hạn định lƣợng (Limit of Quantitation) LOL : Giới hạn tuyến tính (Limit of Linearity) 8
MỞ ĐẦU Cây Vối, một loại cây quen thuộc của làng quê các tỉnh Đồng Bằng bắc bộ, có tên khoa học là Cleistocalyx operculatus (Roxb.) Merr. et Perry thuộc họ Sim (Myrtaceae). Từ lâu nhân dân ta đã biết dùng lá và nụ vối với cách chế biến đơn giản tạo thành loại trà nấu hay hãm lấy nƣớc uống hàng ngày vừa có tác dụng thanh nhiệt vừa có tác dụng kiện tỳ, tiêu thực. Đến nay đã có nhiều nghiên cứu về cây Vối. Thành phần hóa học chính của lá và nụ Vối gồm tinh dầu, triterpenoid và flavonoid. Theo Trung học dƣợc từ hải I (1993), tinh dầu lá vối có 27 thành phần. Vỏ cây chứa một chất triterpen nhóm ursan đã đƣợc nhận dạng là acid ursolic. Nụ vối có nhiều thành phần hóa học đã đƣợc phân lập và xác định cấu trúc hóa học, chủ yếu là các flavonoid. Thành phần hóa học chính trong nụ vối là flavonoid, với khoảng hơn 20 flavonoid khác nhau. Flavonoid là một nhóm hợp chất lớn có cấu trúc hóa học C6-C3-C6, thƣờng gặp nhiều trong thực vật. Đến nay, số lƣợng flavonoid từ thực vật đã đƣợc tìm thấy lên tới trên 8150 flavonoid khác nhau. Các flavonoid có nhiều tác dụng sinh học quý nhƣ chống ung thƣ, chống dị ứng, chống co giật, giảm đau, nghẽn mạch, nghẽn phế quản, lợi mật, diệt nấm... Do đó, chúng đƣợc dùng nhiều trong các ngành công nghiệp dƣợc phẩm, thực phẩm, và mỹ phẩm, phục vụ lợi ích của con ngƣời. Các flavonoid của lá và nụ vối cũng đã đƣợc chứng minh có nhiều tác dụng sinh học quan trọng nhƣ chống oxy hóa, chống ung thƣ, ức chế một số enzym (xanthin oxydase, α-glucosidase, maltase, acetylcholinesterase và butyrylcholinesterase). Đặc biệt, một số chất một hợp chất có tác dụng đối với ung thƣ nhƣ 2',4'-dihydroxy-6'-methoxy-3',5'-dimethylchalcone, 3,5',3'- trihydroxy-6,7,4'-trimethoxy flavon; 3,3'-dihydroxy-5,6,7,4'-tetramethoxy 9
flavon. Do đƣợc sử dụng nhiều để làm trà uống và làm thuốc trong y học dân gian nên cần thiết phải có tiêu chuẩn cho nguyên liệu lá và nụ vối. Trong dự thảo Dƣợc Điển Việt Nam V (dự kiến xuất bản năm 2013-2014) đã có chuyên luận về lá và nụ vối. Tuy nhiên, trong các chuyên luận này chƣa có tiêu chí về định tính và định lƣợng flavonoid trong nụ vối, trong khi flavonoid là thành phần chính và có nhiều tác dụng quan sinh học trọng. Với thực trạng trên, chúng tôi đề xuất thực hiện đề tài “Xây dựng phƣơng pháp định tính, định lƣợng flavonoid trong nụ và lá vối”. Kết quả của đề tài sẽ là cơ sở cho việc xây dựng tiêu chuẩn và kiểm tra chất lƣợng dƣợc liệu nụ và lá vối phục vụ việc quản lý chất lƣợng dƣợc liệu trên thị trƣờng. Các mục tiêu của đề tài gồm có: • Phân lập đƣợc một flavonoid chính trong nụ vối dùng làm chất đối chiếu trong việc định tính, định lƣợng flavonoid. • Xây dựng đƣợc quy trình định tính và định lƣợng flavonoid trong dƣợc liệu nụ và lá vối. 10
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về cây vối 1.1.1 Tên gọi - Tên tiếng Việt: Cây vối, vối nhà - Tên Latin: Cleistocalyx operculatus (Roxb.) Merr. et Perry - Tên đồng nghĩa: Eugenia operculata Roxb. - Họ Sim (Myrtaceae). 1.1.2 Đặc điểm thực vật Cây vối là loại cây gỗ nhỡ, cao 5-10 m, có khi hơn, vỏ thân nứt nẻ, màu nâu đen. Cành nhánh có nhiều vảy, cành non tròn hay hơi hình 4 cạnh, nhẵn [3, 4, 10, 22, 42]. Lá đơn mọc đối, có cuống dài 1-1,5 cm, dai, cứng, phiến lá hình trái xoan hay hình trứng, dài 8-20 cm, rộng 5-8 cm giảm nhọn ở gốc, có mũi ngắn. Hai mặt lá có hai màu khác nhau, có nhiều tuyến mờ nâu, lá già mặt dƣới của lá có chấm nâu, gân phụ khoảng 10 cặp cách mép là 3-5 mm [3, 4, 10, 22, 42]. Hoa nhỏ màu trắng lục nhạt, gần nhƣ không cuống, hợp thành cụm hoa dạng chùy rộng, mọc ở kẽ những lá đã rụng. Nụ hoa dài, lá bắc dễ rụng. Đài dính vào bầu. Hoa đều lƣỡng tính 4 cánh hình tròn hay hình bầu dục, nhiều tuyến mờ dính lại ở đỉnh thành mũ hình chóp. Nhị nhiều xếp thành 7-9 dãy có hình bầu dục nằm sâu trong ống đài, bị nhị che kín [3, 4, 10, 22, 42]. Quả hình cầu hay hơi hình trứng, đƣờng kính 7-12 mm, xù xì, khi chín có màu tím, thể chất nạc, vị ngọt [3, 4, 10, 22, 42]. Mùa hoa quả: Tháng 4 – 6 1.1.3 Phân bố, sinh thái 11
Chi Cleistocalyx Blume gồm một số loài phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới Đông Nam Á. Việt Nam có 3 loài Vối là cây đặc hữu của vùng Việt Nam và Nam Trung Quốc. Ở Việt Nam, vối mọc tự nhiên dọc theo suối hay bờ ao hồ ở vùng núi thấp và trung du, thuộc các tỉnh Cao Bằng (Hà Quảng, Thông Nông, Thạch An…); Lạng Sơn (Đồng Mỏ, Hữu Lũng); Bắc Giang (Sơn Động, Lục Nam, Yên Thế...); Vĩnh Phúc (Lập Thạch, Tam Dƣơng); Phú Thọ, Tuyên Quang, Hà Tây, Hòa Bình….Cây vối còn đƣợc trồng rải rác trong nhân dân các tỉnh đồng bằng và trung du Bắc Bộ. Vối thuộc loại cây gỗ ƣa sáng, ƣa ẩm, sinh trƣởng và phát triển nhanh; trong vòng 3 năm đầu, chiều cao thân có thể đến 5 m. Cây phân cành nhiều chồi và lá non ra nhiều trong mùa xuân, hè. Những cây mọc ở chỗ đƣợc chiếu sáng đầy đủ ra hoa quả rất nhiều, tái sinh tự nhiên từ hạt. a) Cây vối b) Nụ vối tƣơi b) Nụ vối khô ơ Hình 1.1: Hình ảnh Cây và Nụ vối 1.1.4 Thu hái và chế biến Hái lá tƣơi, phơi khô, nhƣng có ngƣời đem ủ rồi mới phơi khô, cách làm nhƣ sau: thái nhỏ, rửa sạch, cho vào thùng hay thúng ủ cho đến khi đen đều thì 12
lấy ra rửa sạch, phơi khô. Lá vối ủ uống thơm ngon hơn. Để làm thuốc thƣờng dùng lá tƣơi phơi khô [4,10]. Nụ vối đƣợc thu hái, phơi khô dùng để pha nƣớc và làm thuốc [4, 10]. 1.1.5 Thành phần hóa học Lá Vối chứa rất ít tanin, vết alcaloid (nhóm indolic) và tinh dầu, tinh dầu lá gồm nhiều thành phần trong đó thành phần chính là (Z)-β-ocimen, myrcen, (E)-β-ocimen [3, 4, 17]. Trong lá vối có chứa flavonoid, coumarin, tanin, acid hữu cơ, đƣờng tự do và sterol. Vỏ cây chứa triterpen nhóm ursan là acid usolic [3]. Nụ vối chứa nhiều flavonoid khác nhau, với nhiều thành phần đã xác định cấu trúc hóa học đƣợc trình bày ở Bảng 1.2. - Tinh dầu: Từ mẫu nụ vối Việt Nam, với phƣơng pháp sắc kí khí khối phổ GC/MS, Nguyễn Thị Dung và cộng sự đã xác định đƣợc 55 thành phần khác nhau có trong tinh dầu nụ vối (Bảng 1.1), gồm các monoterpen, serquiterpen và hydrocarbon serquiterpen [5]. 13
Bảng 1.1. Các thành phần chính trong tinh dầu nụ vối STT Thành phần chính Tỷ lệ (%) 1 α-pinen 3,45 2 β-pinen 3,07 3 β-myrcen 2,40 4 Camphen 4,12 5 γ-terpinen 5,76 6 Cis-linalool oxide 5,21 7 Terpinen-4-ol 2,58 8 Trans-carveol 3,93 9 2,3-dehydro-1,4-cineol 3,01 10 γ-amorphen 2,12 11 Cyclobazzanen 3,12 12 α-cadinen 1,47 13 Globulol 5,61 14 β-himachalol 3,84 15 Acorenol 5,12 16 1-hexanol 2,59 17 2-heptanen 2,03 18 Presilphiperfol-1-en 2,48 19 α-terpinen 1,19 20 Cis-verbenol 1,85 21 Methyl jasmonate 1,92 22 1,8-oxidocadin-4-en 1,84 14
- Thành phần khác: ethyl galat, acid galic, acid ursolic, β-sitosterol và acid cinamic [3, 4, 17, 21, 33]. 1.1.6 Flavonoid trong cây Vối Flavonoid là một nhóm hợp chất tự nhiên lớn thƣờng gặp trong thực vật. Về cấu trúc hóa học flavonoid có khung cơ bản theo kiểu C6-C3-C6 (có 2 vòng benzen A và B nối với nhau qua một mạch 3 carbon) và đƣợc chia làm nhiều nhóm khác nhau [16]. Đã có nhiều nhà khoa học trong và ngoài nƣớc nghiên cứu về thành phần hóa học của cây vối đều chỉ ra rằng flavonoid trong lá và nụ vối có thể ở dạng tự do hoặc dạng glycosid. Chủ yếu là nhóm chalcone, flavanol, flavone và flavanonol. Các flavonoid thƣờng dễ kết tinh và thƣờng có màu. Flavone có màu vàng nhạt hoặc màu da cam; flavonol màu vàng nhạt đến màu vàng; Chalcone màu vàng đến cam-đỏ; flavanonol kết tinh không màu. Các flavonoid đƣợc trình bày ở bảng 1.2. . 15
Bảng 1.2: Thành phần flavonoid trong nụ vối TT Tên chất Công thức cấu tạo Tài liệu [18], 1 2',4'-dihydroxy-6'- [22], methoxy-3',5'- [33] dimethylchalcone 2 5,7-dihydroxy-6,8- [22] dimethylflavone 3 7-hydroxy-5-methoxy-6,8- [22] dimethylflavanon 4 3'-formyl-4',6',4- [27] trihydroxy-2'-methoxy-5'- methylchalcone 3'-formyl-6',4-dihydroxy- 2’-methoxy-5'- [27] 5 methylchalcone 4'-O-β-D- glucopyranosid 16
6 (2S)-8-formyl-6- [33] methylnaringenin (2S)-8-formyl-6- 7 [27] methylnaringenin 7-O-β- D-glucopyranosid 8 (2S)-8-formyl-5-hydroxy- [31], 7-methoxy-6- [33] methylflavanon 9 7-hydroxy-5-methoxy-6,8- [33] dimethylisoflavone 10 (2S,3S)-2,3-trans-5,7 [33] dihydroxy-6,8 dimethyldihydroflavonol 17
11 (2S)-2,7-dihydroxy-5- [33] methoxy-6,8- dimethylflavanol 12 (E)-4,2',4'-trihydroxy-6'- methoxy-3',5'- [33] dimethylchalcone 13 7-hydroxy-5-methoxy-6,8- [33] dimethylflavone 14 (2S)-5-hydroxy-7- [33] methoxy-6,8- dimethylflavanol 2',4'-dihydroxy-3'-methyl- 15 6'-methoxychalcone [33] 16 (2S)-6-formyl-8-methyl-7- O-methylpinocembrin [33] 18
(2S)-7-hydroxy-5- 17 methoxy-8- [18] methylflavanon 18 (2S)-8-methylpinocembrin [18] 2,2',4'-trihydroxy-6'- 19 methoxy-3',5'- [18] dimethylchalcone 20 Quercetin [28] 21 Kaempferol [28] 19
22 Tamarixetin [28] 23 Myricetin-3'-methylether [28] 24 Myricetin-3'-methyether- [28] 3-O-β-D- galactopyranoside 25 5,7,8,4'-Tetrahydroxy- [28] 3',5'-dimethoxyflavone-3- O-β-D-galactopyranoside 26 Gossypetin-8,3'- [28] dimethyether-3-O-β-D- galactoside 20