Luận văn Thạc sĩ ngành Công nghệ Nano sinh học: Nghiên cứu chế tạo bộ kit RT-PCR để chuẩn đoán virus lở mồm long móng (LMLM) đại diện đang lưu hành ở Việt Nam

Nghiên cứu chế tạo bộ kit RT-PCR để chuẩn đoán virus lở mồm long móng (LMLM) đại diện đang lưu hành ở Việt Nam<br /> Kiều Mạnh Hùng<br /> Trường Đại học Công nghệ Luận văn ThS. ngành: Công nghệ Nano sinh học (Chuyên ngành đào tạo thí điểm) Người hướng dẫn: TS. Đồng Văn Quyền Năm bảo vệ: 2012<br /> Abstract. Khái quát về tình hình bệnh lở mồm long móng ở Việt Nam và trên thế giới. Nghiên cứu về Bệnh lở mồm long móng: Sơ lược về bệnh lở mồm long móng; Đặc tính sinh học của virut lở mồm long móng; Khả năng tồn tại của mầm bệnh trong điều kiện tự nhiên; Đặc tính gây bệnh; Đường xâm nhập và phương thức lây lan; Các phương pháp chẩn đoán bệnh. Nghiên cứu cấu trúc hệ gen của virus lở mồm long móng: Sơ đồ cấu trúc hệ gen của virus lở mồm long móng; Gen mã hóa protein VP1. Trình bày và đánh giá các kết quả đạt được: Tách chiết được Acide Ribonucleic (RNA); Xây dựng quy trình kỹ thuật RT-PCR phát hiện virus lở mồm long móng; Tách dòng xác định trình tự gen VP1; Kết quả phân tích cây phát sinh chủng loại. Keywords. Công nghệ Nano; Bộ KIT; Virut; Bệnh lở mồm long móng; Động vật móng guốc; Công nghệ sinh học<br /> <br /> Content MỞ ĐẦU Bệnh lở mồm long móng (LMLM) là một loại bệnh truyền nhiễm cấp tính cực kỳ nguy hiểm do virus LMLM (Foot and Mouth Disease Virus) gây ra trên động vật móng guốc chẵn như lợn, bò, trâu, hươu, dê... Bệnh lây lan rất nhanh qua nhiều con đường khác nhau như tiếp xúc trực tiếp giữa động vật với nhau, qua con đường hô hấp, tiêu hóa, sinh dục... Chính vì vậy mà Tổ chức Thú y thế giới (OIE) xếp bệnh LMLM là bệnh truyền nhiễm nguy hiểm hàng đầu trong các bệnh truyền nhiễm ở động vật. Ở Việt Nam, từ nhiều năm qua dịch bệnh xuất hiện và tái xuất hiện thường xuyên gây ra thiệt hại kinh tế rất lớn đối với ngành chăn nuôi. Đặc biệt năm 2006, dịch bệnh LMLM xảy ra rất mạnh ở hầu hết các tỉnh thành trong cả nước với hàng chục nghìn gia súc bị nhiễm bệnh. Trong những tháng đầu năm 2011, dịch LMLM trên gia súc tại nhiều địa phương trên cả nước có biểu hiện bùng phát mạnh. Chỉ trong hơn 10 ngày đầu tháng 2, dịch đã diễn biến khó lường và xuất hiện đồng thời ở cả 3 miền. Chẩn đoán chính xác sự lây nhiễm và tiêm vaccine phòng dịch bệnh có ý nghĩa to lớn trong việc kiểm soát tới thanh toán được dịch bệnh nguy hiểm này. Việc phòng chống bệnh<br /> <br /> LMLM ở nhiều nước đã trở thành một chính sách rất quan trọng, nhất là trong nền kinh tế thị trường. Việc có hay không bệnh LMLM trong sản xuất, chăn nuôi là một tiêu chí trong quan hệ buôn bán quốc tế và mọi quốc gia đều sử dụng nó như là một thứ vũ khí thương mại. Trong thời gian gần đây, tình hình diễn biến của dịch bệnh LMLM xảy ra ở các nước trên thế giới nói chung và ở Việt Nam nói riêng ngày càng trở nên phức tạp và khó kiểm soát. Ở Việt Nam, một trong những mục tiêu quan trọng nhất của ngành thú y phấn đấu thực hiện là : khống chế một số bệnh truyền nhiễm nguy hiểm ở gia súc, mà đặc biệt là bệnh LMLM. Do đó, nghiên cứu về dịch tễ học phân tử, xác định các type virus đang lưu hành trong nước cũng như tìm hiểu nguồn gốc tiến hóa, sự biến đổi di truyền của các type virus này là rất cần thiết cho việc phòng chống bệnh cũng như định hướng cho việc nhập khẩu, sản xuất và triển khai vaccine một cách hiệu quả. Hiện nay việc chẩn đoán virus LMLM từ các bệnh phẩm thực địa đều phải dùng bộ kit mua của nước ngoài. Đây là một hạn chế trong việc chủ động và nhanh chóng phòng chống bệnh dịch trong nước, ngoài ra cũng rất tốn kém. Xuất phát từ các lý do trên chúng tôi lựa chọn đề tài “Nghiên cứu chế tạo bộ kit RT-PCR để chẩn đoán virus lở mồm long móng (LMLM) đại hiện đang lưu hành ở Việt Nam Đề tài được thực hiện tại phòng thí nghiệm Vi sinh vật học phân tử, Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam. CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình hình bệnh lở mồm long móng trên thế giới và tại Việt Nam 1.1.1 Tình hình bệnh LMLM trên thế giới Bệnh LMLM đã xuất hiện ở nhiều nước thuộc Châu Á, Châu Phi, Mỹ La tinh và Châu Âu. Điển hình là trong những năm 1981-1985, dịch xuất hiện ở 80 nước, gây nên tổn thất lớn cho nền kinh tế của những nước này[8,9,10,58,63]. Năm 1997, dịch xảy ra ở lợn trên toàn lãnh thổ Đài Loan, gây thiệt hại nặng nề về kinh tế và để lại hậu quả xấu cho ngành chăn nuôi lợn trong nhiều năm. Các nước Nhật Bản và Hàn Quốc là những nước từ lâu không có bệnh LMLM nhưng đến năm 2000 đã xuất hiện bệnh này [17]. Tại Châu Âu năm 2001 dịch đầu tiên xảy ra ở Anh, sau đó lan ra Pháp, Hà Lan, Ireland qua con đường vận chuyển gia súc. Từ khi ngừng việc sử dụng vaccine ở các nước thuộc Liên minh Châu Âu (EU) 1991, đã có những ổ dịch nhỏ xảy ra ở Italia 1993[20]; Hy Lạp 1994-1996; Nga 1995. Tính đến tháng 4 năm 2000 ở Nga đã phát hiện một ổ dịch tại một làng ở Viễn Đông, 625 trong số 965 con lợn của đàn bị mắc bệnh, 111 con bị chết do virus LMLM type O gây ra. Nga tiếp tục dùng vaccine xung quanh Moscow vì ở đây có sân bay quốc tế và gần các nhà máy sản xuất vaccine. Việc tiêm phòng cũng được tiến hành dọc theo biên giới phía Nam của Nga. Từ những bằng chứng vừa nêu, có thể khẳng định chưa bao giờ Châu Âu hoàn toàn không có dịch bệnh LMLM. Các ổ dịch nổ ra lặp đi lặp lại, một số đó được khẳng định và một số vẫn chưa có bằng chứng xác đáng. Nguyên nhân chính của việc tái phát các vụ dịch được cho là do sự di chuyển bất hợp pháp gia súc sống từ vùng Anatolia của Thổ Nhĩ Kỳ vào phần lãnh thổ của Thổ Nhĩ Kỳ ở Châu Âu. Tại Nam Mỹ, Chile, Guyana, Suriname không thấy bệnh LMLM trong thập kỷ 90 và trong khoảng 8 năm trở lại đây đã có những tiến bộ đáng kể về hiệu quả của các chương trình khống chế bệnh LMLM [18]. Mặc dù các bằng chứng đưa ra kém thuyết phục hơn nhưng một số nước khác như Argentina, Paraguay, Uruguay, Bolivia, Colombia, Brazil… [16] cũng rất cố gắng trong việc phòng chống bệnh LMLM với kết quả làm giảm thiểu số lượng ổ dịch được công bố. Tại Châu Á, virus LMLM thuộc type O và A có mặt ở hầu hết các nước vùng Trung Đông, cùng với sự thâm nhập của type Asia 1 vào Saudi Arabia. Ở Ấn Độ việc khống chế bệnh LMLM là rất khó bởi số lượng đầu gia súc là rất lớn, ước tính 164 triệu cừu, dê; 200 triệu bò; 80 triệu trâu…Virus type O, A, C, Asia 1 lưu hành khắp nơi và những cố gắng của<br /> <br /> người chăn nuôi bò sữa tìm cách khống chế bệnh một cách riêng rẽ đều không đem lại kết quả. Hơn nữa các nước láng giềng như Pakistan, Bhutan, Nepal, Bangladesh đã làm lây nhiễm nhiều chủng loại virus LMLM của họ cho Ấn Độ [31]. Trung Quốc là nước có đường biên giới rất dài với Việt Nam, là nước thường xuyên có bệnh LMLM, việc buôn bán trao đổi hàng hóa giữa Việt Nam và Trung Quốc, nhất là việc buôn bán vận chuyển trái phép động vật và sản phẩm động vật là nguyên nhân lây lan dịch bệnh giữa hai nước [62]. Ở khu vực Đông Nam Á, một số nước có dịch như Lào, Campuchia, Thái Lan, Myanmar, Philippines, Malaysia và Viêt Nam đã chịu những thiệt hại rất lớn do dịch gây ra [23]. Ở Thái Lan, khi bị dịch này, chính phủ đã chi mỗi năm hàng triệu USD để khống chế dịch. Ngoài ra, Liên Hợp Quốc còn hỗ trợ thêm 36 triệu USD để thành lập Trung tâm chẩn đoán LMLM để định chủng virus, nghiên cứu dịch tễ và sản xuất vaccine. Thái lan đã có 7/9 vùng kinh tế đã sạch bệnh và ở 7 vùng này vẫn xuất khẩu động vật, sản phẩm động vật và nông sản đi nhiều nước với số lượng lớn. Indonesia đã thanh toán được bệnh này từ năm 1983, Phillippines đã được Tổ chức Thú ý Thế giới OIE công nhận an toàn ở vùng Mindanao, Visay và Luzon. Nhiều nước trên thế giới đã thanh toán được bệnh dịch LMLM như Australia, New Zealand, các nước thuộc quần đảo Thái Bình Dương, các nước thuộc EU, các nước thuộc vùng Bắc Trung Mỹ. Các nước trên đều phải thực hiện một chương trình quốc gia về tiêm phòng nhiều năm, kiểm dịch và các biện pháp khác theo quy định của Tổ chức Thú y thế giới [58]. 1.1.2 Tình hình phát triển bệnh LMLM ở Việt Nam 1.1.2.1 Lịch sử bệnh Năm 1898, bệnh LMLM được phát hiện lần đầu tiên ở Nha Trang [1]. Sau đó bệnh lan rộng ra cả 3 miền Bắc, Trung, Nam [4]. Cùng thời gian này bệnh xuất hiện ở các nước lân cận như Lào, Campuchia, Thái Lan… Trong gần trọn một thế kỷ, bệnh này đã tồn tại và phát triển trên địa bàn 107 trong tổng số 229 huyện thuộc 26 tỉnh, gây nên hàng trăm ổ dịch, làm cho hàng chục vạn trâu, bò và lợn bị bệnh. Từ năm 1996-2011, bệnh LMLM đã xảy ra tại 2.873 (26% trong tổng số 11.020) xã, làm tổng số là 5.630 lượt xã có dịch thuốc 463 (66,7% trong tổng số 694) huyện thị, thành phố của tất cả 63 tỉnh, thành phố. Tổng số có 238.669 trâu, bò và lợn bị bệnh trong giai đoạn này [64]. 1.2 Bệnh Lở mồm long móng 1.2.1 Sơ lƣợc về bệnh Lở mồm long móng Bệnh Lở mồm long móng ( viết tắt là LMLM) là bệnh truyền nhiễm nguy hiểm của động vật móng guốc chẵn như : trâu, bò, lợn, dê, hươi, nai…[7,17]. Sự nguy hiểm của bệnh là khả năng lây lan rất nhanh, rất mạnh. Sự lây lan không chỉ do tiếp xúc giữa động vật khỏe với động vật mắc bệnh mà còn qua nhiều con đường kể cả qua không khí. Vì vậy bệnh thường phát thành đại dịch gây thiệt hại về chăn nuôi, ảnh hưởng đến kinh tế xã hội nhiều nước thuộc nhiều châu lục trên thế giới. Do bệnh không lây lan sang người nên đôi khi công tác phòng chống dịch bệnh không nhận được sự hưởng ứng và tham gia tích cực của cộng đồng. Bệnh thường gây thiệt hại lớn cho các loài gia súc chăn nuôi cao sản như bò sữa, bò thịt, lợn hướng nạc. Gia súc mắc bệnh thường giảm tăng trọng, giảm sản lượng sữa và là động vật mang trùng, vì vậy các nước có nền chăn nuôi, kinh tế phát triển rất quan tâm. Mặc dù xuất hiện như một loại bệnh nhẹ, có tỷ lệ tử vong thấp ngoại trừ những con vật non, từ 25% đối với gia súc trưởng thành và 20-50% ở đàn gia súc như bê, nghé, lợn con. Ở gia súc sinh sản, bệnh LMLM làm sảy thai khoảng 25% động vật có chửa, sản lượng sữa giảm 50% do viêm vú và lượng sữa thu được phải trải qua nhiều khâu khử trùng phức tạp mới sử dụng được. Điều này cho thấy sự thiệt hại về kinh tế do bệnh LMLM gây ra là rất trầm trọng [32].<br /> <br /> Khi dịch bệnh xảy ra gây hậu quả nghiêm trọng cho nền kinh tế, xã hội cũng như các vấn đề về môi trường ở khu vực có dịch vì thế bệnh LMLM được đặt ở vị trí số 2 bảng A trong danh mục các bệnh truyền nhiễm ở gia súc. 1.2.2 Đặc tính sinh học của virus LMLM 1.2.2.1 Hình thái và cấu tạo Virus gây bệnh LMLM là loại virus nhỏ nhất thuộc họ Picornavirideae nhóm Aphthovirus,có kích thước 20-30 nm, có cấu trúc đa diện 30 mặt đều, hạt virus chứa 30% acid nucleic, là một đoạn RNA. Vỏ capsid có 60 đơn vị gọi là capsome, mỗi capsome có 4 loại protein (VP1, VP2, VP3, VP4) trong đó VP1 có vai trò quan trọng nhất trong việc gây bệnh, cũng như là loại kháng nguyên chính tạo kháng thể chống lại virus gây bệnh LMLM. Virus LMLM là loại virus không có vỏ bọc, lớp ngoài cùng của chúng được cấu tạo bởi một màng lipid. Do vậy chúng có sức đề kháng cao đối với các loại dung môi hữu cơ (như cồn, ete…). Tuy nhiên, virus LMLM lại rất mẫn cảm với ánh sáng mặt trời, acid, formol… 1.2.2.2 Phân loại Virus LMLM được hai nhà khoa học Đức là Loefler và Frosch phân lập lầu đầu tiên vào năm 1987. Cho đến năm 1902, hai nhà khoa học Pháp Vallée và Carée lần đầu tiên phát hiện ra sự tồn tại của hai type virus gây bệnh LMLM ở bò được gọi là type O (phân lập được tại vùng Oisée – Pháp) và type A (phân lập được tại vùng Ardène – Pháp) có trong đàn bò nhập từ Đức. Năm 1926 hai nhà khoa học Đức là Waldmann và Trautwein đã phân lập được 3 type virus LMLM và đặt tên là A, B, C. Nhưng sau đó các nhà khoa học thấy rằng hai type A và B có đặc tính giống với 2 type O và A mà hai nhà khoa học Pháp đã phân lập được trước đó. Cho đến năm 1952, các nhà khoa học trên thế giới đã thống nhất gọi các type là O, A, C [3]. Type Asia 1 do Brooksby và Rogere (1957) tìm thấy ở Pakistan, đaya là type hay gây bệnh phổ biến ở lục địa Châu Á. (cận Đông, Ấn Độ, Pakistan, Thái Lan, Trung Quốc, Lào, Hồng Kông…) [34]. Type SAT1, SAT2, SAT3 (Southern African Teritoties) tìm thấy ở Nam Phi và được giám định tại viện Pirbright (Anh) trên các bệnh phẩm bò ở miền Nam và Bắc Rhodesia. Các type này chủ yếu có trên lục địa Châu Phi (Nam, Trung và Đông Phi, Saudan, Ai cập…) phổ biến nhất là các type SAT1, mới đây cũng thấy type SAT1 tại vùng Trung Cận Đông. Bệnh gây ra bởi chủng virus thuộc họ Picornaviridae nhóm Aphthovirus. Virus có 7 type là type A, O, C, SAT1, SAT2, SAT3 và Asia 1 [11], các type khác nhau có độc lực khác nhau. Những virus này thường biến hóa không ngừng thành những chủng phụ mới có khác biệt về tính kháng nguyên, tồn tại bền vững, đã có hơn 70 phân type được xác định [57], vì vậy phải thường xuyên chẩn đoán định chủng virus chính xác qua xét nghiệm tại phòng thí nghiệm thì mới chọn được loại vác xin thích hợp để phòng cho từng vùng và từng thời kỳ. Các type virus LMLM gây những triệu chứng lâm sàng giống nhau, nhưng không có miễn dịch bảo hộ chéo với nhau. Đây chính là một khó khăn về kỹ thuật và gây tốn phí lớn về kinh tế trong việc sản xuất vaccine phòng bệnh thích hợp cho từng khu vực dịch. Phương pháp phân loại virus chủ yếu dựa trên kháng nguyên. Cho đến nay chưa phát hiện thêm type nào mới nhưng các chủng virus LMLM do có genome là RNA nên liên tục có sự biến đổi tạo ra các subtype mới. Trước đây các subtype thường được ký hiệu bằng số mũ như O1, A32…thì nay người ta thống nhất ký hiệu là O1, A32… 1.2.3 Khả năng tồn tại của mầm bệnh trong điều kiện tự nhiên Visus LMLM là loại virus không có vỏ bọc, lớp ngoài cùng của virus là một lớp lipid do vậy virus có tính đề kháng cao với các dung môi hữu cơ (cồn, ete…). Tuy nhiên virus LMLM lại khá mẫn cảm với ánh sáng mặt trời, formol, acid, kiềm. Như với dung dịch NaOH 0,5-1% tiêu diệt virus một cách nhanh chóng 5 phút. Ở phân, nước tiểu, máu, những chỗ loét hay với nước bọt trâu, bò, virus có thể tồn tại từ 5-10 ngày sau khi nhiễm ở 180C. Nhiệt độ lạnh là một nhân tố bảo tồn virus LMLM một<br /> <br /> cách khá tốt. Trong tủ lạnh, virus cũng hoạt lực sau 425 ngày. Thịt ướp đông lạnh xong sấy khô có thể giữ virus tồn tại trong 52 tháng . Gia súc khỏi bệnh trở thành vật mang trùng lâu dài, đặc biệt là trâu, bò. Chính những con mang trùng này là nguyên nhân tái phát ổ dịch cũ và phát sinh ổ dịch mới ở nơi chúng được đưa đến. Theo quy định của Tổ chức Thú y thế giới gia súc tại các ổ dịch cũ, trong khi thực hiện công tác giám sát dịch tễ, nếu phát hiện có dương tính với bệnh LMLM phải giết hủy hoặc đánh dấu không cho vận chuyển. 1.2.4 Đặc tính gây bệnh Bệnh LMLM là một bệnh truyền nhiễm cấp tính, có khả năng lây lan nhanh, mạnh với phạm vi rất rộng đối với các loài động vật móng guốc chẵn như trâu, bò, lợn, dê, cừu. Loài động vật một móng như ngựa, lừa, la, gia cầm, chim không bịm ắc bệnh, nhưng vịt có thể bị mắc. Trong phòng thí nghiệm, chuột lang, chuột nhắt trắng, chuột đồng, chuột Hamster dễ cảm nhiễm. Khía da bàn chân của chuột lang rồi chà xát bệnh phẩm có virus lên thì sau 1224 giờ quan sát thấy có nổi mụn nhỏ, màu đỏ, có thủy nhũng, đau chỗ khía, sau 48-72 giờ thấy nổi mụn nước đặc trung, nhiễm trùng toàn thân, xuất hiện nhiều mụn ở miệng, lưỡi, lợi và có tình trạng thần kinh với triệu chứng tê liệt, co giật [1,2]. 1.2.5 Đƣờng xâm nhập và phƣơng thức lây lan 1.2.5.1 Đƣờng lây lan Lây lan trực tiếp: mầm bệnh có xâm nhập do tiếp xúc trực tiếp giữa gia súc có mang mầm bệnh và gia súc cảm nhiễm qua tổn thương ở da Lây lan gián tiếp: mầm bệnh theo thức ăn nước uống xâm nhập vào cơ thể gia súc qua đường tiêu hóa, qua không khí vào đường hô hấp. Trong ổ dịch, mầm bệnh chủ yế truyền lây qua không khí vào đường hô hấp, tiếp theo là qua thức ăn nước uống, chất thải, dụng cụ chăn nuôi, người chăn nuôi và cán bộ thú y mang mầm bệnh truyền đi. Bệnh lây lan từ vùng này sang vùng khác qua con đường tiêu thụ, vận chuyển súc vật sống và sản phẩm động vật không được kiểm dịch chặt chẽ. Từ các ổ dịch cũ không được khử trùng triệt để, mầm bệnh còn tồn tại trong môi trường sẽ gây bệnh cho gia súc. 1.2.5.2 Nguồn bệnh Nguồn bệnh từ các nước láng giềng có thể xâm nhập vào do vận chuyển trái phép động vật và sản phẩm động vật có mang mầm bệnh. Do sự tiếp xúc của gia súc nước ta và gia súc các nước có dịch trên đồng cỏ chăn thả tự nhiên ở vùng biên giới Do việc vận chuyển động vật và sản phẩm động vật từ vùng có dịch đến vùng khác. Do mầm bệnh LMLM tồn tại ở địa phương và tái phát ở các ổ dịch cũ. Do động vật hoang dã mang mầm bệnh truyền cho gia súc. 1.2.6 Các phƣơng pháp chẩn đoán bệnh 1.2.6.1 Chẩn đoán lâm sàng 1.2.6.2 Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm 1.2.6.3 Phƣơng pháp chẩn đoán virus học 1.2.6.4 Phƣơng pháp chẩn đoán huyết thanh học 1.2.6.5 Phản ứng kết hợp bổ thể 1.2.6.6 Phản ứng trung hòa virus 1.2.6.7 Phản ứng ELISA 1.2.6.8 Phƣơng pháp RT-PCR Thông thường chẩn đoán LMLM thường là dựa trên các dấu hiệu lâm sàng, sau đó khẳng định lại bằng các phương pháp khác như phân lập virus trong tế bào, ELISA, RT – PCR… Trong đó phương pháp phân lập virus được gọi là chuẩn vàng “gold standard”, tuy nhiên phương pháp này đòi hỏi thời gian lâu từ 1 đến 4 ngày để cho kết quả, làm<br /> <br />