Luận văn Thạc sĩ Khoa học lâm nghiệp: Nghiên cứu nhân giống in vitro cây Trầm hương (Aquilaria crassna Pierre ex. Lecomte) tại Bình Thuận

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ NÔNG NGHIỆP & PTNT

TRƯỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP

---------------------

TRẦN THỊ CẢNH ĐÀI NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG IN VITRO

CÂY TRẦM HƯƠNG (Aquilaria crassna Pierre ex. Lecomte)

TẠI BÌNH THUẬN

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC LÂM NGHIỆP Đồng Nai, 2012

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ NÔNG NGHIỆP & PTNT

TRƯỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP

---------------------

TRẦN THỊ CẢNH ĐÀI NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG IN VITRO

CÂY TRẦM HƯƠNG (Aquilaria crassna Pierre ex. Lecomte)

TẠI BÌNH THUẬN

CHUYÊN NGÀNH: LÂM HỌC MÃ SỐ: 60.62.60 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC LÂM NGHIỆP NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS.TS. DƯƠNG MỘNG HÙNG

Đồng Nai, 2012

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan, đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu

trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nghiên

cứu nào khác.

Tác giả

Trần Thị Cảnh Đài



Con xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Ba, Mẹ, những người thân đã tận tình giúp

đỡ con về mặt vật chất cũng như tinh thần để con có điều kiện học tập.

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu, Khoa sau Đại học Trường Đại học

Lâm nghiệp và quý Thầy Cô đã tạo điều kiện cho tôi được học tập, trang bị rất

nhiều kiến thức chuyên môn trong lĩnh vực đã chọn.

Trong thời gian làm luận văn tốt nghiệp tôi đã nhận được sự giúp đỡ, chỉ bảo

tận tình của PGS.TS. Dương Mộng Hùng là người thầy hướng dẫn khoa học đã

luôn nhiệt tình chỉ bảo, giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp này. Với tất cả

tấm lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn.

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Trung tâm giống cây trồng Bình

Thuận, các anh chị em bạn hữu, những người đã tạo điều kiện, động viên và giúp

đỡ tôi hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp này.

Do thời gian và kinh nghiệm còn hạn chế, luận văn chắc chắn không tránh khỏi

những thiếu sót. Tôi mong nhận được những ý kiến đóng góp quý báu của các thầy,

cô giáo, các nhà khoa học cùng bạn bè đồng nghiệp để luận văn được hoàn thiện

hơn.

Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn !

Bình Thuận, tháng 07 năm 2012

TRẦN THỊ CẢNH ĐÀI

LỜI CẢM ƠN

MỤC LỤC

Trang

Trang phụ bìa

Lời cam đoan ........................................................................................................................ i

Lời cảm ơn ........................................................................................................................... ii

Mục lục ................................................................................................................................ iii

Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt .............................................................................. vi

Danh mục các bảng ............................................................................................................. vii

Danh mục các hình vẽ, đồ thị ............................................................................................ viii

ĐẶT VẤN ĐỀ ..................................................................................................................... 1

Chương 1.TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU .................................................. 3

1.1. Giới thiệu về cây Trầm hương ...................................................................................... 3

1.1.1. Đặc điểm thực vật học 3

1.1.2. Đặc điểm sinh thái và phân bố ................................................................................... 5

1.1.3. Công dụng của Trầm hương ...................................................................................... 6

1.1.3.1. Hương liệu mỹ phẩm .............................................................................................. 7

1.1.3.2. Dược Liệu ............................................................................................................... 7

1.1.3.3. Các lĩnh vực khác.................................................................................................... 8

1.1.4. Tình hình khai thác Trầm hương trong tự nhiên ........................................................ 9

1.1.5. Giải pháp bảo tồn và phát triển nguồn gien .............................................................. 10

1.2. Khái niệm về nuôi cấy mô ........................................................................................... 11

1.3. Các giai đoạn chính trong quá trình nhân giống .......................................................... 13

1.3.1. Giai đoạn chuẩn bị

........................................................................................... 13

1.3.2. Giai đoạn cấy khởi động ........................................................................................... 14

1.3.3. Giai đoạn nhân nhanh 14

1.3.4. Tạo cây hoàn chỉnh (ra rễ) ........................................................................................ 15

1.3.5. Đưa cây ra môi trường tự nhiên ................................................................................ 15

1.4. Những thành tựu về cây Trầm hương trên thế giới và Việt Nam ................................ 16

1.4.1. Trên thế giới .............................................................................................................. 16

1.4.2. Ở Việt Nam ............................................................................................................... 17

CHƯƠNG 2. MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Mục tiêu ....................................................................................................................... 21

2.1.1. Mục tiêu tổng quát .................................................................................................... 21

2.1.2. Mục tiêu cụ thể

........................................................................................... 21

2.2. Đối tượng ..................................................................................................................... 21

2.2.1. Cây mẹ lấy vật liệu

........................................................................................... 21

2.2.2. Vật liệu nuôi cấy (mẫu cấy) ....................................................................................... 22

......... ................................................................................................................ 21

2.4. Nội dung nghiên cứu

............................................................................................ 23

2.5. Phương pháp nghiên cứu 24

2.5.1. Lựa chọn phương pháp khử trùng mẫu vật nuôi ở các nồng độ khác nhau của HgCl2

và Ca (0Cl)2 trong các khoảng thời gian khác nhau ......................................................... ..26

2.5.2. Chọn loại môi trường phù hợp .................................................................................. 26

2.5.3. Ảnh hưởng của vitamin B2 đến hệ số nhân chồi và tỷ lệ chồi hữu hiệu

............................................................................................................................................ 27

2.5.4. Ảnh hưởng của chất điều hoà sinh trưởng đến hệ số nhân chồi và chất lượng chồi 28

2.5.4.1. Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến hệ số nhân chồi và tỷ lệ chồi hữu hiệu ........... 28

2.5.4.2. Ảnh hưởng của nồng độ BAP + NAA đến hệ số nhân chồi và tỷ lệ chồi hữu

hiệu.…………………………………………………………………… .28

2.5.4.3. Ảnh hưởng của nồng độ IBA đến tỷ lệ ra rễ, số rễ trung bình/cây và chiều dài trung

bình của rễ

2.5.4.4. Ảnh hưởng của thời gian huấn luyện đến tỷ lệ sống và chiều cao cây con ở vườn

ươm -- 29

2.5.4.5. Điều kiện thí nghiệm .............................................................................................. 31

2.5.5.. Bố trí thí nghiệm ..................................................................................................... 31

2.5.6. Thu thập và xử lý số liệu .......................................................................................... 32

Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .......................................................................... 35

3.1. Lựa chọn phương pháp khử trùng mẫu cấy .................................................................. 35

3.2. Nghiên cứu loại môi trường thích hợp cho nhân nhanh chồi ..................................... 38

2.3. Phạm vi nghiên cứu .............................................................................. 22

3.3. Ảnh hưởng của việc bổ sung vitamine B2 vào môi trường đến hệ số nhân chồi và tỷ lệ

chồi hữu hiệu ...................................................................................................................... 43

3.4. Ảnh hưởng của chất điều hoà sinh trưởng trong môi trường đến hệ số nhân chồi và tỷ lệ

chồi hữu hiệu ...................................................................................................................... 47

3.4.1. Ảnh hưởng của BAP đến hệ số nhân chồi và tỷ lệ chồi hữu hiệu ............................ 46

3.4.2. Ảnh hưởng của sự phối hợp nồng độ BAP + NAA trong môi trường đến hệ số nhân

chồi và tỷ lệ chồi hữu hiệu ................................................................................................. 52

3.4.3. Ảnh hưởng của sự phối hợp nồng độ IBA trong môi trường tỷ lệ chồi ra rễ, số rễ trung

bình/cây và chiều dài của rễ 57

3.4.4. Ảnh hưởng của thời gian huấn luyện đến tỷ lệ sống và chiều cao của cây con ở vườn

ươm -- 62

Chương 4. KẾT LUẬN, TỒN TẠI VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................ 65

4.1. Kết luận ....................................................................................................................... 65

4.2. Tồn tại ......................................................................................................................... 65

4.3. Kiến nghị ..................................................................................................................... 66

DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

CHỮ VIẾT TẮT

TÊN ĐẦY ĐỦ

BAP

6- Benzyl amino purine

Riboflavil

Bộ NN&PTNT

Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn

Hypoclorit canxi

Ca (0Cl)2

Na0Cl

Hypoclorit natri

Clorua thuỷ ngân

HgCl2

IBA

3-Indol butyric acid

NAA

Nathyl acetic acid

PVP

polyvinin pyrroline

Nước dừa

MTĐC

Môi trường được chọn

ĐC

Đối chứng

Công thức

HSNC

Hệ số nhân chồi

TLCHH

Tỉ lệ chồi hữu hiệu

TLCS

Tỉ lệ cây sống

CCTB

Chiều cao trung bình

TLCRR

Tỉ lệ chồi ra rễ

SRTB

Số rễ trung bình

CDTBR

Chiều dài trung bình rễ

DANH MỤC CÁC BẢNG

Số hiệu bảng

Tên bảng

Trang

2.1

Công thức khử trùng mẫu cấy

2.2

Công thức ảnh hưởng của 5 loại môi trường đến hệ số nhân

chồi và tỉ lệ chồi hữu hiệu

2.3

Công thức ảnh hưởng của vitamin B2 đến khả năng nhân

chồi

2.4

Công thức thí nghiệm nhân chồi ảnh hưởng của nồng độ

BAP

2.5

Công thức thí nghiệm nhân chồi ảnh hưởng của nồng độ BAP

và NAA

2.6

Công thức thí nghiệm ra rễ

3.1

Tổng hợp kết quả khử trùng mẫu

3.2

Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của 5 loại môi trường đến

HSNC

3.3

Ảnh hưởng của việc bổ sung vitamin B2 đến HSNC và

TLCHH

3.4

Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến HSNC và TLCHH

3.5

Ảnh hưởng của sự phối hợp nồng độ BAP + NAA đến HSNC

và TLCHH

3.6

Ảnh hưởng nồng độ IBA đến tỷ lệ chồi ra rễ, số rễ trung bình

và chiều dài của rễ

3.7

Ảnh hưởng của thời gian huấn luyện đến tỷ lệ sống của cây

con tại vườn ươm

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Tên hình vẽ

Số hiệu hình vẽ

Trang

Một số hình ảnh về cây Trầm hương ngoài thực địa

1.1

Nước hoa từ trầm

1.2

1.3

Nhang từ Trầm

1.4

Đồ thủ công mỹ nghệ

2.1

Hình cây cung cấp vật liệu đưa mẫu vào

3.1

Biểu đồ tỉ lệ mẫu sống khi khử trùng mẫu

3.1

Hình khử trùng mẫu sau 3 tuần nuôi cấy

3.2

Biểu đồ ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến

HSNC

3.2

Hình mẫu nuôi cấy sau 4 tuần trong môi trường MS*

3.3

Hình mẫu nuôi cấy sau 4 tuần trong môi trường WPM

3.3

Biều đồ ảnh hưởng của vitamin B2 đến HSNC

3.4

Hình mẫu nuôi cấy sau 4 tuần trong môi trường Litvay

3.4

Biểu đồ ảnh hưởng của vitamin B2 đến TLCHH

3.5

Hình mẫu nuôi cấy trong môi trường WPM không bổ

sung B2 sau 4 tuần nuôi cấy

3.5

Biểu đồ ảnh hưởng của BAP đến HSNC

3.6

Biểu đồ ảnh hưởng của BAP đến TLCHH

3.6

Hình mẫu nuôi cấy trong môi trường có bổ sung

2.0mg/l B2 sau 4 tuần nuôi cấy

3.7

Hình mẫu nuôi cấy trong môi trường có bổ sung 2mg/l

BAP sau 4 tuần nuôi cấy

3.8

Hình chồi Trầm hương trong môi trường không bổ

sung BAP sau 4 tuần nuôi cấy

3.7

Biểu đồ ảnh hưởng sự phối hợp nồng độ BAP+NAA

đến HSNC

3.8

Biểu đồ ảnh hưởng sự phối hợp nồng độ BAP+NAA

đến TLCHH

3.9

Hình chồi Trầm hương trong môi trường có bổ sung

0.5mg/l BAP sau 4 tuần nuôi cấy

3.9

Biểu đồ ảnh hưởng của IBA đến tỉ lệ chồi ra rễ của

cây

3.10

Hình chồi Trầm hương trong môi trường có phối hợp

0.5mg/l BAP+ 0.2mg/l NAA sau 4 tuần nuôi cấy

3.10

Biểu đồ ảnh hưởng của IBA đến số rễ trung bình của

cây

3.11

Hình chồi nuôi cấy trong môi trường có bổ sung

0.5mg/l IBA sau 4 tuần nuôi cấy

3.11

Biểu đồ ảnh hưởng của thời gian huấn luyện đến tỉ lệ

cây sống

3.12

Hình cây cấy ra ngoài bầu đất

ĐẶT VẤN ĐỀ

Cây Trầm hương còn gọi là cây Dó bầu, hay cây Kì nam, trong gỗ của

nó có khả năng sinh ra một loại sản phẩm đặc biệt gọi là Trầm hương hay Kì

nam. Trầm hương có rất nhiều công dụng đã được biết và sử dụng từ hàng

ngàn năm qua ở nhiều nước trên thế giới. Từ xưa đến nay Trầm hương và Kì

nam là loại sản phẩm đặc biệt quý hiếm của rừng mà thiên nhiên ưu ái ban

tặng cho con người. Đây là sản phẩm đặc biệt có giá trị để sản xuất một số

loại dược phẩm, mỹ phẩm cao cấp cũng như dùng trong tín ngưỡng của nhiều

tôn giáo ở nhiều nước trên thế giới. Chính vì vậy mà Trầm hương có giá trị

kinh tế rất cao trên thị trường. Điều này đã làm cho cây Trầm hương trở thành

loài thực vật đặc biệt được nhiều nhà khoa học và người dân chú ý, có giá trị

đặc biệt về mặt nghiên cứu khoa học ở Việt Nam nói riêng và các nước trên

thế giới nói chung. Với giá trị lợi nhuận cao, người khai thác trầm bằng cách

đốn tất cả các cây, dùng dao hoặc rìu bổ dọc suốt thân và rễ để tìm trầm.

Hậu quả là nguồn gien của cây Trầm hương bị mai một, những cây

Trầm hương đầu dòng hiện nay còn rất ít trong các cánh rừng nguyên sinh, có

nơi hầu như không có cây lớn để gieo giống. Hiện cây Trầm hương đang

đứng trước nguy cơ bị tiêu diệt và đang được xếp vào loại “Nguy Cấp – EN”

trong Sách Đỏ Việt Nam [2], cần được bảo tồn và phục hồi.

Để thực hiện phương án bảo tồn, phát triển nguồn gien và khôi phục lại

nguồn đặc sản quý hiếm, thì đi đôi với việc bảo vệ, cấm khai thác nguồn gien

tự nhiên là nghiên cứu các biện pháp nhân giống cây Trầm hương hoàn toàn

mang đầy đủ các đặc tính ưu việt của cây bố mẹ nhằm cung cấp nguồn giống

đồng đều, sạch bệnh, cũng như làm cơ sở để tạo ra một số lượng lớn cây

giống từ việc nhân nhanh những cây Trầm hương ưu việt đã có trầm chỉ trong

một thời gian ngắn là công việc phải được đặt ra và triển khai khẩn trương.

Trước tình hình đó, để sản xuất được một số lượng lớn cây giống đạt

chất lượng cao cũng như có khả năng tạo trầm về sau, nhưng giá thành cây

con lại thấp. Việc nghiên cứu nhân giống cây Trầm hương bằng kỹ thuật nuôi

cấy mô để hoàn thiện công nghệ và phục vụ nguyên liệu giống cho phát triển

các vùng chuyên canh trầm hương xuất khẩu là rất cần thiết. Từ những đặc

điểm, nhu cầu thực tiễn và nhu cầu khoa học nêu trên, chúng tôi tiến hành

thực hiện đề tài “Nghiên cứu nhân giống In vitro cây Trầm Hương

(Aquilaria crassna Pierre ex. Lecomte) tại Bình Thuận”.

Chương 1

TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

1.1. Giới thiệu về cây Trầm hương

Tên Việt Nam: Trầm hương hay Dó bầu, Kỳ nam, Rà hương

Tên khoa học: Aquilaria crassna Pierre ex. Lecomte

Lớp (Class): Magnoliopsida

Bộ (Order): Myrtales

Họ (Family): Thymelaeaceae

1.1.1. Đặc điểm thực vật học

Trầm hương là một loại cây gỗ lớn, tán thưa, cao khoảng 20m (cũng có

thể đạt được 40m). Đường kính ngang ngực 40-50cm (có thể đạt được 80cm).

Vỏ mỏng khoảng 2-4mm, trong vỏ có nhiều sợi dài, bền. Lá đơn, mọc cách,

hình ngọn giáo, dài 6-15cm, rộng 2-3cm, đầu mũi nhọn. Hoa tự hình tán, màu

trắng. Quả mang hình trứng ngược, dài 3-5cm, rộng 2-3cm, có nhiều lông.

Khi chín khai thành hai mảnh, và có từ một đến hai hạt màu đen, có hai phần

chính ở phía trên hình nón, phần kéo dài ở phía dưới, phần vỏ ngoài cùng hóa

gỗ cứng, bên trong mềm có chứa nhiều dầu.

Một đặc điểm cần chú ý là hạt Trầm hương có đời sống rất ngắn. Cho

đến nay việc nhân giống vẫn chủ yếu bằng hạt. Quả sau khi thu hái cần phơi

trong bóng mát, chỉ sau vài ngày, vỏ quả sẽ nứt và hạt rơi ra. Mỗi quả chỉ

chứa một hạt, cây có kích thước trung bình hàng năm chỉ cho chừng 2.000

hạt. Khối lượng trung bình của 1.000 hạt ở loài A. malaccensis nặng khoảng

670 gram. Hạt Trầm mất sức nảy mầm rất nhanh, do đó cần gieo hạt ngay sau

khi thu hái. Sau khi gieo khoảng 10 – 12 ngày, hạt đã bắt đầu nảy mầm; tuy

nhiên thời gian nảy mầm cũng có thể chậm hơn, đôi khi tới trên một tháng.

Những thử nghiệm tại Ấn Độ đã cho biết, thời gian bảo quản có ảnh hưởng

lớn đến khả năng nảy mầm của hạt. Gieo hạt ngay sau khi thu hái thì tỷ lệ nảy

mầm đạt khoảng 65%; nếu bảo quản hạt một tuần rồi mới đem gieo thì tỷ lệ

nảy mầm giảm rõ rệt, còn khoảng 45%. Sau ba tuần bảo quản, tỷ lệ hạt nảy

mầm chỉ còn có 5%.

Thời gian ra hoa kết trái: Cây Trầm hương sau khoảng 4-5 năm tuổi thì

bắt đầu ra hoa kết trái, tùy vào điều kiện thời tiết của mỗi vùng mà thời gian

ra hoa có khác nhau. ở Miền Trung Việt Nam cây bắt đầu ra hoa vào tháng 3

và trái chín vào tháng 7 dương lịch. Nhưng ở Miền Nam thời gian ra hoa

tháng 2, trái chín tháng 5-tháng 6 dương lịch.

Ở giai đoạn vườn ươm, cây con cần giữ đủ ẩm, cần che bóng và phòng

trừ sâu bệnh. Khi cây mạ đạt 40 – 45 ngày tuổi thì cây đã cao khoảng 3 – 4

cm, có thể đánh trồng vào bầu đất. Khoảng 10 – 12 tháng tuổi, cây con đã đạt

độ cao 30 – 35 cm, lúc này có thể đưa ra trồng trên diện tích sản xuất. Tại

Malaysia, việc trồng cây con trong bầu với bộ rễ nguyên vẹn đã đạt tỷ lệ sống

rất cao.

Tại miền Đông Bắc Ấn Độ, thời vụ trồng Trầm trên diện tích sản xuất

thường vào các tháng 5 – 6 và khoảng cách trung bình giữa các cá thể là 2,5

m x 2,5 m. Các quần thể Trầm của Malaysia đã được trồng theo khoảng cách

6 m x 2 m.

Thời gian đầu, việc làm cỏ, làm vệ sinh trong các quần thể Trầm là rất

cần thiết. Năm đầu tiên thường phải làm cỏ đến 4 lần; các năm tiếp theo, khi

Trầm đã sinh trưởng tốt thì số lần làm cỏ sẽ giảm dần. Khi Trầm đã đạt 5 – 6

năm tuổi, mỗi năm chỉ cần làm cỏ một lần. Sau thời kỳ này, việc tỉa thưa dần

để tạo điều kiện dinh dưỡng, độ thông thoáng và ánh sáng cho cả quần thể là

hết sức cần thiết.

Trong rừng tự nhiên, để tạo điều kiện cho Trầm phục hồi và sinh

trưởng, cần trồng dặm bổ sung hoặc phát quang loại bỏ dây leo và các cây

khác có giá trị kém. Hiện vẫn chưa có thông tin gì về vấn đề sâu bệnh hại ở

Trầm.

Hình 1.1. Một số hình ảnh về cây Trầm hương ngoài thực địa

1.1.2. Đặc điểm sinh thái và phân bố

Trên thế giới chi Trầm hương (Aquilaria) gồm khoảng 8 loài, phân bố

chủ yếu ở khu vực nhiệt đới từ Ấn Độ đến Đông Nam Á và miền nam Trung

Quốc.

Ở nước ta, cây Trầm hương thường mọc rải rác trong các vùng rừng

dọc miền Trung và các tỉnh phía Nam, xuống tận An Giang, Kiên Giang và

đảo Phú Quốc, có nơi có mật độ cao, đạt đến 120 - 150 cây/ha như Ba Rền

(Quảng Bình), Hương Khê (Hà Tĩnh). Phân bố tập trung nhất và nhiều nhất là

ở các tỉnh Hà Tĩnh, Quảng Bình, Quảng Nam, Gia Lai, Kontum, Phú Yên và

Kiên Giang [8].

Trong tự nhiên cây Trầm hương thường mọc trong vùng rừng nhiệt đới

ẩm trên địa hình có độ cao so với mực nước biển từ 300-1000m, nhưng tập

trung nhiều nhất ở độ cao 700m và rất thích hợp ở những nơi có độ dốc từ 25 0

trở lên. Tuy nhiên trong thực tế cây Trầm hương vẫn sinh trưởng tốt ở những

nơi có độ cao trên dưới 40m so với mực nước biển. Nhìn chung, Trầm hương

là loài thực vật ưa sáng, mọc rải rác trong các khu rừng nhiệt đới, mọc ở độ

cao 50-1200m. Nơi cao nhất được tìm thấy ở núi Chu Yang Sinh thuộc tỉnh

Đăklăk của Việt Nam. Thường thì cây Trầm hương mọc riêng lẻ nhưng cũng

có khi tìm thấy một nhóm 5-6 cây mọc gần nhau.

1.1.3. Công dụng của Trầm hương

Cây Dó bầu và sản phẩm chính của nó là Trầm hương đã có lịch sử từ

lâu đời của Việt Nam nói riêng và trên thế giới nói chung. Đó là việc Trầm

hương thường có mặt trong các tác phẩm văn học, trong tín ngưỡng tôn giáo,

trong các đền đài...[6]. Theo tài liệu khảo cổ học thì từ thời cổ đại xa xưa ông

cha ta đã biết khai thác và sử dụng Trầm hương Đời nhà Hán (206-220TCN)

nhiều nước trên thế giới đã đến Giao Châu để mua bán mà chủ yếu mua các

sản vật từ Phương Nam đặc biệt quý hiếm như sừng Tê Giác, Ngà Voi, Trầm

hương để đóng những chiếc rương đựng gia bảo như Long Bào của Hoàng

Đế.

Trầm hương còn là sản vật dùng để cống nộp hoặc là tặng phẩm của

vua chúa ở nhiều nước trên thế giới. Như là ở các nước Đông Nam Á, Ấn Độ,

IRan, IRắc, Hy Lạp…Những người theo đạo Phật, đạo Hồi, đạo Ky Tô…đều

tôn sùng Trầm hương trong những buổi cúng lễ. Hầu hết các tín đồ theo các

đạo kể trên đều coi Trầm hương là vật linh thiêng, giao lưu truyền cảm giữa

người sống và tâm linh.

Trầm hương đã được đề cao đặc biệt trong văn học Phương Đông cũng

như trong nền văn học Việt Nam, cả văn học dân gian cũng như văn học

chính thống. Như Nguyễn Du đã nói đến Trầm hương trong Truyện Kiều,

Nguyễn Gia Thiều trong “Cung Oán Ngâm Khúc”…Và cả trong ca dao tục

ngữ.

Ngày nay cùng với tiến bộ của khoa học kĩ thuật con người không

ngừng tôn vinh giá trị của Trầm hương. Đó là việc chiết xuất tinh dầu Trầm

để làm nước hoa đã và đang được phụ nữ trên thế giới ưa chuộng. Việc chiết

xuất các chất thứ cấp có trong tinh dầu Trầm để làm dược liệu…chính vì

những vấn đề đó mà Trầm hương ngày càng có giá trị kinh tế cao, và được sử

dụng trong các lĩnh vực sau:

1.1.3.1. Hương liệu mỹ phẩm

Làm chất định hương, điều chế các

loại nước hoa hảo hạng như Sental,

Nuitd’Orient, làm xà phòng tắm cao cấp

dùng cho vua chúa thời trước.

1.1.3.2. Dược Liệu

Hình 1.1. Nước hoa từ trầm

Là vị thuốc quý hiếm, có công

dụng chữa bệnh.

* Trong Đông Y Hình 1.2. Nước hoa từ trầm

+ Trừ sơn lam chướng khí: Người ta thường xông Trầm trong nhà để

trừ khí độc và thường mang Kỳ nam trong người để ngừa sơn lam chướng

khí. Ở một vài vùng, là vùng Phú Khánh, người ta thường bọc Kỳ nam trong

túi vải thưa để đeo ở cổ xem như “bùa hộ mệnh”. Trẻ em dưới 1 tuổi đeo 2

chỉ, 1 đến 5 tuổi đeo 3 chỉ, người lớn đeo 5 chỉ.

+ Dùng làm thuốc giải nhiệt và trừ sốt rét: Ở Campuchia, theo các bác

sĩ Menaut và Phana Douk, người ta thường dùng Kỳ nam, Trầm và ngà voi

mài với nước lạnh để uống. Ngày 2-3 lần, mỗi lần uống từ 3 phân đến 1 chỉ.

+ Thuốc trừ đau bụng: Theo bác sĩ Sallet ghi nhận thì thuốc Nam có toa

thuốc trị đau bụng rất hay gồm: Trầm hương 2 chỉ, sắc cùng Đậu khấu, hạt

cau, vỏ cây Mộc lan, Sa nhơn, Can khương...trong 2 chén rưỡi nước còn lại 9

phân chia uống thành 2 lần trong ngày sẽ làm cho bụng hết quặn đau.

+ Chữa bệnh đường tiểu tiện: Người ta thường mang Trầm Kỳ ở vùng

hội âm để chữa bệnh đường tiểu tiện.

+ Theo Đông y, Kỳ nam dùng để trị các chứng độc thủy do phong thổ

gây nên, làm tiêu chứng chướng mãn, no hơi, đau bụng, ói mửa, hen suyễn

thở gấp, hạ được nghịch khí, thông chứng bế do khí hư gây nên. Mài từ 3

phân tới 1 chỉ, tùy theo tuổi lớn nhỏ hòa với nước lạnh hoặc bỏ vào nước đun

sôi mà uống.

+ Chống chỉ định

- Trầm Kỳ là thuốc trụy thai, nên phụ nữ có thai không nên uống hoặc

mang trong mình, có thể làm sảy thai.

- Những người suy nhược và biếng ăn, suy gan…không nên dùng Trầm

hương.

* Trong Tây Y:

Trầm hương có tính kháng sinh, tạo kháng thể mạnh (diệt khuẩn, làm

lành vết thương) và có tác dụng chữa một số bệnh về tim mạch ( đau ngực,

suy tim), bệnh hô hấp (hen suyễn), bệnh thần kinh (an thần, trị mất ngủ, giảm

đau, trấn tĩnh…), bệnh về tiêu hóa đau bụng, buồn nôn, tiêu chảy), bệnh về

đường tiết niệu ( bí tiểu tiện)…

1.1.3.3. Các lĩnh vực khác

+ Sản phẩm biếu tặng trong lĩnh vực ngoại giao

+ Ướp xác…

+Tôn giáo: đốt trong các chùa

chiền, đền thờ…vào dịp lễ đặc biệt, làm

nhang để đốt vào lúc cúng kiến.

+ Chế tác đồ thủ công mỹ nghệ:

Tượng, vật cảnh, đồ trang trí…

+ Làm giấy quý ( vẽ tranh, viết

kinh thánh…)

Hình 1.3. Nhang từ Trầm

Các nhà khoa học ở Trường Ðại

học Rutgers, bang New Jersey (Mỹ) đã sử

dụng một số loại cây Trầm hương phổ

biến có tên khoa học là Commiphora

myrrha để tiến hành thử nghiệm trên loại

tế bào ung thư vú MCF-7, vốn có tính

năng kháng các thuốc trị ung thư. Kết quả

toàn bộ tế bào ung thư đã bị tiêu diệt hoàn

toàn. Phát hiện này cho thấy thêm một Hình 1.4. Đồ thủ công mỹ nghệ

giá trị nữa của nhựa Trầm hương trong lĩnh vực y khoa ngoài tác dụng làm

thuốc giảm đau, làm lành vết thương, chống sâu răng.

1.1.4. Tình hình khai thác Trầm hương trong tự nhiên

Trầm hương, Đinh hương, Nhục quế, Dầu thơm…xuất hiện rất sớm

trên thị trường cùng với muối ăn. Trong đó Trầm hương được xem là mặt

hàng quý giá nhất do có những công dụng đặc biệt trong đời sống cũng như

trong các tín ngưỡng tôn giáo.

Ở Việt Nam, việc khai thác và sử dụng Trầm hương đã có từ rất lâu

đời. Vào thời Bắc thuộc, nhà nước phong kiến phương Bắc hàng năm buộc

nhân dân ta phải cống nạp các sản vật quý giá như Ngà Voi, Sừng Tê Giác,

Ngọc Trai…Trong đó có cả Trầm hương.

Dưới triều nhà Nguyễn, việc khai thác Trầm hương được nhà nước

quản lý hết sức chặt chẽ. Đối với những vùng có nguồn Trầm hương để khai

thác, triều đình cắt đặt các đội canh tuần và buộc những người đi điệu vào

rừng lấy Trầm về cống nạp.

Vào thời Pháp thuộc, lệ bắt dân lấy Trầm nạp cho vua quan được bãi

bỏ, nhưng bù vào đó chính quyền thực dân Pháp tăng cường kiểm soát việc

chặt đốn cây Dó bầu để khai thác Trầm.

Sau năm 1975, do trải qua mấy chục năm chiến tranh, các khu rừng gỗ

quý bị bom đạn tàn phá nặng, nhiều cây Dó bầu bị bệnh, bom đạn hủy hoại lại

sản sinh ra những loại Trầm Kỳ rất tốt. Các địa phương có trữ lượng Trầm

hương tương đối tập trung như Quảng Nam, Quảng Ngãi, Bình Định, Phú

Yên, Khánh Hòa, Đăklăk, Gia Lai, Kontum và đảo Phú Quốc được chính phủ

cho phép khai thác và xuất khẩu Trầm hương để thu hút ngoại tệ và đổi một

số máy móc thiết bị mà địa phương đang cần. Những đội công nhân chuyên

nghiệp được thành lập để khai thác Trầm hương, nhưng thực tế số lượng

những đội khai thác lâm sản của nhà nước tại địa phương lại quá ít ỏi so với

nhu cầu. Trong thời kỳ này, sự khai thác Trầm hương phần lớn qua đường dây

thương buôn cá thể.

Trầm hương của nhà nước thu mua, một phần để phục vụ sản xuất dược

liệu, phần khác thì xuất khẩu qua Singapore, Hồng Kông, Nhật Bản…

Đến cuối thập niên 1990, nguồn Trầm hương tự nhiên ở Việt Nam gần

như cạn kiệt và để bảo vệ nguồn tài nguyên quốc gia, Chính phủ đã cấm hẳn

việc khai thác, mua bán Trầm hương và xem đó là hàng quốc cấm.

Trong tự nhiên, không phải bất kỳ cây Dó bầu nào cũng có Trầm hương

và Kỳ nam. Thông thường chỉ có 1/10 những cây trưởng thành có đường kính

thân trên 20cm có khả năng tạo Trầm, đó là những cây bị bệnh sau một thời

gian từ 10-20 năm hoặc lâu hơn nữa. Trầm kỳ thường tập trung ở phần rễ và

những nơi có trấn thương trên cây, nên khai thác trầm kỳ tức là đã diệt hoàn

toàn cây Trầm hương. Vì vậy, cây trầm hương hiện nay đang đứng trước nguy

cơ bị tiêu diệt ở hầu hết các vùng phân bố trong cả nước [9].

1.1.5. Giải pháp bảo tồn và phát triển nguồn gien

Do tình hình khai thác trầm hương quá mạnh và không thể nào kiểm

soát nổi, nên các cấp có thẩm quyền cần phải có quy chế nghiêm ngặt về khai

thác trầm (cấm khai thác trầm ở những cây có đường kính <30 cm).

+ Xây dựng một hệ thống cung ứng giống có hiệu quả để phục vụ tái

sinh tự nhiên, phục hồi lại các vùng trồng Trầm hương truyền thống.

+ Do nguồn giống ngày càng cạn kiệt, cần mau chóng đầu tư cho việc

khảo sát cây đầu dòng và xây dựng các quần thụ bảo tồn, các rừng giống tại

các vùng quy hoạch điểm.

+ Chủ động mở rộng diện tích trồng Trầm hương trong vùng phân bố

để chủ động và tăng nhanh nguồn trầm kỳ tương lai.

+ Nhân giống Trầm hương bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật.

1.2. Khái niệm về nuôi cấy mô

Nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật (còn gọi

là vi nhân giống) là phương pháp sản xuất hàng loạt cây con từ các bộ phận

rất nhỏ của cây mẹ (các cơ quan, mô hay tế bào tế) bằng cách nuôi cấy chúng

trong ống nghiệm ở điều kiện vô trùng, có môi trường thích hợp và được kiểm

soát nghiệm ngặt [11].

Nuôi cấy mô tế bào thực vật là một công cụ cần thiết trong nhiều lĩnh

vực nghiên cứu cơ bản và ứng dụng của ngành sinh học. Nhờ áp dụng kỹ

thuật nuôi cấy mô, con người đã thúc đẩy thực vật sinh sản nhanh hơn gấp

nhiều lần tốc độ vốn có trong tự nhiên. Do đó, tạo ra hàng loạt cá thể mới giữ

nguyên tính trạng di truyền của cơ thể mẹ, làm rút ngắn thời gian đưa một

giống mới vào sản xuất. Hơn nữa, dựa vào kỹ thuật nuôi cấy mô có thể duy trì

và bảo quản cây trồng quý hiếm. Nhân giống vô tính bằng kỹ thuật nuôi cấy

mô bắt đầu bằng một mảnh nhỏ thực vật vô trùng đặt vào môi trường dinh

dưỡng thích hợp. Chồi mới hay mô sẹo mà mẫu cấy này tạo ra bằng sự tăng

sinh được phân chia và cấy chuyền để nhân giống. Nuôi cấy mô tế bào thực

vật cho đến nay được chứng minh là phương pháp nghiên cứu quá trình hình

thành cơ quan hiệu quả nhất. Năm 1939, nghiên cứu quá trình hình thành cơ

quan trên sự hình thành chồi và rễ. Và các kết quả nghiên cứu về sự tác động

của các nhân tố bên trong và bên ngoài ảnh hưởng đến sự hình thành cơ quan.

Qua kết quả nghiên cứu quá trình hình thành cơ quan in vitro, cho thấy có 3

nhân tố ảnh hưởng trực tiếp: Môi trường nuôi cấy, điều kiện nuôi cấy và mẫu

được sử dụng trong nuôi cấy. Vận dụng quá trình hình thành cơ quan in vitro

qua sự tác động tương hỗ của các nhân tố nói trên, có hàng ngàn loài thực vật

đã được nghiên cứu quá trình hình thành chồi và rễ. Nuôi cấy mô thường

được trẻ hoá cao độ và có rễ giống như cây mọc từ hạt, thậm chí không có sự

khác biệt đáng kể so với cây mọc từ hạt. Trong lúc cây hom lại thường không

có rễ cọc, rễ cây không thể đâm sâu xuống đất như cây mọc từ hạt và thường

có hiện tượng bảo lưu cục bộ (topophisis) như đã đề cập ở trên. Ví dụ: cây mô

keo lai ở giai đoạn 1-2 tháng tuổi (cũng như các loài cây bố mẹ là Keo tai

tượng và Keo lá tràm) cũng có đủ các loại lá kép một lần, kép hai lần và lá

giả, lại có rễ theo kiểu rễ cọc như những cây mọc từ hạt điển hình, thì cây

hom cũng của giống này lại chỉ có lá giả của cây trưởng thành và không có rễ

cọc (nghĩa là tính trẻ hoá bị hạn chế, còn tính bảo lưu cục bộ thì biểu hiện rõ

rệt). Vì thế nuôi cấy mô còn là biện pháp trẻ hoá giống trong sản xuất lâm

nghiệp. Mặc dù nuôi cấy mô đòi hỏi kỹ thuật phức tạp, song vẫn được nhiều

nơi áp dụng, đặc biệt là phối hợp với giâm hom, tạo thành công nghệ mô -

hom đang được sử dụng khá phổ biến trong sản xuất lâm nghiệp. Tuy vậy,

tính trẻ hoá của cây nuôi cấy mô vẫn kém hơn cây mọc từ hạt, Brand và

Lineberger (1992) nghiên cứu so sánh mức độ trẻ hoá của cây mô, cây hom

lấy từ cành của cây trưởng thành và cây ghép của cây Bulô (Betula sp.) đã

thấy rằng sau 1 tháng cây nuôi cấy mô có các băng protein giống như cây mọc

từ hạt, sau 4-8 tháng lại giống với cây trưởng thành, còn cây ghép và cây hom

lấy từ cành của cây trưởng thành sau 4-8 tháng đã có một số cây có hoa, trong

lúc cây mọc từ hạt nhanh nhất cũng phải sau 8 năm mới có hoa. Điều đó

chứng tỏ cây nuôi cấy mô tuy có mức độ trẻ hoá cao hơn cây ghép và cây

hom lấy từ cành của cây trưởng thành (chứ không phải lấy từ chồi của cây đã

trẻ hoá) song không thể trẻ như cây mọc từ hạt.

Những ứng dụng khác của nuôi cấy mô và tế bào:

+ Nuôi cấy các tế bào thực vật trong môi trường lỏng trên qui mô công

nghiệp có thể sản xuất ra một lượng lớn các chất trao đổi thứ cấp rất tiện lợi

và hiệu quả cao hơn khi trồng cây để lấy sản phẩm.

+ Sử dụng phương pháp nuôi cấy mô và tế bào để nuôi cấy hạt phấn, túi

phôi còn rút ngắn được thời gian tạo ra những dòng thuần đồng hợp đơn bộ,

song đơn bội phục vụ cho việc lai tạo hạt giống rất thuận lợi.

+ Nuôi cấy mô tế bào trần và dung hợp tế bào soma để thực hện lai xa

có thể tạo ra những cây mang các tính trạng hoàn toàn mới mà tổ tiên chúng

không có.

+ Chọn lọc dòng tế bào in vitro có thể tạo ra được hàng triệu khả năng

có tác tế bào riêng biệt khác nhau về tính chống chịu với điều kiện môi trường

bất lợi như : chịu hạn, chịu mặn…

+ Dùng nuôi cấy mô tế bào cho việc chuyển nạp gien có thể được thực

hiện, một đoạn gien mã hóa thông tin cho một tính trạng quan trọng có lợi của

tế bào cơ thể này được chuyển sang nhưng tế bào đơn của cơ thể vật chủ

khác, nhưng tế bào đã được chuyển gien này được nuôi cấy và tái sinh.

Phương pháp này có thể làm thay đổi bộ gien của vật chủ, khác hẳn với

phương pháp lai giữa hai cá thể.

1.3. Các giai đoạn chính trong quá trình nhân giống

1.3.1. Giai đoạn chuẩn bị

Đây là giai đoạn rất quan trọng, cần đặc biệt chú ý những đặc tính của

vật liệu khởi đầu sẽ được duy trì và nhân lên ở tất cả các cây giống sau này.

Mục đích của giai đoạn này là tạo ra nguồn mẫu sạch để phục vụ cho các

bước tiếp theo. Giai đoạn này coi như là một bước thuần hoá vật liệu để nuôi

cấy. Cây giống được đưa ra khỏi nơi phân bố tự nhiên để chúng thích ứng với

môi trường mới, đồng thời giảm bớt khả năng nhiễm bệnh của mẫu nuôi cấy

và chủ động trong công tác nhân giống. Trong trường hợp cần thiết có thể làm

trẻ hoá vật liệu giống. Giai đoạn này bao gồm các khâu:

+ Chọn lọc cây mẹ để lấy mẫu, thường là cây ưu việt, khoẻ, có giá trị

kinh tế cao

+ Chọn cơ quan để lấy mẫu, thường là chồi non, đoạn thân có chồi ngủ,

hoa non, lá non và hạt

+ Chọn mô để nuôi cấy, mô có khả năng tái sinh cao trong ống nghiệm

sạch bệnh, giữ được các đặc tính ưu việt của cây mẹ, ít có nguy cơ biến dị.

1.3.2. Giai đoạn cấy khởi động

Mục đích của giai đoạn này là tạo ra các chồi mới từ các mô nuôi cấy.

Khi đã có nguồn nguyên liệu nuôi cấy, cần tiến hành lấy mẫu và xử lý trong

những điều kiện vô trùng. Người ta thường dùng một hoá chất như HgCl2,

Ca(0Cl)2, Na0Cl, H202, để khử trùng mẫu cấy. Tuỳ thuộc vào từng loại vật

liệu mà chọn hoá chất, nồng độ và thời gian khử trùng thích hợp. Đối với mẫu

dễ bị hoá nâu khi nuôi cấy có thể bổ sung than hoạt tính hoặc polyvinin

pyrroline ( PVP) vào môi trường. Giai đoạn này thường kéo dài từ 4 - 6 tuần.

1.3.3. Giai đoạn nhân nhanh

Một trong những ưu điểm của phương pháp nhân giống in vitro so với

các phương pháp nhân giống khác có hệ số nhân cao. Vì vậy, có thể coi đây là

giai đoạn then chốt của toàn bộ quá trình nhân giống. Hệ số nhân ở giai đoạn

này biến động từ 5-50 lần tuỳ thuộc vào loài cây, môi trường và điều kiện

ngoại cảnh thích hợp. Tuỳ vào từng hệ mô và mục đích nuôi cấy mà

Cytokinin được sử dụng ở các nồng độ khác nhau. Ở nồng độ thấp (10-7- 10-6

M) chúng có tác dụng kích thích sự phân bào, ở nồng độ 10-6- 10-5 M chúng

kích thích sự phân hoá chồi. Trong nuôi cấy mô để kích thích sự nhân nhanh

người ta thường xử dụng Cytokinin với nồng độ 10-6- 10-4 [5]. Trong giai

đoạn này vai trò của các chất điều hoà sinh trưởng (Auxin, Cytokinin) là cực

kỳ quan trọng để sản sinh ra lượng cây con tối đa mà vẫn đảm bảo sức sống

và bản chất di truyền của cây. Theo nguyên tắc chung thì môi trường có nhiều

Cytokinin sẽ kích thích tạo chồi.. Chế độ nuôi thường là 25-270C và 10-

16giờ/ngày, cường độ chiếu sáng 1000 lux. Yêu cầu của giai đoạn này là tạo

ra số lượng cây con tối đa trong thời gian ngắn nhưng vẫn đảm bảo sức sống

và bản chất di truyền của cây.

1.3.4. Tạo cây hoàn chỉnh (ra rễ)

Đây là giai đoạn chuẩn bị cho cây con chuyển ra ngoài hệ thống vô

trùng khi đã đạt được kích thước nhất định, các chồi được chuyển từ giai đoạn

3 sang môi trường tạo rễ. Thường sau 2-3 tuần ở các chồi này sẽ xuất hiện rễ

và trở thành cây hoàn chỉnh. Môi trường tạo rễ thường giảm lượng Cytokinin

và tăng lượng Auxine để tạo điều kiện cho sự ra rễ của chồi cây. Giai đoạn

này thường kéo dài từ 2-4 tuần lễ, sau đó được chuyển sang môi trường Auxin

để rễ phát triển.

1.3.5. Đưa cây ra môi trường tự nhiên

Đây là giai đoạn chuyển dần cây con trong ống nghiệm ra nhà kính rồi

ra ngoài trời. Cây mô được chuyển từ môi trường dị dưỡng sang môi trường

tự dưỡng, nên phải tập cho cây quen dần với môi trường tự nhiên, tránh sự

thay đổi đột ngột làm cây có thể bị sốc hoặc chết. Khi cây con đã cứng cáp và

đạt những tiêu chuẩn nhất định về chiều cao, số lá và số rễ thì đưa ra ngoài giá

thể [10].

Tóm lại, quá trình nhân giống in vitro có thể được chia thành các giai

đoạn như trên nhưng kết quả của mỗi giai đoạn không tách biệt nhau mà có sự

kế thừa của giai đoạn trước. Trong các giai đoạn trên thì giai đoạn chuẩn bị

môi trường là đặc biệt quan trọng, giai đoạn này ảnh hưởng xuyên suốt và

quyết định sự thành công hay thất bại của quá trình nhân giống.

1.4. Những thành tựu về cây Trầm hương trên thế giới và Việt Nam

Hiện nay nhu cầu Trầm hương trên thế giới ngày càng gia tăng, trong

khi đó lượng Trầm tự nhiên gần như đã cạn kiệt do việc khai thác bừa bãi.

Giống Aquilaria cho Trầm Kỳ được liệt kê trong sách đỏ của IUCN (The

International Union for the Conservation of Nature and Natural Resources) và

một số loài, trong đó có cây Dó bầu, được xem có nguy cơ tuyệt chủng, cần

được bảo tồn và phục hồi.

1.4.1. Trên thế giới

Ở cây Trầm hương thì việc nghiên cứu cấy tạo trầm đã được các nhà

khoa học theo đuổi hơn 40 năm qua và đã có những thành công đáng kể. Ở

Mỹ, trường đại học Havard đã nghiên cứu thành công phương pháp cấy tạo

trầm vào những năm 80 của thế kỷ 20. Đến năm 1994-1995 trường đại học

Kyoto (Nhật), nghiên cứu thành công phương pháp cấy tạo trầm bằng men vi

sinh và phương pháp này tiếp tục được GS Gishi Honda thử nghiệm tại Trung

Quốc với tỉ lệ thành công trên 80%. Những năm gần đây, GS. Gishi Honda

(Nhật) và GS TS Trần Kim Qui (Việt Nam) đã ứng dụng quy trình công nghệ

sinh học này để gây tạo Trầm trên thân gỗ của cây Dó bầu tại Lâm Đồng -

Việt Nam, kết quả bước đầu cho thấy sau cấy men từ 6-12 tháng lượng Trầm

thu được trên một cây vào khoảng 700gram [23].

Ở Ấn Độ TS. Shiva thì cho rằng kết quả hình thành Trầm hương trong

tự nhiên có liên quan đến bệnh lý của cây. Nhưng nguồn gốc gây bệnh thì

chưa có kết luận.

Ở Malaysia sau khi tìm hiểu và nghiên cứu về vấn đề tạo Trầm hương

ngoài tự nhiên thì tiến sĩ khoa học Julajudin đã đi đến kết luận: Quá trình hình

thành Trầm ngoài tự nhiên có liên quan đến bệnh lý của cây. Nguồn gốc hình

thành Trầm là do sự cộng sinh của loài nấm Criptophoerica Mangifera với

thân gỗ mà thành (1996).

Năm 1989 tiến sĩ Naiyna Thonggijem và các cộng sự (Thái lan) nghiên

cứu về vấn đề tạo Trầm cho rằng quá trình hình thành Trầm hương trên cây

Dó Bầu là kết quả cộng sinh của loài nấm sau đây Cephalos Potrium,

Fusarium Botriodiplodia, Chactomium[22].

Về công nghệ nuôi cấy mô tế bào chưa được áp dụng để nhân nhanh

loài cây gỗ quý hiếm như cây Trầm hương.

1.4.2. Ở Việt Nam

Trước nhu cầu ngày càng cao trên thế giới về Trầm hương nguyên liệu,

cộng với giá cả ngày một tăng, thiên nhiên ưu đãi…Hiện nay có rất nhiều dự

án của các tổ chức và cá nhân trong và ngoài nước đầu tư vào trồng cây Dó

bầu để tạo Trầm. Như ông Nguyễn Ngọc Toàn, chủ tịch Hội đồng tỉnh Quảng

Trị công ty FongSan đã đầu tư trồng 60 hecta Dó bầu tại xã An Khương,

huyện Bình Long, tỉnh Bình Phước, đến nay 11 năm tuổi. Hiện nay ông Toàn

và ông Sơn đã và đang gây tạo Trầm hương trên những cây Dó bầu này và

bước đầu này và bước đầu đã thu được thành công. Chính vì vậy mà công ty

này đã nhân rộng mô hình này tại nhiều tỉnh thành trong cả nước như: Quảng

Nam, Đà Nẵng, Quảng Ngãi, Phú Yên, Lâm Đồng, Gia Lai…(theo tài liệu của

sở Lâm Nghiệp tỉnh Gia Lai).

Ngoài ra ở nhiều tỉnh thành khác trên cả nước bà con nông dân cũng

phát triển và trồng Dó bầu ngay tại những vùng đất của nhà mình. Theo kinh

nghiệm dân gian họ tự truyền nhau và mày mò tìm cách tạo Trầm sao cho

hiệu quả. Như cấy bột sắt vào cây, cấy mảnh bom, đạn, cho dầu vào trong các

vết thương để dẫn dụ kiến. Khi kiến lên ăn dầu vô tình làm tổn thương cây.

Qua quá trình thời gian cây sẽ tạo ra Trầm mắt kiến…

Đề tài nghiên cứu khả năng tạo Trầm bằng chế phẩm sinh học (Lt)

(Viện Khoa Học Lâm Nghiệp Việt Nam, Trung Tâm Nghiên Cứu Lâm Đặc

Sản). Sau khi gây chấn thương bằng tác động cơ giới như đục khoan vào thân

cây vị trí 0.8m, 1.2m, 1.5m so với mặt đất. Sau đó đưa chế phẩm sinh học vào

vết thương. Đề tài tiến hành trên 3 nhóm tuổi khác nhau của cây Dó bầu.

Nhóm 1 từ 4-8 tuổi. Nhóm 2 từ 10-14 tuổi. Nhóm 3 từ 16-20 tuổi. Ngoài ra

trong phạm vi đề tài còn đánh giá sự tạo Trầm ở rừng trồng tập trung và phân

tán. Kết quả cho thấy sự hình thành Trầm ở các nhóm lứa tuổi là như nhau. Sự

tạo Trầm bằng chế phẩm sinh học không phụ thuộc vào độ tuổi. Tuy nhiên,

với cây có độ tuổi cao hơn đường kính gốc lớn hơn thì cho sản lượng Trầm

nhiều hơn.

Hiện nay trên thế giới chủ yếu trồng Trầm hương để lấy trầm hầu hết

trồng từ hạt. Ở nước ta chỉ có loài Aquilaria crassna, còn gọi là cây dó bầu,

cây trầm là có khả năng cho trầm. Còn hai loài Aquilaria baillonii và

Aquilaria banaensis có phân bố ở nước ta nhưng không cho trầm như loài

trên.

Tại nước ta, từ năm 1997 có đề tài di thực cây dó trồng ở huyện Hoài

Ân, tỉnh Bình Định đạt kết quả.

Năm 1999 TS. Trần Văn Minh- Viện sinh học Nhiệt đới đã đưa vào

nghiên cứu nhân giống trầm hương bằng phương pháp nuôi cấy mô, từ cây đã

có trầm ngoài thiên nhiên.

Viện Sinh học Nhiệt đới thực hiện đề tài “Ứng dụng công nghệ tế bào

thực vật trong công tác giống cây trầm hương”. Thời gian thực hiện đề tài

trong gần 10 năm (1997-2005). Nội dung của đề tài nghiên cứu tập trung vào

hai vấn đề chủ yếu: tạo giống trầm và tìm hiểu cơ chế tạo trầm. Phòng thí

nghiệm của Viện Sinh học Nhiệt đới (đặt tại Thủ Đức) đã lập được ngân hàng

giống cây trầm hương. Những cây dó bầu đã có tạo trầm hương trong tự nhiên

ở phía Nam như Quảng Bình, Quảng Nam, Kon Tum, Phú Yên, Hà Tiên, Phú

Quốc... đều đã được tập trung về đây. Trên cơ sở đó, Viện Sinh học Nhiệt đới

đã nhân vô tính những dòng đã cho trầm với mong muốn tạo ra được cây

giống có xác suất tạo trầm cao. Viện Sinh học Nhiệt đới cũng đã đầu tư trồng

100 - 200 ha cây dó bầu ở Đơn Dương (Lâm Đồng) và Bình Phước để nghiên

cứu quá trình tạo trầm.

Năm 2001 Công ty Giống Lâm nghiệp trung ương nghiên cứu quy trình

nhân giống cây trầm hương. Đã có cây trồng thử nhưng chưa công bố quy

trình kỹ thuật.

Năm 2001 ThS. Lê Thị Kim Đào (Trung tâm ứng dụng tiến bộ KHKT

Bình Định) thực hiện đề tài “Nghiên cứu thử nghiệm nhân giống một số cây

trồng rừng bằng phương pháp nuôi cấy mô”. Kết quả nhân giống cây Trầm

hương bằng phương pháp cấy mô như sau : Khử trùng mẫu cấy: Dùng HgCl2

nồng độ là 0,1 % trong 7 phút. Sử dụng môi trường WPM không có chất điều

hòa sinh trưởng thực vật vô mẫu. Môi trường WPM có bổ sung BA (0,1 mg/l)

và nước dừa 100 ml/ l tạo chồi, cụm chồi và phát triển chồi, cụm chồi. Ra rễ

trên môi trường WPM có bổ sung IBA (0,5 mg/ l) và nước dừa 100ml/l [7].

Năm 2005 Đinh Trung Chánh, Bùi Thị Tường Thu, Trần Văn Minh và

Bùi Cách Tuyến ứng dụng công nghệ phôi soma trong công tác giống cây

Trầm hương (Aquilaria crassna Pierre ex Lecomte). Lần đầu tiên tái sinh

thành công tế bào phôi soma cây dó bầu. Rễ cây dó bầu cấy mô được sử dụng

trong nuôi cấy. Tế bào phôi soma được nuôi cây phát sinh trên môi trường

MS + BA (7mg/l) + Ki (5mg/l) + IBA (0,5mg/l) + vitaminB5 (10mg/l); nhân

sinh khối tế bào phôi trên môi trường bán rắn MS + BA (1mg/l) + Ki (1mg/l)

+ NAA (0,5mg/l) + vitaminB5 (5mg/l); nhân sinh khối trên môi trường lỏng

MS + BA (7mg/l) + Ki (5mg/l) + IBA (0,5mg/l); và được trải trên môi trường

bán rắn MS + BA (1mg/l) + Ki (5mg/l) + NAA (0,5mg/l) + vitamin B5

(5mg/l). Tế bào phôi được nuôi cấy tái sinh sau 120 ngày trên môi trường

WPM + BA (0,1mg/l). Chồi non từ phôi được tiếp tục vi nhân giống trên môi

trường WPM + BA ( 0,5mg/l) [3].

Năm 2005 Đinh Trung Chánh, Bùi Thị Tường Thu, Trần Văn Minh và

Bùi Cách Tuyến đã nghiên cứu kỹ thuật nuôi cấy phôi giả trong nhân nhanh

cây Trầm hương (Aquilaria crassna Pierre ex Lecomte). Chồi tái sinh từ phôi

được sử dụng làm nguyên liệu cho các nghiên cứu nuôi cấy phát sinh phôi

giả. Môi trường thích hợp cho nuôi cấy phát sinh phôi giả: WPM + BA

(5mg/l) + Ki (3mg/l) + NAA (0,2mg/l). Phôi giả được tái sinh trên môi trường

WPM + IBA ( 0,7mg/l), đạt chiều cao chồi 65mm sau 45 ngày nuôi cấy [4].

Năm 2005 Đoàn Thị Mai và cộng sự (Trung tâm nghiên cứu giống cây

rừng thuộc Viện khoa học lâm nghiệp Việt Nam) bước đầu ứng dụng công

nghệ mô – hom trong nhân giống Trầm hương. Môi trường khoáng cơ bản

được lựa chọn cho các thí nghiệm là MS*. Nồng độ BA (0,5 mg/l) thích hợp

cho tạo cụm chồi, nhân cụm chồi là 0,5mg/l. Môi trường ra rễ là MS* + IBA

(0,3mg/l) [12].

Song những thành tựu đã có cũng chỉ là những cơ sở, kinh nghiệm để

đặt vấn đề nuôi cấy cây Trầm hương in vitro.

Qua các kết quả còn rất hạn chế như vậy, chứng tỏ những năm qua nhu

cầu thị trường cây cấy mô cho trồng rừng trong nước chưa cao nhất là đối với

loài cây Trầm hương. Mặc dù vậy những thành tựu đã có cũng là những cơ

sở, kinh nghiệm và hy vọng để đặt vấn đề nuôi cấy cây Trầm hương, là một

loài cây quý của rừng nhiệt đới đang có nguy cơ bị tiêu diệt.

Chương 2

MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Mục tiêu

2.1.1. Mục tiêu tổng quát

Nhân giống cây Trầm hương bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào

thực vật nhằm sản xuất được một lượng lớn cây giống đạt chất lượng cao

trong một thời gian ngắn cũng như có khả năng tạo trầm về sau, nhưng giá

thành cây con lại thấp.

2.1.2. Mục tiêu cụ thể

+ Xác định môi trường (hoá học và vật lý) phù hợp để nhân giống cây

Trầm hương (Aquilaria crassna Pierre ex. Lecomte) bằng phương pháp nuôi

cấy mô.

+ Tạo ra cây con hoàn chỉnh bằng phương pháp nuôi cấy mô cho cây

Trầm hương

+ Huấn luyện và cấy cây con ra vườn ươm.

2.2. Đối tượng

Đối tượng nghiên cứu của đề tài là cây Trầm hương được trồng ở vườn

sưu tập giống trồng năm 2007 của Trung tâm giống cây trồng Bình Thuận

thuộc Sở Nông nghiệp và phát triển nông thôn tỉnh Bình Thuận.

2.2.1. Cây mẹ lấy vật liệu

Cây lấy mẫu là cây trồng ở vườn sưu tập giống trồng năm 2007 tại

Trung tâm giống cây trồng Bình Thuận, nguyên sản từ huyện Trà My, tỉnh

Quảng Nam.

Hình 2.1. Hình cây cung cấp vật liệu đưa mẫu vào

2.2.2. Vật liệu nuôi cấy (mẫu cấy)

Mẫu nuôi cấy (explant) lấy từ chồi bên của cây. Mẫu được lấy ở chồi

15 ngày tuổi, sinh trưởng tốt, không sâu bệnh. Chồi được cắt bỏ phần ngọn

non, một phần cuống lá và toàn bộ phiến lá. Mẫu cấy có chiều dài từ 1,5 -

3cm, đường kính từ 2 - 3mm mang từ 2-3 nách lá, trong đoạn từ lá thứ 3 - 6.

Đề tài tiến hành nghiên cứu ở phòng nuôi cấy mô và vườn ươm tại Trung tâm

giống cây trồng Bình Thuận thuộc Sở Nông nghiệp và phát triển nông thôn

tỉnh Bình Thuận.

2.3. Phạm vi nghiên cứu

Nghiên cứu Cây Trầm hương trồng ở tỉnh Bình Thuận

2.4. Nội dung nghiên cứu

Đề tài tập trung nghiên cứu những nội dung chủ yếu sau:

+ Lựa chọn phương pháp khử trùng mẫu ở các nồng độ khác nhau của

HgCl2 và Ca (0Cl)2 trong các khoảng thời gian khác nhau để tìm ra chất khử

trùng mẫu thích hợp.

+ Tìm môi trường tối ưu cho giai đoạn tạo vật liệu khởi đầu và nhân

nhanh chồi.

+ Thử nghiệm ảnh hưởng của vitamin B2 tới hệ số nhân chồi và tỷ lệ

chồi hữu hiệu của quá trình nuôi cấy.

+ Tìm nghiệm thức tối ưu cho việc tái sinh chồi và khảo sát ảnh hưởng

của một số chất điều hoà sinh trưởng và ảnh hưởng phối hợp của chúng cho

việc tạo cụm chồi để nhân nhanh.

+ Thử nghiệm ảnh hưởng của một số chất điều hoà sinh trưởng và ảnh

hưởng của chúng đến hiệu quả của giai đoạn tạo cây con hoàn chỉnh (giai

đoạn tạo rễ).

+ Thử nghiệm ảnh hưởng của thời gian huấn luyện đến tỷ lệ sống và

sinh trưởng chiều cao của cây con ở giai đoạn vườn ươm.

2.5. Phương pháp nghiên cứu

Sơ đồ nghiên cứu giống nuôi cấy mô cây Trầm hương

Cây mẫu

Khử trùng mẫu

(Bằng dung dịch HgCl2 hoặc Ca (ClO)2 hay các hoá chất có tính diệt khuẩn

khác ở các nồng độ khác nhau)

Tạo chồi ban đầu

(Xác định môi trường tái sinh chồi thích hợp)

Nhân chồi

(Xác định môi trường nhân chồi thích hợp được bổ sung các chất kích thích

sinh trưởng như BAP và NAA ở các nồng độ khác nhau)

Tạo rễ

(Tạo rễ in vitro: Xác định môi trường được bổ sung IBA và phương

pháp ra rễ hiệu quả)

Vườn ươm

* Cấy khởi động

Là giai đoạn khử trùng đưa mẫu vào nuôi cấy in vitro. Giai đoạn này

cần đảm bảo các yêu cầu: tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, mô tồn tại và tái

sinh tốt. Khử trùng mẫu bằng chất hoá học có hoạt tính diệt nấm khuẩn được

tiến hành qua các bước:

+ Rửa xà phòng loãng

+ Rửa dưới vòi nước chảy

+ Tráng nước cất

+ Ngâm trong dung dịch khử trùng khoảng 5 - 15 phút

+ Đổ bỏ dung dịch khử trùng, rửa lại bằng nước cất từ 3-5 lần

+ Cấy mẫu vào môi trường tái sinh chồi ban đầu, các thao tác được

thực hiện trong buồng cấy vô trùng

* Tạo và nhân nhanh chồi

Là giai đoạn kích thích mô cấy phát sinh hình thành nhiều chồi. Vấn đề

là phải xác định được môi trường nuôi cấy và điều kiện nuôi cấy thích hợp để

có hiệu quả cao nhất.

+ Tái sinh chồi ban đầu từ mẫu nuôi cấy: Tiến hành cấy trên các môi

trường khác nhau như: WPM, MS, MS* (môi trường MS cải tiến), WV3 và

Litvay có bổ sung agar 8 g/l, đường 30 g/l, 0,2g/l PVP, CW 100ml/l và độ pH

của các môi trường được điều chỉnh 5,8.

+ Nhân chồi: trên cơ sở thí nghiệm tái sinh chồi ban đầu, tiếp tục thử

nghiệm môi trường tối ưu cho quá trình nhân nhanh chồi bằng cách bổ sung

Cytokynin (BAP) riêng rẽ hay phối hợp.

+ Tạo rễ và huấn luyện: là giai đoạn chuyển chồi từ môi trường nhân

nhanh sang môi trường tạo rễ để có thể hoàn chỉnh hoặc có thể ra rễ trực tiếp

trên đất. Chọn các chồi đủ tiêu chuẩn về chiều cao, chất lượng nuôi cấy trên

các môi trường tạo rễ hoặc cho ra rễ trực tiếp, mục đích là để tìm ra môi

trường thích hợp để tạo cây con hoàn chỉnh. Sau đó cây con được huấn luyện

để thích nghi với điều kiện bên ngoài.

+ Đưa cây in vitro ra điều kiện bên ngoài: Để tìm giá thể thích hợp cho

cây con có tỷ lệ sống cao khi đưa ra ngoài điều kiện tự nhiên tiến hành các thí

nghiệm về thành phần ruột bầu.

2.5.1. Lựa chọn phương pháp khử trùng mẫu ở các nồng độ khác nhau của

HgCl2 và Ca (0Cl)2 trong các khoảng thời gian khác nhau

Tiến hành khử trùng mẫu cấy vào môi trường MS + 30g/l đường + 8g/l

agar + 0,2g/l PVP + 100ml/l CW (không bổ sung chất điều hoà sinh trưởng),

pH = 5,8 với 2 hóa chất ứng 3 mức thời gian khác nhau và nồng độ khác.

Bảng 2.1. Công thức khử trùng mẫu cấy

Môi trường Hóa chất Nồng độ ( %) Thời gian ( phút)

CT1 0,1 4 HgCl2

CT2 HgCl2 0,1 6

CT3 0,1 8 HgCl2

CT4 5,0 10 Ca( OCl)2

CT5 5,0 12 Ca( OCl)2

CT6 5,0 14 Ca( OCl)2

2.5.2. Chọn loại môi trường phù hợp

Tiến hành cấy mẫu đã được khử trùng ở mục 2.5.1 vào bình tam giác

chứa 5 môi trường có bổ sung Sucroser 30g/l, agar 8g/l, 0,2g/l PVP, 100ml/l

CW ( không bổ sung chất điều hoà sinh trưởng) là:

+ Môi trường MS (Murashige & Skoog, 1962) phụ lục 01 [19].

+ Môi trường MS cải tiến (có bổ sung thêm vitamin và khoáng chất)

(Murashige & Skoog medium including Nitsch vitamin, 1969) phụ lục 02

[13].

+ Môi trường WPM (Mccown Woody Plant medium, 1980) phụ lục 03 [17].

+ Môi trường WV3 (Westvaco WV3 medium) phụ lục 04 [14].

+ Môi trường Litvay (Litvay, 1985) phụ lục 05 [18].

Bảng 2.2. Công thức ảnh hưởng của 5 loại môi trường đến hệ số nhân

chồi.

Loại môi trường Công thức

MS CT7 ( ĐC)

MS* CT8

WPM CT9

WV3 CT10

Litvay CT11

2.5.3. Ảnh hưởng của vitamin B2 đến hệ số nhân chồi và tỷ lệ chồi hữu

hiệu

Để xác định vai trò của vitamin B2 đối với sự sinh trưởng và phát triển

của chồi, môi trường nhân chồi có sự bổ sung thêm là: môi trường tốt nhất có

hệ số nhân chồi và tỷ lệ chồi hữu hiệu cao nhất ở thí nghiệm mục 2.5.2

(MTĐC) + Sucroser 30g/l + agar 8g/l +0,2g/l PVP + 100ml/l CW, pH = 5,8

với 4 mức nồng độ B2 như sau:

Bảng 2.3. Công thức ảnh hưởng của vitamin B2 đến khả năng nhân chồi

Công thức Nồng độ B2

CT12 ( ĐC) 0 mg/l B2

CT13 1,0 mg/l B2

CT14 2,0 mg/l B2

CT15 3,0 mg/l B2

CT16 4,0 mg/l B2

2.5.4. Ảnh hưởng của chất điều hoà sinh trưởng đến hệ số nhân chồi và tỷ

lệ chồi hữu hiệu

Các thí nghiệm được sử dụng riêng lẻ một chất điều hoà sinh trưởng

hoặc phối hợp 2 chất ở các nồng độ khác nhau. Những thí nghiệm được sử

dụng phối hợp thì có những chất được cố định nồng độ, chỉ một chất có nồng

độ thay đổi. Khi đó việc xử lý số liệu được đưa về dạng ảnh hưởng của một

nhân tố đến hệ số nhân chồi và tỷ lệ chồi hữu hiệu.

2.5.4.1. Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến hệ số nhân chồi và tỷ lệ chồi hữu

hiệu

Từ môi trường tốt nhất cho nhân chồi ở các thí nghiệm về ảnh hưởng

của vitamin B2 ở mục 2.5.3 (MTĐC + 30g/l đường + 8 g/l agar + 0,2g/l PVP

+100ml/l CW + mg/l B2) đề tài tiến hành bổ sung BAP ở các mức nồng độ

thay đổi như sau:

Bảng 2.4. Công thức thí nghiệm nhân chồi ảnh hưởng của nồng độ BAP

Công thức Nồng độ BAP

CT17 ( ĐC) 0mg/l BAP

CT18 0,5 mg/l BAP

CT19 1,0 mg/l BAP

CT20 1,5 mg/l BAP

CT21 2,0 mg/l BAP

2.5.4.2. Ảnh hưởng của nồng độ BAP + NAA đến hệ số nhân chồi và tỷ lệ

chồi hữu hiệu

Nghiên cứu ảnh hưởng phối hợp của BAP và NAA đến hệ số nhân chồi

và tỷ lệ chồi hữu hiệu

MTĐC + 30g/l đường + 8 g/l agar + 0,2g/l PVP + 100ml/l CW + mg/l B2 +

mg/l BAP + bổ sung NAA ở các nồng độ khác nhau, pH= 5,8

Bảng 2.5. Công thức thí nghiệm nhân chồi ảnh hưởng của nồng độ BAP

và NAA

Công thức Nồng độ NAA

CT22 ( ĐC) 0 mg/l

CT23 0,2 mg/l

CT24 0,4 mg/l

CT25 0,6 mg/l

CT26 0,8 mg/l

2.5.4.3. Ảnh hưởng của nồng độ IBA đến tỷ lệ ra rễ, số rễ trung bình/cây và

chiều dài trung bình của rễ

IBA được bổ sung vào môi trường: MTĐC + 15 mg/l đường + 8g/l agar

+ 0,2g/l PVP + 100ml/l CW, pH= 5,8, bổ sung IBA ở nồng độ thay đổi là:

Bảng 2.6. Công thức thí nghiệm ra rễ

Công thức Nồng độ IBA

CT27 ( ĐC) 0 mg/l

CT28 0,5 mg/l

CT29 1,0 mg/l

CT30 1,5mg/l

CT31 2,0 mg/l

2.5.4.4. Ảnh hưởng của thời gian huấn luyện đến tỷ lệ sống và chiều cao cây

con ở vườn ươm

Trước khi đưa cây con trong ống nghiệm ra trồng ở vườn ươm, đề tài

chuyển các bình cây (cây hoàn chỉnh ở trong bình) ra môi trường bên ngoài,

mục đích để cây con làm quen dần với điều kiện ngoài vườn ươm (gọi là giai

đoạn huấn luyện). Đặt bình cây ra điều kiện ánh sáng và nhiệt độ tự nhiên với

cường độ ánh sáng từ 5.000 - 10.000 lux, không cho ánh nắng chiếu trực tiếp

vào bình nuôi cây. Nhằm xác định thời gian huấn luyện cây con để có thể rút

ngắn hoặc kéo dài so với sản xuất. Chúng tôi thử nghiệm 4 khoảng thời gian

huấn luyện cây con. Huấn luyện cây để ở ánh sáng và nhiệt độ trong điều kiện

tự nhiên:

+ Không huấn luyện (0 ngày)

+ 5 ngày

+ 10 ngày

+ 15 ngày

Sau khi huấn luyện, cây con được trồng ra bầu khoảng 4 tuần thì tiến

hành đo đếm tỷ lệ sống, chiều cao và sinh trưởng của cây để đánh giá ảnh

hưởng của thời gian huấn luyện đến tỷ lệ sống và sinh trưởng chiều cao của

cây trong giai đoạn vườn ươm.

Quá trình lấy cây con ra khỏi bình, trồng cây vào bầu đất và chăm sóc

cây ngoài vườn ươm được tiến hành theo các bước kỹ thuật được thực hiện tại

Trung tâm giống cây trồng Bình Thuận.

+ Tạo bầu cấy cây: Dùng bầu nhựa PE có đường kính 13 cm, cao 18

cm, có đục lỗ dưới đáy. Thành ruột bầu là đất, cám dừa tỉ lệ 4:1

+ Xử lý bầu: Trước khi cấy 1-2 ngày, bầu đất được xử lý khử trùng

mầm bệnh bằng dung dịch thuốc tím 0.1% ( hoà thuốc tím vào nước và dùng

ô doa tưới lên bề mặt bầu cho thấm sâu 2-3cm).

+ Lấy cây ra khỏi bình và cấy vào bầu

- Tạo hỗn hợp hồ rễ: Trộn đất bột tầng B với dung dịch thuốc tím 0.1%

với tỷ lệ thể tích đất/dung dịch thuốc tím = 1/1 trước khi ra cây 12-24 giờ.

- Lấy cây ra khỏi bình: cây mầm lấy từ trong lọ đổ ra lòng bàn tay, nhặt

từng cây ra khỏi môi trường nuôi cấy và rửa sạch. Nhúng rễ cây vào hỗn hợp

hồ rễ

- Cấy cây đã hồ rễ vào bầu đất đã được xử lý và để bay hơi sau 1 ngày.

+ Chăm sóc cây sau khi cấy: Cây sau khi cấy được che bằng lưới đen

(độ tàn che 50-60%) 10-15 ngày sau khi cấy. Sau 2 tuần tưới phân NPK tỷ lệ

(5:10:3) nồng độ 0,3%, sau khi tưới rửa lại bằng nước sạch. Phun phòng nấm

bệnh bằng dung dịch Bellate nồng độ 5g/10 lít nước, 1 tuần một lần. Thu thập

tỷ lệ sống và đo chiều cao của cây sau khi cấy 4 tuần.

2.5.4.5. Điều kiện thí nghiệm

Quá trình nuôi cấy (nhân chồi và tạo rễ) được tiến hành trong điều kiện

nhân tạo. Ánh sáng, nhiệt độ và độ ẩm được duy trì như sau:

+ Ánh sáng: Mẫu được nuôi cấy dưới ánh đèn neon với cường độ ánh

sáng từ 1.500 - 3.000 lux, thời gian chiếu sáng 10h/ngày.

+ Nhiệt độ: nhiệt độ trong phòng duy trì từ 23-250C ( ±2)

+ Độ ẩm thường xuyên xấp xỉ 60%

2.5.5. Bố trí thí nghiệm

Thí nghiệm được bố trí theo kiểu thí nghiệm đơn yếu tố và hoàn toàn

ngẫu nhiên, với 3 lần lặp [1].

Với thí nghiệm về ảnh hưởng nồng độ hoá chất và thời gian khử trùng,

thí nghiệm chọn loại môi trường, mỗi công thức theo dõi 10 bình, mỗi bình 3

mẫu (bình tam giác 250ml chứa 50ml môi trường), đánh giá kết quả sau 3

tuần nuôi cấy qua tỉ lệ mẫu sống).

Các thí nghiệm nghiên cứu môi trường nhân chồi, mỗi công thức theo

dõi 10 bình, mỗi bình 6 mẫu. Môi trường chứa trong bình tam giác, đánh giá

kết quả hệ số nhân chồi và tỷ lệ chồi hữu hiệu sau 4 tuần nuôi cấy.

Các thí nghiệm nghiên cứu môi trường tạo rễ, mỗi công thức theo dõi

10 bình, mỗi bình 15 chồi. Môi trường được chứa trong bình 250 ml, với nắp

cao su. Thu thập tỷ lệ ra rễ, số rễ tạo thành và chiều dài của rễ sau 2 tuần nuôi

cấy.

Thí nghiệm về ảnh hưởng của thời gian huấn luyện đến tỷ lệ sống và

chiều cao của cây con ở vườn ươm, mỗi công thức theo dõi 30 bình và đo

đếm 30 cây tại vườn ươm sau khi cấy 4 tuần.

2.5.6. Thu thập và xử lý số liệu

* Thu thập số liệu

Các chỉ tiêu đo đếm trong phòng thí nghiệm:

Tổng số mẫu nhiễm

+ Tỷ lệ mẫu nhiễm ( %) = x 100

Tổng số mẫu ban đầu

Tổng số mẫu sống

+ Tỷ lệ mẫu sống ( %) = x 100

Tổng số mẫu ban đầu

Tổng số mẫu nảy chồi

+ Tỷ lệ mẫu bật chồi ( %) = x 100

Tổng số mẫu thí nghiệm

Tổng chiều cao chồi

+ Chiều cao trung bình của chồi ( cm) =

Tổng số chồi đo đếm

Tổng số chồi mới hình thành

+ Hệ số nhân chồi =

Tổng số chồi ban đầu

Tổng số chồi ra rễ

+ Tỷ lệ ra rễ ( %) = x 100

Tổng số chồi nuôi cấy

Tổng chiều dài rễ

+ Chiều dài rễ trung bình ( cm) =

Tổng số rễ đo đếm

Tổng số cây sống

+ Tỷ lệ cây sống ( %) = x 100

Tổng số cây ban đầu

Số liệu thu được ghi chép trong bảng biểu và xử lý trên máy tính bằng

phần mềm thống kê Excel ( theo Nguyễn Hải Tuất và Ngô Kim Khôi, 1996).

* Một số công thức tính toán:

+ Số trung bình mẫu:

+ Phương sai: Sd2

+ Hệ số biến động:

V% =

* Xử lý số liệu

+ Vẽ biểu đồ và tính các giá trị trung bình được thực hiện trên phần

mềm Excel.

+ Để kiểm tra ảnh hưởng của các nhân tố thí nghiệm bằng phương pháp

phân tích phương sai một nhân tố theo phần mềm SPSS 11.5. Tiêu chuẩn

Duncan được dùng để phân nhóm và tìm công thức thí nghiệm tốt nhất là:

Giả thiết H0: nhân tố A có tác động một cách đồng đều ( ngẫu nhiên)

đến kết quả thí nghiệm khi đó: α1= α2=...= αa = 0 hoặc μ1= μ2 = …..= μa = μ

Giả thiết H1: Tác động của nhân tố A là không đồng đều ở tất cả các

cấp khi đó có ít nhất là có một αi ≠ 0.

Nếu giá trị Sig của F<0,05 thì chấp nhận H0. Sig của F > 0,05 thì chấp

nhận H1 với F=

Trong đó:

- VA là biến động giữa các trị số trung bình mẫu:

VA=VT - VN = n1 – c

y - c

X2 - VT là biến động toàn bộ của n trị số quan sát: VT =

- V N là biến động giữa các trị số quan sát cùng một mẫu. VN = VT - VA

Với những thí nghiệm có phương sai tổng thể không bằng nhau thì

không dùng so sánh phương sai mà chúng tôi sử dụng tiêu chuẩn Tamhane,s

T2 để xác định sự sai khác. Với tiêu chuẩn này nếu 2 công thức có sự sai khác

sẽ được đánh dấu * ở kết quả phân tích số liệu.

Chương 3

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Lựa chọn phương pháp khử trùng mẫu cấy

Trong phương pháp nhân giống bằng nuôi cấy mô, sự thành công phụ

thuộc rất nhiều vào vấn đề vô trùng mẫu cấy. Vì các loài nấm khuẩn còn tồn

tại trên mô cấy phát triển rất nhanh, gấp nhiều lần so với sự phát triển của mô

tế bào. Vì vậy mẫu cấy dễ bị hủy hoại một cách nhanh chóng trong môi

trường nuôi dưỡng mẫu. Nguồn nhiễm nấm khuẩn thường thông qua dụng cụ,

môi trường, thao tác cấy, mô cấy. Trong đó dụng cụ, môi trường và thao tác

cấy đều có cách xử lý vô trùng một cách triệt để. Riêng đối với mô cấy đòi

hỏi phải có biện pháp xử lý hợp lý từ chất khử trùng đến nồng độ, thời gian

xử lý. Hiện nay, HgCl2 đang được sử dụng để khử trùng mẫu trong nhân

giống in vitro cây Lâm nghiệp ở nhiều phòng thí nghiệm. Hầu hết, khi khử

trùng bằng HgCl2 đều cho tỷ lệ mẫu sống cao, tuy nhiên đây là chất được xếp

vào nhóm chất độc hại số 1 đối với cơ thể con người. Trong khi đó Ca(OCl)2

cũng được một số tác giả sử dụng ở nồng độ đạt từ 5-12% có hiệu quả khử

trùng mẫu cao và ít độc hại cho con người. Qua bước thăm dò, đề tài sử dụng

2 loại hoá chất là HgCl2 và Ca(OCl)2.

Ảnh hưởng của thời gian và nồng độ khử trùng được đánh giá qua một

số chỉ tiêu: tỷ lệ mẫu nhiễm, tỷ lệ mẫu chết, tỷ lệ mẫu sống. Sau 3 tuần nuôi

cấy, kết quả được trình bày ở bảng và biểu đồ sau:

Bảng 3.1. Tổng hợp kết quả khử trùng mẫu (tổng 90 mẫu trong một công

thức thí nghiệm)

Hóa chất Nồng Thời Tổng % Tổng % Tổng % phân

độ gian khử số mẫu số mẫu số mẫu nhóm

(%) trùng mẫu nhiễm mẫu chết mẫu sống bằng

(phút) nhiễm chết sống Ducan

0,1 4 63 70 6 6,67 21 23,33 1 và 2 HgCl2

6 12 13,33 27 30 51 56,67 4

8 2 2,23 61 67,77 27 30 2 và 3

5.0 10 59 65,56 13 14,44 18 20 1 Ca(OCl)2

12 36 40 24 26,67 30 33,33 3

14 18 20 57 63,33 15 16,67 1

Biểu đồ 3.1. Biểu đồ tỉ lệ mẫu sống khi khử trùng mẫu

Dựa vào kết quả phân tích phương sai (phụ lục 06), chúng tôi nhận thấy

sự khác biệt giữa các nghiệm thức là rất có ý nghĩa. Từ kết quả bảng 3.1 và

biểu đồ 3.1 cho thấy tỷ lệ mẫu nhiễm chiếm 13,33% của HgCl2 và 40% của

Ca(OCl)2, qua đó chúng tôi thấy việc khử trùng đối với cây Trầm hương là

tương đối khó. Mẫu có độ nhiễm tạp rất cao, với mỗi chất khử trùng, nếu

nồng độ chất khử trùng thấp, thời gian khử trùng ngắn thì tỷ lệ mẫu cấy bị

nhiễm cao, nhưng chỉ cần tăng thời gian khử trùng lên là tỷ lệ cây chết đã tăng

lên một cách đáng kể, điều này chứng tỏ cây Trầm hương rất nhạy cảm với

chất khử trùng.

+ Khử trùng bằng Ca(OCl)2 khi tăng thời gian khử trùng thì mẫu nhiễm

giảm, số mẫu chết tăng do quá thời gian khử trùng. Tỷ lệ mẫu sống cao nhất

là ở công thức 5 (12 phút) với mẫu sống 33,33%; kế đến là công thức 4 (10

phút) với tỉ lệ mẫu sống: 20% nhưng tỉ lệ mẫu nhiễm cao nhất là 65,56%; còn

ở công thức 6 (14 phút) có số mẫu chết nhiều (63,33%), tỉ lệ sống thấp

(16,67%) do thời gian ngâm mẫu dài. Vậy Ca(OCl)2 là chất khử trùng bề mặt

yếu đối với cây Trầm hương (tỷ lệ mẫu chết cao, tỷ lệ mẫu nhiễm cao dẫn đến

tỷ lệ mẫu sống rất thấp).

+ Khử trùng bằng HgCl2: với thời gian khử trùng tăng (4, 6, 8 phút) tỷ

lệ mẫu nhiễm đối với cây Trầm hương giảm từ 70% xuống 2.23% và bên

cạnh đó thì mẫu chết lại tăng từ 6,67% đến 67,77%. Tỷ lệ mẫu sống và tái

sinh tăng khi thời gian từ 6-8 phút.

Từ những số liệu này ta nhận thấy với HgCl2 [0,1%] và Ca(OCl)2

[5.0%] khi thời gian khử trùng mẫu thấp mẫu sẽ bị nhiễm với tỉ lệ cao do

chưa đủ thời gian diệt khuẩn, công thức 1 và 4 có tỉ lệ mẫu nhiễm 70% và

65,56%. Ngược lại, với thời gian xử lí dài sẽ làm giảm rất rõ sự nhiễm khuẩn

trên mẫu cấy nhưng tỉ lệ sống cũng sẽ không cao do mẫu bị chết vì ngộ độc

chất khử trùng. Điều này thể hiện qua công thức 3 (8 phút) và công thức 6 (14

phút) khi ta tăng thời gian khử trùng tỉ lệ mẫu nhiễm do nhiễm khuẩn đã giảm

nhưng xuất hiện mẫu chết cao.

Như vậy HgCl2 có tính khử trùng mạnh hơn Ca(OCl)2, do đó dung dịch

khử trùng này cũng gây tổn thương mạnh đến mô nuôi cấy, đồng thời tỷ lệ

chết cao hơn và tỷ lệ chồi sống sót cũng cao hơn rất nhiều. Với HgCl2 nồng

độ 0,1%, ở thời gian 6 phút thuộc nhóm thứ 4 trong phân nhóm bằng tiêu

chuẩn Ducan, là nhóm cho tỉ lệ mẫu sống cao nhất. So với kết quả nghiên cứu

của ThS. Lê Thị Kim Đào (Trung tâm ứng dụng tiến bộ KHKT Bình Định)

dùng Hgcl2 nồng độ 0,1% khử trùng mẫu cấy Trầm hương cũng cho kết quả

gần với kết quả của chúng tôi. Nên đề tài chọn khử trùng cây Trầm hương

bằng HgCl2 0,1% với thời gian là 6 phút (ứng với công thức 2).

Mẫu chết Mẫu nhiễm Mẫu sống

Hình 3.1. Hình khử trùng mẫu sau 3 tuần nuôi cấy

3.2. Nghiên cứu loại môi trường thích hợp cho nhân nhanh chồi.

Để có sự thành công đối với nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy

mô thì giai đoạn quan trọng đó là xác định môi trường nuôi cấy thích hợp cho

đối tượng cần nhân giống. Với các công bố về môi trường nhân giống cây

Trầm hương còn hạn chế, thêm vào đó chưa có môi trường cụ thể nào và có

độ tin cậy cao. Do vậy, đề tài thử nghiệm một số môi trường sử dụng để nhân

giống các loài cây thân gỗ. Từ đó chọn ra môi trường thích hợp cho nghiên

cứu cây Trầm hương. Trong điều kiện nuôi cấy mô tế bào HSNC phụ thuộc

vào thành phần môi trường, nồng độ chất dinh dưỡng có trong môi trường

nuôi cấy. Các nghiên cứu giai đoạn này nhằm tìm ra được môi trường thích

hợp cho giai đoạn nhân nhanh chồi, giai đoạn có vai trò quyết định đến hiệu

quả của quá trình nhân giống. Sau 4 tuần nuôi cấy, kết quả được trình bày ở

bảng và đồ thị dưới đây:

Bảng 3.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của 5 loại môi trường đến

HSNC (tổng số 180 mẫu/môi trường).

Loại môi Số chồi thu được Hệ số nhân chồi phân nhóm

(lần) bằng tiêu chuẩn trường

Ducan

MS 173 0,96 1 và 2

MS* 173 0,96 2 và 3

WPM 210 1,17 3

WV3 165 0,92 1

Litvay 150 0,83 1

Biểu đồ 3.2. Biểu đồ ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến HSNC.

Từ bảng 3.2 và biểu đồ 3.2 đề tài nhận thấy rằng: HSNC cao nhất ở môi

trường WPM là 1,17 lần, kế đến là môi trường MS* có HSNC là 1,12 lần, thấp

nhất ở môi trường Litvay là 0,83 lần.

Môi trường WPM là môi trường nuôi cấy thân gỗ nói chung, môi

trường này đã được nhiều tác giả trong và ngoài nước sử dụng trong nuôi cấy

mô tế bào thực vật. Nhóm tác giả Đoàn Thị Mai và cs của Trung tâm nghiên

cứu giống cây rừng thuộc Viện khoa học lâm nghiệp Việt Nam đã nghiên cứu

môi trường này thành công cho cây Keo lai, Trung tâm ứng dụng tiến bộ khoa

học kỹ thuật Bình Định đã sử dụng môi trường này nhân giống cho cây Trầm

hương, nhóm tác giả Đinh Trung chánh và cs cũng dùng môi trường WPM

thành công cho nuôi cấy phôi giả cây Trầm hương.

Để kiểm tra sự sai khác, chúng tôi so sánh phương sai về ảnh hưởng

của loại môi trường nuôi cấy đến HSNC được kết quả như sau (phụ lục 07).

+ Phương sai tổng thể của HSNC > 0,05 (có Sig = 0,056) điều này cho

thấy phương sai của các biến ngẫu nhiên là bằng nhau.

+ Phân tích phương sai thu được giá trị Sig của F bằng 0,008 < 0,05.

Như vậy, HSNC ở các công thức môi trường có sự khác nhau rõ rệt.

+ Bảng phân nhóm bằng tiêu chuẩn Duncan cho thấy môi trường WPM

nằm trong nhóm 3, là nhóm tốt nhất trong 5 công thức thí nghiệm. Với α =

0,05 (độ tin cậy 95%).

+ Như vậy môi trường WPM (công thức 09) thích hợp nhất cho tạo

chồi và nhân nhanh chồi cho cây Trầm hương. Môi trường này được đề tài sử

dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.

Hình 3.2. Hình mẫu nuôi cấy sau 4 tuần trong môi trường MS*

Hình 3.3. Hình mẫu nuôi cấy sau 4 tuần trong môi trường WPM

Hình 3.4. Hình mẫu nuôi cấy sau 4 tuần trong môi trường Litvay

3.3. Ảnh hưởng của việc bổ sung vitamin B2 vào môi trường đến hệ số

nhân chồi và tỷ lệ chồi hữu hiệu

Vitamin đóng vai trò quan trọng trong quá trình nhân giống nuôi cấy

mô, tế bào các loài cây trồng nói chung. Chúng chiếm hàm lượng rất nhỏ

trong cá thể thực vật nhưng là chất không thể thiếu trong sinh trưởng và phát

triển. Trong môi trường WPM đã có các vitamin cần thiết như B1, B6, nhưng

không có vitamin B2, một vitamin quan trọng cho sinh trưởng và sự phát triển

của thực vật. Hiện nay, một số nơi sản xuất giống cây Bạch đàn bằng phương

pháp nuôi cấy mô, đang sử dụng vitamin B2 để bổ sung vào môi trường nuôi

cấy. Tuy nhiên, việc nhân giống cây Trầm hương bằng phương pháp nuôi cấy

mô vẫn chưa được sử dụng vitamin B2 để bổ sung vào môi trường nuôi cấy.

Chính vì vậy qua bước thăm dò, chúng tôi sử dụng 5 mức nồng độ vitamin B2

khác nhau để bổ sung vào môi trường nuôi cấy.

Đề tài bổ sung B2 vào môi trường WPM + 30 g/l đường + 8 g/l agar +

0,2g/l PVP + 100ml/l CW, pH=5,8. Sau 4 tuần nuôi cấy, kết quả thu được

trình bày ở bảng sau:

Bảng 3.3. Ảnh hưởng của việc bổ sung vitamin B2 đến HSNC và TLCHH

(180 mẫu cấy/công thức)

Nồng Chồi Chồi HSNC TLCHH phân nhóm phân nhóm

độ thu hữu (lần) (%) HSNC bằng tiêu TLCHH bằng

(mg/l) được hiệu chuẩn Ducan tiêu chuẩn Ducan

210 5 1,17 2,38 1 0,0 1

220 10 1,22 4,55 1 1,0 3

235 14 1,31 5,96 1 2,0 5

220 12 1,22 5,45 1 3,0 4

225 8 1,25 3,56 1 4,0 2

Biểu đồ 3.3. Biều đồ ảnh hưởng của vitamin B2 đến HSNC

Biểu đồ 3.4. Biểu đồ ảnh hưởng của vitamin B2 đến TLCHH

Kết quả bảng 3.3 và biểu đồ 3.3 và 3.4 cho thấy: ở công thức đối chứng

(hàm lượng vitamin B2 = 0,0 mg/l) thì HSNC và TLCHH thấp, có HSNC và

TLCHH lần lượt là 1,17 lần và 2,38%. HSNC và TLCHH tăng khi bổ sung

B2 với nồng độ 1,0 mg/l có HSNC = 1,22 lần, TLCHH = 4,55%. Khi bổ sung

nồng độ 2,0 mg/l HSNC tăng có HSNC = 1,31 lần, TLCHH = 5,96%. Khi bổ

sung B2 tăng hơn nữa ở các nồng độ 3,0 và 4,0 mg/l thì HSNC và TLCHH

không tăng so với nồng độ 2,0 mg/l.

Kết quả thực nghiệm cho thấy hiệu quả của việc bổ sung B2 vào môi

trường nuôi cấy, khi không sử dụng B2 thì HSNC và TLCHH thấp; với việc

sử dụng B2 2mg/l cho HSNC và TLCHH cao.

Từ kết quả đề tài nhận thấy: Vitamin B2 là cần thiết cho sinh trưởng và

phát triển của chồi nuôi cấy. Nhưng chỉ cần một hàm lượng nhỏ vì vậy khi

nồng độ là 1,0 mg/l chồi sinh trưởng và phát triển tốt hơn khi không có trong

môi trường. Bổ sung 2,0 mg/l lúc này môi trường đã được cung cấp thoả mãn

cho sự phát triển của chồi, vậy với nồng độ cao hơn (3,0 và 4,0 mg/l) là không

cần thiết, tuy nhiên cũng không ảnh hưởng lớn đến sự ức chế sinh trưởng và

phát triển của chồi nuôi cấy.

So sánh phương sai một nhân tố (ảnh hưởng của vitamin B2 đến HSNC

và TLCHH) của cây Trầm hương được kết quả sau (phụ lục 08):

+ Giá trị Sig trong bảng Test of Homogeneity of Variances > 0,05.

+ Bảng Anova cho thấy giá trị Sig của F< 0,05 ở cả 2 chỉ tiêu HSNC và

TLCHH. Như vậy, HSNC và TLCHH ở các công thức nồng độ vitamin B2 có

sự khác nhau rõ rệt với α= 0,05.

+ Phân nhóm bằng tiêu chuẩn Duncan cho thấy: HSNC ở các nồng độ

0,0; 1,0; 2,0; 3,0; 4,0 mg/l nằm trong cùng một nhóm, HSNC không có sự

khác nhau rõ rệt. Nhưng qua bảng phân nhóm TLCHH bằng tiêu chuẩn

Duncan cho thấy nồng độ B2 2,0 mg/l nằm trong nhóm 5, là nhóm tốt nhất

trong 5 công thức thí nghiệm. Với α = 0,05 (độ tin cậy 95%).

Như vậy, qua phân tích kết quả thử nghiệm chúng tôi xác định được

nồng độ B2 thích hợp nhất cho môi trường nuôi cấy cây Trầm hương là 2,0

mg/l (công thức 14).

Hình 3.5. Hình mẫu nuôi cấy trong môi trường WPM không bổ sung B2

sau 4 tuần nuôi cấy

Hình 3.6. Hình mẫu nuôi cấy trong môi trường có bổ sung 2,0mg/l B2 sau

4 tuần nuôi cấy

3.4. Ảnh hưởng của chất điều hoà sinh trưởng trong môi trường WPM

đến hệ số nhân chồi và tỷ lệ chồi hữu hiệu

Các đề tài nghiên cứu nuôi cấy mô tế bào cho thấy chất điều hoà sinh

trưởng là rất quan trọng, quyết định đến hiệu quả của giai đoạn trong nhân

giống. Nó ảnh hưởng đến HSNC (đó là khả năng nhân nhanh chồi, TLCHH)

và TLCHH…[13].

3.4.1. Ảnh hưởng của BAP đến hệ số nhân chồi và tỷ lệ chồi hữu hiệu

Từ những năm 50 của thế kỷ XX, người ta đă nhận thấy vai trò của

nhóm cytokinin có ảnh hưởng rất rõ rệt và đặc trưng lên sự phân hoá các cơ

quan của thực vật đặc biệt là sự phân hoá chồi vì vậy để tăng hệ số nhân chồi,

người ta đă bổ sung thêm một số chất có trong nhóm cytokinin trong môi

trường nuôi cấy. BA là một chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm cytokinin

được sử dụng thông dụng nên trong nghiên cứu chúng tôi chọn BA để khảo

sát khả năng tạo cụm chồi in vitro của cây Trầm hương. Dựa vào kết quả của

nhiều nghiên cứu về cây Trầm hương trước đây, nồng độ BAP thường được

sử dụng từ 0,1- 7mg/l [3], [4], [12].

Qua đó, để tìm ra nồng độ BAP thích hợp cho nuôi cấy Trầm hương, đề

tài đã đưa ra 5 mức nồng độ BAP để thử nghiệm. Sau 4 tuần nuôi cấy kết quả

theo dõi ảnh hưởng của BAP đến HSNC và TLCHH cây Trầm hương được

trình bày tại bảng 3.4 và biểu đồ 3.5, 3.6.

Bảng 3.4. Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến HSNC và TLCHH (180

mẫu/công thức)

Nồng Số Chồi HSNC TLCHH Chất phân nhóm phân nhóm

độ chồi hữu (lần) (%) lượng HSNC bằng TLCHH

BAP thu hiệu chồi tiêu chuẩn bằng tiêu

(mg/l) được Ducan chuẩn Ducan

00 235 15 1,31 6,38 ++ 1 3

0,5 360 50 2 13,89 +++ 3 5

1,0 290 25 1,61 8,62 ++ 2 4

1,5 250 10 1,39 4,0 + 1 2

2,0 235 7 1,31 2,98 + 1 1

Ghi chú : + : chồi sinh trưởng kém

++ : Chồi sinh trưởng ở mức độ trung bình

+++: Chồi sinh trưởng tốt

Biểu đồ 3.5. Biểu đồ ảnh hưởng của BAP đến HSNC

Biểu đồ 3.6. Biểu đồ ảnh hưởng của BAP đến TLCHH

Từ bảng 3.4 và biểu đồ 3.5, 3.6 chúng tôi thấy rằng BAP có ảnh hưởng

tích cực đến quá trình nhân chồi, sinh trưởng và chiều cao chồi nuôi cấy. Khi

tăng nồng độ từ 0 lên 0,5 mg/l thì thấy khả năng nhân chồi là rất rõ.

Ở công thức đối chứng không bổ sung BA (CT17) thì không có sự phát

sinh chồi, cây phát triển mạnh về chiều cao, số lá trung bình khoảng 4 lá/cây,

cây màu đậm, có HSNC và TLCHH là 1,31 lần và 6,38%. Các công thức bổ

sung BA thể hiện sự khác biệt lớn so với công thức đối chứng.

Ở môi trường nồng độ BAP là 0,5mg/l có HSNC và TLCHH đạt cao

nhất là 2 lần và 13,89%. Nhưng khi tăng nồng độ từ 0,5 - 1,0 mg/l thì HSNC

và TLCHH giảm (HSNC là 1,61lần, TLCHH là 8,62%). Còn nồng độ 2,0

mg/l thì HSNC và TLCHH giảm mạnh là 1,31 lần và 2,98%. Ở môi trường có

nồng độ BAP là 2,0mg/l xuất hiện những chồi nhỏ, mảnh, chồi hình thành

không rõ rệt thân, lá, ngọn những chồi này không có tác dụng cho những lần

nhân chồi tiếp theo cũng như cấy chuyển sang môi trường tạo rễ do vậy

không được đo đếm. Như vậy thấy rằng nồng độ BAP cao đã ức chế sinh

trưởng và phát triển của chồi. Theo G. J de Klerk, 1999 nồng độ BAP cao sẽ

kìm hãm sự phát triển của quần thể chồi, chồi sinh trưởng và phát triển không

bình thường, mất sắc tố diệp lục (hình 3.7). Ở 3 công thức: CT19, 20, 21 ứng

nồng độ BAP có trong môi trường là 1,0; 1,5; 2,0mg/l có dấu hiệu phù gốc,

thủy tinh thể chứng tỏ cây Trầm hương rất nhạy cảm với BAP.

Trong nhân nhanh cây Trầm hương in vitro: Có một vấn đề trong vi

nhân giống cây Trầm hương là hệ số nhân chồi thấp. Trong các thí nghiệm

của Đinh trung chánh và cs, 2005 bổ sung BA(0,1mg/l) để nuôi cấy tái sinh tế

bào phôi Trầm hương; kết quả nhân giống cây Trầm hương của Lê Thị Kim

Đào (Trung tâm ứng dụng tiến bộ KHKT Bình Định) có bổ sung BA

(0,1mg/l) cho tạo cụm chồi và phát triển chồi, cho kết quả chồi thường xuất

hiện chồi đơn. Như vậy so sánh kết quả của các thí nghiệm trước đây và kết

quả thử nghiệm của đề tài thì ở công thức 18 (bổ sung BAP 0,5 mg/l) cho

HSNC được 2 lần, không có hiện tượng thủy tinh thể.

Phân tích bằng thống kê toán học cho thấy (phụ lục 09): giá trị Sig

trong bảng Test of Homogeneity of Variances của chỉ tiêu HSNC = 0,04 <

0,05 nên đề tài sử dụng tiêu chuẩn Tamhane’sT2 để so sánh, chỉ tiêu TLCHH

có giá trị Sig = 0,249 > 0,05 trong bảng kiểm tra phương sai tổng thể nên đề

tài sử dụng so sánh phương sai để đánh giá sự sai khác.

+ TLCHH ở các công thức nồng độ BAP có sự khác nhau với giá trị

Sig của TLCHH trong bảng Anova thu được bằng 0,00 < 0,05. HSNC cũng

thay đổi rõ rệt, bảng tiêu chuẩn Tamhane’sT2 cho thấy HSNC ở các công thức

nồng độ có sự sai khác rõ rệt. Sai khác có độ tin cậy với α = 0,05.

+ Phân nhóm bằng tiêu chuẩn Duncan cho thấy nồng độ BAP bằng 0,5

mg/l tốt nhất cho HSNC (2 lần) và TLCHH (13,89%), nằm trong nhóm tốt

nhất trong 5 công thức thí nghiệm với độ tin cậy 95%.

Như vậy cây Trầm hương được nhân giống invitro trên môi trường

WPM + BA (0-2 mg/l). Chồi xanh tốt, thân chồi vươn thẳng, lá to trong môi

trường có nồng độ BAP thấp. Trong khi đó, ở môi trường có BAP (2 mg/l),

chồi phát triển không bình thường, thân mọng nước. Do đó môi trường có bổ

sung BAP (0,5 mg/l) là thích hợp nhất cho giai đoạn nhân nhanh cây Trầm

hương. Với môi trường được sử dụng là: WPM + 2,0 mg/l B2 + 0,5 mg/l BAP

+ 30 g/l đường + 8 g/l agar + 0,2g/l PVP + 100ml/l CW, pH=5,8 cho giai

đoạn nhân tiếp theo.

Hình 3.7. Hình mẫu nuôi cấy trong môi trường có bổ sung 2mg/l BAP sau

4 tuần nuôi cấy

Hình 3.8. Hình chồi Trầm hương trong môi trường không bổ sung BAP

sau 4 tuần nuôi cấy

Hình 3.9. Hình chồi Trầm hương trong môi trường có bổ sung 0,5mg/l

BAP sau 4 tuần nuôi cấy

3.4.2. Ảnh hưởng của sự phối hợp nồng độ BAP + NAA trong môi trường

WPM đến hệ số nhân chồi và tỷ lệ chồi hữu hiệu

Trong việc tạo chồi, auxin cũng có tác dụng tích cực khi phối hợp với

cytokinin ở nồng độ thích hợp. Nhiều thí nghiệm đă chứng minh việc tạo chồi

sẽ tỏ ra hiệu quả hơn khi phối hợp hai nhóm auxin và cytokinin hơn là chỉ sử

dụng nhóm cytokinin đơn lẻ. Theo Murashige (1980) [21], quá tŕnh phân hoá

chồi phụ thuộc vào tỷ lệ auxin và cytokinin trong môi trường nuôi cấy. Nếu tỷ

lệ cytokinin/auxin cao kích thích sự hình thành chồi và ngược lại sẽ kích thích

sự hình thành rễ.

Nhằm tăng nhanh hệ số nhân chồi đồng thời kích thích chồi vươn cao

làm nguồn nguyên liệu trước khi nuôi cấy phát sinh rễ. Do đó để tìm ra tổ hợp

BAP và auxine thích hợp cho nhân nhanh chồi cây Trầm hương, đề tài còn

nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ của NAA đến HSNC và TLCHH. Đề tài bổ

sung NAA với các nồng độ đó là: 0; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 mg/l vào môi trường

WPM + 2,0 mg/l B2 + 0,5 mg/l BAP + 30 g/l đường + 8 g/l agar + 0,2g/l PVP

+ 100ml/l CW, pH=5,8. Kết quả được trình bày bảng 3.5 và biểu đồ 3.7, 3.8.

Bảng 3.5. Ảnh hưởng của sự phối hợp nồng độ BAP + NAA đến HSNC và

TLCHH (180 mẫu cấy/công thức)

Nồng Số Chồi HSNC TLCHH Chất phân nhóm phân nhóm

độ chồi hữu ( lần) (%) lượng HSNC bằng TLCHH

NAA thu hiệu chồi tiêu chuẩn bằng tiêu

(mg/l) được Ducan chuẩn Ducan

365 70 2,03 19,18 ++ 2 0,0 3

410 112 2,28 27,32 +++ 2 0,2 5

390 93 2,17 23,85 ++ 2 0,4 4

362 58 2,01 16,02 + 2 0,6 1

290 51 1,61 17,59 + 1 0,8 2

Ghi chú : + : chồi sinh trưởng kém

++ : Chồi sinh trưởng ở mức độ trung bình

+++: Chồi sinh trưởng tốt

Qua bảng số liệu 3.5 ta thấy tổ hợp BAP + NAA có tác động tích cự rõ

đến HSNC và TLCHH, chỉ tiêu theo dõi tăng ở nồng độ 0,2 mg/l (HSNC là

2,28 lần, TLCHH là 27,32%) so với môi trường đối chứng (không bổ sung

NAA). Môi trường có bổ sung với nồng độ NAA là 0,4 - 0,8 mg/l thì HSNC

và TLCHH đều giảm rõ rệt so với nồng độ 0,2 mg/l, điều này chứng tỏ với

nồng độ NAA cao sẽ tác động hạn chế đến tỷ lệ nhân chồi của cây Trầm

hương.

Biểu đồ 3.7. Biểu đồ ảnh hưởng sự phối hợp nồng độ BAP+NAA đến

HSNC

Biểu đồ 3.8. Biểu đồ ảnh hưởng sự phối hợp nồng độ BAP+NAA đến

TLCHH

Ở công thức 23 (nồng độ BA=0,5 mg/l; NAA=0,2 mg/l) chồi mập, sinh

trưởng và phát triển tốt, lá xanh, cây khoẻ, thân lá rõ ràng, số lượng chồi tạo

thành và tỉ lệ chồi hữu hiệu đảm bảo làm nguồn nguyên liệu in vitro cho các

quá trình nhân giống tiếp theo. Do đó ở nồng độ BA=0,5 mg/l; NAA=0,2

mg/l rất thích hợp cho sự nhân chồi ở cây Trầm hương in vitro.

Bảng kết quả 3.5 và biểu đồ 3.7, 3.8 cho thấy Trầm hương cũng tái sinh

chồi tốt ở nồng độ BA=0,5 mg/l và NAA=0,4 mg/l (công thức 24). Tuy nhiên

ở công thức này phần lớn chồi tạo thành có chiều cao của chồi thấp, hình thái

chồi cằn cỗi. Ở công thức 25 (nồng độ BA=0,5 mg/l; NAA= 0,6 mg/l) và ở

công thức 26 (nồng độ BA=0,5mg/l; NAA=0,8mg/l) thì chồi bên sinh trưởng

kém, số lượng ít và chiều cao chồi giảm nguyên nhân do hàm lượng chất điều

hoà sinh trưởng cao gây ức chế khả năng phát triển chồi của cây Trầm hương

in vitro.

Phân tích phương sai về ảnh hưởng của NAA đến HSNC và TLCHH

cũng cho thấy (phụ lục 10): Giá trị Sig trong bảng kiểm tra phương sai tổng

thể của 2 chỉ tiêu HSNC = 0,336 > 0,05, TLCHH = 0,144 > 0,05. Như vậy,

các biến ngẫu nhiên của 2 chỉ tiêu trên có phương sai bằng nhau.

+ Giá trị Sig trong bảng phân tích phương sai thì HSNC và TLCHH

đều < 0,05, vậy các công thức có bổ sung nồng độ NAA thấy khác nhau rõ rệt

với 2 chỉ tiêu được đánh giá có mức độ tin cậy 95%.

+ Bảng phân nhóm Duncan cho thấy HSNC cao nhất ở nồng độ 0,2

mg/l (công thức 23) nằm trong nhóm 2, TLCHH ở 2 nồng độ 0,2 mg/l nằm

trong nhóm 5, là nhóm tốt nhất trong 5 công thức thí nghiệm, với độ tin cậy

95%.

Với kết quả đã phân tích, môi trường WPM + 2,0 mg/l B2 + 0,5 mg/l

BAP + 0,2mg/l NAA + 30 g/l đường + 8 g/l agar + 0,2g/l PVP + 100ml/l CW,

pH=5,8 là tốt nhất cho nhân chồi cây Trầm hương. Môi trường này được thí

nghiệm tiếp cho nhân nhanh chồi tiếp theo.

Việc thử nghiệm tổ hợp chất điều hoà sinh trưởng này (BAP + NAA)

phù hợp với một số nghiên cứu trong và ngoài nước để nhân giống nuôi cấy

mô cho một số cây rừng [16], tuy nhiên với mỗi loài cây thì nồng độ sử dụng

cũng khác nhau. Đặc biệt công bố của Đinh trung chánh và cs, 2005 cũng đã

sử dụng tổ hợp BAP + NAA để nhân giống nuôi cấy mô cho cây Trầm hương,

ở nồng độ khác nhau.

Hình 3.10. Hình chồi Trầm hương trong môi trường có phối hợp 0,5mg/l

BAP+ 0,2mg/l NAA sau 4 tuần nuôi cấy

3.4.3. Ảnh hưởng của sự phối hợp nồng độ IBA trong môi trường WPM

đến tỷ lệ chồi ra rễ, số rễ trung bình/cây và chiều dài của rễ

Giai đoạn ra rễ là giai đoạn tạo cây con hoàn chỉnh có đủ thân, lá và rễ.

Giai đoạn này các chất có tác dụng kích thích tạo chồi và vươn cao của chồi

được loại bỏ. Thay vào đó là các chất có tác dụng kích thích ra rễ, do vậy các

chất auxin thường được sử dụng bổ sung vào môi trường nuôi cấy mô tế bào.

Giai đoạn này không cần sự sinh trưởng về chiều cao mà chỉ cần tạo rễ cho

chồi nên nồng độ auxin, đường được giảm xuống 1/2.

IBA là chất điều hoà sinh trưởng thuộc nhóm auxin, thường được sử

dụng hầu hết trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, có tác dụng tạo rễ cho chồi.

Nó được sử dụng khác nhau phụ thuộc vào loài dao động từ 0,5 - 5 mg/l [21].

Đề tài bổ sung IBA với các nồng độ là: 0,0; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 mg/l vào

môi trường WPM + 15 g/l đường + 8 g/l + 0,2g/l PVP + 100ml/l CW,

pH=5,8, sau 2 tuần theo dõi được kết quả là:

IBA có ảnh hưởng rõ đến tỷ lệ ra rễ, số rễ trung bình/cây và chiều dài

trung bình của rễ. Tỷ lệ ra rễ và số rễ trung bình trên cây tăng rất nhiều khi bổ

sung với nồng độ 0,5 và 1,0 mg/l. Khi chưa bổ sung IBA tỷ lệ chồi ra rễ đạt

4,44%, số rễ trung bình/cây đạt 1,0 rễ/ cây, chiều dài trung bình rễ 0,41cm.

Khi bổ sung IBA lên nồng độ 0,5 và 1,0 mg/l thì hệ số trên tăng mạnh và cao

nhất ở nồng độ 0,5 mg/l (công thức 28) (là 48,89%, 2,6 rễ/cây, 1,12 cm).

Nồng độ IBA tăng ở các nồng độ 1,5 và 2,0 nhưng các chỉ tiêu trên lại giảm

mạnh.

Qua quan sát thấy khi bổ sung IBA thì thấy mặt cắt của chồi cấy sùi to

tạo thành callus, những rễ tạo thành rất ngắn. Rễ được tạo thành trong trường

hợp này có thể do hàm lượng NAA còn có mặt trong chồi nuôi cấy từ quá

trình nhân chồi ở các thí nghiệm trên. Các nồng độ 1,5 và 2,0 mg/l xuất hiện

nhiều rễ có màu đen hoặc đầu rễ bị đen, những rễ này thường phát triển chậm

khi cấy ra bầu và có nhiều chồi sùi đen tại phần tiếp xúc với môi trường ra rễ,

một số chồi bị rụng lá và chết sau đó. Như vậy khi sử dụng IBA kích thích sự

tạo rễ thì nên dùng với lượng 0,5mg/l là tốt cho việc ra rễ, nếu dùng lượng cao

hơn sẽ kim hãm quá tŕnh phát sinh và hình thành rễ.

Bảng 3.6. Ảnh hưởng nồng độ IBA đến tỷ lệ chồi ra rễ, số rễ trung bình

và chiều dài của rễ ( 450 chồi cây/ công thức)

Nồng

Tổng

Tỉ lệ

Tổng

Số rễ

Chiều

Hình

phân phân phân

độ

số

chồi

số rễ

trung

dài

thái rễ

nhóm nhóm nhóm

IBA

chồi

ra rễ

trong

bình

trung

TLCRR SRTB CDTBR

(mg/l)

ra rễ

(%)

công

(rễ/

bình

bằng bằng bằng

(chồi)

thức

cây)

rễ

tiêu tiêu tiêu

( rễ)

(cm)

chuẩn chuẩn chuẩn

4,44

0,41

Rễ

ngắn,

Ducan Ducan Ducan

dòn, dễ

gãy

0,5

220 48,89

572 2,6

1,12

4

3 Rễ

khỏe

và rễ

trắng

đều

1,0

165

36,67

314

1,9

1,0

Rễ

dài,dòn

,đen

1,5

126

1,4

0,74 Rễ dài,

mảnh,

đầu rễ

đen

2,0

6,67

1,03

0,5

Rễ

ngắn,

dòn,

đen

Biểu đồ 3.9. Biểu đồ ảnh hưởng của IBA đến tỉ lệ chồi ra rễ của cây

Biểu đồ 3.10. Biểu đồ ảnh hưởng của IBA đến số rễ trung bình của cây

IBA (3-Indol butyric acid) trong nuôi cấy mô thực vật là nhóm Auxin

thường được sử dụng để kích thích sự phân chia tế bào, biệt hoá rễ, hình thành

mô sẹo, kìm hãm sự phát triển chồi và tạo ra các rễ phụ. IBA sử dụng tạo rễ

cho chồi trong nuôi cấy mô tế bào thực vật. Kết quả nuôi cấy tái sinh phôi giả

cây Trầm hương trên môi trường có bổ sung IBA (0,7mg/l) đạt chiều cao chồi

65mm sau 45 ngày nuôi cấy của Đinh Trung Chánh và cs. Đoàn thị mai và cs

của Trung tâm nghiên cứu giống cây rừng thuộc Viện KHLN- VN cũng đã ra

rễ thành công cây Trầm hương trên Môi trường có bổ sung IBA (0,3mg/l).

Vậy so sánh kết quả của các thí nghiệm trước đây và kết quả thử nghiệm của

đề tài thì có sự chênh lệch về nồng độ IBA cho việc tạo rễ cây Trầm hương in

vitro.

Kết quả phân tích thống kê ảnh hưởng của nồng độ IBA đến các chỉ

tiêu ra rễ (tỷ lệ ra rễ, số rễ trung bình/cây, chiều dài trung bình của rễ) của cây

trầm hương cho thấy (phụ lục 11):

Ảnh hưởng của IBA đến các chỉ tiêu ra rễ với độ tin cậy 95%, theo

phương pháp phân nhóm Duncan thu được nồng độ 0,5 mg/l (công thức 28) là

nhóm tốt nhất cho tỷ lệ ra rễ (thuộc nhóm 4), số rễ trung bình/cây (thuộc

nhóm 4). Nồng độ 0,5 mg/l tốt nhất cho chiều dài trung bình của rễ (thuộc

nhóm 3). Hai chỉ tiêu tỉ lệ ra rễ, số rễ trung bình/cây ảnh hưởng rõ rệt hơn chỉ

tiêu chiều dài của rễ đến chất lượng cây con và tỷ lệ sống của cây tại vườn

ươm. Vì thế môi trường có bổ sung nồng độ IBA 0,5 mg/l (công thức 28) là

thích hợp cho giai đoạn ra rễ cho cây Trầm hương.

Hình 3.11. Hình chồi nuôi cấy trong môi trường có bổ sung 0,5mg/l IBA

sau 4 tuần nuôi cấy

3.4.4. Ảnh hưởng của thời gian huấn luyện đến tỷ lệ sống và chiều cao của

cây con ở vườn ươm

Đưa cây con ra ngoài vườn ươm là giai đoạn quan trọng trong quá trình

sản xuất cây giống bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào, nó có ý nghĩa đến

ứng dụng quá trình vi nhân giống vào thực tiễn sản xuất. Đề tài thử nghiệm

ảnh hưởng của 4 khoảng thời gian huấn luyện cây con như sau: Không huấn

luyện; huấn luyện 5, 10, 15 ngày để nghiên cứu tỷ lệ sống và sinh trưởng của

cây con ở vườn ươm. Kết quả thu được sau 4 tuần ngoài vườn ươm là:

Bảng 3.7. Ảnh hưởng của thời gian huấn luyện đến tỷ lệ sống của cây con

tại vườn ươm (90 cây mạ/công thức)

Thời gian Tổng số Tỷ lệ Chiều cao phân nhóm phân nhóm

huấn luyện cây sống sống trung bình TLCS bằng tiêu CCTB bằng tiêu

(ngày) ( cây) chuẩn Ducan chuẩn Ducan (%) (cm)

5,56 5,6 5 0 1 1

44,44 5,73 40 5 2 1 và 2

83,33 5,8 75 10 4 2

66,67 5,6 60 15 3 1

Biểu đồ 3.11. Biểu đồ ảnh hưởng của thời gian huấn luyện đến tỉ lệ cây

sống

Từ kết quả bảng 3.7, thời gian huấn luyện có ảnh hưởng rõ đến tỷ lệ

sống của cây con tại vườn ươm. Cây con không được huấn luyện đạt tỷ lệ

sống rất thấp (là 5,56%). Tỷ lệ sống tăng lên với thời gian huấn luyện 5 ngày,

44,44%, thời gian huấn luyện 10 ngày đạt tỷ lệ sống cao nhất (83,33%), tỷ lệ

sống giảm ít ở thời gian huấn luyện 15 ngày (66,67%). Qua quan sát thấy với

công thức 15 ngày rễ của cây con trong bình thường bị đen, xuất hiện nhiều rễ

chết, có thể đã chết sau khi cấy ra vườn ươm. Ngược lại với tỷ lệ sống, chiều

cao trung bình thay đổi không đáng kể ở các công thức.

So sánh phương sai về ảnh hưởng của thời gian huấn luyện đến tỷ lệ

sống và chiều cao thu được kết quả (phụ lục 12): có giá trị Sig trong bảng

phương sai tổng thể của chỉ tiêu tỷ lệ sống bằng 0,13; của chỉ tiêu chiều cao

trung bình bằng 0,137. Như vậy phương sai của biến ngẫu nhiên bằng nhau.

Bảng phân tích phương sai thu được kết quả Sig trong bảng Anova, chỉ

tiêu tỷ lệ sống bằng 0,00. Vì thế, tỷ lệ sống ở các công thức có sự sai khác với

α = 0,05, giá trị Sig của chiều cao trung bình > 0,05 (bằng 0,067). Ta thấy chỉ

số chiều cao trung bình của cây con không có sự sai khác giữa các công thức.

Phân nhóm bằng tiêu chuẩn Duncan cho thấy tỷ lệ sống khoảng thời

gian huấn luyện 10 ngày nằm nhóm tốt nhất trong 5 công thức thí nghiệm.

Với α = 0,05 (độ tin cậy 95%). Vì vậy chúng tôi chọn khoảng thời gian huấn

luyện là 10 ngày đối với cây Trầm hương.

Hình 3.12. Hình cây cấy ra ngoài bầu đất

Chương 4

KẾT LUẬN, TỒN TẠI VÀ KIẾN NGHỊ

4.1. Kết luận

Quá trình nghiên cứu về cây Trầm hương đề tài thấy sinh trưởng và

phát triển chịu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy. Thành phần và nồng độ

các chất điều hoà sinh trưởng ảnh hưởng mạnh và rõ đến hiệu quả quá trình

nhân nhanh chồi và tạo cây hoàn chỉnh.

1. Chất khử trùng mẫu cho cây Trầm hương tốt nhất là HgCl2 nồng độ

0,1%, thời gian khử trùng là 6 phút.

2. Môi trường thích hợp cho nhân nhanh chồi cây Trầm hương là:

WPM

3. Vitamin cần thiết cho giai đoạn nhân chồi cây Trầm hương là: 2,0

mg/l B2

4. Môi trường tạo chồi và nhân chồi thích hợp là: WPM + 2,0 mg/l B2

+ 0,5 mg/l BAP + 0,2mg/l NAA + 30 g/l đường + 8 g/l agar + 0,2g/l PVP +

100ml/l CW, pH=5,8

5. Môi trường tạo cây hoàn chỉnh ra rễ là: WPM + 0,5mg/l IBA + 15 g/l

đường + 8 g/l agar + 0,2g/l PVP + 100ml/l CW, pH=5,8

6. Thời gian huấn luyện cây con tốt nhất cho cây Trầm hương khi cấy ở

vườn ươm là 10 ngày.

4.2. Tồn tại

Do thời gian và kinh nghiệm của tác giả có hạn nên đề tài vẫn còn rất

nhiều hạn chế:

+ Chưa nghiên cứu ảnh hưởng của mùa vụ đến khả năng tái sinh chồi

ban đầu

+ Chưa nghiên cứu được điều kiện nuôi cấy thích hợp như ánh sáng,

nhiệt độ.

+ Các thí nghiệm về môi trường dinh dưỡng và phối hợp các chất điều

hoà sinh trưởng chưa nhiều.

4.3. Kiến nghị

Để cho cây con cây Trầm hương phục vụ cho công tác sản xuất giống

cây trồng rừng cần nghiên cứu chi tiết hơn nữa đối với môi trường nhân chồi,

đặc biệt là nồng độ chất điều hoà sinh trưởng và một số chất phụ gia, vitamin

khác bổ sung vào môi trường nuôi cấy.

+ Tiếp tục nghiên cứu nhân giống các loại vật liệu khác như rễ, lá…

+ Nghiên cứu về một số giá thể phù hợp cho cây.

+ Nghiên cứu khả năng sinh trưởng, phát triển và tạo trầm của cây cấy

mô.

+ Sản xuất số lượng cây con lớn và giảm giá thành sản phẩm.

DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu tiếng việt

1. Andrew I, (1991), “Thiết kế đơn giản cho các thí nghiệm lâm nghiệp”, Bản

tin, Viện nghiên cứu lâm nghiệp (số 71), 39 trang.

2. Bộ khoa học và công nghệ, (2007), Sách đỏ VN, phần thực vật, NXB

KH&KT, Hà Nội.

3. Đinh Trung Chánh, Trần Văn Minh, Bùi Thị Tường Thu và Bùi Cách

Tuyến, (2005), “ứng dụng công nghệ phôi soma trong công tác

giống cây Trầm hương (Aquilaria crassna Pierre ex Lecomte)”,

Hội nghị khoa học và công nghệ 2007.

4. Đinh Trung Chánh, Trần Văn Minh, Bùi Thị Tường Thu và Bùi Cách

Tuyến, (2005), “nghiên cứu kỹ thuật nuôi cấy phôi giả trong nhân

nhanh cây Trầm hương (Aquilaria crassna Pierre ex Lecomte)”,

Hội nghị khoa học và công nghệ 2007.

5. Lê Văn Chi, (1992), Cách sử dụng chất điều hoà sinh trưởng và vi lượng

hiệu quả cao, NXB Khoa học - Kỹ thuật, Hà Nội.

6. Võ Văn Chi và Nguyễn Hiền, (1991), Trầm hương, NXB KH&KT, Hà Nội.

7. Lê Thị Kim Đào, (2001), “nghiên cứu thử nghiệm nhân giống một số cây

trồng rừng bằng phương pháp nuôi cấy mô”, Trung tâm ứng dụng

tiến bộ khoa học kỹ thuật Bình Định.

8. Hồ Văn Giảng, Vũ Thị Huệ, (2006), “Xây dựng qui trình nhân giống cây

Gió trầm bằng kỹ thuật nuôi cấy mô-tế bào”, Tạp chí Nông nghiệp

& phát triển nông thôn, (số đặc san 1-2006), tr. 45-47.

9. Nguyễn Đức Minh Hùng, (2001), Công nghệ sinh học cây dó bầu

(Aquilaria Crassna Pierre Ex), Tuyển tập công trình nghiên cứu

khoa học công nghệ Viện SHNĐ năm 1999-2000, Nhà xuất bản

Nông nghiệp.

10. Đặng Ngọc Hùng, (2009), Nghiên cứu nhân giống các dòng bạch đàn lai

UE35 và UE56 giữa Eucalyptus Urophylla và E. Exserta bằng

phương pháp nuôi cấy mô, Trường Đại học Nông Lâm Thái

Nguyên.

11. Lê Đình Khả, Dương Mộng Hùng, (2003), Giống cây rừng, NXB Nông

nghiệp, Hà Nội.

12. Đoàn Thị Mai và cộng sự, (2005), “Bước đầu ứng dụng công nghệ mô –

hom trong nhân giống Trầm hương”, Tạp chí NN&PTNT (số 2), tr.

57-67.

13. Đoàn Thị Ái Thuyên và cộng sự, (2005), “Nhân giống vô tính cây Hông

(Paulowvina fortunei Hemsi) bằng phương pháp nuôi cấy mô”, Tạp

chí sinh học, (số 9), tr. 46-50.

14. Vũ Văn Vụ (1994), Sinh lý học thực vật, Nhà xuất bản Khoa học - Kỹ

thuật, Hà Nội, tr. 182 - 237.

Tài liệu tiếng Anh

15. Boland D. J., M. I. H. Brooker, G. M. Chippendale, N. Hall, B. P. M.

Hyland, R. D. Jonhson, D. A. Kleing, M. W. Mcdonald and J. D.

Turnor (2006), Forest Tree of Australia (Sixth edition)- CSIRO,

ERSIS, Mellbourne, pp. 330 - 331, 736 p.

16. Darus H. Ahmad (1994), “Multiplication of Acacia mangium by stem

cutting and tissue culture techniques”, Advances in tropical acacia

research, pp. 32-34.

17. Lloyd G and McCown B, (1980), Commercially – feasible

micropropagation of mountain laurel, Kalmia latifolia, by use of

shoot - tip culture, Int. Plant. Proc. 30, pp. 410 - 421.

18. Litvay J. D et al (2002), Plant cell and tissue culture media, Duchefa

Biochemie, Hofmanweg 71 2031 BH Haarlem, The Netherlands, p.

44.

19. Murashige T. and Skoog F, (1962), “A resied medium for rapid growth

and bioassays wirh tobacco tissue cultures”, Physiol. Plant (15),

pp. 473-495.

20. Murashige T. (1980) Plant Growth, Substances & Commercial Uses of

tissues Verlarg, Berlin, Heidelberg, Newyork .

21. Trindate, H. Ferreina, J. G. Pais, M. S. Aloni, R,(1990), The role of

Cytokinin and auxin in rapid multiplication of shoots of Eucalyptus

globolus grown in vitro, Aust. For. 53(4), pp. 221-223.

Internet

22. http://congnghesinhhoc24h/tai-lieu/nghien cuu gay tao tram huong bang

phuong phap vi sinh va hoa hoc.

23. http://www.Tramhuongvietnam.com/caydo10.php.

PHỤ LỤC

Phụ lục 01. Thành phần môi trường MS

Đa lượng

332.02 mg/l 2.99 μM CaCl2

170.00 mg/l 1.25 μM KH2PO4

1900.00 mg/l 18.79 μM KNO3

180.54 mg/l 1.50 μM MgSO4

1650.00 mg/l 20.61 μM NH4NO3

Vi lượng

0.025 mg/l 0.11 μM CoCl2.6H2O

0.025 mg/l 0.10 μM CuSO4

FeNaEDTA 36.700 mg/l 0.10 μM

6.200 mg/l 0.10 μM H3BO3

KI 0.830 mg/l 5.00 μM

16.900 mg/l 0.10 μM MnSO4. H2O

0.250 mg/l 1.03 μM Na2MoO4.2 H2O

8.600 mg/l 29.91 μM ZnSO4.7 H2O

Vitamin

Glycine 2.00 mg/l 26.64 μM

Myo-Inositol 100.00 mg/l 0.564 μM

Nicotinic acid 0.50 mg/l 4.06 μM

Pyridoxine HCl (vitamin B6) 0.50 mg/l 2.43 μM

Thiamine HCl (vitamin B1) 0.10 mg/l 0.30 μM

Phụ lục 02. Thành phần môi trường MS * (MS cải tiến)

Đa lượng

mg/l 2.99 μM 332.02 CaCl2

mg/l 1.25 μM 170.00 KH2PO4

mg/l 18.79 μM 1900.00 KNO3

mg/l 1.50 μM 180.54 MgSO4

mg/l 20.61 μM 1650.00 NH4NO3

Vi lượng

mg/l 0.11 μM 0.025 CoCl2.6H2O

mg/l 0.10 μM 0.025 CuSO4

mg/l 0.10 μM FeNaEDTA 36.700

mg/l 0.10 μM 6.200 H3BO3

mg/l 5.00 μM 0.830 KI

mg/l 0.10 μM 16.900 MnSO4. H2O

mg/l 1.03 μM 0.250 Na2MoO4.2 H2O

mg/l 29.91 μM 8.600 ZnSO4.7 H2O

Vitamin

μM Biotin 0.05 mg/l 0.21

μM Folic acid 0.05 mg/l 1.13

μM Glycine 2.00 mg/l 26.64

μM Myo-Inositol 100.00 mg/l 0.56

μM Nicotinic acid 5.00 mg/l 40.62

μM 0.50 mg/l 2.43 Pyridoxine HCl (vitamin B6)

μM 0.50 mg/l 1.48 Thiamine HCl (vitamin B1)

( Môi trường được bổ sung thêm vitamin và thay đổi nồng độ một số nguyên

tố khoáng )

Phụ lục 03. Thành phần môi trường WPM

Đa lượng

mg/l 0.65 μM 72.50 CaCl2

mg/l 2.35 μM 386.80 Ca(NO3)2

mg/l 1.25 μM 170.00 KH2PO4

mg/l 5.68 μM 990.00 K2SO4

mg/l 1.50 μM 180.54 MgSO4

mg/l 5.00 μM 400.00 NH4NO3

Vi lượng

mg/l 1.00 μM 0.25 CuSO4

mg/l 0.10 μM 36.700 FeNaEDTA

mg/l 0.10 μM 6.200 H3BO3

mg/l 0.10 μM 16.900 MnSO4. H2O

mg/l 1.03 μM 0.250 Na2MoO4.2 H2O

mg/l 29.91 μM 8.600 ZnSO4.7 H2O

Vitamin

μM Glycine 2.00 mg/l 26.64

μM Myo-Inositol 100.00 mg/l 0.564

μM Nicotinic acid 0.50 mg/l 4.06

μM 0.50 mg/l 2.43 Pyridoxine HCl (vitamin B6)

μM 1.00 mg/l 2.96 Thiamine HCl (vitamin B1)

Phụ lục 04. Thành phần môi trường WV3

Đa lượng

4.08 μM mg/l 452.88 CaCl2

1.98 μM mg/l 270.00 KH2PO4

9.00 μM mg/l 910.06 KNO3

7.51 μM mg/l 903.79 MgSO4

8.81 μM mg/l 656.79 KCl

Vi lượng

0.11 μM mg/l 0.025 CoCl2.6H2O

0.10 μM mg/l 0.025 CuSO4

0.10 μM mg/l 36.71 FeNaEDTA

0.50 μM mg/l 31.000 H3BO3

5.00 μM mg/l 0.830 KI

0.09 μM mg/l 15.160 MnSO4. H2O

1.03 μM mg/l 0.250 Na2MoO4.2 H2O

0.03 μM mg/l 8.600 ZnSO4.7 H2O

Vitamin

Myo-Inositol 1000.00 mg/l 0.564 μM

Thiamine HCl (vitamin B1) 0.40 mg/l 1.19 μM

Phụ lục 05. Thành phần môi trường Litvay

Đa lượng

mg/l 10.15 μM 16.61 CaCl2

mg/l 18.79 μM 1900.00 KNO3

mg/l 2.50 μM 340.00 KH2PO4

mg/l 7.51 μM 903.38 MgSO4

mg/l 20.61 μM 1650.00 NH4NO3

Vi lượng

mg/l 2.00 μM 0.5 CuSO4

mg/l 0.10 μM FeNaEDTA 36.700

mg/l 0.50 μM 31.00 H3BO3

mg/l 0.12 μM 21.00 MnSO4. H2O

mg/l 5.17 μM 1.250 Na2MoO4.2 H2O

mg/l 0.15 μM 43.00 ZnSO4.7 H2O

mg/l 0.53 μM 0.125 CoCl2.6H2O

mg/l 25.00 μM 4.150 KI

Vitamin

Myo-Inositol 100.00 mg/l 0.564 μM

Nicotinic acid 0.50 mg/l 4.06 μM

Pyridoxine HCl (vitamin B6) 0.10 mg/l 0.49 μM

Thiamine HCl (vitamin B1) 0.1 mg/l 0.30 μM

Phụ lục 06. Phân tích kết quả khử trùng mẫu cấy

Phụ lục 07. Phân tích ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy

Phụ lục 08. Ảnh hưởng của nồng độ B2 đến HSNC và TLCHH

Phụ lục 09. Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến HSNC và TLCHH

Phụ lục 10. Ảnh hưởng của sự phối hợp giữa nồng độ BAP + NAA đến

HSNC và TLCHH

100

Phụ lục 11. Ảnh hưởng của IBA đến hiệu quả ra rễ

101

102

103

Phụ lục 12. Ảnh hưởng của thời gian huấn luyện đến tỷ lệ sống và chiều

cao của cây con

104

105

Luận văn Thạc sĩ Khoa học lâm nghiệp: Nghiên cứu nhân giống in vitro cây Trầm hương (Aquilaria crassna Pierre ex. Lecomte) tại Bình Thuận

TRƯỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP

---------------------

TRẦN THỊ CẢNH ĐÀI NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG IN VITRO

CÂY TRẦM HƯƠNG (Aquilaria crassna Pierre ex. Lecomte)

TẠI BÌNH THUẬN

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC LÂM NGHIỆP Đồng Nai, 2012

TRƯỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP

---------------------

TRẦN THỊ CẢNH ĐÀI NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG IN VITRO

CÂY TRẦM HƯƠNG (Aquilaria crassna Pierre ex. Lecomte)

TẠI BÌNH THUẬN

CHUYÊN NGÀNH: LÂM HỌC MÃ SỐ: 60.62.60 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC LÂM NGHIỆP NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS.TS. DƯƠNG MỘNG HÙNG

LỜI CAM ĐOAN

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1. Nước hoa từ trầm

Nồng

Tổng

Tỉ lệ

Tổng

Số rễ

Chiều

Hình

độ

số

chồi

số rễ

trung

dài

thái rễ

IBA

chồi

ra rễ

trong

bình

trung

(mg/l)

ra rễ

(%)

công

(rễ/

bình

(chồi)

thức

cây)

rễ

( rễ)

(cm)

0,5

220

48,89

572

2,6

1,12

4

4

3

Rễ

khỏe

và rễ

trắng

đều

7. Lê Thị Kim Đào, (2001), “nghiên cứu thử nghiệm nhân giống một số cây

Có thể bạn quan tâm

Luận văn Thạc sĩ: Quản lý hoạt động phát triển nhận thức cho trẻ mẫu giáo ở các trường mầm non, huyện Hoàng Su Phì, tỉnh Hà Giang

Luận văn Thạc sĩ tóm tắt: Pháp luật về điều kiện đầu tư kinh doanh trong lĩnh vực giáo dục, đào tạo ở Việt Nam

Luận văn Thạc sĩ: Sự nghiệp nghiên cứu phê bình văn học của Hoài Thanh

Luận văn Thạc sĩ: Tiểu thuyết của Đỗ Phấn từ góc nhìn sinh thái

Luận văn Thạc sĩ: Giải pháp ứng phó với nhập cư ở Liên minh Châu Âu

Luận văn Thạc sĩ: Diễn ngôn về giới nữ trong văn xuôi nữ Việt Nam đương đại (khảo sát sáng tác của Dạ Ngân, Y Ban, Lý Lan, Nguyễn Thị Thu Huệ)

Luận văn Thạc sĩ: Xây dựng mức phát thải tham chiếu rừng khu vực huyện Bảo Lâm tỉnh Lâm Đồng

Luận văn Thạc sĩ: Đặc điểm nhân vật chính trong ba tác phẩm của Franz Kafka: Lâu đài, Vụ án, Hóa thân

Kháo luận tốt nghiệp: Vận dụng lí thuyết học tập trải nghiệm vào dạy học Thống kê - Xác suất ở lớp Hai

Luận văn Thạc sĩ: Xây dựng hệ thống điều khiển và thu nhận dữ liệu cho Robot dịch vụ

Luận văn Thạc sĩ: Thế giới nhân vật trong truyện ngắn Lê Minh Khuê sau năm 1975

Luận văn Thạc sĩ: Tác động của cấu trúc vốn đến hiệu quả hoạt động của các ngân hàng thương mại cổ phần niêm yết trên thị trường chứng khoán Việt Nam

Luận văn Thạc sĩ: Kiểm soát rủi ro tín dụng bán lẻ tại Ngân hàng Thương mại Cổ phần Đầu tư và Phát triển Việt Nam chi nhánh Thủ Thiêm