Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu đặc điểm sinh học của một số chủng vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzym nhằm định hướng ứng dụng trong xử lý nước thải hữu cơ

Luận văn Thạc sĩ sinh học Nguyễn Thị Hồng Hà

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

----------

NGUYỄN THỊ HỒNG HÀ

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC

CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI SINH VẬT CÓ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP ENZYM NHẰM ĐỊNH HƯỚNG ỨNG DỤNG TRONG XỬ LÝ NƯỚC THẢI HỮU CƠ

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

Mã số: 60 42 01 03

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Thế Trang

Hà Nội, tháng 12 năm 2014

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

K16

1 Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

Luận văn Thạc sĩ sinh học Nguyễn Thị Hồng Hà

CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ

1. Nguyễn Thị Hồng Hà, Nguyễn Thế Trang, Nguyễn Thị Đà, Phạm Thị

Thu Phương, Lê Thị Thanh Xuân, Nguyễn Thúy Nga, Lê Quang

Sáng, Phạm Văn Duy (2014). Nghiên cứu đặc điểm sinh học và

phân loại một số chủng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp

xenlulaza phân lập từ nước thải sau hầm biogas. Tạp chí Khoa học

ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, 30,6S.

2. Nguyễn Thế Trang, Nguyễn Thị Hồng Hà, Nguyễn Thúy Nga, Phạm Văn

Duy (2014). Ứng dụng một số chủng vi khuẩn xử lý nước thải giàu

hữu cơ sau hầm biogas, Tuyển tập báo cáo khoa học, Hội thảo khoa

học quốc tế “Năng lượng và tăng trưởng xanh khu vực ASEAN”, Hà

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Nội 2014. Nhà xuất bản Khoa học tự nhiên và Công nghệ.

K16

2 Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

Luận văn Thạc sĩ sinh học Nguyễn Thị Hồng Hà

MỞ ĐẦU

Cùng với sự phát triển của các nhà máy chế biến nông sản (đồ hộp từ dứa,

dưa chuột bao tử, cà chua, ngô ngọt ...) một vấn đề đang làm bức xúc các nhà sản

xuất đó là: nước thải, phế thải từ các quá trình chế biến. Chất thải của các nhà máy

chế biến đồ hộp rau quả có hàm lượng các chất hữu cơ rất cao (các loại đường đơn,

axit hữu cơ, protein, xenluloza …), đây là nguồn dinh dưỡng thích hợp cho nhiều

loại vi sinh vật sinh trưởng. Sự sinh trưởng của các vi sinh vật trong môi trường

nước thải giàu hữu cơ từ nông sản khi không có sự kiểm soát của con người thường

tạo ra các sản phẩm có mùi hôi thối tác động xấu tới môi trường sinh thái. Do vậy,

các chất thải cần phải được xử lý trước khi thải ra môi trường tự nhiên. Có nhiều

phương pháp xử lý nước thải hữu cơ khác nhau như: Phương pháp cơ học, hóa học,

hóa lý và sinh học. Đối với nước thải hữu cơ thì phương pháp xử lý sinh học sẽ có

hiệu quả hơn, thân thiện với môi trường hơn, có nhiều ưu điểm cả về hiệu quả kinh

tế và kỹ thuật . Trong các nghiên cứu xử lý nước thải thì việc dùng biện pháp sinh

học đang là ưu tiên hàng đầu. Viê ̣c phân hủ y chất hữu cơ dựa trên các vi sinh vâ ̣t tự nhiên có sẵn trong nướ c thải còn gă ̣p nhiều ha ̣n ch ế như thời gian phân hủy lâu, quá trình phân hủ y chưa triê ̣t để . Do đó , cần tuyển cho ̣n những chủ ng vi sinh vật (VSV) thích hợp bổ sung vào bên cạnh những VSV có sẵn để có thế giúp cho quá trình xử

lý đạt kết quả tốt hơn [1]. Vì vậy, đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm sinh học của một số

chủng vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzym nhằm định hướng ứng dụng

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

trong xử lý nước thải hữu cơ” được thực hiện là cần thiết.

K16

3 Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

Luận văn Thạc sĩ sinh học Nguyễn Thị Hồng Hà

PHẦN I. TỔNG QUAN

1.1 . TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU XỬ LÝ NƢỚC THẢI HỮU CƠ TRÊN THẾ

GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM

1.1.1. Tình hình nghiên cứu xử lý nƣớc thải hữu cơ trên thế giới

Sự phát triển của phương pháp thứ cấp để xử lý nước thải trong những năm

đầu thế kỷ XX được cho là cải tiến đáng kể nhất đối với y tế công cộng và môi

trường trong suốt thời gian này, đó là việc phát minh ra "bùn hoạt tính" cho quy

trình xử lý nước thải. Gilbert Fowler và cộng sự tại Đại học Manchester được tiến

hành tại Trạm Thí nghiệm Lawrence ở Massachusetts liên quan đến việc sục khí

vào nước thải trong bình đã được phủ một lớp tảo. Các đồng nghiệp của Fowler,

Edward Ardern và William Lockett, những người đã triển khai nghiên cứu cùng với

Văn phòng công ty đường sông Manchester ở công trình xử lý nước thải

Davyhulme. Thí nghiệm trên được thực hiện trong một lò phản ứng bằng cách hút

ra và thu vào, việc xử lý cho hiệu quả cao hơn. Họ sục khí liên tục cho nước thải

trong khoảng một tháng và kết quả đạt được là nitrat hóa hoàn toàn các nguyên liệu

mẫu. Điều đó chỉ ra rằng bùn đã hoạt hóa các chất (một cách tương tự như than hoạt

tính) quá trình được đặt tên là bùn hoạt tính. Kết quả đã được công bố trong công

trình tại Hội thảo 1914, và lần đầu tiên một hệ thống quy mô đầy đủ với dòng chảy

liên tục được lắp đặt tại Worcester hai năm sau đó. Do hậu quả của chiến tranh thế

giới thứ nhất phương pháp xử lý mới được truyền bá nhanh chóng, đặc biệt là Hoa

Kỳ, Đan Mạch, Đức và Canada [26]. Vào cuối những năm 1930, việc xử lý nước

thải bằng bùn hoạt tính là quá trình chủ yếu được sử dụng trên toàn thế giới. Trong

bùn hoạt tính có nhiều chi vi sinh vật khác nhau : Actinomyces, Arthrobacer,

Bacillus, Bacterium, Corynebacterium, Desulfotomacillium, Micrococcus,

Pseudomonas, Sarcina … Chúng oxy hóa rượu , axit béo, paraffin, hydrocacbon và

các hợp chất khác.

Ở Mỹ, hàm lượng nitơ trong nước thải thường dao động trong khoảng 20 ÷

85 mg/l trong đó nitơ ở dạng hợp chất hữu cơ trung bình từ 8 ÷ 35 mg/l, hàm lượng

NH3 từ 12 ÷ 50 mg/l. Hàm lượng photphat trong nguồn nước không ô nhiễm nhỏ

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

hơn 0,01 mg/l. Theo quy định của Hà Lan, tiêu chuẩn của Việt Nam, hàm lượng

K16

4 Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

Luận văn Thạc sĩ sinh học Nguyễn Thị Hồng Hà photphate trong nước uống không được vượt quá 6 mg/l. Theo tiêu chuẩn của cộng

đồng chung châu Âu, trong nước sinh hoạt, hàm lượng photphat không được vượt

quá 2,18 mg/l [4].

Xử lý nước thải của quá trình chế biến rau quả các nhà khoa học Thái Lan đã

sử dụng chủng nấm men Candida utilis CBS1517 có khả năng đồng hóa tốt các loại

đường và axit hữu cơ có nhiều trong thành phần nước thải, kết quả thu được cho

thấy sau 96 giờ xử lý trong điều kiện phòng thí nghiệm là COD giảm 89,9 % và pH

tăng từ 3,5 lên 8,5 [36]. Mô ̣t số kết quả nghiên cứ u xử lý nướ c thải chăn nuôi lơ ̣n bằng quá trình SBR hoă ̣c tương tự đươ ̣c tổng hơ ̣p : Trong nghiên cứu của Bortone G. (1992) hiệu quả xử lý COD và T-N của quá trình SBR cấp nước một lần đạt khá

cao, tương ứng là khoảng 93 % và 88 ÷ 93 %. Tải trọng COD và T-N cũng đạt cao lần lượt là 0,37 kg/(m3.ngày) và 0,13 kg/(m3.ngày) [28]. Nghiên cứu của Chang

Won Kim (2000) hiệu quả xử lý COD ở chế độ cấp nước một lần đạt 57 ÷ 87 %. Tải trọng COD và T-N lần lượt là 1,0 kg/(m3.ngày) và 0,2 kg/(m3.ngày) [29]. Quá trình

sục khí luân phiên cấp nước liên tục trong nghiên c ứu của Jiang Cheng (2011) cho

hiệu quả xử lý khá cao, của COD là 57 %, T-N là 91 % [31]. Nghiên cứu của

Mohammad N. (2011) với quá trình SBR cấp nước một lần cho hiệu quả xử lý COD

và T-N lần lượt là 80,3 % và 61 % [34]. Trong nghiên cứu của Zang và đồng tác giả

(2006) cho hiệu quả xử lý cao hơn cả, đối với cả COD và T-N tương ứng là 96,3 % và 97,5 %; tải trọng COD và T-N cũng đạt rất cao lần lượt là 2,1 kg/(m3.ngày) và 0,28 kg/(m3.ngày), nước thải trong nghiên cứu này có COD và tỉ lệ COD/T-N rất

cao và các tác giả đã đưa thêm các giai đoạn kỵ khí vào trước và giữa các giai đoạn

thiếu khí/hiếu khí, do đó đã nâng cao được tải trọng xử lý COD. Mặt khác, các tác

giả đã thực nghiệm ở thời gian lưu tương đối lớn, tỉ lệ COD/T-N và tỉ lệ lưu nước

(n=9) rất cao, vì vậy cũng đã nâng cao được hiệu suất xử lý T-N [38].

1.1.2. Tình hình nghiên cứu xử lý nƣớc thải hữu cơ ở Việt Nam

Xử lý nước thải hiện nay luôn là vấn đề thời sự nóng bỏng và nổi cộm ở Việt

Nam hiện nay, theo dự báo của Tổ chức Kinh tế thế giới thì Việt Nam sẽ là một

trong những nước có tốc độ phát triển kinh tế vào loại nhanh trên thế giới với tốc độ

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

tăng trưởng được dự báo là 7 % trong thập kỷ tới. Tuy nhiên, việc tăng trưởng kinh

K16

5 Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

Luận văn Thạc sĩ sinh học Nguyễn Thị Hồng Hà tế một cách nhanh chóng và mạnh mẽ cũng đồng thời tạo nên những thách thức áp

lực tác động về mặt môi trường, trong đó, tác động của chất thải rắn và nước thải

đang là vấn đề nổi cộm ở Việt Nam.

Hiện nay, ô nhiễm môi trường là vấn đề đang được quan tâm không chỉ ở

Việt Nam mà còn ở nhiều quốc gia trên thế giới. Theo báo cáo môi trường Quốc gia

năm 2010 của Bộ Tài Nguyên và Môi Trường, từ năm 2007 đến năm 2009, ô nhiễm

môi trường nước mặt ở tất cả các chỉ số đều vượt quá tiêu chuẩn cho phép theo

QCVN 40:2011/BTNMT. Các chỉ số COD, BOD đều vượt quá tiêu chuẩn từ 5 ÷ 10 + trong môi trường nước mặt của sông Nhuệ, sông Đáy và sông lần. Hàm lượng NH4

Cầu đều vượt quy chuẩn cho phép QCVN 40:2011/BTNMT cho nước mặt phù hợp

với việc bảo tồn động thực vật thủy sinh là là 0,2 mg/l [17].

Nước thải chăn nuôi là một trong những nguyên nhân gây ô nhiễm nguồn

nước. Hàm lượng nitơ tổng số nước thải chăn nuôi nằm trong khoảng từ 512 ÷ 594

mg/l, trong đó NH3 từ 304 ÷ 471 mg/l, hàm lượng photpho tổng số từ 13,8 ÷ 62

mg/l [6]. Ngày nay, cùng với sự phát triển của dân số, rác thải sinh hoạt ngày một

gia tăng, nước rỉ rác từ các hố chôn lấp tại khu xử lý rác thải gây ảnh hưởng rất lớn

đến đời sống của người dân xung quanh, gây ô nhiễm nguồn nước mặt và nước

ngầm quanh khu vực. Tổng hàm lượng nitơ trong nước thải rỉ rác dao động trong

khoảng từ 200 ÷ 2000 mg/l, hàm lượng amoni cao, trung bình 200 mg/l, trong khi

đó tiêu chuẩn cho phép là 0,2 mg/l [11].

Với xu hướng hội nhập nền kinh tế quốc tế, đặc biệt từ khi Việt Nam gia

nhập WTO, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của quá trình công nghiệp hoá đất

nước, chất thải công nghiệp cũng đang ngày một gia tăng về khối lượng, đa dạng về

chủng loại và đang là vấn đề cấp bách của xã hội, đòi hỏi phải có nhận thức đúng

đắn và đầu tư thích đáng cho vấn đề xử lý nước thải. Hiện nay công nghệ xử lý

nước thải bị ô nhiễm các hợp chất hữu cơ trên thế giới và Việt Nam chủ yếu là sử

dụng các biện pháp sinh học, trong đó phương pháp xử lý hiếu khí và xử lý kị khí là

phổ biến nhất, với nguồn nước thải có mức độ ô nhiễm cao thông thường người ta

xử lý kết hợp kị khí và hiếu khí. Kết quả nghiên cứu của Vũ Thúy Nga và các cộng

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

sự cho thấy có thể cải thiện chất lượng nước thải chế biến tinh bột sắn bằng chế

K16

6 Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

Luận văn Thạc sĩ sinh học Nguyễn Thị Hồng Hà phẩm vi sinh vật. Để nhằm khắc phục tình trạng ô nhiễm do nước thải chế biến tinh

bột sắn, công trình nghiên cứu tập trung tuyển chọn bộ giống vi sinh vật có hoạt

tính sinh học cao, sản xuất và ứng dụng chế phẩm vi sinh vật để nâng cao hiệu quả

xử lý nước thải sau biogas của nhà máy chế biến tinh bột sắn. Kết quả nghiên cứu

đã tuyển chọn được 3 chủng vi sinh vật gồm Bacillus velezensis, Streptomyces

fradiae và Nitromonas sp. có khả năng chuyển hóa tốt hợp chất hữu cơ trong nước

thải chế biến tinh bột sắn [15]. Nghiên cứu về ứng dụng vi khuẩn tích lũy poly-

photphat trong xử lý nước thải của Lê Quang Khôi và các cộng sự cho thấy các

dòng vi khuẩn tích lũy poly-P được tuyển chọn có hiệu suất loại bỏ photphat hòa tan

sp.TGT025L có hiệu quả loại bỏ PO4

cao. Hai dòng vi khuẩn Acinetobacter radioresistens TGT013L và Kurthia 3- cao nhất trong môi trường tổng hợp sau 25 3- được thực hiện bởi hoạt động của gen ppk 1 dạng giờ thí nghiệm. Sự loại bỏ PO4

IIA trong quá trình chuyển hóa photphat thành dạng poly-P tích lũy trong tế bào.

Kết quả nghiên cứu mang lại nhiều triển vọng ứng dụng 2 dòng vi khuẩn tích lũy

poly-P trên để xử lý photpho hòa tan trong nước thải chăn nuôi [14].

Với mục đích nghiên cứu phát triển công nghệ xử lý hiệu quả đồng thời hữu

cơ và chất dinh dưỡng trong nước thải ngành chăn nuôi lợn, trong nghiên cứu của

Phạm Thị Hải Thịnh và đồng tác giả, đã nghiên cứu ảnh hưởng của một số điều

kiện vận hành như tỷ lệ COD/T-N (tỉ lệ giữa nhu cầu oxy hóa học và tổng nitơ) và

chế độ sục khí đến hiệu quả xử lý COD và T-N của quá trình SBR đối với nước

thải chăn nuôi đã qua xử lý kị khí. Với chế độ hai chu trình thiếu - hiếu khí thích

hợp, hiệu quả xử lý COD và T-N đạt khá cao, tương ứng là khoảng 90 % và 80 ÷

85 % [12]. Tuy nhiên nồng độ T-N trong nước thải chăn nuôi lợn là rất cao và thay

đổi trong khoảng khá rộng, vì vậy nghiên cứu nâng cao hiệu quả xử lý nitơ của quá

trình nhằm đáp ứng một cách ổn định các quy chuẩn xả thải là rất cần thiết. Theo

Phan Đỗ Hùng và cộng sự cho thấy ảnh hưởng của tỉ lệ cấp nước thải đến hiệu quả

xử lý của quá trình SBR hai chu trình thiếu - hiếu khí cấp nước hai lần và so sánh

với chế độ cấp nước một lần. Với quá trình SBR hai chu trình thiếu-hiếu khí, cấp

nước hai lần là một giải pháp để nâng cao hiệu quả xử lý T-N của quá trình. Thực

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

nghiệm cho thấy, khi tăng tỉ lệ cấp nước (tỉ lệ giữa lượng nước thải cấp lần thứ nhất

K16

7 Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

Luận văn Thạc sĩ sinh học Nguyễn Thị Hồng Hà và tổng lượng nước thải xử lý trong một mẻ), lúc đầu hiệu suất xử lý T-N sẽ tăng,

tuy nhiên đến một giới hạn nhất định hiệu suất xử lý T-N sẽ giảm trở lại. Hiệu suất

xử lý T-N ở cả ba tỉ lệ cấp nước nghiên cứu đều khá cao, trong đó ở tỉ lệ 2/3 đạt cao

nhất, trong khoảng 85 ÷ 90 %. Hiệu suất xử lý T-N thực nghiệm ở các tỉ lệ cấp

nước thấp 1/2 và 2/3 khá phù hợp với hiệu suất lý thuyết. Hiệu suất xử lý COD ở

chế độ cấp nước hai lần cũng khá cao, 85 ÷ 90 % ở tỉ lệ cấp nước 2/3, xấp xỉ với

trường hợp cấp nước một lần [5].

1.2. THÀNH PHẦN CƠ BẢN CỦA NƢỚC THẢI HỮU CƠ

1.2.1. Xenluloza trong nƣớc thải

Trong nước thải hữu cơ hàm lượng chiếm xenluloza là thành phần chủ yếu

của các tổ chức thực vật. Trong xác thực vật (nhất là trong thân và rễ) thành phần

hữu cơ chiếm tỷ lệ cao nhất bao giờ cũng là xenluloza. Hàm lượng xenluloza trong

thực vật thường thay đổi trong khoảng 30 ÷ 80 % (tính theo trọng lượng khô), trong

sợi bông hàm lượng này thường vượt trên 90 % [30].

Xenluloza là polysaccarit rất bền vững, được cấu tạo bởi rất nhiều gốc

anhydroglucoza, liên kết với nhau nhờ dây nối β-1,4-glucozit. Mỗi phân tử

xenluloza thường chứa từ 1.400 đến 10.000 gốc glucoza. Khối lượng phân tử

xenluloza rất khác nhau phụ thuộc vào từng loại thực vật (ở bông 150.000 ÷

1.000.000, ở sợi gai lên tới 1.840.000). Trên mỗi chuỗi glucan đơn vị lặp lại không

phải là glucoza mà là xenlobioza. Mỗi phân tử glucoza có dạng “ghế bành”, phân tử này quay 180o so với phân tử và vị trí β của các nhóm hydroxyl đều ở mặt phẳng

nằm ngang của phân tử.

Xenluloza có cấu trúc lớp sợi song song, các phân tử và các chuỗi xenluloza

gắn với nhau nhờ mạng lưới liên kết hydro, còn các lớp gắn với nhau nhờ lực Van-

der-Van. Trong tự nhiên, các chuỗi glucan của xenluloza có cấu trúc dạng sợi, đơn

vị sợi nhỏ nhất có đường kính khoảng 3 nm. Các sợi sơ cấp hợp lại thành vi sợi có

đường kính từ 10 ÷ 40 nm, những vi sợi này hợp thành bó sợi to có thể quan sát

dưới kính hiển vi quang học. Toàn bộ lớp sợi này có một lớp vỏ hemixenluloza và

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

lignin rắn chắc bao bọc bên ngoài. Phân tử xenluloza có cấu trúc không đồng nhất

K16

8 Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

Luận văn Thạc sĩ sinh học Nguyễn Thị Hồng Hà gồm hai vùng: Vùng kết tinh có trật tự cao, rất bền vững và vùng vô định hình kém

trật tự và bền vững hơn. Vùng vô định hình có thể hấp thụ nước và trương lên, còn

vùng kết tinh mạng lưới liên kết hydrogen ngăn cản sự trương này. Xenluloza có

cấu trúc đặc, bền chắc cùng với sự có mặt của lớp vỏ hemixenlulo-lignin khiến cho

sự xâm nhập của enzym vào cấu trúc hết sức khó khăn và làm tăng tính kỵ nước của

chuỗi β-1-4-glucan, làm cản trở tốc độ của phản ứng thủy phân.

Xenluloza là hợp chất cacbon chiếm tỷ lệ trọng lớn nhất (50 %) trong tổng số

hydratcacbon tự nhiên và là thành phần hữu cơ chủ yếu của rác, trong giấy, gỗ, thân

cây, cành cây, lá cây, rơm rạ, sợi đay, vải bông, vv…

Mầu nâu - cacbon, màu đỏ - oxy, màu trắng - hydro

Hình 1.1. Hình ảnh hợp chất cao phân tử xenluloza [30]

Xenluloza có cấu trúc rất bền vững. Không tan trong nước, không bị tiêu hóa

trong đường tiêu hóa của người và động vật. Trong dạ dày của động vật nhai lại và

trong đất có nhiều vi sinh vật có khả năng phân giải được xenluloza.

1.2.2. Hemixenluloza trong nƣớc thải

Trong tế bào thực vật hemixenluloza đứng thứ hai về khối lượng. Trong

thành phần của hemixenluloza có nhiều loại đường khác nhau, chính vì vậy tên của

chúng thường được gọi theo tên của một loại đường chủ yếu nào đó có trong thành

phần của chúng. Khối lượng phân tử của hemixenluloza nhỏ hơn rất nhiều so với

xenluloza, thường chúng chỉ có khoảng 150 gốc đường. Các gốc đường đơn này

được nối với nhau bằng các liên kết β-1-4, β-1-3, β-1-6 glucozit. Các hemixenluloza

thường tạo mạch ngắn và phân nhánh, so với xenlulo thì hemixenluloza có cấu trúc

không chặt chẽ dễ bị phân giải bởi axit yếu và kiềm yếu, đôi khi còn bị phân giải

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

trong nước nóng [30].

K16

9 Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

Luận văn Thạc sĩ sinh học Nguyễn Thị Hồng Hà 1.2.3. Protein trong nƣớc thải

Protein là hợp chất cao phân tử chứa nitơ (15 ÷ 17 % tính theo trọng lượng

khô). Protein là thành phần quan trọng của cơ thể động, thực vật. Sự phân giải

protein trải qua các quá trình thuỷ phân protein thành các polypeptit, sau đó là các

axit amin, tiếp theo là các quá trình amon hoá, nitrat hoá và phản nitrat hoá. Quá

trình amon hoá là quá trình chuyển hoá các hợp chất nitơ hữu cơ thành nitơ dạng

khoáng. Quá trình nitrat hoá là quá trình chuyển hoá các chất ammoniac ban đầu

thành axit nitơ sau đó thành axit nitric. Quá trình khử nitrat thành nitơ gọi là phản

nitrat hoá[ 16].

1.2.4. Tinh bột trong nƣớc thải

Tinh bột là một cacbonhyđrat cao phân tử bao gồm các đơn vị D-glucoza nối

với nhau bởi liên kết α-glucozit. Công thức phân tử gần đúng là (C6H10O5)n trong

đó n có giá trị từ vài trăm đến khoảng mười nghìn. Tinh bột có dạng hạt màu trắng

tạo bởi hai loại polyme là amiloza và amilopectin. Amiloza là polime mạch thẳng

gồm các đơn vị D-glucoza liên kết với nhau bởi liên kết α-1,4-glucozit. Amilopectin

là polime mạch nhánh, ngoài chuỗi glucoza thông thường còn có những chuỗi

nhánh liên kết với chuỗi chính bằng liên kết α-1,6-glucozit.

Trong tự nhiên, tinh bột là thành phần chủ yếu của các loại ngũ cốc, củ, quả.

Hàm lượng tinh bột có trong hạt và củ là 40  70 %, trong các phần khác của cây là

4  25 %. Chúng đóng vai trò là nguồn dự trữ năng lượng cho quá trình nảy mầm

của hạt, và là nguồn lương thực chủ yếu của con người. Enzym thủy phân tinh bột

phân hủy chủ yếu liên kết α-glucozit. Nhóm enzym này gồm các enzym: α-amylaza,

β-amylaza, glucoamylaza, dextrinaza [16].

1.2.5. Một số vi sinh vật gây bệnh khác trong nƣớc thải

Các vi sinh vật gây bệnh chủ yếu trong nước thải: Salmonella spp., một vài

loài Salmonella có thể hiện hiện trong nước thải đô thị, kể cả S. typhi (gây bệnh

thương hàn). Doran và cộng sự cho rằng số lượng 700 Salmonella/l; khoảng chừng

đó Shigellae và khoảng 1.000 Vibrio cholera/l thường phát hiện trong nước thải đô

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

thị của khu vực nhiệt đới. Shigellae và Vibrio cholera nhanh chóng chết đi khi thải

K16

10 Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

Luận văn Thạc sĩ sinh học Nguyễn Thị Hồng Hà ra môi trường. Do đó nếu chúng ta sử dụng một biện pháp xử lý nào đó để loại

được Salmonella thì cũng có thể bảo đảm là phần lớn các vi khuẩn kia đã bị tiêu

diệt. Enteroviruses: Có thể gây các bệnh nguy hiểm như sởi, viêm màng não. Số

lượng của chúng tương đối thấp hơn enteroviruses. Người ta đã chứng minh được

rằng việc loại bỏ các loài vi rút có quan hệ mật thiết với việc loại bỏ các chất rắn lơ

lửng. Ngoài vi sinh vật gây bệnh còn có một số ký sinh trùng: thường thì các bệnh

ký sinh trùng chủ yếu là do Ascaris lumbricoides, trứng của loài ký sinh trùng này

có kích thước lớn (45  70 m  35  50 m).

1.3. VI SINH VẬT PHÂN GIẢI NƢỚC THẢI HỮU CƠ

1.3.1. Vi sinh vật phân giải xenluloza

Xenlulaza đươ ̣c thu từ nhiều nguồn nguyên liê ̣u khác nhau như đô ̣ng vâ ̣t (các

nhóm thân mềm, lơ ̣n, bò, gà); thực vâ ̣t (trong ha ̣t ngũ cốc nảy mầm là đa ̣i ma ̣ch , yến

mạch, lúa mì, mạch đen) và vi sinh vật (nấm sơ ̣i, nấm men, xạ khuẩn và vi khuẩn ).

nuôi

Tuy nhiên, vi sinh vâ ̣t là nguồn thu enzym chủ yếu vì thời gian sống ngắn nên thu đươ ̣c nhiều lần trong năm và chủ đô ̣ng sử du ̣ng nguồn nguyên liê ̣u rẻ tiền để cũng như dễ dàng điều khiể n có đi ̣nh hướ ng nguồn enzym hoă ̣c gia tăng lươ ̣ng

enzym. Có rất nhiều chủng vi khuẩn , xạ khuẩn, nấm mốc và mô ̣t số loài nấm men

có khả năng sinh tổng hợp xenlulaza.

Các loài vi khuẩn cả hiếu khí lẫn ki ̣ khí đều có khả năng sinh xenlulaza như licheniformis, Bacillus pumilis, Acidothermus subtilis, Bacillus Bacillus

cellulobuticus. Ngoài ra còn có các loài ưa kiềm như Cephalosporium sp.RYM-202

[9].

1.3.2. Vi sinh vật phân giải hemixenluloza

Có nhiều loại vi sinh vật có khả năng phân giải hemixenluloza. Các vi sinh

vật có khả năng phân giải xenluloza khi sản sinh ra xenlulaza thường sinh ra

hemixenlulaza. Một số loại vi sinh vật có khả năng phân giải hemixenluloza như:

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Bacillus, Aspergillus, Clostridium, Streptomyces ...

K16

11 Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

Luận văn Thạc sĩ sinh học Nguyễn Thị Hồng Hà 1.3.3. Vi sinh vật phân giải protein

Dưới tác dụng của các vi sinh vật hoại sinh, protein được phân giải thành các

hoặc NH4

-nhờ nhóm vi khuẩn nitrat hóa.

axit amin. Các axit amin này lại được một số nhóm vi sinh vật phân giải thành NH3 + gọi là nhóm vi khuẩn amin hóa. Quá trình này gọi là sự khoáng hóa chất + sẽ hữu cơ vì qua đó, nitơ hữu cơ được chuyển thành dạng nitơ khoáng. Dạng NH4

được chuyển hóa thành dạng NO3

Nhóm vi khuẩn nitrat hóa bao gồm bốn chi khác nhau: Nitrosomonas,

Nitrozocystic, Nitrozolobus và Nitrosospira, chúng đều thuộc loại dị dưỡng bắt

buộc [3].

1.3.4. Vi sinh vật phân giải tinh bột

Có nhiều loại vi khuẩn có khả năng phân hủy tinh bột, đó là vi khuẩn

Bacillus, Pseudomonas, Athrobacter, Achromobacter, Agrobacterium … Một số vi

sinh vật có khả năng tiết ra các loại enzym trong hệ enzym amylaza. Ví dụ như một

số vi nấm bao gồm một số loại trong các chi Aspergillus, Fusarium ... Xạ khuẩn

cũng có một số chỉ có khả năng phân hủy tinh bột. Đa số các vi sinh vật đều không

có khả năng tiết ra một hoặc vài enzym trong hệ đó, chúng chỉ có khả năng tiết ra

môi trường [3].

1.4. THÔNG SỐ CƠ BẢN ĐÁNH GIÁ NƢỚC BỊ Ô NHIỄM

Để đánh giá chất lượng nước cũng như mức độ ô nhiễm của nước nói chung

thì có rất nhiều các thông số. Tuy nhiên, mỗi loại nước với thành phần các chất có

trong đó mà ta chọn những thông số thích hợp nhất rồi so sánh với tiêu chuẩn cho

phép về thành phần hóa học và sinh học đối với từng loại nước sử dụng cho các

mục đích khác nhau. Các thông số cơ bản để đánh giá chất lượng nước thải hữu cơ

là: pH, độ đục, các chất rắn lơ lửng, oxy hòa tan … Đặc biệt hai chỉ số BOD và

COD có ý nghĩa rất quan trọng. Theo QCVN 40:2011/BTNMT - Quy chuẩn kỹ thuật

quốc gia về nước thải công nghiệp, một số thông số ô nhiễm trong nước thải công

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

nghiệp (bảng 1.1).

K16

12 Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

Luận văn Thạc sĩ sinh học Nguyễn Thị Hồng Hà

Bảng 1.1. Một số thông số ô nhiễm trong nước thải công nghiệp [9]

QCVN 40:2011/BTNMT Thông số Đơn vị Cột A Cột B

40 40 Nhiệt độ

- 6 ÷ 9 5,5 ÷ 9 pH

Pt-Co 50 150 Màu

mg/l 50 100 Chất rắn lơ lửng

mg/l 75 150 COD

mg/l 30 50 BOD5

mg/l 20 40 Tổng nitơ

mg/l 4 6 Tổng photpho

mg/l 5 10 NH4(N)

MPN/100ml 3000 5000 Coliform

 Màu sắc

Nước bình thường không có màu, nước trong các ao hồ có thể có màu tùy

thuộc vào các chất có mặt trong đó. Nước thải thường có màu nâu đen, đỏ hoặc đỏ

nâu. Màu sắc của nước là do các chất hữu cơ, vô cơ có mặt trong nước gây nên.

Màu sắc của nước ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm khi sử dụng nước có màu

trong sản xuất [16].

Màu của nước là do:

+ Các chất hữu cơ và phần chết của thực vật gọi là màu thực vật, màu này rất

khó xử lý được bằng phương pháp đơn giản. Ví dụ rong tảo làm nước có màu xanh.

+ Các chất vô cơ là những hạt rắn có màu gây ra, màu này có thể xử lý.

Có nhiều phương pháp xác định màu của nước, nhưng thường dùng ở đây là

phương pháp so màu với các dung dịch chuẩn là Chlophantinat coban. Cường độ

màu của nước xác định theo phương pháp so màu khi lọc bỏ các chất vẩn đục [16].

 Mùi của nước

Nước tự nhiên sạch không mùi, nước thải và nước ô nhiễm thường có mùi

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

khó chịu từ nhẹ đến hôi thối.

K16

13 Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

Luận văn Thạc sĩ sinh học Nguyễn Thị Hồng Hà

Có thể xác định mùi của nước theo phương pháp đơn giản sau: Mẫu nước

chứa trong bình có nắp đậy kín, lắc trong khoảng 10 ÷ 20 giây, sau đó mở nắp, ngửi

mùi và đánh giá: không mùi, mùi nhẹ, trung bình, nặng và rất nặng. [16]

 Độ pH

pH củ a nướ c thải có một ý nghĩa quan trọng trong quá trình xử lý . Các công

trình xử lý nước thải áp dụng các quá trình sinh học làm việc tốt khi pH nằm trong

giớ i ha ̣n từ 7 ÷ 7,6. Môi trườ ng thuâ ̣n lơ ̣i nhất để vi khuẩn phát triển l à môi trường có pH từ 7 ÷ 8. Các nhóm vi khuẩn khác nhau có giới hạn pH hoạt động khác nhau .

Ví dụ vi khuẩn nitrit phát triển thuận lợi nhất với pH từ 4,8 ÷ 8; còn vi khuẩn nitrat

vớ i pH từ 6,5 ÷ 9,3. Vi khuẩn lưu huỳnh có th ể tồn tại trong môi trường có pH từ 1 ÷ 4. Ngoài ra pH còn ảnh hưởng đến quá trình tạo bông cặn của các bể lắng bằng

cách tạo bông cặn bằng phèn nhôm [21].

Nướ c thải sinh hoa ̣t có pH từ 7,2 ÷ 7,6.

 Nhu cầu oxy sinh hóa - BOD

BOD là nhu cầu oxy sinh hóa hay nhu cầu oxy sinh học, là lượng oxy cần

thiết để oxy hóa các chất hữu cơ dễ phân hủy có trong nước bằng VSV (chủ yếu là

vi khuẩn) hoại sinh, hiếu khí [19].

Chỉ tiêu BOD là một trong những chỉ tiêu quan trọng nhất để xác định mức ô

nhiễm của nước. Nó chỉ biểu thị lượng chất hữu cơ có thể bị phân hủy bởi VSV.

Trong thực tế không thể xác định lượng oxy cần thiết để VSV oxy hóa hoàn

toàn chất hữu cơ có trong nước, mà chỉ cần xác định lượng oxy cần thiết khi ủ ở nhiệt độ 20 oC trong 5 ngày ở phòng tối để tránh quá trình quang hợp, khi đó có

khoảng 70 ÷ 80 % nhu cầu oxy được sử dụng và kết quả được biểu thị là BOD5 [19].

 Nhu cầu oxy hóa học - COD

COD là nhu cầu oxy cần thiết để oxy hóa toàn bộ chất hữu cơ và các chất

khử có trong nước thành CO2 và H2O [19].

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

 Hàm lượng các chất rắn

K16

14 Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

Luận văn Thạc sĩ sinh học Nguyễn Thị Hồng Hà

Các chất rắn có trong nước là: Các chất vô cơ là dạng các muối hòa tan hoặc

không tan như đất đá ở dạng huyền phù lơ lửng. Các chất hữu cơ như xác các vi

sinh vật, tảo, động vật nguyên sinh, động vật phù du …, các chất hữu cơ tổng hợp

như phân bón, các chất thải công nghiệp.

Chất rắn ở trong nước gồm có: Tổng chất rắn (TS) được xác định bằng trọng

lượng khô phần còn lại sau khi cho bay hơi nước trên bếp cách thủy rồi sấy khô ở 105 oC cho đến khi trọng lượng không đổi. Đơn vị tính bằng mg (hoặc g/l). Chất rắn

lơ lửng ở dạng huyền phù (SS). Hàm lượng các chất huyền phù là trọng lượng khô

của chất rắn còn lại trên giấy lọc sợi thủy tinh. Chất rắn hòa tan (DS). Hàm lượng

chất rắn hòa tan chính là hiệu số của tổng chất rắn với huyền phù: DS = TS – SS.

Đơn vị tính bằng g (hoặc mg) [22].

 Hàm luợng nitơ

+), -) và trong một số hợp chất hữu cơ khác.

Trong môi trường nước, hợp chất nitơ tồn tại chủ yếu ở dạng amoni (NH4

-), ít hơn ở dạng nitrit (NO2

nitrat (NO3

Thành phần được xem là bền đối với trường và không gây hiệu quả xấu cho môi

trường là khí nitơ (N2).

Các quá trình trong chu trình nitơ chuyển đổi nitơ từ dạng này sang dạng

khác đều được tiến hành bởi các nhóm vi sinh vật khác nhau với mục đích lấy năng

lượng hoặc để tích tụ nitơ thành một dạng cần thiết cho sự phát triển của chúng.

+ được chuyển hóa thành NO2

+ ; sau đó NH4

hóa chuyển hóa thành dạng NH4

Các dạng nitơ hữu cơ từ nguồn động thực vật sau khi chết được các vi khuẩn amoni - nhờ vi - sinh ra được nhóm sinh vật nitrat hóa chuyển hóa thành NO3; khuẩn nitrit hóa; NO2

cuối cùng nitrat được nhóm sinh vật kỵ khí chuyển thành dạng nitơ phân tử nhờ quá

trình khử nitrat.

Hiện nay, kết hợp phương pháp sinh học trong xử lý đối với cả nitơ, photpho

trong nước ô nhiễm đang là một hướng nghiên cứu mới. Trong nghiên cứu của

Jorgensen và Pauli, một số chủng vi sinh vật có khả năng tích lũy photpho cũng có

khả năng khử nitrat [18].

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

 Hàm lượng photpho

K16

15 Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

Luận văn Thạc sĩ sinh học Nguyễn Thị Hồng Hà

Các hợp chất chứa photpho trong tự nhiên thường khó phân giải [7]. Các

nguồn nước thải chăn nuôi, biogas...thường có hàm lượng photpho cao. Theo tiêu

chuẩn Việt Nam về nước thải, hàm lượng photpho trong nước thải vượt quá 6 mg/l

có thể dẫn đến hiện tượng phú dưỡng (dư thừa các chất dinh dưỡng), gây tác động

trực tiếp đến động vật, thực vật và gây ảnh hưởng đến môi trường sinh thái. Việc xử

lý nước thải giàu photpho thường khó thực hiện bằng còn đường sinh học do trong

tự nhiên số lượng loài vi sinh vật phân giải chuyển hóa photpho không nhiều. Một

số chủng vi sinh vật phân lập trong tự nhiên có khả năng tích lũy photphat cao thuộc

các chi: Acinetobacter, Aeromonas, Pseudomonas, Alcaligenes, Bacillus, … [8,9].

Kết quả nghiên cứu của Bao và cộng sự về khả năng thu nhận tích lũy photpho của

các chi vi khuẩn cho thấy sau 20 giờ vi khuẩn thuộc chi Pseudomonas có khả năng

thu nhận 14,34 mg/l khi tiến hành ở điều kiện yếm khí, chi Enterobacteriaceae có

khả năng thu nhận 8,91 mg/l, chi Alcaligenes là 6,43 mg/l, Staphylococcus là 6,23

mg/l, Bacillus là 4,41 mg/l ở điều kiện hiếu khí [8]. Sự tích lũy photphat cung cấp

nguồn năng lượng cho vi sinh vật phát triển. Trong cơ thể vi sinh vật, photpho tích

lũy ở dạng chủ yếu là photphat. Photphat chiếm đến 12 % trọng lượng tế bào đối

với vi khuẩn có hoạt tính tích lũy photphat, trong khi ở vi khuẩn không tích lũy

photphat chỉ có khoảng 1 ÷ 3 %. Xử lý nước thải có chứa các hợp chất photpho

bằng phương pháp sinh học dựa trên khả năng của một số nhóm vi sinh vật tích lũy

lượng photpho nhiều hơn mức cơ thể chúng cần trong điều kiện hiếu khí. Thông

thường hàm lượng photpho trong vi sinh vật chiếm từ 1,5 ÷ 2,5 % khối lượng tế bào

khô, một số loài có khả năng hấp thu cao hơn, từ 6 ÷ 8 % [3], [14].

Nghiên cứu Van Bethum và cộng sự, cho thấy photpho trong cơ thể vi sinh vật

được tích lũy dưới dạng chủ yếu là photphat. Trong cơ thể của chúng, photphat có

thể chiếm đến 12 % trọng lượng tế bào đối với vi khuẩn có tích lũy polyphotphat,

và với vi khuẩn không tích lũy polyphotphat, chỉ chiếm khoảng 1÷ 3 % trọng lượng

tế bào [3].

 Chỉ số vệ sinh (E. coli)

Nước làm lan truyền các nguồn bệnh và trong thực tế các bệnh lây lan qua

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

môi trường nước là nguyên nhân chính gây ra nhiều loại bệnh có thể dẫn đến tử

K16

16 Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

Luận văn Thạc sĩ sinh học Nguyễn Thị Hồng Hà vong, nhất là ở các nước đang phát triển. Các tác nhân gây bệnh thường được bài

tiết ra trong phân của người và động vật bị bệnh, bao gồm các nhóm chính sau: Các

vi khuẩn, virus, động vật đơn bào, giun kí sinh. Chất lượng về mặt vi sinh của nước

thường được sử dụng rộng rãi nhất là chỉ số E. coli [20].

1.5. CÁC YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG ĐẾN SƢ̣ SINH TRƢỞ NG CỦ A VI SINH

VẬT TRONG QUÁ TRÌNH XƢ̉ LÝ NƢỚ C THẢ I

1.5.1. Ảnh hƣở ng củ a nƣớ c và nồng đô ̣ cá c chấ t dinh dƣỡng

Nướ c đóng vai trò rất quan tro ̣ng trong hoa ̣t đô ̣ng sống củ a vi sinh vâ ̣t . Nướ c thẩm thấu qua hòa tan các chất dinh dưỡng nhờ đó mà chất dinh dưỡng dễ dàng

màng tế bào để cho vi sinh vật sử dụng . Nồng đô ̣ các chất dinh dưỡng trong nướ c

thải phải phù hợp với đặc điểm sinh lý của tế bào . Nồng đô ̣ các chất dinh dưỡng cao

. Tỉ

. Mỗi quá mức giới hạn tế bào sẽ mất nước, nguyên sinh chất trong tế bào bi ̣ keo tu ̣ la ̣i làm hoạt động trao đổi chất bị ngưng trệ . Ngươ ̣c la ̣i, trong nướ c cất tế bào bi ̣ trương lên do xảy ra hiê ̣n tươ ̣ng thẩm thấu củ a nướ c qua màng tế bào làm cho tế bào bi ̣ vỡ lê ̣ các chất dinh dưỡng có ảnh hưở ng lớ n đến hoa ̣t đô ̣ng sống củ a vi sinh vâ ̣t

loài vi sinh vật cũng có nhu cầu khác nhau về tỷ lệ các chất dinh dưỡ ng. Tỷ lệ C : N

: P phổ biến cho nhiều loài là 100 : 10 : 1.

1.5.2. Ảnh hƣởng của nhiê ̣t đô ̣

Mỗi loa ̣i vi sinh vâ ̣t có đô ̣ giớ i ha ̣n nhiê ̣t đô ̣ sinh trưởng thích hợp khác nhau. Đối với mỗi loại vi sinh vật có các giới hạn nhiệt độ sinh trưởng tối thiểu, nhiê ̣t đô ̣

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

phát triển tối đa và nhiệt độ sinh trưởng thích hợp. Phần lớ n vi khuẩn có nhiệt độ sinh trưởng thích hợp 30 ÷ 37 oC, có nhiều loài vi khuẩn có nhiệt độ sinh trưởng thấp 10 ÷ 20 oC (vi sinh vâ ̣t ưa la ̣nh ) và có nhiều loài nhiệt độ sinh trưởng khá cao 50 ÷ 60 oC (vi sinh vâ ̣t ưa nhiê ̣t ). Trong xử lý nướ c thải hầu như viê ̣c điều chỉnh nhiê ̣t đô ̣ không thể thực hiê ̣n đươ ̣c mà thườ ng xử lý ở nhiê ̣t đô ̣ tự nhiên củ a môi trườ ng. Vì vậy, ngườ i ta thườ ng cho ̣n các loa ̣i vi sinh vâ ̣t có sẵn trong tự nhiên củ a khu vực để chú ng có khả năng thích nghi vớ i nhiê ̣t đô ̣ môi trườ ng tự nhiên [27].

K16

17 Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

Luận văn Thạc sĩ sinh học Nguyễn Thị Hồng Hà 1.5.3. Ảnh hƣởng của pH môi trƣờng

Cũng tương tự như nhiệt độ , pH môi trường ban đầu cũng là yếu tố ảnh

hưở ng lớ n đến tốc đô ̣ sinh trưở ng củ a vi sinh vâ ̣t . Phần lớ n cá c vi sinh vâ ̣t có pH

sinh trưởng tối ưu từ 5,5 ÷ 7,5 có một số loài sinh trưởng tối ưu ở pH thấp (< 4,5) và mô ̣t số loài sinh trưởng tối ưu ở pH kiềm . Ở pH không thích hơ ̣p hê ̣ enzym của vi sinh vâ ̣t hoa ̣t đô ̣ng yếu hoă ̣c bi ̣ bất hoa ̣t do đó ảnh hưở ng trực tiếp đến quá trình trao đổi chất củ a vi sinh vâ ̣t . Để vi sinh vâ ̣t sinh trưở ng tốt cần duy trì pH thích hơ ̣p

trong suốt thờ i gian nuôi cấy.

1.5.4. Ảnh hƣởng của oxy hòa tan

Mối quan hê ̣ củ a vi sinh vâ ̣t đối vớ i o xy rất khác nhau . Vi sinh vâ ̣t hiếu khí . Nhóm vi

cần oxy để sinh trưở ng . Vi sinh vâ ̣t yếm khí oxy la ̣i là tác nhân gây đô ̣c sinh vâ ̣t trung gian giữa hai nhóm này là nhóm hiếu khí tù y tiê ̣n .

Trong xử lý nướ c thải ở các bể a eroten cần cung cấp đủ oxy để vi sinh vâ ̣t . Còn xử lý yếm khí thì tiến

hiếu khí oxy hóa các chất hữu cơ có trong nướ c thải hành trong các bể kín để oxy không tan được vào trong nước thải gây ức ch ế các vi

sinh vâ ̣t yếm khí [23].

1.6. CÁC PHƢƠNG PHÁP XỬ LÝ NƢỚC THẢI GIÀU HỮU CƠ

Có nhiều biện pháp xử lý nước thải: Xử lý cơ học, xử lý hóa học, xử lý sinh

học, xử lý cơ-lý-hóa, và xử lý nhờ kết hợp các biện pháp sinh học và cơ-lý-hóa.

Trong các phương pháp trên thì phương pháp xử lý sinh học được sử dụng

nhiều với hiệu quả cao, đặc biệt là đối với nước thải chứa nhiều chất hữu cơ dễ bị

phân hủy, nhưng không mang hiệu quả đối với nước thải công nghiệp có chứa các

chất vô cơ độc hại (kim loại nặng, axit, kiềm) hoặc các chất hữu cơ bền vững (các

clobenzen, phenol …) và ít hiệu quả đối với một số loại vi khuẩn gây bệnh. Trong

các trường hợp này phải kết hợp phương pháp xử lý sinh học với các phương pháp

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

xử lý cơ-lý-hóa [29].

K16

18 Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

Luận văn Thạc sĩ sinh học Nguyễn Thị Hồng Hà 1.6.1. Phƣơng pháp xử lý cơ học

Phương pháp cơ học thường sử dụng ở giai đoạn xử lý sơ bộ, dùng để loại

các vật rắn có kích thước lớn và các tạp chất rắn không tan trong nước. Các chất này

có thể ở dạng vô cơ hoặc hữu cơ. Các phương pháp xử lý cơ học thường dùng: lọc

qua song chắn hoặc lưới, lắng, lọc qua lớp cát và quay ly tâm.

1.6.2. Phƣơng pháp xử lý hóa học

Phương pháp hóa học dựa trên cơ sở là các phản ứng hóa học, các quá trình

hóa lý diễn ra giữa chất ô nhiễm với các hóa chất bổ sung vào. Các phản ứng xảy ra

có thể là phản ứng oxy hóa khử, các phản ứng tạo chất kết tủa hoặc các phản ứng

phân hủy. Do vậy, có 3 phương pháp xử lý hóa học thường được sử dụng đó là:

Phương pháp trung hòa, phương pháp oxy hóa-khử, phương pháp điện hóa học.

1.6.3. Phƣơng pháp xử lý sinh học

Phương pháp phổ biến và kinh tế nhất để xử lý nước thải giàu chất hữu cơ là

phương pháp sinh học. Phương pháp này dựa trên cơ sở sử dụng hoạt động của các

vi sinh vật để phân hủy các chất hữu cơ gây ô nhiễm trong nước thải.

Các vi sinh vật sử dụng các chất hữu cơ và một số khoáng chất làm nguồn

dinh dưỡng và tạo năng lượng. Trong quá trình phát triển, chúng nhận các chất dinh

dưỡng để xây dựng tế bào, sinh trưởng và sinh sản nên sinh khối của chúng được

tăng lên. Quá trình phân hủy các chất hữu cơ nhờ vi sinh vật gọi là quá trình oxy

hóa sinh hóa [8].

Nước thải có thể xử lý bằng phương pháp sinh học sẽ được đặc trưng bởi chỉ

tiêu COD hoặc BOD. Để có thể xử lý bằng phương pháp này, nước thải cần không

chứa các chất độc và tạp chất, các muối kim loại nặng hoặc nồng độ của chúng

không được vượt quá nồng độ cực đại cho phép, đồng thời thỏa mãn: BOD/COD ≥

0,5.

1.7. TIÊU CHÍ TUYỂN CHỌN VI SINH VẬT XỬ LÝ NƢỚC THẢI HỮU CƠ

Xử lý nướ c thải bằng phương pháp sinh ho ̣c chủ yếu dựa vào hoa ̣t đô ̣ng sống

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

của các vi sinh vật dị dưỡng có khả năng phâ n giải chất hữu cơ . Các vi sinh vật dị

K16

19 Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

Luận văn Thạc sĩ sinh học Nguyễn Thị Hồng Hà dưỡng có t hể chia thành ba nhóm nhỏ : Vi sinh vâ ̣t hiếu khí , vi sinh vâ ̣t yếm khí và vi sinh vâ ̣t tù y nghi . Khu hê ̣ vi sinh vâ ̣t sử du ̣ng trong quá trình xử lý nướ c thải gồm vi khuẩn, nấm men, nấm mốc, xạ khuẩn ... Trong đó , vi khuẩn chiếm số lươ ̣ng lớ n nhất. Trong các bể xử lý sinh ho ̣c , vi khuẩn đóng vai trò quan tro ̣ng hàng đầu vì nó chịu trách nhiệm phân hủy các thành phần hữu cơ trong nước thải . Do vâ ̣y, bên cạnh

viê ̣c lơ ̣i dụng những tính năng ưu viê ̣t của các loài vi sinh vâ ̣t thì chúng ta cần phải

lựa chọn những chủng vi sinh vâ ̣t thích hơ ̣p vừ a có khả năng làm sạch, vừ a tạo đô ̣

kết lắng tốt vừ a không gây đô ̣c hại cho môi trườ ng. Các tiêu chí đươ ̣c xét: Có hoạt

tính sinh học cao: Có phức hệ enzym phân giải hữu cơ cao, ổn định. Sinh trưởng tốt

trong điều kiện thực tế của nước thải hữu cơ, cạnh tranh được với vi sinh vật có sẵn

trong nước thải. Nuôi cấy dễ dàng, sinh trưởng tốt trong môi trường tự nhiên, thuận

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

lợi cho quá trình nhân giống thu sinh khối.

K16

20 Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

Luận văn Thạc sĩ sinh học Nguyễn Thị Hồng Hà

PHẦN II. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP

2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu

Các chủng được tuyển chọn: Vi khuẩn NT01, NT03 và NT05 được lưu giữ

trong Bộ sưu tập giống Phòng Công nghệ vật liệu sinh học, Viện Công nghệ sinh

học thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Nước thải sau hầm biogas tại hộ gia đình ông Bùi Vinh Nghê, xóm Văn

Miếu, thôn Đại Phùng, xã Đan Phượng, huyện Đan Phượng, thành phố Hà Nội.

2.1.2. Thiết bị và hóa chất

2.1.2.1. Thiết bị chính

Kính hiển vi quang học Olympius, Model CHD (Nhật Bản); máy đo pH,

Metter Toledo (Thụy Sỹ); cân điện tử AB 204, Metter Toledo (Thụy Sỹ); máy lắc

ổn nhiệt (Hàn Quốc); các loại pipetman Gilson, Biohit; nồi khử trùng ướt (Trung

Quốc); tủ sấy khô (Sellab - Mỹ); tủ lạnh, Hàn Quốc; máy đo OD; lò vi sóng; ống

đong: 100 ml, 500 ml, 1.000 ml; cốc đong: 100 ml, 200 ml, 1.000 ml, 2.000 ml;

máy sục khí; các dụng cụ khác …

2.1.2. Thiết bị và hóa chất

Cao thịt (Merck- Đức); cao nấm men (Merck - Đức); pepton (Merck - Đức);

thạch (Merck- Đức); bột xenlulo (Nhật); CMC; tinh bột tan, các loại đường: D-

glucoza, saccaroza, D-fructoza, …(Merck- Đức); các hóa chất vô cơ khác: NaCl,

KH2PO4, MgSO4.7H2O, KNO3 …

+ Bộ Kit chuẩn hóa sinh 50 API CHB

+ Bộ kit TOPO TA Cloningđ bao gồm các thành phần cần thiết cho quá trình tách dòng: Vectơ pCRđ2.1-TOPOđ, enzym, tế bào khả biến chủng TOP 10, và dung

dịch đệm cho từng loại enzym.

+ Để tinh sạch vectơ tái tổ hợp phục vụ cho mục đích đọc trình tự, sử dụng

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

bộ sinh phẩm S.N.A.P Miniprep Kit [2].

K16

21 Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

Luận văn Thạc sĩ sinh học Nguyễn Thị Hồng Hà

+ Cặp mồi cho phân loại vi khuẩn:

Pr16F: AGAGTTTGATCCTGGCTCAG

Pr16R: TACGGTTACCTTGTTACCGACTT

- Cặp mồi tổng hợp gene 16S rARN được đặt tổng hợp tại hãng GENSET

(Singapore BioTech pte, Ltd).

2.1.3. Môi trƣờng nuôi cấy

Môi trường MPA (g/l): Cao thịt 3; pepton 5; NaCl 5; agar 20; nước cất 1.000

ml; pH 7.

Môi trường Winogradsky (g/l): NaNO21; K2HPO4 0,5; MgSO4.7H2O 0,3;

Na2CO3 1; NaCl 0,5; FeSO4 0,1; nước cất 1.000 ml

Môi trường Pikoskaya (g/l): Glucoza 10; Ca3(PO4)2 5; (NH4)2SO4 0,5; NaCl

0,2; MgSO4.7H2O 0,1; KCl 0,2; Cao nấm men 0,5; MnSO4 vết ; FeSO4. 7H2O vết;

nước cất 1.000 ml; pH 7 ÷ 7,2.

Môi trường xenlulo (g/l): NH4NO3 0,2; ure 0,1; cazein 0,2; KH2PO4 0,2;

MgSO4.7H2O 0,3; CaCO3 0,2; FeSO4.7H2O 0,05; bột giấy 20; cao nấm men 0,1;

cazamino axit 0,1; agar 20; nước cất 1.000; pH 7.

Môi trường xenlulo Glovina (g/l): CMC1,5; KNO3 0,5; KH2PO4 0,85;

MgSO4.7H2O 0,0625; cao nấm men 0,025; nước cất 1.000 ml; pH 7 ÷ 7,2.

Môi trường Gelatin: Môi trường MPA + 0,4 % gelatin; khử trùng ở 121 oC

trong 20 phút.

2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1. Phƣơng phá p nghiên cƣ́ u vi sinh vâ ̣t

2.2.1.1. Đặc điểm hình thái, sinh lý sinh hóa của các chủng vi khuẩn

 Đặc điểm hình thái

Đặc điểm hình thái tế bào c ủa vi khuẩn được quan sát dưới kính hiển vi điện

tử và được chụp tại Khoa Hình thái, Viện 69 thuộc Bộ Tư lệnh bảo vệ Lăng Chủ

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

tịch Hồ Chí Minh.

K16

22 Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

Luận văn Thạc sĩ sinh học Nguyễn Thị Hồng Hà  Nhuộm Gram vi khuẩn [3]

Xác định các vi khuẩn phân lập được thuộc Gr (-) hay (+) căn cứ vào màu

thuốc nhuộm bắt màu trên tế bào vi khuẩn. Nếu vi khuẩn bắt màu hồng là Gr (-),

màu tím là Gr (+).

 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa

 Khả năng sinh tổng hợp enzym

Thủy phân tinh bột: Cấy chấm điểm vi khuẩn trên môi trường MPA bổ sung thêm 1 % tinh bột. Nuôi ở nhiệt độ 30 oC trong 48 giờ và thử bằng thuốc thử Lugol.

Nếu vi khuẩn có khả năng thủy phân tinh bột chúng sẽ tạo vòng phân giải xung

quanh chỗ vi khuẩn sinh trưởng [3].

Thủy phân xenlulo: Cấy vi khuẩn trên môi trường MPA bổ sung 1 % bột giấy. Nuôi ở nhiệt độ 30 oC trong 48 giờ và thử bằng thuốc thử Lugol. Nếu vi

khuẩn có khả năng thủy phân xenlulo chúng sẽ tạo vòng phân giải xung quanh

chỗ vi khuẩn sinh trưởng.

Làm loãng gelatin: Cấy vi khuẩn vào môi trường gelatin đã vô trùng, nuôi ở nhiệt độ 30 oC, sau 72 giờ lấy ra cho vào tủ lạnh 4 oC để trong 2 giờ. Sau 2 giờ môi

trường trong ống nghiệm không bị đông thì chủng đó có khả năng làm loãng

gelatin.

 Khả năng sử du ̣ng các nguồn cacbon

Nuôi vi sinh vâ ̣t trên môi trườ ng có bổ sung 1 % nguồn đườ ng, cacbon. Xác

đi ̣nh khả năng phát triể n củ a chú ng.

 Khả năng chịu NaCl, chịu nhiệt, pH

Thay đổi nồng đô ̣ NaCl và nuôi ở các thang nhiệt độ , pH khác nhau . Theo

* Phương pháp phân tích nitơ tổng số

dõi khả năng sinh trưởng của chúng.

Nguyên tắc của việc phân tích nitơ tổng số là chuyển toàn bộ nitơ ở cả dạng

vô cơ và hữu cơ về dạng nitrat nhờ chất oxi hóa mạnh sau đó tiến hành so màu ở

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

bước sóng 220 nm [9].

K16

23 Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

Luận văn Thạc sĩ sinh học Nguyễn Thị Hồng Hà

* Phương pháp phân tích hàm lượng amoni NH4

Khả năng chuyển hóa amoni của các chủng vi khuẩn được phân tích dựa trên

nồng độ amoni trong môi trường theo các khoảng thời gian nuôi. Phản ứng của + và hypochlorit với sự có mặt của xúc tác phenol tạo thành hợp chất NH4

* Phương pháp thử khả năng chuyển hóa nitrit

-) của các chủng được

indophenol blue. So màu ở bước sóng 640 nm [9].

-) thành nitrat (NO3

Khả năng chuyển hóa nitrit (NO2

đánh giá thông qua sự giảm nồng độ nitrit trong môi trường nuôi cấy. Phản ứng

giữa nitrit và hỗn hợp sulfanylamit với naphtylendiamin tạo phức màu hồng ở pH 2.

* Đánh giá khả năng tích lũy photpho

So màu ở bước sóng 540 nm [9].

Đánh giá khả năng tích lũy photpho của vi sinh vật thông qua hàm lượng

photphat còn lại trong môi trường. Hàm lượng photphat được đánh giá dựa trên

nguyên tắc tạo phức giữa gốc phosphat, amonium molypdat và kali antimon tatrat

thành một phức chất màu xanh đậm và được đo ở bước sóng 710 nm [11].

2.2.1.2. Phương pháp đánh giá tính đối kháng giữa các chủng vi khuẩn

Đối kháng giữa các chủng vi khuẩn: Cấy vi khuẩn sao cho các đường cấy giao nhau trên môi trường MPA, nuôi ở 37 oC sau 24 giờ quan sát sinh trưởng của

các chủng ở các đường giao nhau [3].

2.2.1.3. Phương pháp nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng của vi

khuẩn

+ Ảnh hưởng của thời gian: Trong quá trình nuôi cấy khi không thay đổi

môi trường thì thời gian nuôi cấy quyết định sự thay đổi của các tế bào vi sinh vật.

Vì vậy, sinh trưởng của vi sinh vật phụ thuộc vào thời gian, tùy từng thời điểm

lượng enzym sinh ra cũng khác nhau. Tiến hành thí nghiệm bằng cách nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường MPA, nuôi ở 37 oC, điều kiện lắc 200 vòng/phút trong 60

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

giờ. Cứ sau 6 giờ lấy mẫu một lần, xác định khả năng sinh trưởng (OD620 nm) [4].

K16

24 Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

Luận văn Thạc sĩ sinh học Nguyễn Thị Hồng Hà

+ Ảnh hưởng của nhi ệt độ: Để nghiên cứu sự sinh trưởng của các chủng vi

khuẩn ở các nhiệt độ khác nhau, sử dụng môi trường MPA dịch thể. Sau đó, cấy các

chủng vi sinh vật trong các ống nghiệm chứa môi trường đã vô trùng và để ở các

thang nhiệt độ: 25; 30; 35; 45 và 55. Sau 48 giờ nuôi cấy, xác định khả năng sinh

trưởng (OD620 nm).

+ Ảnh hưởng của pH : Sử dụng môi trường MPA có pH ban đầu là: 3; 4; 5; 6; 7; 8; và 9. Cấy vi sinh vật, nuôi ở 37 oC, sau 48 giờ xác định khả năng sinh

trưởng bằng cách đo OD620 nm.

+ Ảnh hưởng của nồng độ NaCl: Nuôi cấy vi khuẩn vào môi trường MPA

sau đó bổ sung NaCl với các nồng độ khác nhau lần lượt là (g/l): 0,3; 1; 3; 5; 7 và 9 và 11 nuôi ở 37 oC trong 48 giờ. Đánh giá sinh trưởng bằng chỉ số (OD620nm).

+ Ảnh hưởng của ngu ồn cacbon: Ảnh hưởng của nguồn cacbon lên sinh

trưởng và sinh tổng hợp xenlulaza của các chủng vi sinh vật được tuyển chọn trên

các nguồn cơ chất khác nhau. Trên môi trường cơ sở có bổ sung tinh bột, CMC-Na,

glucoza, saccaroza, lactoza, rỉ đường. Vi khuẩn nuôi cấy trên môi trường MPA

trong 48 giờ. Sau khoảng thời gian đó, kiểm tra sự sinh trưởng của vi khuẩn bằng

chỉ số (OD620nm).

+ Ảnh hưởng của nguồn nitơ: Giống vi sinh vật được cấy vào môi trường

cơ sở có bổ sung các nguồn nito khác nhau: pepton, cao men, cao thịt, KNO3 và

(NH4)2SO4. Vi khuẩn nuôi cấy trên môi trường MPA trong 48 giờ. Sau khoảng

thời gian đó, kiểm tra sự sinh trưởng của vi khuẩn bằng chỉ số (OD620nm).

2.2.1.4. Phương pháp xác định hoạt tính enzym

Phương pháp đường khử : Làm các mẫu đường chuẩn với các nồng độ: 0.5; 1;

1.5; 2 và 3 (mg/ml). Pha loãng dịch enzym trong đệm ít nhất 2 nồng độ đến khi xấp

xỉ nồng độ 0,5 mg/ml đường (thể tích dịch sau khi pha loãng bằng 1 ml). Bổ sung 1 ml cơ chất, mix đều và ủ ở 37 oC trong 10 phút, sau đó thêm 3 ml DNSA, mix đều

rồi đun sôi các mẫu enzym, đường chuẩn, EB và S cùng nhau (khoảng 30 phút). Sau

đó làm lạnh bằng cách ủ vào đá rồi đo OD (540 nm). Chỉnh S về 0 rồi đo các mẫu

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

tiếp.

K16

25 Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

Luận văn Thạc sĩ sinh học Nguyễn Thị Hồng Hà

Công thức pha hóa chất: Spectro zero: 1 ml cơ chất, 1 ml đệm, 3 ml DNSA.

Đường chuẩn: 1 ml cơ chất, 3 ml DNSA, 0,5 ml đường. Enzym blank: 1 ml cơ chất,

3 ml DNSA, 1 ml enzym. Đệm PBS 6,8: (a): NaH2PO4 0,2 M: cân 27,8 g và định

mức đến 1.000 ml, (b) NaH2PO4.7H20 0,2 M: cân 53,05 g và định mức đến 100 ml,

dung dịch đệm bằng tổng của 51 ml (a) và 49 ml (b) định mức đến 200 ml. DNSA:

DNSA 10,6 g, NaOH 19,8, Na2S2O5 8,3 g, N-K-tatarat 306 g, phenol 7,6 ml. Kết

quả thu được áp vào đường chuẩn hình 2.1 tính hoạt độ xenlulaza.

Hình 2.1. Đồ thị đường chuẩn glucoza theo Bernfeld [26]

2.2.2. Phƣơng pháp phân loại

2.2.2.1. Phân loại theo Bergey’s

Dựa vào các đặc điểm hình thái, sinh lý sinh hóa đối chiếu với chủng chuẩn

đã được nghiên cứu theo khóa phân loại Bergey’s [32].

2.2.2.2. Phân loại vi khuẩn theo kit chuẩn API 50 CHB

Chủng vi khuẩn cấy sau 24 giờ trên thạch nghiêng, lấy 2 ÷ 3 vòng que cấy

hoà tan vào nước muối sinh lý, dùng pipet vô trùng hút 2 ml từ nước muối sinh lý

đã có vi sinh vật vào môi trường API 50 CHB, lắc đều. Dùng pipet hút dịch từ môi

trường API 50 CHB cho vào các chíp (vạch 1), tiếp theo nhỏ parafin khoảng 5 ÷ 6 giọt cho đầy. Nuôi 37 oC, sau 24 giờ và 48 giờ ghi kết quả. Trong suốt quá trình

nuôi cấy, các đường lên men tạo thành axit làm giảm pH, được nhận biết bằng sự

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

đổi màu chất chỉ thị [8].

K16

26 Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

Luận văn Thạc sĩ sinh học Nguyễn Thị Hồng Hà 2.2.2.3. Phân loại theo sinh học phân tử dựa trên trình tự gene 16S rRNA

a. Tách chiết ADN tổng số

Quy trình tách chiết ADN tổng số của vi khuẩn được tiến hành theo phương

pháp CTAB/NaCl của Ausubel, 1994.

(1) Vi khuẩn nuôi trong 24 giờ trên môi trường thạch thu sinh khối hòa trong

1,5 ml nước khử trùng. (2) Cặn tế bào được thu bằng cách ly tâm lạnh ở tốc độ 5000

vòng/5 phút để thu sinh khối. (3) Cặn tế bào hòa trong 567 µl TE, 5 µl lyzozym mix đều ủ 37 oC trong 20 phút. (4) Bổ sung 3 µl proteaza K, 30 µl SDS 10 % vào dung dịch trên mix đều ủ 37 oC trong 30 phút. (5) Sau đó bổ sung 100 µl NaCl 5 M, mix

đều, bổ sung tiếp 80 µl dung dịch CTAB/NaCl (10 % cetyltrimethylammoium bromit, 0.7 M NaCl) mix đều ủ 65 oC/10 phút. (6) Chiết 1 V hỗn hợp chloroform :

isoamyl (24 : 1), vortex. (7) Ly tâm 12000 vòng/phút thu dịch nổi (lặp lại chiết dung

môi hai lần). (8) Bổ sung 10 µl Na - acetat 3 M, mix đều, bổ sung tiếp 2 V cồn 100 % (lạnh) hoặc 0,7 V isopropanol (lạnh), mix đều. (9) Để lạnh ở -20 oC ít nhất 4 giờ. (10) Ly tâm 12000 vòng/ 20 phút thu cặn. (11) Rửa tủa bằng 500 µl cồn 70o, ly tâm

12000 vòng/ 10 phút, thu cặn. (12) Làm khô. (13) Hòa cặn trong 40 ÷ 60 µl TE - ARNaza, ủ ở 37 oC/ 1 giờ. (14) Kiểm tra độ tinh sạch của ADN bằng máy đo quang

phổ ở bước sóng 260 nm và 280 nm. CADN (protein) = A260 (280) x 50 x độ pha loãng

mẫu. Tỉ lệ ADN/protein > 1,8 là mẫu sạch. (15) Điện di kiểm tra trên gel agaroza

0,8 %, điện thế 100 V. Nhuộm bản gel trong dung dịch ethidium bromit 1 %/ 10

phút.

Nhân bản đoạn ADN thuộc gen 16S rARN bằng PCR

Thu nhận đoạn gen 16S ARN bằng phản ứng PCR sử dụng cặp mồi:

Pr16F: AGAGTTTGATCCTGGCTCAG

Pr16R: TACGGTTACCTTGTTACCGACTT

PCR được tiến hành với tổng thể tích 25 µl/ mẫu: ADN tổng số (1 µl), 16F (1

µl), 16R (1 µl), dNTPs 10 mM (2 µl), Taq polymeraza (0,25 µl), đệm Taq

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

27 Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

polymeraza 10 X (5 µl), nước khử ion (bổ sung cho đủ 25 µl).

K16

Chu trình nhiệt: (1) 94 oC - 3 phút, (2) 94 oC - 1 phút, (3) 55 oC - 1 phút, (4) 72

Luận văn Thạc sĩ sinh học Nguyễn Thị Hồng Hà oC - 2 phút. Lặp lại 30 chu kỳ từ bước 2 ÷ 4; 72 oC - 7 phút. Giữ ở 4 oC.

b. Thu nhận ADN thuộc gen 16S rARN bằng cách thôi gel

Sản phẩm PCR được điện di trên gel agaroza 0,8 %, phân đoạn ADN có độ dài

~ 1500 bp được thu nhận, tiến hành thôi gel và tinh sạch sản phẩm bằng kit

QiaQuick PCR Purification (Qiagen, Hilden, Đức).

(1) Thêm 3 lần thể tích của dung dịch đệm ADB (Agarose Dissolving Buffer) vào mỗi thể tích gel. Ủ trong bể ổn nhiệt 55 oC trong 5 ÷ 10 phút, đến khi tan hết

gel. (2) Chuyển dung dịch gel đã hoà tan vào cột Zymo-Spin, sau đó ly tâm 12.000

vòng/ phút trong 5 ÷ 10 giây. (3) Thêm 200 µl dung dịch đệm rửa (Wash Buffer)

vào cột, ly tâm 12.000 vòng/ phút trong 5 ÷ 10 giây, lặp lại bước này hai lần. (4)

Thêm trực tiếp 6 ÷ 8 µl nước khử ion vào màng của cột, đặt cột vào trong ống 1,5

ml và ly tâm 12.000 vòng/ phút trong 1 phút. Thu sản phẩm ADN tinh sạch.

c. Xác định trình tự gen 16s rARN

(1) Trình tự ADN được xác định bằng kit Dyedeoxy Terminator Cycle

Sequencing (Applied Biosystems, Weiterstadt, Đức), sản phẩm được phân tích trên

máy đọc trình tự tự động ABI 377 (Perkin-Elmer, Mỹ). (2) Chuỗi nucleotit được xử

lý bằng chương trình Bioedit. (3) Truy cập dữ liệu ngân hàng gen

EMBL(http://www.ncbi.nlm.nih.gov) để so sánh bằng chương trình GENDOC 2.5

(Nicholas, 1999). (4) Sử dụng chương trình phân tích phả hệ và tiến hóa MEGA 2.1

để xác định mối quan hệ di truyền giữa các chủng được phân tích [24].

2.2.3. Phƣơng pháp lên men, xử lý nƣớc thải hữu cơ sau hầm biogas

2.2.3.1. Phương pháp lên men vi khuẩn

Nhân giống cấp 1: Nhân giống trong môi trường MPA cho vi khuẩn, nuôi lắc

trong bình tam giác, nhiệt độ và thời gian nuôi thích hợp cho từng chủng, số lượng tế bào đạt khoảng 109/ml dịch nuôi.

Nhân giống cấp 2: Tiếp tục nhân giống lớn trong thiết bị lên men trên môi

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

trường MPA cho vi khuẩn, số lượng tế bào đạt 109/ml dịch nuôi.

K16

28 Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

Luận văn Thạc sĩ sinh học Nguyễn Thị Hồng Hà 2.2.3.2. Thiết kế thí nghiệm xử lý nước thải sau hầm biogas

Thí nghiệm xử lý nước thải sau hầm biogas quy mô phòng thí nghiệm được thực hiện quy mô 2,5 m3/mẻ sục khí liên tục, tại thôn Đại Phùng, xã Đan Phượng,

huyện Đan Phượng, thành phố Hà Nội.

2.2.3.3. Phương pháp đánh giá mức độ ô nhiễm

+ Phương pháp xác định pH theo TCVN 6492 - 1999 (ISO 10523 - 1994) [21]

+ Xác định BOD theo TCVN 6001 - 1995 (ISO 5815 - 1989) [19]

Thử nghiệm BOD được thực hiện bằng cách hòa loãng mẫu nước thử với

nước đã khử ion và bão hòa về oxy, thêm một lượng cố định vi sinh vật mầm giống,

đo lượng oxy hòa tan và đậy chặt nắp mẫu thử để ngăn ngừa oxy không cho hòa tan

thêm (từ ngoài không khí). Mẫu thử được giữ ở nhiệt độ 20 °C trong bóng tối để

ngăn chặn quang hợp (nguồn bổ sung thêm ôxy ngoài dự kiến) trong vòng 5 ngày

và sau đó đo lại lượng ôxy hòa tan. Khác biệt giữa lượng DO (oxy hòa tan) cuối và

lượng DO ban đầu chính là giá trị của BOD. Giá trị BOD của mẫu đối chứng được

trừ đi từ giá trị BOD của mẫu thử để chỉnh sai số nhằm đưa ra giá trị BOD chính

xác của mẫu thử [2].

+ Xác định COD theo TCVN 6491 - 1999 (ISO 6060 - 1989). Xác định nhu cầu oxy

hóa học [21]

Phạm vi áp dụng : Đối với nước có hàm lượng COD cao từ 30 ÷ 700 mg/l,

nếu giá trị COD vượt quá 700 mg/l mẫu nước cần pha loãng. Giá trị COD nằm trong khoảng 300 - 600 mg/l đạt được độ chính xác cao nhất, hàm lượng Cl- < 1000

mg/l. Nguyên tắc: Trong môi trường axit sunfuric đặc, Với sự có mặt của xúc tác

Ag2SO4 thì khi đun nóng K2Cr2O7 oxi hoá các hợp chất hữu cơ. Chuẩn độ lượng dư

K2Cr2O7 bằng dung dịch muối Morh với chỉ thị feroin, tại điểm cuối chuẩn độ, màu

của dung dịch chuyển từ màu xanh lục sang màu nâu đỏ.

+ Xác định chất rắn lơ lửng (SS) theo TCVN 6625 – 2000

Lấy 10 ml nước đem lọc qua giấy lọc đã được sấy khô ở trọng lượng không

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

đổi (105 oC)

K16

29 Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

Luận văn Thạc sĩ sinh học Nguyễn Thị Hồng Hà

T1 – T2 .1000 SS (mg/l) = ---------------- V

Trong đó: T1: Khối lượng cặn và giấy lọc

T2: Khối lượng giấy lọc (mg)

V: Thể tích mẫu nước.

+ Xác định chất rắn lơ lửng (SS) theo TCVN 6625 - 2000 [14]

Lấy 10 ml nước đem lọc qua giấy lọc đã được sấy khô ở trọng lượng không

đổi (105 oC). Công thứ c: SS (mg/l) = (T1 – T2 .1000)/ V

Trong đó: T1: Khối lượng cặn và giấy lọc; T2: Khối lượng giấy lọc (mg); V: Thể

tích mẫu nước.

+ Xác định P tổng theo Hach DR2800-10127

Nguyên tắc xác định: Trong môi trường axit, amonimolipdat phản ứng với

dung dịch octophotphat tạo thành axit tạp (Axit molipdophtphoric). Với sự có mặt

của vannadat axit vannadomolipdophotphoric màu vàng được hình thành. Cường độ

màu thể hiện nồng độ photphat trong dung dịch. Nồng độ tối thiểu có thể phát hiện được là 10-4 g/l.

+ Xác định N tổng theo TCVN 5988-1995 (ISO 5664-1984)

Nguyên tắc chung của phương pháp này là dùng axit sunfuric đậm đặc oxy

hóa toàn bộ các hợp chất hữu cơ có nitơ về amoniac (NH3). Do vậy, không để lẫn

với lượng amoni mới được hình thành phải phân tích xác định NH3 tự do có sẵn

trong mẫu nước thải trước để hiệu chỉnh về sau. NH3 mới sinh ra và NH3 tự do đều

kết hợp với axit sunfuric đậm đặc để chuyển thành muối amoni sunfat. Sau đó lại

tách toàn bộ NH3 từ amoni sunfat (vừa hình thành) bay ra khỏi dung dịch bằng cách

đun nóng dung dịch với NaOH.

+ Phương pháp xác định giá tri ̣ SV30 (solid value)

. Dịch Đây là phương pháp xác đi ̣nh khả năng ta ̣o bù n lắng củ a di ̣ch xử lý

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

nướ c thải đã đươ ̣c xử l ý lắc đều rót vào ống đong 500 ml. Để lắng tự nhiên , sau 30

K16

30 Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

Luận văn Thạc sĩ sinh học Nguyễn Thị Hồng Hà phút ghi lại thể tích bùn lắng (Vtb). Giá tri ̣ SV30 đươ ̣c tính như sau:

SV30 = (Vtb/500)×100.

+ Xác định Coliforms theo TCVN 6187 - 2 : 1996 (ISO 9308 - 2:1990) [20]

Mỗi độ pha loãng được nuôi cấy lặp lại nhiều lần (3 ÷ 10 lần). Các độ pha

loãng được lựa chọn sao cho trong các lần lặp lại có số lần dương tính và có số lần

âm tính. Số lần dương tính được ghi nhận và so với bảng thống kê Mac Crady.

2.2.4. Phƣơng pháp xử lý số liệu

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Số liệu được xử lý thống kê bằng chương trình IRISTAT 5.0 và EXCEL.

K16

31 Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

Luận văn Thạc sĩ sinh học Nguyễn Thị Hồng Hà

PHẦN III. KẾ T QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CÁC CHỦNG VI KHUẨN NGHIÊN CỨU

3.1.1. Khả năng phân giải cơ chất của các chủng nghiên cứu

Ba chủng vi khuẩn được ký hiệu NT01, NT03 và NT05 được phân lập từ

nguồn nước thải giàu hữu cơ tại Công ty Cổ phần thực phẩm xuất khẩu Đồng Giao -

Ninh Bình, các chủng được xác định khả năng phân giải cơ chất là CMC và tinh

bột: Môi trường MPA có bổ sung CMC và tinh bột 1 % khử trùng ở 0,8 atm trong 30

phút, sau đó đổ ra đĩa Petri. Sử dụng phương pháp cấy chấm điểm trên đĩa, ủ ở nhiệt độ 37 oC trong 48 giờ. Sau đó nhuộm màu bằng thuốc thử Lugol. Nếu vi khuẩn có khả

năng thủy phân xenlulo chúng sẽ tạo vòng phân giải xung quanh chỗ vi khuẩn sinh

trưởng. Kết quả được trình bày ở hình 3.1 và bảng 3.1.

NT01

NT05

NT03

Hình 3.1. Vòng phân giải CMC của 3 chủng vi khuẩn

Từ hình 3.1 cho thấy 3 chủng vi khuẩn NT 01, vi khuẩn NT 03, vi khuẩn

NT05 đều có hoạt tính và được đo vòng phân giải tại bảng 3.1.

Bảng 3.1. Khả năng phân giải CMC và tinh bột của các chủng

Vòng phân giải (D-d (± 2mm)) STT Ký hiệu chủng CMC Tinh bột

1 NT01 21,0 20,0

2 NT03 19,0 17,0

3 NT05 17,0 15,0

Từ hình 3.1 và bảng 3.1 cho thấy chủng vi khuẩn NT01 có vòng phân giải

xenlulo là 21,0 mm, chủng NT03 có vòng phân giải xenlulo 19,0 mm, chủng NT05

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

có vòng phân giải 17,0 mm. Các chủng này đều có khả năng sinh tổng hợp

K16

32 Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

Luận văn Thạc sĩ sinh học Nguyễn Thị Hồng Hà xenlulaza cao, phù hợp với mục tiêu nghiên cứu.

+ Khả năng tích lũy phân giải photphat của các chủng có hoạt tính

xenlulaza: Khả năng sử dụng photpho của các chủng có hoạt tính xenlulaza được

đánh giá thông qua hàm lượng photphat được tích lũy trong vi sinh vật dẫn đến việc

giảm hàm lượng của hợp chất này trong môi trường nuôi cấy.

Bảng 3.2. Hàm lượng photpho còn trong môi trường sau 7 ngày nuôi cấy

Hàm lượng photpho còn trong môi trường (%) STT Ký hiệu chủng 6 mg/l 18 mg/l

1 NT01 0 70,88

2 NT03 0 74,23

3 NT05 0 77,06

Kết quả nghiên cứu cho thấy, cả 3 chủng vi sinh vật có hoạt tính xenlulaza

tuyển chọn đều có khả năng tích lũy photpho nhanh và mạnh. Với hàm lượng

photpho là 6 mg/l trong môi trường nuôi cấy, cả 3 chủng NT01, NT03 và NT05 sau

7 ngày nuôi cấy đã không còn phát hiện được photphat còn trong môi trường, tiếp

tục bổ sung và tăng hàm lượng photpho trong môi trường nuôi cấy lên gấp 3 lần ở

mức 18 mg/l. Tại nồng độ này kết quả nghiên cứu cho thấy chủng NT01 có khả

năng sử dụng photphat tốt nhất so với các chủng còn lại. Lượng photphat trong dịch

nuôi của chủng NT01 giảm đi 29,12 % sau 7 ngày trong khi với các chủng NT03 và

NT05 lượng giảm tương ứng là 25,77 % và 22,94 % .

+ Đánh giá khả năng chuyển hóa các hợp chất nitơ: Các chủng NT01, NT03

và NT05 được nuôi lắc ở 37 °C trong các khoảng thời gian từ 0, 5, 10, 15 và 20

ngày. Môi trường nuôi lắc là dung dịch môi trường Winogradsky có bổ sung 1 %

pepton và kết quả thu đươc như sau.

Bảng 3.3. Hàm lượng nitơ còn trong môi trường sau thời gian nuôi cấy

Hàm lượng nitơ còn trong môi trường (%), ngày Ký hiệu chủng Ban đầu 5 10 15 20

NT01 100 88,64 70,88 66,66 65,24

NT03 100 90,06 74,23 69,03 68,56

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

NT05 100 92,68 77,06 71,28 70,58

K16

33 Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

Luận văn Thạc sĩ sinh học Nguyễn Thị Hồng Hà

NH4

Kết quả cho thấy, sau 5 ngày, ba chủng NT01, NT03 và NT05 làm nồng độ + giảm nhiều. Sau 15 ngày, chủng NT01 có hàm lượng NH4+ có trong mẫu đã + trong dung dịch giảm giảm xuống 66,66 % và 2 chủng còn lại hàm lượng NH4

xuống 69,03 % so với mẫu ban đầu với chủng NT03 và 71,28 % với chủng NT05

nhưng sau 20 ngày các chủng đều chuyển hóa nitơ chậm. Từ kết quả trên cho thấy

cả 3 chủng đều có khả năng chuyển hóa nitơ nhưng chủng NT01 có khả năng

chuyển hóa tốt nhất và thời gian tối ưu là khoảng 15 ngày.

+ Khả năng làm loãng gelatin của các chủng phân lập: Các chủng vi khuẩn

nghiên cứu được cấy trong môi trường MPA lỏng bổ sung 10 % gelatin, nuôi ở nhiệt độ 37 oC. Sau 2 ngày, trước khi quan sát giữ mẫu ở 20 oC trong khoảng 4 giờ,

kiểm tra kết quả với vi khuẩn. Dịch môi trường loãng chứng tỏ chủng có khả năng

làm loãng gelatin.

NT01 NT03 NT05 ĐC

Hình 3.2. Khả năng làm loãng gelatin của các chủng nghiên cứu

Kết quả được trình bày ở hình 3.2 cho thấy các chủng nghiên cứu đều có khả

năng làm loãng gelatin rất tốt so với đối chứng không cấy vi sinh vật.

3.1.2. Khả năng đối kháng của các chủng nghiên cứu

Để xử lý nước thải hữu cơ một cách tốt nhất thì hệ vi sinh vật tuyển chọn cần

phải có sự tương trợ lẫn nhau, nếu chúng đối kháng với nhau thì việc cùng bổ sung

chủng vào nước thải là vô nghĩa. Vì vậy, cần kiểm tra khả năng đối kháng của các

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

chủng nghiên cứu với nhau. Cấy vi khuẩn sao cho các đường cấy giao nhau trên

K16

34 Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

Luận văn Thạc sĩ sinh học Nguyễn Thị Hồng Hà môi trường MPA, nuôi ở 37 oC sau 48 giờ quan sát sinh trưởng của các chủng ở các

đường giao nhau.

NT03

NT05

NT01

NT03

NT05

Hình 3.3. Khả năng đối kháng của các chủng nghiên cứu

Kết quả hình 3.3 cho thấy các chủng nghiên cứu không đối kháng nhau . Cả

ba vi khuẩn đề u phát triển bình thường tại các điểm giao nhau, không có sự ứ c chế giữa các chủ ng . Như vậy, chúng hoàn toàn có thể sinh trưởng trong cùng một môi

trường cũng như phối hợp chúng trong xử lý nước thải hữu cơ.

3.1.3. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc và tế bào

Đặc điểm hình thái khuẩn lạc và tế bào của các chủng vi khuẩn nghiên cứu được xác định khi nuôi cấy trên môi trường MPA, ở nhiệt độ 37 oC, sau 48 giờ quan

sát hình thái khuẩn lạc và hình ảnh tế bào được chụp tại Khoa Hình thái, Viện 69

thuộc Bộ Tư lệnh Lăng Chủ tịch Hồ Chí Minh. Kết quả hình 3.4 cho thấy 2 chủng

vi khuẩn NT01 và chủng vi khuẩn NT03 đều có tế bào hình que dài, kích thước từ 1

÷ 3 µm. Hình thái tế bào của 2 chủng tương tự nhau nhưng hình thái khuẩn lạc thì

khác nhau hoàn toàn, chủng NT01 khuẩn lạc lồi, không bóng, nhầy, hơi nhăn,

chủng vi khuẩn NT03 khuẩn lạc màu trắng sữa, hơi lồi, mép răng cưa. Chủng vi

khuẩn NT05 có tế bào hình que ngắn hơn, kích thước 1 ÷ 2 µm. Hình thái khuẩn lạc

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

tròn, màu trắng kem.

K16

35 Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

Luận văn Thạc sĩ sinh học Nguyễn Thị Hồng Hà

a/ b/

d/ c/

f/ e/

a; b/ Chủng NT01; c; d/ Chủng NT03; e; f/ Chủng NT05

Hình 3.4. Hình thái khuẩn lạc và tế bào các chủng vi khuẩn

3.1.4. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa

3.1.4.1. Ảnh hưởng của thời gian đến sinh trưởng và sinh tổng hợp xenlulaza của

các chủng vi khuẩn nghiên cứu

+ Ảnh hưởng của thời gian đến sinh trưởng của các chủng vi khuẩn: Thời

gian là yếu tố cần thiết cho sự sinh trưởng của bất cứ loài nào, thời gian nào là thời

điểm vi sinh vật sinh trưởng mạnh nhất tùy thuộc vào mỗi loài. Ba chủng vi khuẩn lựa chọn được nuôi cấy trên môi trường MPA, nhiệt độ 37 oC, điều kiện lắc 200

vòng/phút. Sau khi cấy giống thu mẫu 6 giờ một lần, tiến hành xác định khả năng

sinh trưởng bằng cách đo OD với bước sóng 600 nm. Kết quả được trình bày ở hình

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

3.5.

K16

36 Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

Luận văn Thạc sĩ sinh học Nguyễn Thị Hồng Hà

Hình 3.5. Ảnh hưởng của thời gian đến sinh trưởng của 3 chủng vi khuẩn

Kết quả hình 3.5 cho thấy thời gian tối ưu cho sinh trưởng của 3 chủng vi

khuẩn là 42 giờ, OD chủng NT01 đạt 2,155, chủng NT03 đạt 2,89, chủng NT05 đạt

2,715. Từ 6 ÷ 42 giờ các chủng sinh trưởng rất nhanh. Từ 42 giờ trở đi sinh trưởng

của các chủng nghiên cứu giảm dần.

+ Ảnh hưởng của thời gian đến sinh tổng hợp xenlulaza của các chủng vi

khuẩn: Các chủng vi khuẩn lựa chọn được nuôi trong môi trường MPA lỏng có bổ sung 0,1 % CMC, nuôi 37 oC, lắc 200 vòng/phút. Lấy mẫu dịch nuôi cấy cứ sau 6 giờ một lần, bảo quản dưới 0 oC để vi khuẩn không tiếp tục sinh trưởng. Sau khi kết

thúc tiến hành làm đường khử xác định hoạt tính xenlulaza của các chủng nghiên

cứu. Kết quả được trình bày ở hình 3.6.

Hình 3.6. Ảnh hưởng của thời gian đến khả năng sinh tổng hợp xenlulaza của các

chủng vi khuẩn

Kết quả hình 3.6 cho thấy 3 chủng vi khuẩn sau 6 giờ nuôi cấy, lượng enzym

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

sinh ra tăng liên tục nhưng tương đối khác nhau. Chủng NT01 sau 6 ÷ 24 giờ khả năng

K16

37 Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

Luận văn Thạc sĩ sinh học Nguyễn Thị Hồng Hà sinh tổng hợp xenlulaza tăng, tiếp tục tăng nhanh từ 42 ÷ 48 giờ, lượng enzym sinh ra

nhiều nhất tại thời điểm sau 48 giờ, đạt 2,6 IU/ml, ở hình 3.6 cho thấy chủng NT03 và

NT05 lượng sinh khối sinh ra rất lớn song khả năng sinh tổng hợp xenlulaza không cao

bằng chủng NT01. Hai chủng còn lại cũng đạt lượng enzym cao nhất sau 48 giờ, chủng

NT03 đạt 2,5 IU/ml, chủng NT05 đạt 2,45 IU/ml. Sau 48 giờ lượng enzym sinh ra của

cả 3 chủng đều giảm.

3.1.4.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến khả năng sinh trưởng và sinh tổng

hợp xenlulaza của chủng vi khuẩn

+ Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến khả năng sinh trưởng của vi

khuẩn: Nhiê ̣t đô ̣ là mô ̣t yếu tố tác đô ̣ng trực tiếp đến khả năng sinh trưở ng và phát triển củ a vi khuẩn , mỗi chủ ng có mô ̣t khoảng nhiê ̣t đô ̣ tối ưu khác nhau . Khả năng chịu được nhiệt độ cao là một trong những tiêu chí quan trọng trong ứng dụng xử

lý. Chúng tôi tiến hành nuôi cấy các chủng vi khuẩn ở dải nhiệt độ: 25, 30, 37, 40, 45, 50, 55 và 60 oC. Các chủng vi khuẩn nuôi trên môi trường MPA, lắc 200

vòng/phút. Sau 48 giờ nuôi cấy chúng tôi tiến hành đánh giá sự sinh trưởng. Kết

quả được thể hiện ở hình 3.7.

Hình 3.7. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh trưởng của các chủng vi khuẩn

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Kết quả ở hình 3.7 cho thấy các chủng vi khuẩn có khả năng chịu được nhiệt độ khá cao, ở nhiệt độ 25 ÷ 30 oC và lớ n hơn 50oC các ch ủng vi khuẩn sinh trư ởng yếu nhưng từ 37 ÷ 50 oC các chủng sinh trưởng rất tốt, cả 3 chủng đạt tối ưu ở nhiệt độ 45 oC, chủng NT01 khả năng sinh trưởng đạt 3,76, chủng NT03 khả năng sinh trưởng đạt 3,82, chủng NT05 khả năng sinh trưởng đạt 3,8. Ở 55 ÷ 60 oC 3 chủng

K16

38 Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

Luận văn Thạc sĩ sinh học Nguyễn Thị Hồng Hà sinh trưởng yếu.

+ Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh tổng hợp xenlulaza của chủng vi

khuẩn: Nhiệt độ là yếu tố rất quan trọng, nó quyết định sự sinh trưởng và sinh tổng

hợp enzym của các chủng vi sinh vật. Thông thườ ng ở nhiê ̣t đô ̣ nào mà vi khuẩn sinh trưở ng tốt nhất thì sẽ sinh enzym thủ y phân cơ chất có trong môi trườ ng cao nhất. Tuy nhiên cũng có chủ ng vi khuẩn mă ̣c dù ở nhiê ̣t đô ̣ sinh trưở ng tốt nhưng la ̣i không sinh tổng hơ ̣p en zym cao ở nhiê ̣t đô ̣ đó . Vì vậy, để xác định ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh xenlulaza, ba chủng vi khuẩn được nuôi trong môi

trường MPA, lắc 200 vòng/phút và nuôi ở các dải nhiệt độ 25, 30, 37, 40, 45, 50, 55 và 60 oC. Sau 54 giờ nuôi cấy tiến hành lấy kết quả.

Hình 3.8. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh tổng hợp xenlulaza của các

chủng vi khuẩn

Kết quả hình 3.8 cho thấy dải nhiệt độ sinh tổng hợp xenlulaza của ba chủng vi khuẩn từ 37 ÷ 50 oC và nhiệt độ sinh tổng hợp xenlulaza tối ưu là 45 oC, chủng

NT01 hoạt tính đạt 2,3 IU/ml, chủng NT03 hoạt tính đạt 2,1 IU/ml, chủng NT05 hoạt tính đạt 2,0 IU/ml. Nếu nhiệt độ nuôi cấy dưới 37 oC và cao hơn 50 oC thì khả

năng sinh xenlulaza của các chủng đều giảm. Qua kết quả nghiên cứu ảnh hưởng

của nhiệt độ đến sinh trưởng và sinh tổng hợp xenlulaza cho thấy cả ba chủng lựa

chọn đều là thuộc nhóm vi sinh vật ưa ấm, phù hợp với yêu cầu xử lý nướ c thải.

3.1.4.3. Ảnh hưởng của pH môi trường đến khả năng sinh trưởng và sinh tổng

hợp xenlulaza của chủng vi khuẩn

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

+ Ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh trưởng của 3 chủng vi khuẩn: pH

K16

39 Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

Luận văn Thạc sĩ sinh học Nguyễn Thị Hồng Hà

môi trường ảnh hưởng rất lớn đến sinh trưởng của các vi sinh vật, đă ̣c biê ̣t đối vớ i vi khuẩn. Các ion H +, OH- là hai ion có tác động lớn nhất đến hoạt động của vi

. Với mục tiêu chọn chủng có khả năng phân giải sinh vâ ̣t, những biến đổi dù nhỏ trong nồng đô ̣ củ a chú ng cũng có ảnh hưở ng đến sinh trưở ng củ a vi sinh vâ ̣t

xenlulo để xử lý nướ c thải thì chủng vi sinh vật có khả năng tồn tại ở dải pH rộng

là rất cần thiết. Chủng nghiên cứu được nuôi trong môi trường MPA lỏng, nhiệt độ 37 oC, lắc 200 vòng/phút, và dải pH môi trường là: 3; 4; 5; 6; 7; 8 và 9., bằng

cách cho thêm NaOH 1N hoặc HCl 1N và đo bằng máy đo pH 320 pH Metter.

Nuôi trong thời gian 48 giờ thu dịch đo OD (600 nm) kiểm tra sinh trưởng của

chủng.

Hình 3.9. Ảnh hưởng của pH đến sinh trưởng của 3 chủng vi khuẩn

Kết quả trên cho thấy 3 chủng lựa chọn có thể sinh trưởng ở dải pH rộng 3 ÷

9, pH tối ưu của chủng NT01 ở pH 8, khả năng sinh trưởng OD đạt 3,95, chủng

NT03 khả năng sinh trường đạt 3,81; chủng NT05 sinh trưởng đạt 3,78 và hai chủng

này tối ưu ở pH 7, khi giá tri ̣ pH < 5 và ≥ 9 thì tốc độ sinh trưởng của các chủng vi khuẩn bi ̣ yếu đi.

+ Ảnh hưởng của pH đến sinh tổng hợp xenlulaza của 3 chủng vi khuẩn: Độ

pH môi trường không chỉ ảnh hưởng tới sinh trưởng của vi khuẩn mà còn tác động

rất lớn đến quá trình sinh tổng hợp xenlulaza của chủng. Để nghiên cứu sự ảnh

hưởng đó, 3 chủng lựa chọn được nuôi cấy trong môi trường MPA lỏng và ở dải pH 3 ÷ 9, nhiệt độ 37 oC, lắc 200 vòng/phút. Sau 54 giờ lấy dịch làm đường khử thu kết

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

quả.

K16

40 Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

Luận văn Thạc sĩ sinh học Nguyễn Thị Hồng Hà

Hình 3.10. Ảnh hưởng của pH đến sinh tổng hợp xenlulaza của 3 chủng vi khuẩn

Hình 3.10 trên cho thấy pH 7 là pH tối ưu cho sinh tổng hợp enzym của 2 chủng

NT03 (hoạt tính enzym đạt 2,1 IU/ml) và NT05 (hoạt tính enzym đạt 2 IU/ml), chủng

NT01 sinh tổng hợp xenlulaza cao nhất ở pH 8 đạt 2,28 IU/ml.

3.1.4.4. Ảnh hưởng của nồng độ NaCl đến sinh trưởng của các chủng vi khuẩn

Ba chủng vi khuẩn được nuôi trong môi trường MPA nhưng thay thế nồng độ NaCl từ 0,3 % bằng dải nồng độ 1, 3, 5, 7, 9 và 11 %, nuôi ở 37 oC, lắc 200

vòng/phút, sau 48 giờ nuôi cấy lấy mẫu xác định sinh trưởng bằng phương pháp đo

mật độ quang OD (600 nm).

Hình 3.11. Ảnh hưởng của nồng độ NaCl đến sinh trưởng của các chủng vi khuẩn

Kết quả trình bày trên hình 3.11 cho thấy ở nồng độ 0,3 % (đối chứng) và

nồng độ 1 ÷ 5 % ba chủng sinh trưởng tốt, từ 7 % NaCl các chủng sinh trưởng yếu

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

và gần như không sinh trưởng ở nồng độ 9 ÷ 11 %.

K16

41 Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

Luận văn Thạc sĩ sinh học Nguyễn Thị Hồng Hà 3.1.4.5. Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến sinh trưởng và sinh tổng hợp

xenlulaza của các chủng vi khuẩn

Dinh dưỡng củ a vi sinh vâ ̣t là quá trình chuyển hóa các hơ ̣p chất hữu cơ , vô , mỗi loài thườ ng sinh trưở ng và cơ thành những chất hữu cơ củ a tế bào vi sinh vâ ̣t phát triển tốt trên một nguồn cacbon nhất định . Nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn

cacbon lên sinh trưởng và sinh tổng hợp xenlulaza của các chủng vi khuẩn trên các

nguồn cơ chất khác nhau, môi trường cơ sở bổ sung glucoza, lactoza, saccaroza, tinh bột, CMC và rỉ đường, điều kiện nhiệt độ 37 oC, lắc 200 vòng/ phút. Sau 48 giờ

nuôi cấy thu kết quả và được trình bày dưới hình 3.12 và hình 3.13.

Hình 3.12. Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến sinh trưởng của 3 chủng vi khuẩn

Kết quả hình 3.12 và hình 3.13 cho thấy các chủng nghiên cứu sinh trưởng

tốt trên môi trường có nguồn cacbon là glucoza, rỉ đường và tinh bột. Trong đó

nguồn rỉ đường có tác dụng tốt lên sinh trưởng của các chủng vi khuẩn NT01 giá trị

sinh trưởng OD đạt 5,02, chủng vi khuẩn NT03 giá trị sinh trưởng OD đạt 5,33,

chủng vi khuẩn NT05 giá trị sinh trưởng OD đạt 5,17. Hoạt lực xenlulaza nhận

được từ các nguồn cacbon khác nhau của các chủng có khác nhau. Trong các loại cơ

chất dùng thí nghiệm thì CMC và tinh bột và rỉ đường có ảnh hưởng tốt nhất lên

sinh tổng hợp xenlulaza của các chủng. Nguồn dinh dưỡng lactoza là nguồn cacbon

không thích hợp cho sinh trưởng của các chủng vi khuẩn tuyển chọn như chủng vi

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

khuẩn NT01 và chủng vi khuẩn NT03.

K16

42 Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

Luận văn Thạc sĩ sinh học Nguyễn Thị Hồng Hà

Hình 3.13. Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến sinh tổng hợp xenlulaza

của 3 chủng vi khuẩn

3.1.4.6. Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến sinh trưởng và sinh tổng hợp xenlulaza

của các chủng vi khuẩn

Trong thành phần nước thải còn một lượng hợp chất nitơ. Đánh giá khả năng

sử dụng các nguồn nitơ của các chủng góp phần vào quá trình tuyển chọn chủng

trong xử lý nước thải, nuôi cấy vi khuẩn môi trường cơ bản MPA và các môi trường

trong đó nguồn nitơ được thay thế với lượng tương ứng bằng nguồn nitơ khác như

nguồn pepton, cao men, cao thịt, KNO3, (NH4)2SO4. Kết quả được trình bày dưới

hình 3.14 và hình 3.15.

Hình 3.14. Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến sinh trưởng của 3 chủng vi khuẩn

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Để phân giải polysacarit khó phân giải như xenlulo thì tế bào vi sinh vật phải tổng hơ ̣p mô ̣t lươ ̣ng lớ n xenlulolaza, có chủng sử dụng tới 60 % tổng nhu cầu nitơ cho viê ̣c sản xuất enzym ngoa ̣i bào . Do vâ ̣y, viê ̣c nghiên cứ u ảnh hưở ng củ a nguồn nitơ lên sinh trưở ng và sinh tổng hơ ̣p enzym củ a chủ ng vi khuẩn có ý nghĩa rất quan

K16

43 Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

Luận văn Thạc sĩ sinh học Nguyễn Thị Hồng Hà trọng.

Hình 3.15. Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến sinh tổng hợp xenlulaza của 3 chủng vi

khuẩn

Kết quả hình 3.14 và hình 3.15 cho thấy các chủng vi khuẩn thích hợp với nguồn

nitơ hữu cơ như nguồn pepton và cao men. Hầu hết các nguồn nitơ hữu cơ không ức chế

sinh tổng hợp xenlulaza của các chủng vi khuẩn.

3.2. ĐẶC ĐIỂM PHÂN LOẠI CÁC CHỦNG VI KHUẨN NGHIÊN CỨU

3.2.1. Phân loại theo khóa phân loại của Bergey’s

Từ những kết quả nghiên cứu ở trên tập hợp được số liệu bảng 3.2 cho thấy

đặc điểm sinh học của ba chủng vi khuẩn NT01, NT03 và NT05 tế bào của chúng

đều là hình que, kích thước tế bào từ 1 ÷ 3 µm, riêng chủng NT05 ngắn hơn 1 ÷ 2

µm. Hình thái khuẩn lạc của chúng hoàn toàn khác nhau, chủng NT01 màu trắng

ngà, lồi, nhầy, khuẩn lạc tương đối to. Chủng NT03 màu trắng sữa, chủng NT05

màu trắng kem, khuẩn lạc tròn, nhỏ, lồi, cả ba chủng vi khuẩn nghiên cứu đều là vi

khuẩn Gram dương, sinh bào tử, có khả năng phân giải tốt các nguồn cơ chất như:

tinh bột, CMC và gelatin. Cả ba chủng đều sinh trưởng tốt ở khoảng nhiệt độ 37 ÷ 50 oC, điều này cho thấy chúng đều là những vi sinh vật ưa ấm , chúng còn có khả

năng sinh trưởng ở pH rộng từ 5 ÷ 8. Các đặc điểm sinh lý của ba chủng cho thấy

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

chúng thích hợp để ứng dụng xử lý nước thải hữu cơ.

K16

44 Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

Luận văn Thạc sĩ sinh học Nguyễn Thị Hồng Hà

Bảng 3.4. Đặc điểm sinh học của các chủng vi khuẩn nghiên cứu

Ký hiệu chủng vi khuẩn Đặc điểm NT01 NT03 NT05

Màu sắc khuẩn lạc Trắng ngà Trắng sữa Trắng kem

Lồi Bề mặt khuẩn lạc Lồi, không bóng Hơi lồi, có răng cưa

Kích thước tế bào, µm 1 ÷ 3,0 1 ÷ 3,0 1 ÷ 2,0

(+) Nhuộm Gram (+) (+)

Có Tạo bào tử Có Có

15 Thủy phân tinh bột, mm 20 17

17 Thủy phân CMC, mm 21 19

Có Phân giải nitơ Có Có

Có Phân giải photpho Có Có

Có Làm loãng gelatin Có Có

Nhiệt độ thích hợp, oC 37 ÷ 50 37 ÷ 50 37 ÷ 50

pH thích hợp 5 ÷ 8 5 ÷ 8 5 ÷ 8

Khả năng chịu NaCl, g/l 1 ÷ 5 1 ÷ 5 1 ÷ 5

Với các đặc điểm trên so sánh với khóa phân loại của Bergey’s có thể xếp cả

3 chủng vi khuẩn NT01, chủng NT03 và chủng NT05 vào giống Bacillus. Tuy

nhiên để xác định đến loài với các đặc điểm phân loại trên là chưa đủ, vì vậy cả 3

chủng trên được phân loại bằng Kit chuẩn sinh hóa API 50 CHB.

3.2.2. Phân loại theo Kit chuẩn sinh hóa API 50 CHB

Kit chuẩn sinh hóa API 50 CHB dùng để phân loại vi khuẩn Gram (+) thuộc

các giống vi khuẩn Bacillus tương đối đặc hiệu, các đặc điểm phân loại được thực

hiện dựa trên khả năng lên men 49 loại đường. Lấy 1 ÷ 4 khuẩn lạc (nuôi cấy trong

24 giờ) làm đồng nhất trong môi trường API 50 CHB. Sau đó dùng pipet hút dịch

huyền phù nhỏ vào từng tube. Nhỏ parafin lên miệng tube nhằm giữ cho dịch môi trường không bị tràn và tránh bị lây nhiễm. Nuôi cấy được thực hiện ở 37 oC rồi đọc

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

kết quả sau 24 giờ và 48 giờ. Trong suốt quá trình nuôi cấy, các đường lên men tạo

K16

45 Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

Luận văn Thạc sĩ sinh học Nguyễn Thị Hồng Hà thành axit làm giảm pH, được nhận biết bằng sự đổi màu chất chỉ thị.Kết quả khả

năng sử dụng cơ chất của 3 chủng NT01, NT03 và NT05 thể hiện ở bảng 3.3, bảng

3.4 và bảng 3.5 (hình ảnh xem phụ lục 1; phụ lục 2 và phụ lục 3).

Bảng 3.5. Khả năng sử dụng cơ chất theo Kit API 50 CHB của chủng vi khuẩn

NT01 so sánh với loài trong bảng Index của Kit

So sánh chủng vi khuẩn NT01 với chủng chuẩn STT Cơ chất

24 h 48 h Bacillus lichenifomis

0 Control - - -

1 Glycerol + + +

2 Erythritol - - -

3 D-Arabinoza - - -

4 L- Arabinoza + + +

5 Riboza + + +

6 D-Xyloza + + +

7 L-Xyloza - - -

8 Adonitol - - -

9 - - -  Methyl-xylosit

10 Galactoza - - -

11 D-Glucoza + + +

12 D-Fructoza + + +

13 D-Mannoza + + +

14 L-Sorboza - - -

15 Rhamnoza + + +

16 Dulcitol - - -

17 Inositol + + +

18 Mannitol + + +

Sorbitol 19 + + +

20 - - -  Methyl-D-mannosit

21 + + +  Methyl-D-glucosit

22 N Acetyl glucosamin + + +

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

23 Amygdalin + + +

K16

46 Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

Luận văn Thạc sĩ sinh học Nguyễn Thị Hồng Hà

24 Arbutin + + +

25 Esculin + + +

26 Salicin + + +

27 Cellobioza + + +

28 Maltoza + + +

29 Lactoza - - -

30 Melibioza - - -

31 Saccaroza + + +

32 Trehaloza + + +

33 Inulin + + +

34 Melezitoza - - -

35 D-Raffinoza + + +

36 Amidon + + +

37 Glycogen + + +

38 Xylitol - - -

39 + + +  Gentiobioza

40 D-Turanoza - - -

41 D-Lyxoza - - -

42 D-Tagatoza - - -

43 D-Fucoza - - -

44 L-Fucoza - - -

45 D-Arabitol - - -

46 L-Arabitol - - -

47 Gluconat + + +

48 2 ceto-gluconat - - -

Chú thích: -: không có phản ứng; +: có phản ứng

49 5 ceto-gluconat - - -

Đối chiếu kết quả này với API profile index, kết hợp với các đặc điểm hình

thái theo khoá phân loại vi khuẩn của Bergey’s, cho thấy mức độ xác định của

chủng vi khuẩn NT01 thuộc Bacillus licheniformis (% ID = 91,4 và T = 0,88), được

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

ký hiệu là B. licheniformis NT01.

K16

47 Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

Luận văn Thạc sĩ sinh học Nguyễn Thị Hồng Hà

Bảng 3.6. Khả năng sử dụng cơ chất theo Kit API 50 CHB của chủng vi khuẩn

NT03 so sánh với loài trong bảng Index của Kit

STT Cơ chất So sánh chủng vi khuẩn NT03 với chủng chuẩn

24 h 48 h Bacillus subtilis

0 Control - - -

1 Glycerol + + +

2 Erythritol - - -

3 D-Arabinoza - - -

4 L- Arabinoza + + +

5 Riboza + + +

6 D-Xyloza + + +

7 L-Xyloza - - -

8 Adonitol - - -

9 - - -  Methyl-xylosit

10 Galactoza - - -

11 D-Glucoza + + +

12 D-Fructoza + + +

13 D-Mannoza + + +

14 L-Sorboza - - -

15 Rhamnoza - - -

16 Dulcitol - - -

17 Inositol + + +

18 Mannitol + + +

Sorbitol 19 + + +

20 - - -  Methyl-D-mannosit

21 + + +  Methyl-D-glucosit

22 N Acetyl glucosamin + + +

23 Amygdalin + + +

24 Arbutin + + +

25 Esculin + + +

26 Salicin + + +

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

27 Cellobioza + + +

K16

48 Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

Luận văn Thạc sĩ sinh học Nguyễn Thị Hồng Hà

28 Maltoza + + +

29 Lactoza - - -

30 Melibioza - - -

31 Saccaroza + + +

32 Trehaloza + + +

33 Inulin + + +

34 Melezitoza - - -

35 D-Raffinoza + + +

36 Amidon + + +

37 Glycogen + + +

38 Xylitol - - -

39 + + +  Gentiobioza

40 D-Turanoza - - -

41 D-Lyxoza - - -

42 D-Tagatoza - - -

43 D-Fucoza - - -

44 L-Fucoza - - -

45 D-Arabitol - - -

46 L-Arabitol - - -

47 Gluconat - - -

48 2 ceto-gluconat - - -

Chú thích: -: không có phản ứng; +: có phản ứng

49 5 ceto-gluconat - - -

Đối chiếu kết quả này với API profile index, kết hợp với các đặc điểm hình

thái theo khoá phân loại vi khuẩn của Bergey’s, cho thấy mức độ xác định của

chủng vi khuẩn NT03 thuộc Bacillus subtilis (% ID = 88,5 và T = 0,96), được ký

hiệu là B. subtilis NT03.

Bảng 3.7. Khả năng sử dụng cơ chất theo Kit API 50 CHB của chủng vi khuẩn

NT05 so sánh với loài trong bảng Index của Kit

STT Cơ chất So sánh chủng vi khuẩn NT05 với chủng chuẩn

24 h 48 h Bacillus megaterium

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

0 Control - - -

K16

49 Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

Luận văn Thạc sĩ sinh học Nguyễn Thị Hồng Hà

1 Glycerol + + +

2 Erythritol - - -

3 D-Arabinoza - - -

4 L- Arabinoza + + +

5 Riboza + + +

6 D-Xyloza - - -

7 L-Xyloza - - -

8 Adonitol - - -

9 - - +  Methyl-xylosit

10 Galactoza + + +

11 D-Glucoza + + +

12 D-Fructoza + + +

13 D-Mannoza - - -

14 L-Sorboza - - -

15 Rhamnoza - -

16 Dulcitol - - -

17 Inositol + + +

18 Mannitol + + +

19 Sorbitol - - -

- - - 20  Methyl-D-mannosit

+ + + 21  Methyl-D-glucosit

22 N Acetyl glucosamin + + +

23 Amygdalin + + +

24 Arbutin + + +

25 Esculin + + +

26 Salicin + + +

27 Cellobioza + + +

28 Maltoza + + +

29 Lactoza + + +

30 Melibioza + + +

31 Saccaroza + + +

32 Trehaloza + + +

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

33 Inulin - - -

K16

50 Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

Luận văn Thạc sĩ sinh học Nguyễn Thị Hồng Hà

34 Melezitoza + + +

35 D-Raffinoza + + +

36 Amidon + + +

37 Glycogen + + +

38 Xylitol - - -

39 + + +  Gentiobioza

40 D-Turanoza - + +

41 D-Lyxoza - - -

42 D-Tagatoza - - -

43 D-Fucoza - - -

44 L-Fucoza - - -

45 D-Arabitol - - -

46 L-Arabitol - - -

47 Gluconat - + +

48 2 ceto-gluconat - - -

Chú thích: -: không có phản ứng; +: có phản ứng

49 5 ceto-gluconat - - +

Đối chiếu kết quả này với API profile index, kết hợp với các đặc điểm hình

thái theo khoá phân loại vi khuẩn của Bergey’s, cho thấy mức độ xác định của

chủng vi khuẩn NT05 thuộc Bacillus megaterium (% ID = 84,6 và T = 0,76), được

ký hiệu là B. megaterium NT05.

3.2.3. Phân loại theo sinh học phân tử

Hiện nay, bên cạnh những phương pháp định loại vi sinh vật truyền thống,

các nhà khoa học còn sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử để phân loại dựa trên

trình tự gen. Đối với vi khuẩn xác định trình tự gen 16S rARN là phương pháp đang

được dùng phổ biến. Gen này có mặt trong tất cả các tế bào, chứa vùng bảo thủ cao

và vùng biến đổi cho phép phân biệt giữa các loài khác nhau. Hai chủng NT03 và

NT05 có chỉ số % ID thấp hơn nên được chọn để xác định trình tự 16S.

3.2.3.1. Phân lập đoạn gen mã hoá 16S rARN từ ADN genom của chủng vi

khuẩn NT03 và vi khuẩn NT05

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Tách chiết ADN tổng số là bước khởi đầu để tiến hành các thí nghiệm tiếp

K16

51 Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

Luận văn Thạc sĩ sinh học Nguyễn Thị Hồng Hà theo, hình 3.16 trình bày kết quả điện di sản phẩm tách chiết ADN tổng số từ chủng

NT03 và NT05 trên agaroza 0,8 %. Kết quả kiểm tra trên máy đo quang phổ cũng

cho thấy ADN tổng số tách chiết được có độ tinh sạch cao (A260/280 = 1,85 ÷ 1,91),

mẫu ADN có thể sử dụng làm khuôn để thực hiện phản ứng PCR. Trong quá trình

tiến hành phản ứng, nhiệt độ điều chỉnh bắt cặp của đoạn mồi, nồng độ các đoạn

mồi, MgCl2, cũng như ADN genom khuôn để PCR xảy ra đặc hiệu nhất. Bằng

kỹ thuật PCR sử dụng cặp mồi 16S F và 16S R đã thu được gen mã hoá 16S

M NT05

rARN của chủng vi khuẩn NT03 và vi khuẩn NT05.

1,5 kb

NT03 M

Hình 3.16. Điện di đồ sản phẩm PCR chủng vi khuẩn NT03 và NT05

Kết quả điện di đồ trên hình 3.16 cho thấy sản phẩm PCR thu được 1 băng

rất đặc hiệu. Kích thước phân tử vào khoảng 1,5 kb tương đương với tính toán

lý thuyết.

3.2.3.2. Xác định trình tự gen 16S rARN của chủng vi khuẩn NT03 và NT05

Sản phẩm PCR sau tinh sạch được dùng trực tiếp để xác định trình tự

nucleotit của gen 16S rARN. Sử dụng đoạn mồi đã gắn huỳnh quang của bộ hoá

chất chuẩn, phân tích trên máy xác định trình tự ADN tự động, xử lí bằng

chương trình PC/GENE. Truy cập ngân hàng gen để tìm những loài đã đăng ký

có trình tự tương đồng. Trình tự đoạn gen 16S rARN của chủng NT03 được thể

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

hiện bảng 3.8 và hình 3.17, chủng NT05 được thể hiện ở bảng 3.9 và hình 3.18.

K16

52 Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

Luận văn Thạc sĩ sinh học Nguyễn Thị Hồng Hà

Bảng 3.8. Mức độ tương đồng của gen 16S chủng vi khuẩn NT03 với trình tự của

các chủng trên GenBank

Mã Thông tin chủng % tương đồng

AY775778.1 Bacillus subtilis BFAS 100

HQ236379.1 Bacillus subtilis SL9-9 100

EU257436.1 Bacillus subtilis C8-4 99

AB501113.1 Bacillus subtilis A97 99

FJ528074.1 Bacillus sp. BM2 99

Kết quả bảng 3.8 cho thấy chủng vi khuẩn NT03 có độ tương đồng 100 % so

với chủng Bacillus subtilis. Vì vậy, chủng vi khuẩn NT03 được ký hiệu là B.

subtilis NT03.

1 tgcgcaagct tagagtttga tcctggctca ggacgaacgc tggcggcgtg cctaatacat 61 gcaagtcgag cggacagatg ggagcttgct ccctgatgtt agcggcggac gggtgagtaa 121 cacgtgggta acctgcctgt aagactggga taactccggg aaaccggggc taataccgga 181 tggttgtttg aaccgcatgg ttcagacata aaaggtggct tcggctacca cttacagatg 241 gacccgcggc gcattagcta gttggtgagg taacggctca ccaaggcaac gatgcgtagc 301 cgacctgaga gggtgatcgg ccacactggg actgagacac ggcccagact cctacgggag 361 gcagcagtag ggaatcttcc gcaatggacg aaagtctgac ggagcaacgc cgcgtgagtg 421 atgaaggttt tcggatcgta aagctctgtt gttagggaag aacaagtgcc gttcaaatag 481 ggcggcacct tgacggtacc taaccagaaa gccacggcta actacgtgcc agcagccgcg 541 gtaatacgta ggtggcaagc gttgtccgga attattgggc gtaaagggct cgcaggcggt 601 ttcttaagtc tgatgtgaaa gcccccggct caaccgggga gggtcattgg aaactgggga 661 acttgagtgc agaagaggag agtggaattc cacgtgtagc ggtgaaatgc gtagagatgt 721 ggaggaacac cagtggcgaa ggcgactctc tggtctgtaa ctgacgctga ggagcgaaag 781 cgtggggagc gaacaggatt agataccctg gtagtccacg ccgtaaacga tgagtgctaa 841 gtgttagggg gtttccgccc cttagtgctg cagctaacgc attaagcact ccgcctgggg 901 agtacggtcg caagactgaa actcaaagga attgacgggg gcccgcacaa gcggtggagc 961 atgtggttta attcgaagca acgcgaagaa ccttaccagg tcttgacatc ctctgacaat 1021 cctagagata ggacgtcccc ttcgggggca gagtgacagg tggtgcatgg ttgtcgtcag 1081 ctcgtgtcgt gagatgttgg gttaagtccc gcaacgagcg caacccttga tcttagttgc 1141 cagcattcag ttgggcactc taaggtgact gccggtgaca aaccggagga aggtggggat 1201 gacgtcaaat catcatgccc cttatgacct gggctacaca cgtgctacaa tggacagaac 1261 aaagggcagc gaaaccgcga ggttaagcca atcccacaaa tctgttctca gttcggatcg 1321 cagtctgcaa ctcgactgcg tgaagctgga atcgctagta atcgcggatc agcatgccgc 1381 ggtgaatacg ttcccgggcc ttgtacacac cgcccgtcac accacgagag tttgtaacac

Trình tự đoạn gen 16S rARN của chủng NT03 được thể hiện ở hình 3.17.

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Hình 3.17. Trình tự nucleotit 16S rARN của chủng vi khuẩn NT03

K16

53 Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

Luận văn Thạc sĩ sinh học Nguyễn Thị Hồng Hà

Bảng 3.9. Mức độ tương đồng của gen 16S chủng vi khuẩn NT05 với trình tự của

các chủng trên GenBank

Mã Thông tin chủng % tương đồng

AB738793.1 Bacillus megaterium GMA479 100

JQ739717.1 Bacillus megaterium UT10 100

JQ799103.1 Bacillus aryabhattai KJ-W5 99

JN208059.1 Bacillus megaterium CCMM B583 99

JQ659928.1 Bacillus aryabhattai R8-309 99

CP003017.1 Bacillus megaterium WSH-002 99

JF792521.1 Bacillus aryabhattai MDSR14 99

JF833087.1 Bacillus megaterium Jz11 99

1 gatgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg caagtcgagc gaactgatta gaagcttgct 61 tctatgacgt tagcggcgga cgggtgagta acacgtgggc aacctgcctg taagactggg 121 ataacttcgg gaaaccgaag ctaataccgg ataggatctt ctccttcatg ggagatgatt 181 gaaagatggt ttcggctatc acttacagat gggcccgcgg tgcattagct agttggtgag 241 gtaacggctc accaaggcaa cgatgcatag ccgacctgag agggtgatcg gccacactgg 301 gactgagaca cggcccagac tcctacggga ggcagcagta gggaatcttc cgcaatggac 361 gaaagtctga cggagcaacg ccgcgtgagt gatgaaggct ttcgggtcgt aaaactctgt 421 tgttagggaa gaacaagtac gagagtaact gctcgtacct tgacggtacc taaccagaaa 481 gccacggcta actacgtgcc agcagccgcg gtaatacgta ggtggcaagc gttatccgga 541 attattgggc gtaaagcgcg cgcaggcggt ttcttaagtc tgatgtgaaa gcccacggct 601 caaccgtgga gggtcattgg aaactgggga acttgagtgc agaagagaaa agcggaattc 661 cacgtgtagc ggtgaaatgc gtagagatgt ggaggaacac cagtggcgaa ggcggctttt 721 tggtctgtaa ctgacgctga ggcgcgaaag cgtggggagc aaacaggatt agataccctg 781 gtagtccacg ccgtaaacga tgagtgctaa gtgttagagg gtttccgccc tttagtgctg 841 cagctaacgc attaagcact ccgcctgggg agtacggtcg caagactgaa actcaaagga 901 attgacgggg gcccgcacaa gcggtggagc atgtggttta attcgaagca acgcgaagaa 961 ccttaccagg tcttgacatc ctctgacaac tctagagata gagcgttccc cttcggggga 1021 cagagtgaca ggtggtgcat ggttgtcgtc agctcgtgtc gtgagatgtt gggttaagtc 1081 ccgcaacgag cgcaaccctt gatcttagtt gccagcattt agttgggcac tctaaggtga 1141 ctgccggtga caaaccggag gaaggtgggg atgacgtcaa atcatcatgc cccttatgac 1201 ctgggctaca cacgtgctac aatggatggt acaaagggct gcaagaccgc gaggtcaagc 1261 caatcccata aaaccattct cagttcggat tgtaggctgc aactcgccta catgaagctg 1321 gaatcgctag taatcgcgga tcagcatgcc gcggtgaata cgttcccggg ccttgtacac 1381 accgcccgtc acaccacgag agtttgtaac acccgaagtc ggtggagtaa ccgtaaggag 1441 ctagccgcct aaggtgggac agatgattgg ggtgaagtcg taacaaggta gccgtatcgg 1501 a

Trình tự đoạn gen 16S rARN của chủng NT05 được thể hiện ở hình 3.18.

Hình 3.18. Trình tự nucleotit 16S rARN của chủng vi khuẩn NT05

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Kết quả ở bảng 3.9 cho thấy trình tự 16S rRNA của chủng vi khuẩn NT05

K16

54 Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

Luận văn Thạc sĩ sinh học Nguyễn Thị Hồng Hà được phân tích bằng chương trình Chromas. Sử dụng chương trình Clustalw để so

sánh các trình tự của các chủng vi khuẩn với ngân hàng dữ liệu GenBank. Kết quả

cho thấy chủng vi khuẩn NT05 có độ tương đồng 100 % với chủng Bacillus

megaterium. Chính vì vậy, chủng vi khuẩn NT05 được ký hiệu là B. megaterium

NT05.

3.3. ỨNG DỤNG CÁC CHỦNG VI KHUẨN XỬ LÝ NƢỚC THẢI SAU HẦM BIOGAS QUY MÔ 2,5 M3/MẺ

3.3.1. Đánh giá nƣớc thải trƣớc xử lý

Nước thải sử dụng trong nghiên cứu này là nước thải sau hầm biogas 10 m3

tại xóm Văn Miếu, thôn Đại Phùng, xã Đan Phượng, huyện Đan Phượng, thành phố

Hà Nội, hình ảnh thu mẫu của nhóm đề tài trình bày hình phụ lục 4.

Bảng 3.10. Thành phần của nước thải sau hầm biogas trong nghiên cứu

Kết quả phân tích Thông số Lần 1 Lần 2 Lần 3

pH 6,8 6,2 6,3

COD (mg/l) 4.020 3.780 4.010

2.150 1.620 2.030 BOD5 (mg/ml)

rắn lơ lửng 566 420 536 Chất (TSS), (mg/l)

N tổng số (mg/ml) 759,6 589,4 725,2

P tổng số (mg/ml) 19,41 16,56 18,62

Coliforms, 2,1 x 104 2,4 x 104 2,9 x 104 Tổng MPN/100 ml

SV30 (%) 0 0 0

Màu, (Co-Pt ở pH 7) 260 250 270

Mùi Khó chịu Khó chịu Khó chịu

Kết quả phân tích bảng 3.10 cho thấy nước thải sau hầm biogas có nồng độ

chất hữu cơ và nitơ cao, COD của nước thải dao động 3.780 ÷ 4.020 mg/l. Như

chúng ta đã biết, thông thường trong quá trình xử lý hiếu khí giá trị COD của nước

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

thải từ 1.000 mg/l ÷ 1.500 mg/l thì quá trình xử lý sẽ tốt hơn. Vì vậy để tiến hành thí

K16

55 Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

Luận văn Thạc sĩ sinh học Nguyễn Thị Hồng Hà nghiệm chúng tôi đã pha loãng nước thải theo tỷ lệ 1 nước thải : 2 nước máy. Tiến hành thí nghiệm xử lý nước thải sau hầm biogas quy mô 2,5 m3/mẻ.

3.3.2. Hiệu quả của chế phẩm vi sinh vật trong xử lý nƣớc thải sau hầm biogas

Từ kết quả nghiên cứ u ở trên cho thấy các chủ ng vi khuẩn tuyển cho ̣n có khả năng sử dụng tốt các hợp chất hữu cơ đặc biệt là đường , các axit hữu cơ. Tuy nhiên,

để xử lý được nước thải thì ngoài khả năng sử dụng tốt nguồn đường , axit, tinh bô ̣t,

xenluloza, hemixenluloza, ... thì chúng phải có khả năng kết dính lại với nhau và

lắng xuống sau quá trình xử lý .

Để có thể ứ ng du ̣ng các chủ ng vi khuẩn đã tuyển cho ̣n vào quá trình xử lý

nướ c thải giàu hữu cơ , cần tiến hành thí nghiêm như sau : các chủng giống vi khuẩn đươ ̣c giữ trên môi trườ ng MPA tha ̣ch nghiêng và đươ ̣c hoa ̣t hóa trong môi trườ ng MPA lỏng trên máy lắc tròn 220 vòng/phút, cho đến khi chú ng phát triển tốt , nhiệt độ và thời gian nuôi thích hợp cho từng chủng, số lượng tế bào đạt khoảng 109/ml

dịch nuôi. Thí nghiệm xử lý nước thải sau hầm biogas được thực hiện quy mô 2,5 m3/mẻ, bổ sung 2 % chủng giống. Kết quả bước đầu phân tích nước thải sau 48 giờ được tổng hợp ở hình 3.19 và bảng 3.11.

Hình 3.19. Xử lý nướ c thải quy mô 2,5 m3/mẻ (Tại xóm Văn Miếu, thôn Đại phùng, xã Đan Phượng, huyện Đan Phượng, Hà Nội)

Đối với quá trình xử lý , quá trình tác h bù n ra khỏi hỗn hơ ̣p bù n

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

- nướ c để làm trong nước đã xử lý , đồng thờ i có thể hồi lưu bù n hoa ̣t tính về bể su ̣c khí nhằm

K16

56 Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

Luận văn Thạc sĩ sinh học Nguyễn Thị Hồng Hà duy trì bù n hoa ̣t tính trong bể su ̣c khí ở nồng đô ̣ ổn đi ̣nh là tuyê ̣t đối cần thiết . Do đó khả năng lắng bùn là thong số có ý nghĩa quan trọng , quyết đi ̣nh đến hiê ̣u quả xử lý và tính ổn định của quá trình . Khả năng lắ ng củ a bù n hoa ̣t tính phu ̣ thuô ̣c vào hê ̣ vi sinh vâ ̣t có trong đó . Nếu trong hê ̣ có nhiều thành phần vi sinh vâ ̣t da ̣ng sơ ̣i bù n sẽ khó lắng, khi đó sẽ xảy ra hiê ̣n tươ ̣ng phồng bù n . Các nguyên nhân chủ yếu gây ra hiê ̣n tươ ̣ng phồn g bù n là : do pH không thích hơ ̣p , DO quá thấp , thiếu thành phần dinh dưỡng N, P hay tải lươ ̣ng hữu cơ quá cao . Xác định khả năng tạo bùn lắng của dịch xử lý. Dịch nước thải đã được xử lý lắc đều rót vào ống đong 500 ml. Để lắng

tự nhiên, sau 30 phút ghi lại thể tích bù n lắng hình 3.20 và bảng 3.11.

a/ b/

a/ Nước thải trước xử lý; b/ Nước thải sau xử lý

Hình 3.20. Hình ảnh nước thải trước và sau khi xử lý

Chỉ số Coliforms của nước thải được xác định: Mỗi độ pha loãng được nuôi

cấy lặp lại nhiều lần (3 ÷ 10 lần). Các độ pha loãng được lựa chọn sao cho trong các

lần lặp lại có số lần dương tính và có số lần âm tính. Số lần dương tính được ghi

nhận và so với bảng thống kê Mac Crady. Kết quả xác định chỉ số Coliforms nước

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

thải sau xử lý được trình bày ở hình 3.21.

K16

57 Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

Luận văn Thạc sĩ sinh học Nguyễn Thị Hồng Hà

104

102

103

Hình 3.21. Xác định số lượng Coliforms theo phương pháp MPN

Kết quả hình 3.21 cho thấy nước thải sau xử lý ở các ống là 3 : 1 : 0 tương

ứng với chỉ số Coliorms là 43 x 102= 4.300.

Bảng 3.11. Kết quả phân tích chất lượng nước thải trước và sau xử lý

QCVN 40:2011/TNMT Thông số Đầu vào Đầu ra có chế phẩm Đầu ra không chế phẩm Cột A Cột B

6 ÷ 9 5,5 ÷ 9 pH 6,5 7,1 7,8

100 150 COD, mg/l 1.254 932 96

30 50 750 612 47 BOB5, mg/l

50 100 TSS, mg/l 131 126 94

20 40 N tổng số, mg/l 152 135 29

4 6 P tổng số, mg/l 7,2 6,4 5,7

Màu, (Co-Pt ở pH 7)

Coliforms, 7.500 7.500 4.300 3.000 5.000 Tổng MPN/100 ml

160 80 30 50 150

SV30, % 0 1 9 -

Ghi chú: -: Không có trong QCVN 40:2011/TNMT

Mùi - Không khó chịu Không khó chịu Không khó chịu

Chỉ số bùn lắng của dịch xử lý SV30: Dịch nước thải đã được xử lý lắc đều

rót vào ống đong 500 ml. Để lắng tự nhiên , sau 30 phút ghi lại thể tích bùn lắng .

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Với đầu vào hầu như không có bùn lắng.

K16

58 Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

Luận văn Thạc sĩ sinh học Nguyễn Thị Hồng Hà

Từ kết quả bảng trên cho thấy nướ c thải x ử lý bằng phương pháp hiếu khí ở quy mô phòng thí nghiệm sử dụng 3 chủng vi khuẩn Bacillus licheniformis NT01;

Bacillus subtilis NT03 và Bacillus megaterium NT05 sau 48 giờ xử lý chỉ số SV03

đa ̣t 9 %; BOD đạt 47 mg/l; COD đạt 96 mg/l giảm nhiều so vớ i ban đầu , và chỉ số Coliforms đạt 4.300 MPN/100 ml. Nướ c thải sau khi x ử lý đ ạt tiêu chuẩn loại B

theo QCVN 40:2011/BTNMT và đủ điều kiện thải ra hệ thống nước thải công cộng.

3.3.3. Xây dựng quy trình công nghệ xử lý nƣớc thải sau hầm biogas

Từ những kết quả trên, xây dựng quy trình công nghệ xử lý nước thải sau

hầm biogas bằng biện pháp sinh học sau:

Bể điều hòa tỷ lệ 1 nước thải : 2 nước máy

Sục khí

Chế phẩm vi sinh vật, 2 % giống

Xử lý hiếu khí (10 lít/ phút / 100 lít)

Bể lắng

Phần nước trong (khử khuẩn)

Thải ra môi trường

Nước thải sau hầm khí

Bể chứa bùn

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Hình 3.22. Quy trình công nghệ xử lý nước thải sau hầm biogas quy mô 2,5 m3/mẻ

K16

59 Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

Luận văn Thạc sĩ sinh học Nguyễn Thị Hồng Hà

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

KẾT LUẬN

Đã nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hoá của 3 chủng vi khuẩn

NT01, chủng NT03 và chủng NT05 là các chủng Gram (+), ưa nhiệt, chịu NaCl từ 1

÷ 5 %, pH thích hợp 5 ÷ 8, có khả năng phân giải CMC, tinh bột cũng như làm

loãng gelatin.

Đã sử dụng khóa phân loại của Bergey’s kết hợp với Kit chuẩn hóa sinh API

CHB, cùng với kỹ thuật sinh học phân tử 16S xếp chủng vi khuẩn NT01 là B.

licheniformis NT01, chủng vi khuẩn NT03 là B. subtilis NT03 và chủng vi khuẩn

NT05 là B. megaterium NT05.

Đã xử lý nước thải sau hầm biogas quy mô 2,5 m3/mẻ bằng phương pháp xử

lý hiếu khí sử dụng 3 chủng vi khuẩn B. licheniformis NT01 ; B. subtilis NT03 và B.

megaterium NT05 sau 48 giờ xử lý chỉ số pH 7,8; BOD đạt 47 mg/l; COD đạt 96

mg/l, và đặc biệt chỉ số Coliforms đạt 4.300 MPN/100 ml đạt tiêu chuẩn loại B theo

QCVN 40:2011/BTNMT.

Đã xây trình quy trình công nghệ xử lý hiếu khí nước thải sau hầm khí quy

mô 2,5 m3/mẻ.

KIẾN NGHỊ

Tiếp tục được nghiên cứu bổ sung thêm một số chủng vi sinh vật khác như

xạ khuẩn, vi nấm để tăng hiệu quả xử lý nước thải. Hoàn thiện chế phẩm vi sinh vật

xử lý nước thải giàu hữu cơ và lặp lại thí nghiệm xử lý nước thải giàu hữu cơ quy

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

mô pilot.

K16

60 Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

Luận văn Thạc sĩ sinh học Nguyễn Thị Hồng Hà

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN

1. Nguyễn Thị Hồng Hà, Nguyễn Thế Trang, Nguyễn Thị Đà, Phạm Thị Thu

Phương, Lê Thị Thanh Xuân, Nguyễn Thúy Nga, Lê Quang Sáng, Phạm

Văn Duy (2014). Nghiên cứu đặc điểm sinh học và phân loại một số chủng

vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp xenlulaza phân lập từ nước thải sau hầm

biogas. Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên và Công nghệ,

30,6S.

2. Nguyễn Thế Trang, Nguyễn Thị Hồng Hà, Nguyễn Thúy Nga, Phạm Văn Duy

(2014). Ứng dụng một số chủng vi khuẩn xử lý nước thải giàu hữu cơ sau

hầm biogas, Tuyển tập báo cáo khoa học, Hội thảo khoa học quốc tế “Năng

lượng và tăng trưởng xanh khu vực ASEAN”, Hà Nội 2014. Nhà xuất bản

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Khoa ho ̣c tự nhiên và Công nghê ̣.

K16

61 Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

Luận văn Thạc sĩ sinh học Nguyễn Thị Hồng Hà

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu tiếng Việt

1. Đặng Thị Mai Anh, Tăng Thị Chính, Nguyên Thị Hòa, Nguyên Hồng Khánh

(2013). Ảnh hưởng của điều kiện cấp khí lên sinh trưởng của vi khuẩn Bacillus

thuringiensis var. Kurstaki nuôi cấy trên môi trường bùn hoạt tính, Báo cáo

khoa học, Hội nghi ̣ Công nghê ̣ s inh học toà n quốc 2013, Quyển 2. NXB Khoa học tự nhiên và Công nghệ, 25-29.

2. Lê Trần Bình, Phan Văn Chi, Nông Văn Hải, Trương Nam Hải, Lê Quang Huấn

(2003). Áp dụng các kỹ thuật phân tử trong nghiên cứu sinh vật Việt Nam. NXB

Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội.

3. Tăng Thị Chính (2001). Nghiên cứu các vi sinh vật phân giải xenlluloza trong

phân hủy rác thải hiếu khí và ứng dụng. Luận án tiến sĩ sinh học, Viện Công

nghệ sinh học, Trung tâm Khoa học tự nhiên và Công nghệ Quốc gia.

4. Tăng Thị Chính, Đặng Mai Anh, Nguyễn Thị Hòa, Trần Văn Tựa (2013). Ứng

dụng chế phẩm vi sinh (SAGI - BIO) để xử lý chất thải rắn chăn nuôi lợn, Báo

cáo khoa học, Hội nghị Khoa học Công nghệ Sinh học toàn quốc 2013, NXB

Khoa học tự nhiên và Công nghệ, Hà Nội, 80-84.

5. Hoàng Kim Cơ (chủ biên), Trần Hữu Uyển, Lương Đức Phẩm, Lý Kim Bảng,

Dương Đức Hồng (2000). Kỹ thuật môi trường, NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà

Nội.

6. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đăng Đức, Đặng Hồng Miên, Nguyễn Vĩnh Phước,

Nguyễn Đình Quyến, Nguyễn Phùng Tiến, Phạm Văn Ty (1972). Một số

phương pháp nghiên cứu vi sinh vật, tập 1. NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội.

7. Nguyễn Lân Dũng, Đoàn Xuân Mượu, Nguyễn Phùng Tiến, Đặng Đức Trạch,

Phạm Văn Ty (1976). Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật, tập 2, NXB

Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội

8. Nguyễn Lân Dũng, Đoàn Xuân Mượu, Nguyễn Phùng Tiến, Đặng Đức Trạch và

Phạm Văn Ty (1977). Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, tập 3,

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội.

K16

62 Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

Luận văn Thạc sĩ sinh học Nguyễn Thị Hồng Hà 9. Egorov. N. X (1983). Người dịch: PGS Nguyễn Lân Dũng, Thực tập vi sinh vật

học, NXB “MIR” Maxcơva. NXB Đại học và Trung học chuyên nghiệp, Hà

Nội.

10. Nguyễn Quang Huy, Ngô Thị Kim Toán (2014). Khả năng tích lũy photpho và

tạo biofilm của chủng Bacillus lichenifomis A4.2 phân lập tại Việt Nam. Tạp chí

Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, 30(1): 43-50.

11. Phan Đỗ Hùng, Phạm Thị Hải Thịnh, Trần Thị Thu Lan (2013). Xử lý đồng thời

hữu cơ và nitơ trong nước thải chăn nuôi lợn bằng phương pháp SBR: Ảnh

hưởng của chế độ cấp nước thải. Báo cáo khoa học , Hội nghi ̣ Công nghê ̣ sinh

học toàn quốc 2013, Quyển 2. NXB Khoa ho ̣c tự nhiên và Công nghê ̣, 261-265.

12. Lê Gia Hy, Đặng Tuyết Phương (2010). Enzym vi sinh vật và chuyển hóa sinh

học. Nxb Khoa học tự nhiên và Công nghệ. Hà Nội.

13. Lê Gia Hy, Khuất Hữu Thanh (2010). Cơ sở công nghệ vi sinh vật và ứng dụng,

NXB Giáo dục Việt Nam.

14. Lê Quang Khôi, Trương Trọng Ngôn, Cao Ngọc Diệp (2013). Ứng dụng vi

khuẩn tích lũy poly-phosphat để loại bỏ phosphor hòa tan trong nước thải. Báo

cáo khoa học công nghệ sinh học toàn quốc 2013, Quyển 2. NXB Khoa ho ̣c tự

nhiên và Công nghê ̣, 284-288.

15. Vũ Thúy Nga, Lương Hữu Thành, Phạm Văn Toản (2013). Nghiên cứu cải thiện

chất lượng nước thải chế biến tinh bột sắn bằng chế phẩm vi sinh vật. Báo cáo khoa

học, Hội nghi ̣ Công nghê ̣ sinh học toà n quốc 2013, Quyển 2. NXB Khoa ho ̣c tự nhiên và Công nghê ̣, 389-392.

16. Nguyễn Xuân Nguyên, Trần Quang Huy (2004). Công nghệ xử lý nước thải và

chất thải rắn. NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội.

17. QCVN 40:2011/BTNMT - Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về nước thải công nghiệp

18. TCVN 5988 - 1995 (ISO 5664-1984). Chất lượng nước - Xác định amoni -

Phương pháp chưng cất và chuẩn độ.

19. TCVN 6001 - 1995 (ISO 5815 - 1989). Chất lượng nước - Xác định nhu cầu oxi

sinh hoá sau 5 ngày (BOD5) - phương pháp cấy và pha loãng.

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

20. TCVN 6187 - 2 : 1996 (ISO 9308 - 2 : 1990). Chất lượng nước - Phát hiện và

K16

63 Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

Luận văn Thạc sĩ sinh học Nguyễn Thị Hồng Hà

đếm vi khuẩn Coliform, vi khuẩn Coliform chịu nhiệt và Escherichia coli giả

định - Phần 2: Phương pháp nhiều ống.

21. TCVN 6492 - 1999 (ISO 10523 - 1994). Chất lượng nước - Xác định pH.

22. TCVN 6625 - 2000 (ISO 11923-1997). Chất lượng nước - Xác định chất rắn lơ

lửng bằng cách lọc qua cái lọc sợi thuỷ tinh.

23. TCVN 6185:2008. Chất lượng nước - Kiểm tra và xác định độ màu

24. Quyền Đình Thi, Nông Văn Hải (2008). Những kỹ thật PCR và ứng dụng trong

phân tích DNA, tập 2, NXB Khoa học tự nhiên và Công nghệ, Hà Nội.

25. Phạm Thị Hải Thịnh, Phan Đỗ Hù ng, Trần Thi ̣ Thu Lan (2012). Xử lý đồng thờ i : Ảnh

tỉ lệ giữa cacbon hữu cơ và nitơ . Báo cáo khoa

hữu cơ và nitơ trong nướ c thải chăn nuôi lơ ̣n bằng phương pháp SBR hưở ng củ a chế đô ̣ vâ ̣n hành và học, Hội nghị công nghê ̣ sinh học toà n quốc 2012. NXB Khoa học tự nhiên và Công nghệ, 153-161.

Tài liệu tiếng nƣớc ngoài

26. Bernfeld, A. P. (1995). Methods in Enzymology, 1: pp 149-158.

27. Bhat, M.K (2000). Cellulases and related enzyms in biotechnology. Blotech,

Adv, 18, 355 - 383.

28. Bortone G., Gemelli S., Rambaldi A. And Tilche A. (1992). Nitrification,

Denitrification and Biological Phosphate Removal in Sequencing Batch

Reactors Treating Piggery Wastewater. Wat Sci Tech 26(5-6): pp 977- 985.

29. Chang Won Kim, Myung – Won Choi, Ji-Yeon Ha (2000). Optimazation of

operating mode for sequecing batch reactor (SBR) treating piggery wastewater with high nitrogen, 2nd . Int. Sym. On SBR Technology IWA, 10-12, July, France.

30. Dong-Shan An, Wan-Taek Im, Hee-Chan Yang, Myung Suk Kang, Kwang Kyu

Kim, Long Jin, Myung Kyum Kim and Sung-Taik Lee (2005). Cellulomonas

terrae sp. Nov., a cellulolytic and xylanolytic bacterium isolated from soil.

International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 55: pp

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

1705-1709.

K16

64 Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

Luận văn Thạc sĩ sinh học Nguyễn Thị Hồng Hà 31. Jiayang Cheng, Bin Liu (2011). Nitrification/Denitrification in Intermittent

Aeration Process for Swine Wastewater Treatment. Journal of Environment

Engineering 127(8): pp 705-711.

32. John G. Holt, Noel R. Krieg, Peter H. A. Sneath, James T. Staley and Stanley T. Wiliams (1986). Bergey’s manual of Systematic Bacteriology, 9th Edition, 2.

33. N. Annamalai, R Thavasi, S Vijayalakshmi, T Balasubramanian (2011). A novel thermostable and halostable carboxymethylcellulase from marine bacteria Bacillus licheniformis AU01. World J Microbiol Biotechnol 27: pp 2111-2115.

34. N. Mohammad, J. Keum, Md. J. Alam (2011). Treatment of Swine Wastewater Using Sequecing Batch reactor. Engineering in Agriculture Environment and

Food 4(2): pp 47-53.

35. LL. Bao, L. Dong, H. Xiang-kun, Z. Rong-xin, L. Jie, X. Yang, Guang-qing (2007). Photphorus accumulation by bacteria isolated from a continuous-flow

two-sludge system, J. Environ. Sci. 19(4): pp 391.

36. Tarnitip Rattana, et.al (2008). Reducing of COD from fruit cannery waste

effluent using Candida utilis CBS 1517 in batch culture.

37. Williams, A.G. (1983). Staining reactions for the detection of hemicelluloses – degrading bacteria. FEMS. Microbiol. Lett. 20: 253 - 258. 28. Bernfeld, A. P.

(1995), Methods in Enzymology,1: pp.149-158.

38. ZhiJian Zhang, Jun Zhu, Jennifer King, WenHong Li (2006). A Two-step Fed

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

SBR for Treating Swine manure. Process Biochemistry, 41: pp 892-900.