Luận văn Thạc sĩ Thú y: Giải mã gen kháng nguyên H, phân tích đặc điểm phân tử và xác định phả hệ nguồn gốc của Canine Distemper virus gây bệnh Care ở chó tại Hà Nội

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

ĐỖ ĐỨC THÀNH

GIẢI MÃ GEN KHÁNG NGUYÊN H, PHÂN TÍCH ĐẶC ĐIỂM PHÂN TỬ VÀ XÁC ĐỊNH PHẢ HỆ NGUỒN GỐC CỦA CANINE DISTEMPER VIRUS GÂY BỆNH CARE Ở CHÓ TẠI HÀ NỘI Ngành: Thú y Mã số ngành: 8.64.01.01

LUẬN VĂN THẠC SĨ THÚ Y

Người hướng dẫn khoa học:

1. TS. Đặng Thị Mai Lan - Đại học Nông Lâm Thái Nguyên

2. TS. Đoàn Thị Thanh Hương - Viện Công nghệ sinh học

Thái Nguyên - 2020

i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi được thực

hiện với sự giúp đỡ của:

- Ths. Đỗ Thị Roan, Ths. Nguyễn Thị Khuê, Ths. Phạm Thị Khánh

Linh, KS. Nguyễn Thị Thu Hiền cùng các anh, chị, em Phòng Miễn dịch học -

Viện Công nghệ Sinh học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

- Chủ các Phòng khám Thú y tại quận Hà Đông, Nam Từ Liêm, Cầu

Giấy - Hà Nội đã luôn tạo điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành luận văn.

Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được

ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác.

Tôi xin cam đoan rằng các thông tin trích dẫn trong luận văn đều đã

được chỉ rõ nguồn gốc.

Thái Nguyên, ngày tháng năm 2020

Tác giả

Đỗ Đức Thành

ii

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn này, cùng với sự nỗ lực, cố gắng của bản thân,

tôi xin được đặc biệt bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới cô giáo: TS. Đặng Thị

Mai Lan và TS. Đoàn Thị Thanh Hương, người đã trực tiếp hướng dẫn và

truyền đạt nhiều kinh nghiệm quý báu cho tôi trong quá trình nghiên cứu và

hoàn thành luận văn.

Tôi xin được chân thành cảm ơn tới Ths. Đỗ Thị Roan, Ths. Nguyễn

Thị Khuê, Ths. Phạm Thị Khánh Linh, KS. Nguyễn Thị Thu Hiền cùng các

anh, chị, em Phòng Miễn dịch học - Viện Công nghệ Sinh học - Viện Khoa

học và Công nghệ Việt Nam đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện cho tôi trong quá

trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn này.

Nhân dịp này tôi cũng xin trân trọng cảm ơn Ban Giám hiệu nhà

trường, Ban Chủ nhiệm Khoa Chăn nuôi Thú y, các thầy cô, các anh chị em

đồng nghiệp khoa Chăn nuôi Thú y, Chủ các Phòng khám Thú y tại quận Hà

Đông, Nam Từ Liêm, Cầu Giấy - Hà Nội đã luôn tạo điều kiện tốt nhất để tôi

hoàn thành luận văn.

Lời sau cùng, xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới những người

bạn, người thân trong gia đình và nhất là bố, mẹ đã luôn kịp thời động viên và

tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất để tôi hoàn thành luận văn.

Xin trân trọng cảm ơn tất cả sự giúp đỡ quý báu này.

Thái Nguyên, ngày tháng năm 2020

Đỗ Đức Thành

iii

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN ............................................................................................. i

LỜI CẢM ƠN .................................................................................................. ii

MỤC LỤC ....................................................................................................... iii

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ............................................................... vi

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU ................................................................. vii

DANH MỤC CÁC HÌNH ............................................................................ viii

MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1

1. Tính cấp thiết của đề tài ................................................................................ 1

2. Mục tiêu nghiên cứu ...................................................................................... 2

3. Ý nghĩa của đề tài .......................................................................................... 3

3.1. Ý nghĩa khoa học ....................................................................................... 3

3.2. Ý nghĩa thực tiễn ........................................................................................ 3

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................ 4

1.1. Cơ sở khoa học của vấn đề nghiên cứu ...................................................... 4

1.1.1. Nguyên nhân gây bệnh ............................................................................ 4

1.1.2. Con đường xâm nhập và cách lây lan ..................................................... 4

1.1.3. Cơ chế gây bệnh ...................................................................................... 5

1.1.4. Triệu chứng lâm sàng và bệnh tích ......................................................... 6

1.1.5. Chẩn đoán và phòng, trị bệnh ................................................................. 8

1.2. Cơ sở pháp lý của vấn đề nghiên cứu ...................................................... 14

1.2.1. Đặc điểm sinh học của virus Canine Distemper (CDV) ....................... 14

1.2.2. Tầm quan trọng của việc giải mã hệ gen virus Care ............................. 17

1.3. Tổng quan về tình hình nghiên cứu trên thế giới ..................................... 20

1.4. Tổng quan về tình hình nghiên cứu ở Việt Nam ........................................ 22

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU ............................................................................................... 24

iv

2.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu ............................................................ 24

2.1.1. Đối tượng nghiên cứu............................................................................ 24

2.1.2. Phạm vi nghiên cứu ............................................................................... 24

2.1.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ......................................................... 24

2.2. Nội dung nghiên cứu ................................................................................ 24

2.2.1. Tình hình chó mắc bệnh Care tại một số quận trên địa bàn Hà Nội ..... 24

2.2.2. Thu nhận mẫu bệnh phẩm nhiễm CDV ................................................ 24

2.2.3. Thu nhận gen kháng nguyên H bằng kỹ thuật PCR .............................. 24

2.2.4. Giải trình tự nucleotide và amino acid của gen H ................................ 24

2.2.5. So sánh tỷ lệ đồng nhất về nucleotide và amino acid của chủng CDV

Việt Nam với các chủng của thế giới .............................................................. 24

2.2.6. Xác định phả hệ nguồn gốc của các chủng CDV Việt Nam .................... 24

2.3. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu ....................................................... 25

2.3.1. Vật liệu nghiên cứu ............................................................................... 25

2.3.2. Phương pháp nghiên cứu ....................................................................... 26

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .................... 34

3.1. Kết quả về tình hình chó mắc bệnh Care tại một số Quận trên địa bàn

Hà Nội ............................................................................................................. 34

3.1.1. Tình hình chó mắc bệnh Care tại một số Quận ở Hà Nội ..................... 34

3.1.2. Tỷ lệ chó mắc bệnh Care theo giống..................................................... 35

3.1.3. Tỷ lệ mắc bệnh Care theo lứa tuổi ........................................................ 37

3.1.4. Tỷ lệ chó mắc bệnh Care theo mùa ....................................................... 39

3.1.5. Tỷ lệ chó mắc bệnh Care theo nhóm đã được tiêm phòng và chưa

được tiêm phòng vaccine ............................................................................... 40

3.1.6. Những triệu chứng lâm sàng của chó mắc bệnh Care .......................... 42

3.2. Kết quả về số mẫu xét nghiệm và thu nhận gen H của chó mắc bệnh Care ...... 43

3.3. Kết quả phản ứng PCR và giải trình tự nucleotide, amino acid của

gen H ............................................................................................................... 45

v

3.4. Kết quả phân tích gen H và so sánh với các chủng của thế giới .............. 49

3.5. Kết quả phân tích phả hệ nguồn gốc của các chủng CDV Việt Nam ...... 55

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................................ 58

1. Kết luận ........................................................................................................ 58

2. Đề nghị ......................................................................................................... 59

TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................. 60

vi

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

Canine Distemper Virus CDV:

base pair (cặp base) bp:

Deoxyribonucleic acid DNA:

Ribonucleic acid RNA:

Cyto pathogenic Effect CPE

ELISA Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay

Immunohistochemistry IHC

Immuno Fluorescent test IF

RT-PCR Reverse Transcription Polymesase Chain Reaction

Reverse Transcriptase RT

multiple sequence file msf

deoxynucleotide triphosphate dNTPs:

Molecular Evolutionary Genetics Analysis MEGA

Eppendorf Epp:

Ngân hàng gen NCBI:

Polymerase Chain Reaction PCR:

vii

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU

Bảng 2.1. Bộ mồi thu nhận gen H ................................................................... 25

Bảng 2.2: Các bước tách chiết RNA tổng số .................................................. 27

Bảng 2.3: Thành phần phản ứng chuyển đổi cDNA từ RNA tổng số ............ 28

Bảng 2.4: Thành phần của phản ứng PCR ...................................................... 28

Bảng 2.5: Các bước tinh sạch sản phẩm PCR ................................................. 31

Bảng 3.1. Tỷ lệ chó mắc bệnh Care tại 3 Quận ở Hà Nội............................... 34

Bảng 3.2. Tỷ lệ chó mắc bệnh Care theo giống .............................................. 36

Bảng 3.3. Tỷ lệ chó mắc bệnh Care theo lứa tuổi ........................................... 37

Bảng 3.4. Tỷ lệ chó mắc bệnh Care theo mùa ................................................ 39

Bảng 3.5. Tỷ lệ chó mắc bệnh theo nhóm đã được tiêm và chưa được tiêm

phòng vaccine .................................................................................................. 40

Bảng 3.6. Triệu chứng lâm sàng chủ yếu của chó mắc bệnh Care ................. 42

Bảng 3.7. Các mẫu virus CDV sử dụng trong nghiên cứu ............................. 44

Bảng 3.8. Nồng độ RNA tổng số được đo bằng máy Nanodrop .................... 45

Bảng 3.9. Danh sách các chủng CDV của Việt Nam và thế giới

sử dụng trong nghiên cứu ................................................................................ 49

Bảng 3.10. Tỷ lệ đống nhất về nucleotide và amino acid giữa các chủng CDV

nghiên cứu và các chủng của thế giới ............................................................. 53

viii

Hình 1.1. Mô hình cấu trúc của virus Canine Distemper (CDV) ............................. 15

Hình 1.2. Hình thái của virus Canine Distemper ...................................................... 16

Hình 2.1: Sơ đồ nghiên cứu ...................................................................................... 26

Hình 2.2: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR ........................................................... 29

Hình 3.1. Biểu đồ tỷ lệ chó mắc bệnh Care tại 3 Quận ở Hà Nội ............................. 34

Hình 3.2. Biểu đồ tỷ lệ chó mắc bệnh Care theo giống ............................................ 36

Hình 3.3. Biểu đồ tỷ lệ chó mắc bệnh Care theo lứa tuổi ......................................... 38

Hình 3.4. Biểu đồ tỷ lệ chó mắc bệnh Care theo mùa............................................... 39

Hình 3.5. Biểu đồ tỷ lệ chó mắc bệnh theo nhóm đã được tiêm và chưa được tiêm

phòng vaccine ............................................................................................................ 41

Hình 3.6. Sản phẩm điện di RNA các chủng CDV thu thập được ............................ 43

Hình 3.7. Kết quả điện di sản phẩm PCR nhân gen H của 2 mẫu CDV

nghiên cứu ................................................................................................................. 45

Hình 3.8. Trình tự nucleotide và amico acid (suy diễn) của gen H chủng

CDVHN7 ................................................................................................................... 47

Hình 3.9. Trình tự nucleotide và amino acid (suy diễn) của gen H chủng

CDVHN6 ................................................................................................................... 48

Hình 3.10. Sai khác nucleotide ở cuối gen H dẫn đến sự khác biệt của chủng virus

vaccine so với chủng virus nghiên cứu ..................................................................... 54

Hình 3.11. Cây phả hệ thể hiện mối quan hệ nguồn gốc giữa các chủng CDV nghiên

cứu và các chủng của thế giới ................................................................................... 56

DANH MỤC CÁC HÌNH

1

MỞ ĐẦU

1. Tính cấp thiết của đề tài

Bệnh Care hay còn được gọi là bệnh sài sốt ở chó là một bệnh truyền

nhiễm cấp tính do virus Canine Distemper (Canine Distemper Virus - CDV)

gây ra. Đặc trưng của bệnh là sốt cấp tính, rối loạn tiêu hóa, hô hấp và rối loạn

hệ thần kinh, đặc biệt bệnh có tỷ lệ chết rất cao (Nguyễn Như Pho, 2003).

Bệnh Care được phát hiện lần đầu tiên ở Peru từ thế kỷ XVIII và sau đó

lan ra toàn thế giới như Mỹ, Argentina, Brazil, Mexico, Nam Phi và nhiều

nước châu Âu. Ở châu Á, bệnh được ghi nhận tại Nhật Bản (Lan và cs.,

2006), Thái Lan (Kubo và cs.,2007), Hàn Quốc (Cha và cs.,2013) và Ấn Độ

(Swati và cs.,2015). Tại Việt Nam, bệnh xảy ra tương đối phổ biến và là một

trong những bệnh có tỷ lệ tử vong cao nhất ở chó. Chó mắc bệnh Care bao

gồm chó chưa được tiêm vaccine và cả những chó đã được tiêm vaccine (theo

ghi nhận của các phòng khám thú y).

Virus gây bệnh Care có hệ gen là RNA sợi đơn âm, có kích thước

khoảng 15.7kb, thuộc loài Canine morbillivirus, họ Paramixoviridae, chi

Morbillivirus. Hệ gen mã hóa cho 8 protein, gồm 2 protein không cấu trúc

(protein C và V) và 6 protein cấu trúc là nucleocapsid (N), matrix (M), fusion

(F), hemagglutinin (H), phospho (P) và large (L) protein. Trong đó, protein H

và protein F là 2 protein kháng nguyên, quyết định tính độc lực của virus. Đây

là các gen có nhiều biến đổi nhất giữa các chủng và giữa các genotype nên

được chọn là đối tượng chính cho nghiên cứu dịch tễ phân tử và nguồn gốc

phả hệ (Ke và cs.,2015).

Có ít nhất 14 genotype khác nhau của CDV đã được công bố, bao gồm:

Asia-1, Asia-2, Asia-3, Asia-4, Europe, European wildlife, Arctic, Rockborn-

like, America-1, America-2, Africa, South America-1, South America-2 và

South America-3 (Espinal và cs., 2014; Guo và cs., 2013).

2

Ở châu Á, một số nước đã tiến hành nghiên cứu về đặc điểm phân tử và

xác định được nguồn gốc, genotype của các chủng CDV đang lưu hành. Một

số nghiên cứu cho thấy, các chủng CDV của Trung Quốc thuộc genotype

Asia-1, các chủng của Hàn Quốc thuộc về hai genotype Asia-1 và Asia-2 (An

và cs., 2008), trong khi các chủng CDV phân lập tại Ấn Độ lại tách riêng khỏi

nhóm Asia-1 và Asia-2, gần gũi với các chủng của Thụy Điển, Hungary và

Đức (Cheng và cs., 2015; Swati và cs., 2015). Gần đây đã phát hiện genotype

Asia-4 tại Trung Quốc và Thái Lan.

Gen H (mã hóa protein H) là một trong những gen biến đổi nhất được

dùng để xác định mối liên hệ di truyền giữa các chủng (Gámiz và cs., 2011).

Gen H có khả năng biến đổi cao, quyết định tính dinh dưỡng của tế bào và vật

chủ bằng cách liên kết với phân tử hoạt hóa tế bào lympho báo hiệu (SLAM)

và các thụ thể hoại tử -4 của vật chủ.

Tuy nhiên, nhiều sự kiện tiến hóa có thể đã tạo điều kiện cho CDV

thích nghi với các vật chủ khác nhau và phải được đánh giá bằng cách giải

trình tự bộ gen hoàn chỉnh mới có khả năng xác định được (Duque-Valencia

J. và cs., 2019).

Xuất phát từ những điều kiện thực tiễn trên, tôi đã tiến hành nghiên

cứu đề tài: “Giải mã gen kháng nguyên H, phân tích đặc điểm phân tử và

xác định phả hệ nguồn gốc của Canine Distemper virus gây bệnh Care ở

chó tại Hà Nội”.

2. Mục tiêu nghiên cứu

- Xác định được tình hình mắc bệnh Care trên chó tại một số quận trên

địa bàn Hà Nội.

- Nghiên cứu và xác định được gen kháng nguyên H, phân tích được

các đặc điểm phân tử, xác định được phả hệ nguồn gốc của virus CDV, xác

định genotype của chủng virus gây bệnh Care trên chó tại địa bàn Hà Nội.

3

3. Ý nghĩa của đề tài

3.1. Ý nghĩa khoa học

- Cung cấp tư liệu khoa học về gen kháng nguyên H, đặc điểm phân tử

và phả hệ nguồn gốc của virus CDV gây bệnh Care trên chó.

- Cung cấp thêm thông tin về thành phần, đặc điểm, cấu trúc gen kháng

nguyên H của virus CDV nhằm phát triển vắc xin tái tổ hợp.

3.2. Ý nghĩa thực tiễn

- Bổ sung thêm tư liệu về tình hình mắc bệnh Care trên chó tại Hà Nội

hiện nay.

- Là cơ sở khoa học để từ đó có thể lựa chọn vắc xin phòng, bệnh Care

có hiệu quả nhất.

4

Chương 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Cơ sở khoa học của vấn đề nghiên cứu

Bệnh Care được coi là bệnh cổ điển và phổ biến ở chó trên thế giới

cũng như tại Việt Nam. Bệnh gây thiệt hại rất lớn về kinh tế và là mối lo ngại

cho các nhà chăn nuôi và người nuôi chó. Ở Việt Nam trước đây, có thể nói

các bệnh về chó chưa được quan tâm đúng mức, ngoại trừ ở các trại nuôi và

huấn luyện chó nghiệp vụ. Tuy nhiên ngày nay, các bệnh này ngày càng được

quan tâm nhiều hơn do tầm ảnh hưởng của nó trong đời sống xã hội. Có rất

nhiều loại chó quý, đắt tiền đã được nhập về Việt Nam; nhiều bệnh viện, bệnh

xá thú y, phòng khám và các cơ sở chăm sóc chó mèo đặc biệt đã mọc lên trên

cả nước.

1.1.1. Nguyên nhân gây bệnh

Virus gây bệnh Care là một siêu virus có cấu trúc rất tinh vi thuộc

nhóm paramyxovirus.

Bệnh gây hại cho chó ở tất cả mọi lứa tuổi. Chó một tuổi trở xuống (2 -

6 tháng tuổi) dễ cảm thụ nhất, tỷ lệ mắc bệnh lên đến 70%. Chó đang bú mẹ ít

mắc bệnh, nếu chó mẹ có miễn dịch thì chó mẹ có thể truyền miễn dịch thụ

động cho chó con qua sữa đầu cho tới hơn 1 tháng, có khi tới 3 tháng.

1.1.2. Con đường xâm nhập và cách lây lan

1.1.2.1. Con đường xâm nhập

Virus CDV xâm nhập vào chó qua đường hô hấp, tiêu hóa và da. Chó

thường bài thải virus sau 7 ngày cảm nhiễm, virus lẫn vào các hạt bụi trong

không khí và có thể tồn tại từ 6 - 22 ngày hoặc lâu hơn ngoài môi trường.

Dịch chảy từ mắt, mũi trong cơn sốt đầu tiên của bệnh chứa rất nhiều virus.

Mầm bệnh được thải qua dịch tiết mắt, mũi, nước bọt, phân, nước tiểu…

5

1.1.2.2. Cách lây lan

Bệnh lây do tiếp xúc trực tiếp với con bệnh, con mắc thể ẩn tính, con

mang trùng hoặc gián tiếp do thức ăn, nước uống bị nhiễm những chất bài tiết

của con bệnh. Sự lây nhiễm nhanh hay chậm phụ thuộc vào mật độ chó nuôi

tại vùng đó và tỷ lệ chó được tiêm phòng. Đặc biệt, virus có thể xâm nhập vào

cơ thể qua da qua các vết thương hở (Nguyễn Vĩnh Phước và cs.,1978).

Mặc dù virus được bài tiết qua môi trường thông qua hầu hết các chất

dịch cơ thể, bệnh này ít có khả năng lây lan qua nước tiểu. Chất bài tiết qua

đường hô hấp từ chó bị ho có thể gây bệnh (Hồ Đình Chúc và cs., 1993).

Thời gian ủ bệnh của CDV có thể thay đổi từ 1 đến 4 tuần. Ban đầu,

CDV lây nhiễm qua mô lympho đường hô hấp. Giai đoạn đầu virus nhân lên

và phân bố khắp các mô bạch huyết của toàn thân, dẫn đến ức chế miễn dịch

và sốt. Giai đoạn thứ hai xảy ra từ 6 - 9 ngày sau khi nhiễm bệnh, các tế bào

nhu mô và biểu mô trên khắp cơ thể bị nhiễm trùng (Pope và cs., 2016).

1.1.3. Cơ chế gây bệnh

Khi vào cơ thể vật chủ, đầu tiên, virus nhân lên trong mô lymphoid của

hệ thống hô hấp, trong 24 giờ virus sẽ nhân lên ở đại thực bào và phát tán bởi

hệ lymphocyte tới hạch amydal và các hạch bạch huyết. 2 - 4 ngày sau số

lượng virus tăng lên nhanh chóng và xuất hiện trong máu, amydal, tuyến ức,

lá lách, hạch bạch huyết, tủy xương, mô bạch huyết. Trong 4 - 6 ngày tiếp

theo, lượng virus sẽ tăng lên nhiều lymphocyte ở lá lách, biểu mô dạ dày và

ruột, niêm mạc ruột và tế bào Kuffer trong gan. Sự lan truyền của virus trong

hệ bạch huyết gây ra cơn sốt đầu tiên, cùng lúc đó, virus tiếp tục phá hủy các

lympho bào (bạch cầu lymphô bào, bạch cầu lympho T) dẫn đến suy giảm

bạch cầu (Carter và cs., 1992).

Vào ngày 8 - 9 sau khi bị nhiễm, virus theo máu đến hệ thống thần

kinh trung ương và chó có biểu hiện thần kinh hay không phụ thuộc vào hệ

miền dịch dịch thể và miễn dịch tế bào cua vật chủ.

6

Ngày thứ 9 - 14 sau khi nhiễm trùng, hệ miễn dịch của chó bị suy giảm,

sức đề kháng kém, virus sẽ lan tràn trong các mô kể cả da, tuyến nội - ngoại

tiết, trong mô dạ dày, ruột, đường hô hấp, niệu quản. Virus tồn tại lâu dài

khiến triệu chứng lâm sàng của bệnh trở nặng tới khi con bệnh chết.

1.1.4. Triệu chứng lâm sàng và bệnh tích

1.1.4.1. Triệu chứng lâm sàng

Canine distemper virus (CDV) là một bệnh rất dễ lây lan, chủ yếu liên

quan đến chó non và các động vật ăn thịt nhạy cảm khác với tỷ lệ mắc bệnh

và tử vong cao. Nhiễm trùng CDV được đặc trưng bởi tính chất dinh dưỡng

lympho, thần kinh và biểu mô dẫn đến nhiễm trùng toàn thân với các dấu hiệu

lâm sàng nghiêm trọng và tử vong (Alessia Peserico và cs., 2019).

Biểu hiện bệnh và phụ thuộc vào độ tuổi của chó mắc bệnh, giống chó,

tình trạng sức khỏe, chế độ chăm sóc, nuôi dưỡng cũng như độc lực của mầm

bệnh (Greene và Appel, 1987).

Thời gian ủ bệnh chó mệt mỏi, ủ rũ, ít vận động, sốt cao 40 - 41°C kéo

dài 1 - 2 ngày, chó bỏ ăn, mắt đỏ, sau đó thân nhiệt trở về 38,5 - 39,5°C; chó

tỉnh táo hơn. 3 - 4 ngày sau, xuất hiện đợt sốt thứ 2 kèm theo chảy nước mắt,

nước mũi ban đầu loãng sau đặc dần, đôi khi kèm mủ xanh hoặc máu đen.

Viêm niêm mạc miệng và hạch amidan. Chó ho do viêm thanh quản, viêm

phế quản rồi viêm phổi, ban đầu ho khan, sau ho ướt dẫn đến khó thở, nhịp

thở tăng rõ, suy nhược cơ thể, bỏ ăn, bạch cầu (lympho bào) giảm.

Chó có biểu hiện nôn khan, nôn liên tục, mệt lả, háo nước. Sau đó ỉa

chảy, lúc đầu phân lỏng có màu xám vàng lẫn bọt và niêm mạc dạ dày, ruột

lầy nhày kèm lẫn máu màu cà phê hoặc màu hồng nhớt như máu cá, có mùi

tanh khẳm điển hình, giai đoạn cuối phân sẽ gần như nước do virus CDV đã

làm hỏng hệ tiêu hóa. Chó mất nước và mất chất điện giải nên gầy sút nhanh,

mắt trũng, bụng hóp, đi lại không vững, nằm liệt một chỗ, nhiệt độ hạ, loạn

nhịp tim.

7

Gương mũi khô và bong tróc, chảy nước mũi có màu xanh, thở khó, thở

khò khè. Da dầy lên, nổi các nốt chấm đỏ to bằng hạt đỗ xanh, hạt gạo ở

những vùng da mỏng, có thể loét, chảy mủ (gọi là các nốt sài) làm lông bết

lại, hôi hám, vết thương nhanh chóng lành, không hình thành sẹo. Màng kết

mạc sung huyết, mắt có nhiều ghèn, bị đục, có thể kèm thêm viêm giác mạc

mắt. Sau khi bị bệnh từ 10 đến 15 ngày, ở khoảng 80 - 90% số con bị bệnh, da

ở gan bàn chân, mõm có hiện tượng tăng sinh dày lên và cứng lại, có khi bị

nứt ra làm cho chó đi khập khiễng.

Một số trường hợp chó chạy lung tung không định hướng, sủa rống lên,

miệng chảy rãi rớt, ngã và dãy dụa, sau đó chó tỉnh táo lại nhưng rất mệt,

chệch choạng, co giật và run rẩy liên tục. Chó bài tiết tiểu tiện và đại tiện

không tự chủ. Cuối cùng nằm bệt, loạn nhịp tim, thân nhiệt hạ dẫn đến liệt

chân rồi chết.

Từ khi ủ bệnh cho tới khi xuất hiện các triệu chứng lâm sàng khoảng 14

- 18 ngày, chó thường sốt cao từ 3 - 6 ngày sau khi nhiễm. Carre thể thần kinh

khi chữa khỏi vẫn để lại di chứng (đi xiêu vẹo, mù và điếc, gầy còm....)

1.1.4.2. Bệnh tích

Theo Appel và Gillespie (1972), bệnh tích đại thể có thể gặp bao gồm

sừng hoá da ở mõm và gan bàn chân. Tuỳ theo mức độ kế phát các loại vi

khuẩn mà có thể thấy viêm phế quản phổi, viêm ruột hay mụn mủ ở da...

Tế bào thượng bì đường hô hấp, tiết niệu, lưỡi, mắt, hạch và tuyến

nước bọt có thể tìm thấy tiểu thể Lenst trong nguyên sinh chất tế bào. Chó mẹ

có thai thời kỳ cuối mắc bệnh thì chó con sau khi sinh thường xuất hiện triệu

chứng toàn thân, tổn thương đường hô hấp trên, viêm mũi, viêm phế quản,

viêm kết mạc mắt (Carter và cs., 1992). Viêm kẽ phổi lan toả mà đặc trưng là

sự tăng sinh và dày lên của biểu mô vách phế nang, lòng phế nang bao gồm

các tế bào long vách phế nang và đại thực bào.

8

Xác chết thường gầy, mắt trũng sâu, niêm mạc mũi, miệng viêm cata

đỏ mọng, sưng dầy lên, có nhiều chất nhớt. Phổi viêm, sung to, mầu đỏ thẫm,

khí quản - phế quản có nhiều bọt, nhiều vùng phổi chắc đặc, hạch lympho

sung và xuất huyết, trên vùng da mỏng có nốt sài, xoang bao tim, xoang ngực,

xoang bụng tích nước và não sung huyết. Ruột viêm cata xuất huyết khiến

thành niêm mạc bong ra lẫn máu với phân. Đây chính là nguyên nhân khiến

phân có mùi đặc trưng (Nguyễn Thị Huyền và cs., 2018).

Các biến đổi bệnh tích đại thể của chó nghi mắc Care chủ yếu thể hiện

ở hệ hô hấp (phổi, họng), ở hệ tiêu hóa (ruột non), hạch là nhiều nhất. Các

bệnh tích đặc trưng của bệnh Care trên chó Phú Quốc như sau: Phổi có hiện

tượng viêm xuất huyết ở chó C1, C3, C4, sưng hay xốp dai, có trường hợp

phổi viêm dính với thành ngực. Bên cạnh đó, sung huyết mạch máu ruột và

xuất huyết ruột non ở hầu hết các chó nghiên cứu. Hạch lympho sưng to, xuất

huyết, mặt cắt của hạch lồi có dịch màu hồng chảy ra. Các cơ quan còn lại,

sung huyết, xuất huyết ở mạch máu, não, lách nhồi huyết, dạ dày sung huyết,

gan hơi sưng, túi mật sưng to, thận sưng và màng thận khó bóc (Nguyễn Thị

Lan và Khao Keonam, 2012).

1.1.5. Chẩn đoán và phòng, trị bệnh

1.1.5.1. Chẩn đoán bệnh

* Chẩn đoán dựa vào triệu chứng lâm sàng

Sốt cao, chán ăn hay bỏ ăn, chảy nước mũi, ho, khó thở, có gỉ mắt, nôn

mửa và ỉa chảy nặng đối với chó con, xuất hiện các triệu chứng thần kinh

trong thời kỳ cuối của bệnh, co giật cơ chân, cơ mắt, không đi được hoặc đi

lại khó khăn, lắc đầu, ho ở chó trưởng thành, có các nốt sài ở bụng, bẹn, ngực,

phía trong đùi.... có các triệu chứng trên đường tiêu hóa hoặc triệu chứng thần

kinh thì khả năng chó mắc bệnh Care là rất cao (Hồ Đình Chúc, 1993).

Chẩn đoán ban đầu chủ yếu dựa vào các dấu hiệu lâm sàng liên quan

đến nhiễm trùng. Tuy nhiên, hình thức chẩn đoán này còn gặp nhiều khó

9

khăn vì cần tiến hành phân biệt với các bệnh khác có dấu hiệu hô hấp, thần

kinh và/hoặc tiêu hóa, chẳng hạn như bệnh dại, giảm bạch cầu ở mèo,

coronavirus, toxoplasmosis, vi khuẩn enteritides và parvovirus (Angelika K

Loots và cs., 2017).

* Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

Bằng xét nghiệm sinh hóa và phân tích nước tiểu.

Xét nghiệm huyết thanh học có thể xác định các, kháng thể dương tính,

nhưng xét nghiệm này không thể phân biệt giữa các kháng thể tiêm chủng và

kháng thể được cơ thể con vật sản sinh ra khi tiếp xúc với virus độc hại.

Chụp X-Quang để xác định con vật có mắc bệnh viêm phổi hay không.

Chụp cắt lớp vi tính (CT) và chụp cộng hưởng từ (MRI) có thể được sử dụng

để kiểm tra não đối với bất kỳ tổn thương nào có thể phát triển.

Xét nghiệm tế bào để phát hiện sự hiện diện protein đặc hiệu của virus

hàm trong nguyên sinh chất, chủ yếu trên lớp tế bào biểu mô (Chó còn sống

lấy lớp màng nhầy biểu mô màng sinh dục hoặc niệu đạo. Chó đã chết lấy

mẫu sớm nhất ở các cơ quan: phổi, bàng quang, thận, não, hạch lâm ba…)

* Chẩn đoán virus học

Phân lập virus: bệnh phẩm máu, lách, phổi, nước và chất bài tiết của

con vật.

* Chẩn đoán bằng phương pháp phân lập virus trên môi trường tế bào

Mẫu bệnh phẩm đem nghiền thành huyễn dịch, xử lý kháng sinh, ly

tâm lấy nước trong và lọc qua màng lọc vi khuẩn rồi đem gây nhiễm lên môi

trường tế bào một lớp Vero-DST (tế bào thận khỉ xanh châu Phi có gắn

receptor đặc hiệu cho virus CDV), virus CDV chỉ có thể nhân lên và gây bệnh

tích tế bào (Cyto pathogenic Effect - CPE) khi gây nhiễm lên tế bào phù hợp.

Bệnh tích tế bào do CDV gây ra có thể quan sát được là những thể hợp bào.

Tế bào bị phá hủy màng và xuất hiện nhiều thể vùi. Ở trung tâm vùng tế bào

xuất hiện CPE. Sự xuất hiện nhiều hay ít, nhanh hay chậm của CPE phụ thuộc

10

vào số lượng, độc lực của virus và “tuổi” tế bào. Tế bào mới nuôi cấy thì virus

gây nhiễm dễ dàng hơn, CPE xuất hiện nhanh và nhiều hơn ở những tế bào đã

nuôi cấy nhiều ngày (Lan và cs., 2005).

* Chẩn đoán bằng phản ứng miễn dịch đánh dấu enzym (ELISA)

ELISA (Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay) là một phương pháp

xét nghiệm miễn dịch dựa trên cơ chế liên kết đặc hiệu giữa kháng nguyên và

kháng thể. Trên kháng thể có có gắn enzyme và chất phát quang nhằm phát

hiện ra sự kết hợp kháng nguyên-kháng thể (Nguyễn Bá Hiên và Trần Thị

Lan Hương, 2009).

* Chẩn đoán bằng phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch

Nhuộm hóa mô miễn dịch (Immunohistochemistry - IHC) là phương

pháp có độ chính xác cao cho phép phát hiện kháng nguyên tồn tại trong tổ

chức. Phương pháp này được thực hiện dựa trên nguyên lý là sự kết họp giữa

kháng nguyên và kháng thể đặc hiệu và được phát hiện bằng chất chỉ thị màu

(Nguyễn Hữu Nam, 2010).

* Chẩn đoán bệnh bằng phương pháp miễn dịch huỳnh quang

Phản ứng miễn dịch huỳnh quang IF (Immuno Fluorescent test) có độ

sáng của bước sóng nhất định sẽ phát ra ánh sáng có bước sóng dài hơn.

Phương pháp này được thực hiện dựa trên nguyên lý: dùng kháng thể hoặc

kháng kháng thể đã được nhuộm bằng chất phát huỳnh quang, rồi cho kết hợp

với kháng nguyên - kháng thể khi soi dưới kính hiển vi huỳnh quang sẽ phát

sáng (Nguyễn Bá Hiên và Trần Thị Lan Hương, 2010).

* Chẩn đoán bằng phương pháp RT-PCR/PCR

Phương pháp RT-PCR (Reverse Transcription Polymesase Chain

Reaction) là sự kết hợp giữa phương pháp phiên mã ngược và phương pháp

PCR. Phương pháp này có thể phát hiện các RNA tồn tại với lượng rất thấp

mà khó có thể phát hiện bằng phương pháp khác. Do Taq polymerase sử

dụng trong PCR không hoạt động trên RNA nên trước hết cần chuyển RNA

11

thành cDNA, nhờ enzyme phiên mã ngược Reverse Transcriptase (RT). Sau

đó, cDNA này sẽ được khuếch đại nhờ Taq polymerase. Dấu hiệu xác định

bệnh là sản phẩm nhân bản một đoạn gen đặc hiệu của virus. Sự hiện diện

của sản phấm này thường được nhận biết qua điện di trên gel agarose (Lan

và cs., 2008).

Bên cạnh phương pháp RT-PCR, ngày nay phương pháp chuyển đổi

cDNA được sử dụng rất rộng rãi và hiệu quả trong nghiên cứu giải mã gen.

Hệ gen của virus RNA trước tiên được chuyển đổi thành DNA bổ sung

(cDNA) sử dụng mồi xác suất hecxamer, bộ hóa chất sinh phẩm của Hãng

Fermentas. Tiếp theo sản phẩm cDNA được sử dụng làm khuôn cho phản ứng

PCR. Phương pháp này có ưu điểm là tiết kiệm được lượng khuôn ban đầu và

đỡ tốn kém hơn.

So với các phương pháp chẩn đoán khác, chẩn đoán bằng phương pháp

sinh học phân tử cho độ chính xác tuyệt đối, ngoài ra bằng giải trình tự gen có

thể xác định chính xác các type/genotype của virus gây bệnh.

* Chẩn đoán phát hiện bệnh Care bằng kit chẩn đoán nhanh

Về bản chất, đây là phương pháp xét nghiệm ELISA để phát hiện

kháng nguyên của virus Care trong máu, gỉ mắt và nước mũi của chó. Hai

kháng thể đơn dòng trong thiết bị sẽ kết hợp đặc hiệu với các nhóm quyết

định kháng nguyên khác nhau của virus Care. Sau khi cho bệnh phẩm vào vị

trí đệm cellulose của thiết bị, virus Care sẽ kết hợp với kháng thể đơn dòng

thứ nhất. Rồi phức hợp này kết hợp với kháng thể đơn dòng khác trong màng

nitơ - cellulose của thiết bị để tạo thành hợp chất kép hoàn chỉnh. Kết quả xét

nghiệm được biểu hiện qua các vạch do thiết bị sử dụng theo phương pháp

“sắc ký miễn dịch”.

Ưu điểm: có độ nhạy cao, có thế chẩn đoán bệnh sớm trong thời gian

đầu của bệnh, dễ dàng thực hiện với nhiều loại mẫu bệnh phẩm như huyết

12

tương, huyết thanh, gỉ mắt và nước mũi. Có thể đọc kết quả phản ứng sau 5-

10 phút.

1.1.5.2. Phòng và trị bệnh

* Phòng bệnh

Tiêm vắc xin là biện pháp phòng bệnh phổ biến đối với các bệnh do

virus gây ra nói chung, trong đó có bệnh Care. Vắc xin được tiêm lần đầu cho

chó lúc 2 tháng tuổi. Mũi thứ 2 nhắc lại sau mũi đầu tiên 3 tuần, mũi thứ 3

nhắc lại sau mũi thứ 2 là 3 tuần. Sau đó, tiêm nhắc lại mỗi năm một lần đề

đảm bảo khả năng bảo hộ.

Thị trường thuốc thú y Việt Nam hiện nay, vắc xin phòng bệnh Care

cho chó khá phong phú về chủng loại do doanh nghiệp trong nước sản xuất và

nhập khẩu từ nước ngoài như Intervet - Hà Lan, Merial - Pháp, Biocan - Cộng

hòa Séc, Pfizer - Mỹ, Fort Dodge Animal Health - Mỹ. Thống kê từ danh mục

vắc xin và chế phẩm sinh học được phép nhập khẩu năm 2008 cho thấy có tới

17 loại vắc xin phòng Care và 1 loại kháng huyết thanh (Homoserum -

Merial, Pháp) để phòng và điều trị bệnh này.

Xí nghiệp thước thú y Trung ương (Vetvaco) đã chế tạo được vaccine

phòng bệnh Care từ chủng virus nhược độc đông khô, sản xuất qua môi

trường tế bào xơ phôi gà một lớp, mỗi liều chứa tối thiểu 103 TCID50 virus.

Khi phát hiện chó nghi mắc bệnh Care phải cách ly triệt để, điều trị

bằng kháng huyết thanh hoặc xử lý đúng quy trình để tránh lây lan cho chó

khỏe mạnh. Chó chết do mắc bệnh phải được chôn sâu, rắc vôi bột. Chuồng

trại và môi trường nuôi thả phải được vệ sinh sạch sẽ, phun sát trùng đầy đủ

bằng Vim iodin hoặc Han iodin 5% hoặc nước vôi 10%.

* Trị bệnh

Hiện nay, chưa có loại thuốc kháng virus CDV nào đặc hiệu. Chủ yếu

là điều trị triệu chứng và chống phụ nhiễm, hỗ trợ mất nước và chất điện giải.

Nếu con vật chán ăn hoặc bị tiêu chảy, có thể dùng chất hỗ trợ tiêm, truyền

13

tĩnh mạch. Cầm ỉa chảy bằng cách cho uống thuốc đặc trị tiêu chảy Imodium

uống I viên/con, sau 12h mà con vật vẫn bị tiêu chảy thì uống tiếp viên thứ 2;

Bisepton: uống nửa viên đối với chó nhỏ, chó to uống 1 viên, uống cho tới khi

khỏi tiêu chảy; Hampiseptol: tiêm bắp 1ml/ 10kgP. Dùng kháng huyết thanh:

liều 15 - 30ml/con, tiêm sớm. Khi con vật đã có triệu chứng viêm phổi hay

triệu chứng thần kinh thì kháng huyết thanh không có tác dụng. Lấy gỉ khỏi

mắt và mũi con vật, sau đó làm sạch mắt mũi thường xuyên bằng cách nhỏ

nước muối sinh lý 0,9%. Giảm tình trạng con vật bị nôn bằng cách tiêm

Atropin hay Primeran tiêm dưới da. Bổ sung nước và chất điện giải bằng cách

cho uống Ozeron 5%, tiêm nước muối sinh lý 0,9% hay nước đường Glucoza

5% vào tĩnh mạch khoeo của chó.

Thuốc kháng sinh được sử dụng để kiểm soát các triệu chứng do nhiễm

khuẩn thứ phát, gentamycin (tiêm bắp) 8 - 10 mg/kg, 2 lần/ngày, streptomycin

(tiêm bắp) 10 - 20mg/kg, 2 lần/ngày. Meprobamat (an thần) cho chó nhỏ uống

1 viên/ngày, chó to 2 viên/ngày trong 3 ngày. Ngoài ra, phenobarbital và

kalibromua có thể được sử dụng để kiểm soát các cơn co giật.

Điều trị nhiễm CDV thường điều trị triệu chứng và hỗ trợ vì không có

loại thuốc kháng virus cụ thể nào. Các nghiên cứu về tác dụng in vitro của các

hợp chất kháng virus trong điều trị CDV đang được tiến hành nhằm xác định

tính an toàn và hiệu quả của chúng trong việc điều trị (Angelika K Loots và

cs., 2017).

Krumm S. A. và cs. (2014) đã đánh giá một chất ức chế virus pan-

morbillivirus có sẵn bằng đường uống, ổn định trong thời hạn sử dụng khi

điều trị cho chồn bị nhiễm CDV bằng thuốc ức chế và nhận thấy những con

chồn này giảm lượng virus trong máu, không có triệu chứng và sẽ hồi phục

sau khi nhiễm bệnh trong khi các con chồn đối chứng không qua khỏi.

Các hợp chất khác như fucoidan, một polysaccharide sulfat được tìm

thấy trong tảo nâu, cũng đã được đánh giá về khả năng hoạt động như thuốc

14

kháng virus chống lại CDV (Trejo-Avila và cs., 2014). Kết quả in vitro cho

thấy fucoidan có thể ức chế các bước ban đầu của chu trình nhân lên của

virus, ngăn chặn mạnh sự hình thành hợp bào trong các tế bào bị nhiễm bệnh.

Carvalho O. V. và cs. (2013) đã đánh giá hoạt tính kháng virus của một

số flavonoid (quercetin, morin, rutin và hesperidin) và các axit phenolic (axit

cinnamic, trans - cinnamic và ferulic), tập trung vào khả năng in vitro của

chúng để ức chế các giai đoạn của chu trình sao chép CDV. Tất cả các

flavonoid và axit phenolic đã chứng minh tác dụng kháng virus chống lại sự

lây nhiễm của CDV.

Ngoài ra, các phương pháp điều trị nhiễm CDV khác đã được xác định

bao gồm liệu pháp tế bào gốc trung mô và sử dụng chế phẩm dược phẩm thú

y chứa các hạt nano bạc (Angelika K Loots và cs., 2017).

1.2. Cơ sở pháp lý của vấn đề nghiên cứu

1.2.1. Đặc điểm sinh học của virus Canine Distemper (CDV)

1.2.1.1. Đặc điểm cấu trúc hệ gen của virus CDV

Virus CDV được bao phủ bởi các gai glycoprotein có kích thước 8 - 14

nm và chứa một nucleocapsid đối xứng xoắn ốc, có chiều dài 1μm và đường

kính 18nm (MacLachlan và Dubovi, 2011).

Hệ gen CDV là phân tử RNA sợi đơn âm, có kích thước khoảng 15.7

kb, không chứa đầu 5'-UTR và không có chuỗi poly (A) ở đầu 3'-UTR, nhưng

có các phân tử mã hóa thực hiện chức năng của vùng 5'-UTR và vùng 3'-

UTR. Hệ gen của virus mã hóa cho hai protein không cấu trúc (là C và V

protein) và 6 protein cấu trúc, gồm: large protein (L), haemagglutinin (H),

phosphoprotein (P), nucleocapsidprotein (N), fusion protein (F) và matrix

protein (M) (Diallo, 1990).

15

Hình 1.1. Mô hình cấu trúc của virus Canine Distemper (CDV)

(Nguồn: www.veteriankey.com)

Protein không cấu trúc (C) được mã hóa từ một khung đọc mở khác ở

gen P (Lamb và Kolakofsky, 2001). Chức năng của protein C cho đến nay vẫn

chưa được xác định rõ ràng.

Protein N: là nucleocapsid, có khối lượng phân tử 58 kDa bao quanh và

bảo vệ cho hệ gen của virus. Protein này rất nhạy cảm với những chất phân

giải protein.

Protein P: là phosphoprotein, có khối lượng phân tử 54,9 - 66 kDa,

nhạy cảm với những yếu tố phân giải protein, đóng vai trò quan trọng trong sự

sao chép của RNA (Sidhu và cs., 1993).

M: Matrix, khối lượng phân tử 34 - 39 kDa, đóng vai trò quan trọng

trong sự trưởng thành của virus và nối nucleocapsid với những protein vỏ bọc

(Sidhu và cs., 1993).

F: Fusion là glycoprotein trên bề mặt của vỏ bọc, khối lượng phân tử 59

- 62 kDa, đóng vai trò trong sự kết hợp virus với thụ thể màng tế bào, dẫn đến

kết hợp nhiều tế bào cảm nhiễm (hợp bào).

H: Protein ngưng kết hồng cầu (Haemagglutinin) hay yếu tố kết dính, là

glycoprotein thứ hai của vỏ bọc virus, khối lượng phân tử 76 - 80 kDa, đóng

vai trò gắn virus vào tế bào đích, quyết định tính kháng nguyên của virus.

16

L: Large protein, có khối lượng phân tử lớn 180 - 200 kDa, do đó nó

thể hiện phần lớn các hoạt động của RNA polymerase (Diallo,1990).

Trong đó, protein H được mã hóa bởi gen H là protein kháng nguyên,

quyết định tính kháng nguyên và độc lực của virus. Độ dài gen H của các

chủng virus Care đã được công bố là 1824 bp. Đây là protein có vai trò quan

trọng nhất trong hệ gen của virus và thường được sử dụng trong phân tích xác

định genotype và nguồn gốc phả hệ của virus CDV.

1.2.1.2. Hình thái của virus CDV

Hình thái virus CDV quan sát được dưới kính hiển vi điện tử có hình

vòng tròn, hình bán nguyệt do các sợi tóc cuộn tròn hình thành. Dạng vòng

tròn này có đường kính từ 115 - 230 nm. Màng cuộn kép có độ dày từ 75 -

85Ao với bề mặt phủ các sợi xoắn ốc từ bên trong ra (Kennedy và cs., 1989).

Hình 1.2. Hình thái của virus Canine Distemper

(Nguồn: http://www.marvistavet.com/canine-distemper)

1.2.1.3. Phân loại virus gây bệnh Care

Virus gây bệnh Care là Canine Distemper Virus - CDV, thuộc:

Loài: Cannine morbilivirus

Họ: Paramixoviridae

Giống: Morbillivirus

Là một virus có kích thước tương đối lớn, đường kính 150 - 250nm, cấu

trúc xoắn, nhân là một RNA sợi đơn, có vỏ Lipoprotein. Virus này chỉ có một

17

serotype duy nhất nhưng có nhiều chủng được phân lập ở nhiều khu vực địa lý

khác nhau trên thế giới và có những đặc trưng riêng (Lê Thị Tài, 2006). Virus

CDV có mối liên quan gần gũi về tính kháng nguyên và sinh lý với virus gây

bệnh sởi ở người và virus dịch tả trâu bò (Lan NT và cs., 2005).

Nguyen Thi Lan và cs. (2008) đã mô tả cây phân loại dựa trên việc giải

trình tự gen mã hóa protein H. Kết quả nghiên cứu cho thấy: trên thế giới có 5

type virus lớn, phân lập tại những vùng địa lý khác nhau, đó là: genotype châu

Âu (Europe), cổ điển (classic type), Asia 1, Asia 2 và America. Chủng gây

bệnh tiêu chuẩn là chủng Snyderhill thuộc genotype cổ điển. Viện Thú y Việt

Nam đã và đang sử dụng chủng này để công cường độc, kiểm nghiệm hiệu

lực của vaccine phòng bệnh Care trên chó (Lê Thị Tài, 2006).

1.2.2. Một số hiểu biết về gen H và tầm quan trọng của việc giải mã hệ gen

virus Care

Bộ gen của virus Care là sợi RNA đơn khoảng 15,7kb, mã hóa cho 8

loại protein. Trong đó, protein H giữ vai trò quan trọng trong việc gắn virus

vào tế bào đích, có nhiệm vụ là kênh protein màng tế bào và cũng có thể giữ

vai trò là protein kháng nguyên màng của virus. Gen mã hóa cho protein H có

sự biến đổi khá lớn giữa các chủng virus khác nhau. Chính vì vậy, trình tự

nucleotide của vùng gen H thường được lựa chọn để nghiên cứu về dịch tễ

học phân tử và đánh giá sự biến đổi di truyền giữa các chủng virus CDV

(Hashimoto và cs., 2001; Lednicky và cs., 2004).

Đoạn gen protein H này chứa một khung đọc mở mã hóa cho khoảng

607 axid amin, trình tự nucleotide và axit amin dự đoán của gen H của CDV

Haku93 và Haku00 cho thấy sự tương đồng cao (Hirama K. và cs., 2004), do

đó việc nghiên cứu đặc tính sinh học phân tử của các chủng virus Care dựa

trên trình tự nucleotide của đoạn gen H là cần thiết để hiểu mối quan hệ di

truyền giữa các chủng virus nghiên cứu.

18

Có hai kiểu gen hemagglutinin riêng biệt đã được xác định trong virus

gây bệnh Care ở chó từ năm 1991 tại Nhật Bản. Một là kiểu gen KDK-1 bản

địa, chiếm ưu thế về mặt số lượng, trong khi kiểu kia là kiểu gen 98-002 có

thể đã phát triển ở Viễn Đông bên ngoài biên giới giữa Nhật Bản và Hàn

Quốc (Hashimoto và cs., 2001).

Messling và cs. (2001) cho biết: protein H là yếu tố chính quyết định

hiệu quả dung hợp. Một hệ thống di truyền ngược để tạo ra các CDV tái tổ

hợp đã được thiết lập dựa trên một plasmid chứa trình tự kháng gen có chiều

dài đầy đủ của CDVOS. Các vùng mã hóa của protein H của tất cả các chủng

CDV và MVEdm đã được đưa vào nền tảng di truyền CDV và MV, và các vi

rút tái tổ hợp rCDV-H5804, rCDV-HOL , rCDV-HEdm, rMV-H5804, rMV-HOL và

rMV-HOS đã được phục hồi. Do đó, các protein H của hai morbillivirus có thể

hoán đổi cho nhau và có đầy đủ chức năng trong một phức hợp dị loại.

Gen H của CDV có sự biến đổi di truyền lớn nhất và được sử dụng

rộng rãi để khảo sát tính đa hình ở các chủng CDV. Dựa trên sự biến đổi của

gen H, các chủng CDV có thể được nhóm thành ít nhất 14 dòng di truyền liên

quan đến vùng địa lý: châu Á-1, châu Á-2, châu Á-3, châu Á-4, châu Âu,

động vật hoang dã châu Âu, giống Bắc Cực, Rockborn-like, America-1,

America-2, Africa, South America-1, South America-2 and South America-3

(Li W. và cs., 2018).

Trong số sáu protein cấu trúc được mô tả cho CDV, protein H có sự

biến đổi di truyền lớn nhất và là protein quan trọng trong việc gắn virion vào

các thụ thể trên bề mặt tế bào chủ. Tính đặc hiệu mà CDV-H tương tác với

SLAM và tiềm năng của nó như một yếu tố quyết định phạm vi vật chủ đã

được nghiên cứu. Các gốc axit amin Y525, D526 và R529 của CDV-H đã

được xác định bằng cách gây đột biến hướng vào vị trí để tương tác với

SLAM (Angelika K Loots và cs., 2017).

19

Protein H phần lớn được biết đến là có sự biến đổi kháng nguyên và

các kháng thể đối với protein H rất quan trọng đối với khả năng miễn dịch bảo

vệ chống lại nhiễm trùng. Do tính chất biến đổi di truyền của nó, gen H đã

được sử dụng để xác định các dòng di truyền CDV có liên quan đến nguồn

gốc địa lý mà các dòng được phát hiện (Chutchai Piewbang và cs., 2019) [].

Các phân tích trình tự gen chỉ ra rằng protein H liên quan đến khả năng

di truyền ở các khu vực địa lý khác nhau, tập trung ở châu Mỹ 1 (bao gồm

hầu hết các chủng vắc xin thương mại có sẵn), châu Mỹ 2, châu Á 1 và 2,

châu Âu/Nam Mỹ 1, châu Âu động vật hoang dã, Nam Mỹ 2 và 3, Bắc Cực,

giống Rockborn, châu Phi và châu Phi 2. Kiểu gen được xác định trên cơ sở

các chủng nằm trong cùng một nhánh có sự tương đồng >95%về axit amin

trong protein H của chúng. Sự lây nhiễm của CDV có thể được ngăn ngừa

bằng một phản ứng miễn dịch đầy đủ của vật chủ chống lại protein

H (Angelika K Loots và cs., 2017).

Tại thành phố Hồ Chí Minh, Nguyễn Văn Dũng và cs. (2018) đã phát

hiện được gen H trong 5 chó nuôi bị bệnh tiêu chảy thuộc giống chó Việt

Nam và hai trong số các chủng CDV phát hiện được phân lập thành công với

toàn bộ bộ gen là CDV/dog/HCM/33/140816 đều thuộc genotype Asia-1 và

có độ tương đồng khá cao (98,4 - 99,3%) với các chủng CDV từ Trung Quốc.

Các gen hemagglutinin có 1824 nucleotit và mã hóa cho các protein H,

trong đó cho thấy sự thay đổi lớn nhất trong CDV khi so sánh với

morbillivirus khác. Gen này có sự khác biệt cao nhất trong bộ gen CDV với tỷ

lệ thay thế trong khoảng 5,4×10-4 -1,8×10-3 lần thay thế nucleotide trên mỗi vị

trí, mỗi năm. Protein H xác định tính hữu cơ của virus và bắt đầu lây nhiễm

bằng cách liên kết với thụ thể truyền tín hiệu phân tử kích hoạt tế bào lympho

(SLAM) trong tế bào miễn dịch và thụ thể hoại tử -4 trong tế bào biểu

mô. Khi chó hồi phục sau nhiễm trùng/bệnh tự nhiên do CDV, chúng sẽ phát

20

triển các kháng thể trung hòa chống lại protein H, giúp tạo ra khả năng miễn

dịch suốt đời đối với các bệnh (Duque-Valencia J. và cs., 2019).

1.3. Tổng quan về tình hình nghiên cứu trên thế giới

Bệnh sài sốt ở chó đã được phát hiện đầu tiên ở Peru, sau đó lây lan

sang Tây Ban Nha trong thế kỷ 17. Theo như mô tả của Antonio de Ulloa vào

năm 1746: vào khoảng giữa thế kỷ 18, căn bệnh lần đầu tiên được báo cáo ở

Tây Ban Nha, tiếp theo là Anh, Ý (1764) và Nga (1770) (Blancou, 2004). Còn

theo Appel và Gillespie (1972), bệnh Care ở chó được báo cáo lần đầu tiên ở

châu Âu vào năm 1760. Các triệu chứng lâm sàng và tiến triển của bệnh đã

được mô tả từ năm 1809 bởi Edward Jenner.

Năm 1905, bác sĩ thú y người Pháp Henri Carré đã phân lập được mầm

bệnh từ nước mũi của chó bị bệnh, ông đã lọc mẫu bệnh phẩm qua màng lọc

vi khuẩn và đem gây bệnh thực nghiệm cho chó khỏe mạnh khác thì thấy vẫn

gây được bệnh. Vì thế, ông kết luận nguyên nhân của bệnh là do virus. Sau

này, người ta lấy tên ông để đặt tên cho mầm bệnh và tên bệnh (David và

Martin, 1979). Gần đây, bệnh còn được ghi nhận ở các nước châu Á như Nhật

Bản, Thái Lan, Hàn Quốc, Trung Quốc, Ấn Độ và Việt Nam (Kubo và cs.,

2007; An và cs., 2008; Swati và cs., 2015; Dung và cs.,2016; Đoàn Thị Thanh

Hương và cs.,2018).

Vào năm 1923, Putoni lần đầu tiên tạo ra được vaccine nhược độc, tuy

nhiên vaccine này độc lực vẫn còn cao. Từ năm 1948 về sau, với sự phát triển

mạnh mẽ của virus học, nhiều vaccine phòng bệnh Care có hiệu quả đã được

tìm ra. Trong nhiều thập kỷ, bệnh Care đã được khống chế bằng vắc xin. Tuy

nhiên thời gian gần đây các ổ dịch lại liên tiếp nổ ra ở nhiều nước khác nhau,

kể cả ở những chó chưa được tiêm vaccine cũng như những chó đã được tiêm

vaccine (Demeter và cs., 2010).

Hiện nay, bệnh có ở khắp nơi trên thế giới, không những xảy ra ở chó

nuôi mà còn ở nhiều quần thể động vật hoang dã. Tại Brazil, tỷ lệ nhiễm CDV

21

ở chó hoang rất cao do chó không được tiêm chủng. Do đó, đòi hỏi những

nghiên cứu mới về dịch tễ học phân tử. Kết quả phân tích sinh thái học vào

những năm 1980 cho thấy, các chủng có nguồn gốc từ Brazil chủ yếu tập

trung tại Nam Mỹ (SAI) clade 1. Người ta cho rằng những chó mắc bệnh Care

nhưng không biểu hiện triệu chứng rõ ràng đã trở thành mối đe dọa nghiêm

trọng cho công tác bảo tồn nhiều loài thú ăn thịt và thú có túi. Con người là

tác nhân làm gia tăng sự tiếp xúc của chó nuôi với động vật hoang dã, kéo

theo sự lan truyền bệnh vào các quần thể mới và các vùng địa lý mới. Do dân

số của con người trên trái đất tiếp tục phát triển và xâm phạm môi trường

sống của các loài động vật hoang dã, khiến bệnh này có thể sẽ tiếp tục lây lan

vào quần thể động vật mới. Các thống kê cho thấy, bệnh Care là một trong

những nguyên nhân chính dẫn đến sự tuyệt chủng của chồn chân đen, hổ

Tasmania và là nguyên nhân gây tử vong của chó hoang dã châu Phi

(Assessment, 2005).

Năm 1991, bệnh xảy ra trên quần thể sư tử Serengeti ở Tanzania làm

giảm 20% số lượng toàn đàn (Timothy và cs., 2009). Còn vào năm 2014,

virus gây bệnh Care đã được các nhà khoa học xác định là nguyên nhân, ít

nhất là một phần của sự suy giảm số lượng hổ ở loài hổ Amulet ở Nga

Sikhote - Alin Biosphere Zapovednik (SABZ). Năm 2018, một nghiên cứu

mới được công bố trên tạp chí Journal of Wildlife Diseases mô tả trường hợp

đầu tiên của bệnh CDV được phát hiện trong một con báo cái 2 tuổi thuộc bộ

báo Viễn Đông hoang dã.

Li W. và cs. (2018) đã phân lập thành công 9 mẫu CDV từ bệnh phẩm

trong phân và dịch mắt của 20 chó nghi mắc bệnh. Kết quả cho thấy, ba mẫu

CDV (ANHAO, 11HAO và 2HAO) thu được từ những chó đã được tiêm

phòng vaccine và sáu CDV (56hao, xiaosi, 54hao, 55hao, 14hao và 17hao)

thu được từ những chó không được tiêm phòng.

22

Các gen H của những virus này được nhân bản với các cặp mồi: CDV-

WH1 (5′-AACAATGCTCTCCTACCAAGA-3′) và CDV-WH2 (5′-

AATGCTAGAGATGGGTTTATT-3′) và giải trình tự. Trình tự gen H của ba

CDV phân lập từ chó đã tiêm phòng được nộp vào cơ sở dữ liệu NCBI với số

gia nhập: MG922460, MG922458 và MG922459.

Chutchai Piewbang và cs. (2019), trình tự bộ gen hoàn chỉnh của 8

chủng CDV được phân lập từ chó nhà ở Thái Lan là (CDV1-3, -5, -8

TH/2014) được nhóm lại như một dòng Asia-4 mới, trong khi CDV4, -6, -7

TH/2014 thuộc dòng Asia-1.

Cho đến nay đã có tổng số 82 hệ gen của CDV của thế giới được giả

mã toàn bộ hệ gen và đăng kí trên Ngân hàng Gen, bao gồm các chủng virus

phân lập tại Mỹ, Anh, Italia, Thụy Điển, Brazil, Canada, Kazakhstan,

Uruguay, Trung Quốc, Nhật Bản và một chủng của Việt Nam.

1.4. Tổng quan về tình hình nghiên cứu ở Việt Nam

Ở Việt Nam, lần đầu tiên bệnh được phát hiện từ năm 1920. Cho đến

nay, bệnh xảy ra ở hầu hết các tỉnh thành trên cả nước và gây thiệt hại lớn do

tỷ lệ tử vong của bệnh rất cao (Trần Văn Nên và cs., 2016).

Ở nước ta, bệnh Care cũng được nhiêu nhà thú y quan tâm. Các nghiên

cứu của các tác giả nhận thấy chó mắc bệnh Care sẽ xuất hiện các triệu chứng

đặc trưng: sốt, viêm phổi, viêm ruột và các nốt sài ở vùng da mỏng. Cuối thời

kỳ của bệnh, chó thường có triệu chứng thần kinh. Bệnh trở nên trầm trọng hơn

do sự kế phát của vi khuẩn ký sinh sẵn có ở đường tiêu hóa, hô hấp. Bệnh Care

thường biểu hiện ở hai dạng: viêm phổi và viêm ruột. Khi mắc bệnh Care con

vật có biểu hiện sốt rất cao trên 40°C. Tất cả các giống và lứa tuổi đều mẫn cảm

với bệnh sài sốt, tuy nhiên đối với giống chó ngoại và chó non thì chúng lại

mẫn cảm hơn (Tô Du và Xuân Giao, 2006). Các nghiên cứu về bệnh mới chủ

yếu tập trung về dịch tễ học, triệu chứng, bệnh tích và một số biến đối bệnh lý

23

của bệnh (Hồ Đình Chúc và cs., 1993; Lê Thị Tài, 2006; Nguyễn Thị Lan và

Khao Keonam, 2012; Nguyễn Thị Lan và Trần Trung Kiên, 2010).

Việc phân lập virus và nghiên cứu gen học hệ gen virus vẫn còn rất hạn

chế. Năm 2008, một chủng virus Care (CDV-768) đã được nghiên cứu đặc

tính sinh học và gây bệnh thực nghiệm (Nguyễn Thị Lan và cs., 2015). Một số

nghiên cứu khác cũng đã được thực hiện trong thời gian gần đây nhưng chỉ

tập trung vào triệu chứng lâm sàng và bệnh lý (Nguyễn Thị Lan và cs., 2015;

Trần Văn Nên và cs., 2016).

Cho đến nay đã có một số công bố về sinh học phân tử giải mã 01 hệ

gen virus Care tại Việt Nam (Dung và cs., 2016). Khi so sánh về trình tự

nucleotide ở gene H giữa 5 chủng virus nghiên cứu với nhau kết quả thu được

chủng CDV-VNUA-768 có số lượng vị trí sai khác so với chủng CDV-HUA-

02H, CDVHUA-03R, CDV-HUA-04H và CDV-HUA-05P lần lượt là: 126,

131, 154, 16 vị trí. Chủng CDVHUA-02H có số lượng vị trí sai khác so với

chủng CDV-HUA-03R, CDV-HUA-04H và CDV-HUA-05P lần lượt là: 7,

153, 124 vị trí. Chủng CDV-HUA-03R có số lượng vị trí sai khác so với

chủng CDV-HUA-04H và CDVHUA-05P lần lượt là 156 và 128 vị trí. Chủng

CDV-HUA-04H có 154 vị trí sai khác so với chủng CDV-HUA-05P (Trần

Văn Nên và cs., 2017).

Lan và cs. (2005), đã nghiên cứu thành công đặc tính sinh trưởng cụ thể

của một số chủng CDV trên dòng tế bào Vero có gắn receptor tương ứng với

virus Care (Vero-DogSLAMtag hay Vero-DST). Qua đó, tác giả cũng chỉ ra

tế bào Vero-DST là dòng tế bào thích hợp có thể sử dụng để phân lập và xác

định hiệu giá virus.

Năm 2018, Nguyễn Văn Dũng và cs. (2018) đã nghiên cứu và phát hiện

gen H của CDV với các chủng phân lập là CDV/dog/HCM/33/140816 và

CDV/dog/HCM/38/140827 được phân lập thành công từ 5 chủng được phát

hiện toàn bộ gen H với các bệnh tích điển hình là tế bào nhiễm tạo thể hợp bào.

24

CHƯƠNG 2

ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

2.1.1. Đối tượng nghiên cứu

- Chó nghi mắc bệnh Care ở mọi lứa tuổi đã được kiểm tra dương tính

bằng test thử nhanh One - step Canine Distemper Virus Ag test (IMMUNO).

2.1.2. Phạm vi nghiên cứu

- Thu nhận và giải trình tự toàn bộ gen H (gen kháng nguyên) của các

mẫu virus CDV tại Hà Nội.

- Mẫu bệnh phẩm được thu thập từ các phòng khám thú ý tại quận Hà

Đông, Nam Từ Liêm và Cầu Giấy - Hà Nội.

2.1.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu

- Địa điểm thu mẫu: một số phòng khám tại quận Cầu Giấy, Hà Đông

và Nam Từ Liêm trên địa bàn Hà Nội

- Địa điểm phân tích mẫu: Phòng Miễn dịch học - Viện Công nghệ Sinh

học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

- Thời gian thực hiện: từ tháng 8/2019 đến tháng 8/2020

2.2. Nội dung nghiên cứu

2.2.1. Tình hình chó mắc bệnh Care tại một số quận trên địa bàn Hà Nội

- Tình hình chó mắc bệnh Care tại một số quận ở Hà Nội

- Tỷ lệ chó mắc bệnh Care theo giống, theo lứa tuổi, theo mùa, theo

nhóm đã được tiêm phòng và chưa được tiêm phòng vaccine

- Những triệu chứng lâm sàng của chó mắc bệnh Care

2.2.2. Thu nhận mẫu bệnh phẩm nhiễm CDV

2.2.3. Thu nhận gen kháng nguyên H bằng kỹ thuật PCR

2.2.4. Giải trình tự nucleotide và amino acid của gen H

2.2.5. So sánh tỷ lệ đồng nhất về nucleotide và amino acid của chủng CDV

Việt Nam với các chủng của thế giới

2.2.6. Xác định phả hệ nguồn gốc của các chủng CDV Việt Nam

25

2.3. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

2.3.1. Vật liệu nghiên cứu

2.3.1.1. Nguyên liệu

Mẫu bệnh phẩm: gỉ mắt, gỉ mũi, phân, máu, thu nhận trên chó mắc

bệnh Care ở mọi lứa tuổi (cho kết quả dương tính với kit thử nhanh) phân lập

tại quận Hà Đông, Nam Từ Liêm và Cầu Giấy trên địa bàn TP Hà Nội.

2.3.1.2. Các dụng cụ và thiết bị

- Máy móc, dụng cụ và thiết bị dùng cho sinh học phân tử: thuộc phòng

thí nghiệm của phòng Miễn dịch học - Viện Công nghệ Sinh học - Viện Khoa

học và Công nghệ Việt Nam.

2.3.1.3. Hóa chất

- Hoá chất: Agarose (Sigma, Mỹ), cồn tuyệt đối (Prolabo - Pháp), đệm

TAE (1X). Các mồi dùng cho phản ứng PCR, Macrogen (Hàn Quốc). Dung

dịch dùng để điện di trên thạch agarose. - Bộ kit tách chiết RNA tổng số, “QIAamp Viral Mini kit (QIAGEN

Inc, USA)” và hoá chất do hãng QIAGEN cung cấp.

- Bộ kit dùng cho phản ứng chuyển đổi cDNA của hãng Thermo (Mỹ).

- Bộ kit Dream Taq PCR master mix (2X) để thực hiện phản ứng PCR

của hãng Thermo (Mỹ).

- Bộ kit dùng để tinh sạch sản phẩm PCR của hãng Thermo (Mỹ).

Bảng 2.1. Bộ mồi thu nhận gen H

Độ dài

Vị trí trên

Tên mồi

Trình tự (5’….3’)

Chú thích

(nt)

hệ gen

Mồi cho phản ứng

C6863H-F GTCGATCCGRCATTTAAACCTG

22

6863-6885

PCR

C7950H-F TGACACTRGCTTCCTTGTGTG

7950-7971 Mồi giải trình tự

21

C8250H-R

TTCCCATGAYGTTYGGTTGC

8230-8250 Mồi giải trình tự

20

Mồi cho phản ứng

C9071H-R ATTTGGGCTATCTAGATGGACC

22

9049-9071

PCR

(Nguồn: Phòng Miễn dịch học - Viện Công nghệ Sinh học - Viện Khoa học và

Công nghệ VN)

26

2.3.2. Phương pháp nghiên cứu

2.3.2.1. Sơ đồ nghiên cứu

Để thu nhận hệ gen virus chúng tôi tiến hành các thí nghiệm theo sơ đồ

Chuyển đổi cDNA

Thu mẫu bệnh phẩm

Tách chiết ARN tổng số

Giải trình tự

Tinh sạch sản phẩm PCR

Thực hiện phản ứng PCR

Phân tích, xử lý chuỗi gen

So sánh, đối chiếu, lập phả hệ

Tìm kiếm/so sánh/tìm cấu trúc gen

sau đây

Hình 2.1: Sơ đồ nghiên cứu

2.3.2.2. Phương pháp khảo sát triệu chứng lâm sàng

Lập sổ theo dõi, ghi đầy đủ thông tin: lứa tuổi, giới tính, giống, địa

phương, tình trạng tiêm phòng vaccine… thông qua chủ nuôi

Chó nghi mắc bệnh sẽ được khảo sát đầy đủ thông tin về triệu chứng

lâm sàng ở: mắt, mũi, nôn mửa, tiêu chảy, gan bàn chân, nốt sài, biểu hiện

thần kinh… Sau đó dùng test để kiểm tra và xác định chó mắc bệnh.

* Biểu hiện của chó nghi mắc bệnh: Chó ủ rũ, mệt mỏi, giảm ăn hoặc

bỏ ăn. Con vật nôn ra bọt vàng, bọt trắng, thời gian nôn kéo dài. Chảy nước

mũi, lâu dần sẽ thở gấp, thở khò khè. Tiêu chảy kéo dài, phân nhày, mùi tanh.

Chó kiệt sức nhanh, co giật và chịu tác động trực tiếp vào hệ thần kinh. Mắt

đục dần và có mủ, loét. Xuất hiện chấm đỏ ở bẹn và bụng dưới. Phân chuyển

màu theo các giai đoạn bệnh cho tới khi ra máu tươi và chết.

27

2.3.2.3. Phương pháp thu thập bệnh phẩm

Dùng tăm bông vô trùng lấy các mẫu bệnh phẩm (gỉ mắt, gỉ mũi, phân)

thu nhận trên chó nghi mắc bệnh Care, sau đó cho vào túi nilon và buộc kín,

có đánh dấu và ký hiệu để nhận biết.

Dùng xilanh lấy máu tĩnh mạch, có đánh dấu và ký hiệu để nhận biết.

Các mẫu bệnh phẩm được bảo quản lạnh và đem về phòng Miễn dịch

học - Viện Công nghệ sinh học.

2.3.2.4. Phương pháp tách chiết RNA tổng số

Mẫu bệnh phẩm được hòa tan lại trong 200 µl nước vô trùng trước khi

dùng để tách chiết RNA tổng số.

RNA tổng số của virus được tách chiết bằng bộ sinh phẩm QIAamp

Viral Mini Kit (QIAGEN Inc.) theo hướng dẫn của nhà sản xuất như sau:

Bảng 2.2: Các bước tách chiết RNA tổng số

Bước 1 Bổ sung 350 µl RLT Working vào ống eppendorf 2ml sạch.

Bước 2 Thêm 150 µl mẫu và lắc đều.

Bước 3 Bổ sung 350µl Ethanol 70%, lắc đều và đảo trộn.

Bước 4

Bước 5

Bước 6

Bước 7

Chuyển toàn bộ dịch lên cột, ly tâm 10.000 vòng/phút trong 1 phút, bỏ dịch phía dưới ống hứng. Bổ sung 700µl dung dịch RW1, ly tâm 10.000 vòng/phút trong 1 phút rồi bỏ dịch phía dưới ống hứng. Thêm 500µl RPE Working, ly tâm 10.000 vòng/phút trong 1 phút và bỏ dịch dưới ống hứng. Làm khô cột bằng cách ly tâm 10.000 vòng/phút trong 1 phút. Bổ sung 30µl dịch Elution Buffer vào giữa màng lọc của cột, ủ nhiệt độ phòng 2 phút, ly tâm 10.000 vòng/phút trong 2 phút để thu dịch.

Bước 8 Bảo quản RNA tổng số ở -800C cho đến khi sử dụng.

2.3.2.5. Phương pháp chuyển đổi cDNA

Sợi cDNA được tổng hợp theo phương pháp chuyển đổi từ RNA tổng

số của virus bằng mồi xác suất (hexamer) sử dụng bộ kit và enzyme Maxima

28

Reverse Transcriptase của hãng Fermentas. Phản ứng được thực hiện ở 500C

trong 1 giờ, sau đó dừng phản ứng ở 800C trong 5 phút.

Sản phẩm cDNA được bảo quản -200C cho đến khi được sử dụng để

thực hiện phản ứng PCR thu nhận vùng gen H của virus. Thành phần phản

ứng chuyển cDNA được trình bày trong bảng 2.3.

Bảng 2.3: Thành phần phản ứng chuyển đổi cDNA từ RNA tổng số

Thành phần

ARN tổng số (100ng/µl) Primer Hexamer (100 picomol/µl) dNTP mix (10mM) H2O (nuclease-free) 5X RT buffer RiboLock™Rnase Inhibitor (50U/µl) Maxima Reverse Transcriptase (20U/µl)

Tổng Thể tích 2 µl 1 µl 1 µl 10,5 µl 4 µl 0,5 µl 1 µl 20 µl

2.3.2.6. Phương pháp PCR

Phản ứng PCR được thực hiện trên khuôn cDNA thu vùng gen H của

mẫu nghiên cứu. Trong nghiên cứu này chúng tôi dùng bộ kit DreamTaq PCR

Mastermix (2X) do hãng Thermo Scientific (Mỹ) cung cấp và phản ứng thực

hiện trên máy PCR (PTC-100). Thành phần phản ứng và chu trình nhiệt được

trình bày trong bảng 2.4 và hình 2.2.

Bảng 2.4: Thành phần của phản ứng PCR

Thành phần PCR

DreamTaq Mastermix (2X) Mồi xuôi (10pmol/µl) Mồi ngược (10pmol/µl) Khuôn cDNA DMSO Nước tinh khiết

Tổng Thể tích 25 µl 2 µl 2 µl 2 µl 2 µl 17 µl 50 µl

29

35 chu kỳ

94oC

94oC

72oC

72oC

5 phút

30 giây

52oC

3 phút

10 phút

4oC

30 giây



Hình 2.2: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR

Sản phẩm PCR được bảo quản ở -200C. Kết quả phản ứng PCR được

đánh giá bằng điện di kiểm tra sản phẩm PCR trên gel agarose 1%. Sản phẩm

chất lượng tốt chúng sẽ được dùng để giải trình tự trực tiếp.

2.3.2.7. Phương pháp kiểm tra sản phẩm PCR bằng điện di trên gel agarose

Nguyên lý: các acid nucleic mang điện tích âm trong môi trường pH

trung tính do có chứa gốc phosphat trong cấu trúc hóa học, dưới tác dụng của

điện trường không đổi chúng di chuyển về cực dương và dừng lại ở điểm

đẳng điện (pI) đặc trưng cho kích thước của mỗi loại phân tử acid nucleic.

Các phân tử có trọng lượng cao di chuyển chậm hơn các phân tử có trọng

lượng thấp. Sản phẩm điện di được nhận biết nhờ nhuộm gel trong Ethidium

bromide và soi dưới tia cực tím.

Có 2 loại gel sử dụng trong kỹ thuật điện di nghiên cứu di truyền và

sinh học phân tử là: Gel agarose sử dụng trong các máy điện di và gel

polyacrylamide sử dụng phân tách các phân tử acid nucleic kích thước nhỏ

trong giải trình tự DNA.

Một trong các chất chỉ thị phân tử DNA thường được dùng là DNA của

thực khuẩn Lambda, dài 43kb được cắt bằng enzym giới hạn HindIII thành 8

phân đoạn có độ dài: 23,1kb; 9,4kb; 6,5kb; 4,3kb; 2,3kb; 2,0kb; 0,56kb;

0,125kb. Tuy nhiên, trên thực tế chỉ nhìn được 7 băng, còn băng có chiều dài

30

0,125kb thì rất khó phát hiện. Nhờ chỉ thị phân tử DNA có thể xác định được

chiều dài đoạn DNA cần nghiên cứu.

- Chuẩn bị gel agarose 1%: Lấy 0,4g bột thạch agarose nguyên chất cho

vào cốc đong thủy tinh chịu nhiệt, đổ vào đó 40ml đệm TAE (1X). Cho vào lò

vi sóng để agarose tan chảy hết (trong 3 phút). Để thạch bớt nóng (khoảng

600C) rồi đổ thạch đã tan chảy vào hệ thống điện di, gài lược có nhiều răng

vào đổ ngập răng lược khoảng 0,5 cm; để nguội ở nhiệt độ phòng. Khi nguội,

các răng lược sẽ tạo thành các giếng để tra mẫu vào kiểm tra.

- Dìm ngập khuôn có thạch trong hộp điện di chứa đệm TAE 1x (đệm

này cung cấp ion cho điện trường hoạt động)

- Tra mẫu: lấy 10µl sản phẩm trộn với 2 µl loading dye (6X), tra riêng

biệt vào từng giếng trong thạch.

- Tra chỉ thị phân tử: trong 1 giếng riêng biệt khác cho 5 µl chỉ thị phân

tử (ADN marker) (ADN của thực khuẩn thể λ cắt bằng enzyme giới hạn

HindIII).

- Chạy điện di ở hiệu điện thế 100V trong khoảng 25 - 30 phút.

- Bổ sung 4µl ethidium bromide vào 40ml nước cất rồi bỏ thạch vào

ngâm khoảng 10 phút.

- Rửa thạch sau đó đưa vào máy Dolphin Doc để soi và chụp ảnh.

2.3.2.8. Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR

Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng bộ kit GeneJET Gel PCR

Purification của hãng Thermo theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Sản phẩm

được tinh sạch được dùng để giải trình tự trực tiếp hoặc dòng hóa trước khi

giải trình tự.

Các bước này thực hiện sau khi điện di trên thạch agarose 1% và cắt

phần gel chứa sản phẩm DNA cần thu nhận.

31

Bảng 2.5: Các bước tinh sạch sản phẩm PCR

Thêm dung dịch Binding Buffer vào ống có chứa sản phẩm PCR Bước 1 với tỉ lệ 1 : 1 (w/v). Đun nóng ở 65°C cho đến khi gel tan hết.

Chuyển toàn bộ dung dịch thu được từ bước 1 vào cột tinh

Bước 2 sạch GeneJET. Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 30-60 giây.

Loại bỏ phần dịch phía dưới ống hứng.

Bổ sung 700 µl dung dịch rửa Wash Buffer, ly tâm 13.000 Bước 3 vòng/phút trong 30-60 giây. Loại bỏ dịch phía dưới ống hứng.

Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút để loại bỏ hoàn toàn Bước 4 dung dịch rửa.

Chuyển cột sang ống eppendorf 1,5ml sạch.

Bước 5 Bổ sung 50 µl dung dịch Eluted Buffer, để nhiệt độ phòng 2

phút, ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút.

Bước 6 Thu dịch DNA, bảo quản ở -200C

2.3.2.9. Phương pháp giải trình tự

Phương pháp giải trình tự (sequencing) dựa vào hoạt động của enzyme

DNA-polymerase trong quá trình tổng hợp DNA, emzym DNA-polymerase

xúc tác gắn các nucleotide vào mạch đơn DNA đang tổng hợp ở vị trí 3’ có

chứa nhóm -OH tự do, khi gặp nucleotide không chứa nhóm 3’-OH (ddNTP)

thì phản ứng tổng hợp dừng lại. Đặc trưng của phương pháp này là dùng

ddNTP (bị mất 2 nguyên tử oxy ở vị trí cacbon 3 và 4) để dừng phản ứng một

cách ngẫu nhiên. Kết quả là tạo ra các đoạn DNA sợi đơn dài ngắn khác nhau

và chỉ sai khác nhau một nucleotide.

Kỹ thuật này kết hợp ba bước của một chu kỳ nhiệt phản ứng PCR, bao

gồm: bung liên kết, mồi bám và enzyme Taq-polymerase cùng các điều kiện

thích hợp. Mồi sử dụng là mồi đơn dài khoảng 20 đến 24 nucleotide, thành

phần tổng hợp DNA là hai loại NTP bao gồm deoxy NTP (dNTP) và 1%

32

dideoxy NTP (ddNTP) tương ứng (lượng nhỏ ddNTP so với dNTP nên thỉnh

thoảng mới có 1 ddNTP được sử dụng để làm cho phản ứng nối dài chuỗi đơn

nucleotide dừng lại ngẫu nhiên). Chuỗi DNA sản phẩm được xác định trình tự

theo chiều 5’→ 3’ dùng thuốc nhuộm huỳnh quang (fluorescent dye) để đánh

dấu, sử dụng thạch polyacrylamide và quét tia lazer dọc theo chuỗi để đọc

trình tự, phân tích tự động bằng máy với các chương trình phần mềm tin -

sinh học.

Chuỗi DNA cuối cùng thu nhận được bao giờ cũng được xác định theo

chiều 5’→3’. Mỗi một lần giải trình tự, chuỗi thô (chuỗi có thành phần DNA

ban đầu chưa được xử lý) có độ dài khoảng vài trăm đến vài nghìn nucleotide;

thông thường là 500 - 1000 nucleotide nếu được giải trình trên máy giải trình

trình tự tự động.

2.3.2.10. Phương pháp xử lý số liệu sử dụng các phần mềm tin - sinh học

Trình tự DNA thu nhận được từ máy giải trình tự, được cung cấp ở hai

dạng: chuỗi nucleotide thô ở dạng chữ (.txt) và chuỗi nucleotide thô ở dạng

giản đồ chromatogram (.ab1). Chuỗi ở dạng .txt cho phép nhận biết chuỗi giải

trình tự có đạt yêu cầu không, còn chuỗi nucleotide ở dạng .ab1 cho phép đưa

vào các chương trình chuyên biệt (ví dụ: Chromas, BioEdit, SeqEd) để phân

tích, biên tập với mục đích xác định chính xác từng nucleotide để có chuỗi

cuối cùng (chuỗi tinh hay chuỗi đã biên tập). Cuối cùng, chuỗi đã được biên

tập (edition) được sử dụng ở dạng .txt, vì ở dạng này, tất cả các chương trình

phân tích gen (ví dụ: MEGA, GeneDoc, MacVector) đều có thể nhận biết.

* Chương trình so sánh và phân tích chuỗi gen - GeneDoc

GeneDoc là một chương trình nổi (interface application) được lập trình

cho máy tính PC sử dụng hệ Window, dùng để mở file, đọc và phân tích file ở

dạng .msf (multiple sequence file) (Nicholas KB và Nicholas HB, 1999),

GeneDoc cho phép xác định trình tự amino acid của gen nhân và gen ty thể,

33

đưa ra cấu hình của các chuỗi đã được so sánh để chuyển nạp vào MEGA cho

phân tích phả hệ. Trong nghiên cứu sử dụng chương trình GeneDoc 2.7.

* Chương trình phân tích di truyền tiến hóa phân tử (MEGA)

MEGA (Molecular Evolutionary Genetics Analysis) là một hệ chương

trình nổi giao diện (interface application) được lập trình dễ sử dụng cho các

nhà nghiên cứu di truyền học phân tử với mục đích so sánh đối chiếu các

chuỗi gen đồng chức năng từ các chủng cùng loài, từ các chủng khác loài

trong cùng giống/chi thuộc cùng một họ từ đó suy ra mối quan hệ nguồn gốc

và phả hệ ở góc độ tiến hóa phân tử (Tamura và cs., 2013). Trong nghiên cứu

sử dụng chương trình MEGA 7.

34

CHƯƠNG 3

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

3.1. Kết quả về tình hình chó mắc bệnh Care tại một số Quận trên địa

bàn Hà Nội

3.1.1. Tình hình chó mắc bệnh Care tại một số Quận ở Hà Nội

Chúng tôi đã đến một số phòng khám trên địa bàn 3 quận Hà Đông,

Cầu Giấy và Nam Từ Liêm - Hà Nội để thu thập thông tin về chó mắc bệnh

Care được mang đến khám, điều trị và thu các mẫu bệnh phẩm. Kết quả được

thể hiện ở bảng 3.1:

Bảng 3.1. Tỷ lệ chó mắc bệnh Care tại 3 Quận ở Hà Nội

Số chó Số chó Tỷ lệ Số chó Tỷ lệ Địa điểm điều tra mắc bệnh mắc chết chết (Quận) (con) (con) (con) (%) (%)

Hà Đông 312 63 48 76,19 20,19

Cầu Giấy 298 48 30 62,50 14,30

Nam Từ Liêm 235 50 42 84,00 21,28

Tính chung 845 161 120 74,53 19,05

Hình 3.1. Biểu đồ tỷ lệ chó mắc bệnh Care tại 3 Quận ở Hà Nội

35

Kết quả của bảng 3.1 và hình 3.1 cho thấy, trong tổng số 845 chó điều

tra tại các phòng khám ở 3 Quận trên địa bàn Hà Nội có 161 chó được phát

hiện mắc bệnh Care chiếm 19,05%.

Chó mắc bệnh có các triệu chứng điển hình: sốt, bỏ ăn hoặc ăn ít, nôn

mửa, ỉa chảy, phân có lẫn máu, trên vùng da mỏng có nốt chấm đỏ (nốt sài),

chảy dịch mắt dịch mũi và có thể có triệu chứng thần kinh…. Tỷ lệ chó chết

khi mắc bệnh chiếm tỷ lệ 74,53% do chó ỉa chảy, mất nước, mất máu, đặc biệt

hệ hô hấp bị tổn thương ảnh hưởng tới quá trình trao đổi khí ở hệ hô hấp. Kết

quả của chúng tôi hoàn toàn phù hợp với nhận xét của Phan Thị Hồng Phúc

và cs. (2019), khi chó bị mắc bệnh Care thì việc điều trị là rất khó do virus tác

động, gây tổn thương nặng hệ tiêu hóa và hệ hô hấp, đồng thời làm giảm sức

đề kháng của chó nên tỷ lệ chết còn khá cao.

Qua quá trình thăm khám và hỏi chủ chó thì hầu hết các trường hợp

mắc bệnh đều chưa được tiêm đầy đủ vắc xin phòng bệnh Care vì họ cho rằng

chó được nuôi trong môi trường an toàn không tiếp xúc với mầm bệnh bên

ngoài sẽ không mắc bệnh. Bên cạnh đó, một số chủ chó mua vắc xin về tự

tiêm nhưng tiêm chưa đúng cách, chưa đúng quy trình, quá trình bảo quản vắc

xin chưa đúng nên làm giảm hiệu lực của vắc xin dẫn đến tình trạng chó đã

được tiêm phòng nhưng vẫn mắc bệnh.

3.1.2. Tỷ lệ chó mắc bệnh Care theo giống

Tại Hà Nội, hiện nuôi rất nhiều giống chó khác nhau do sở thích chơi

chó cảnh và mục đích trông nhà. Mỗi giống chó có đặc điểm riêng ưu việt, từ

giống có thể vóc nhỏ như: Fox, Chihuahua, Bắc Kinh... thông minh, tình cảm,

sạch sẽ và tốn ít thức ăn đến Rottweiler, Béc giê Đức, Doberman... được huấn

luyện trông nhà, làm vệ sĩ bảo vệ chủ… Chúng tôi đã tiến hành chia thành 3

nhóm chó để tiện theo dõi. Kết quả thu được ở bảng 3.2:

36

Bảng 3.2. Tỷ lệ chó mắc bệnh Care theo giống

Số chó Số chó Tỷ lệ Số chó Tỷ lệ

Giống chó điều tra mắc bệnh mắc chết chết

(con) (con) (%) (con) (%)

44 Chó nội 151 29,13 34 72,27

63 Chó ngoại 562 11,20 42 66,67

54 Chó lai 132 40,90 44 81,48

161 Tính chung 845 19,05 120 74,53

Hình 3.2. Biểu đồ tỷ lệ chó mắc bệnh Care theo giống

Kết quả bảng 3.2 và hình 3.2.cho thấy: với 3 giống chó được kiểm tra thì

giống chó lai có tỷ lệ mắc bệnh cao hơn chó nội và chó ngoại chiếm 40,90%.

Đối với chó nội, mặc dù có vóc dáng trung bình, có sức đề kháng tốt

với môi trường và điều kiện ngoại cảnh nhưng tỷ lệ mắc bệnh vẫn cao

(29,13%) do chó nội được nuôi ở hầu hết các gia đình, giá trị kinh tế thấp

nên ít được quan tâm chăm sóc, không được tiêm phòng vắc xin đầy đủ,

thường thả rông nên tiếp xúc với nhiều tác nhân gây bệnh. Mặt khác, khi chó

bị bệnh, chủ nuôi thường tự mua thuốc về điều trị, nếu bệnh không tiến triển

hoặc nặng hơn mới mang đến các phòng khám thú y.

37

Còn chó ngoại có tỷ lệ mắc thấp hơn cả (11,20%) là do các giống chó

này có giá trị kinh tế cao, được nuôi làm cảnh, giữ nhà, làm chó bảo vệ… nên

người nuôi đã chủ động tẩy giun sán và tiêm phòng vắc xin ngay từ khi mới

bắt chó về, đồng thời cũng chú ý đến chế độ chăm sóc nuôi dưỡng và khẩu

phần ăn có đủ chất dinh dưỡng để nâng cao sức đề kháng cho chó.

Thực tế hiện nay, người chăn nuôi chó thường mới chỉ tiêm phòng

vaccine dại còn các loại vắc xin phòng bệnh khác thì chưa được quan tâm và

tiêm đúng, đủ cho chó. Chỉ khi nào chó ốm, thì mới tìm đến bác sĩ thú y và cơ

sở thú y vì giá thành để tiêm từ 2 đến 3 mũi vắc xin có thể cao hơn cả giá trị

tiền để mua một con chó, đồng thời một lượng lớn người nuôi chó với mục

đích là bán chó thịt nên cũng không đầu tư vào việc tiêm phòng.

3.1.3. Tỷ lệ mắc bệnh Care theo lứa tuổi

Trong tổng số 845 chó tại các phòng khám ở 3 quận được chúng tôi

điều tra về tỷ lệ mắc bệnh ở các lứa tuổi khác nhau. Chúng tôi đã tiến hành

ghi chép và phân làm 3 giai đoạn để thuận tiện cho việc đánh giá, nhận xét về

tình trạng mắc bệnh cũng như những yếu tố ảnh hưởng, tác động gây làm tỷ lệ

mắc bệnh khác nhau ở mỗi lứa tuổi.

Kết quả tỷ lệ mắc bệnh Care theo lứa tuổi của chó được chúng tôi thể

hiện ở bảng 3.3:

Bảng 3.3. Tỷ lệ chó mắc bệnh Care theo lứa tuổi

Số chó Số chó Tỷ lệ Số chó Tỷ lệ

Lứa tuổi chó điều tra mắc bệnh mắc chết chết

(con) (con) (%) (con) (%)

537 125 23,28 108 86,40 2 - 6 tháng

218 26 11,92 11 42,30 6 - 12 tháng

90 10 11,11 1 1,00 >12 tháng

845 161 19,05 120 74,53 Tính chung

38

Hình 3.3. Biểu đồ tỷ lệ chó mắc bệnh Care theo lứa tuổi

Kết quả của bảng 3.3 và hình 3.3 cho thấy: tỷ lệ chó mắc bệnh Care

theo lứa tuổi mà chúng tôi điều tra chủ yếu mắc ở giai đoạn dưới 12 tháng

tuổi và chó mắc bệnh cao nhất vào khoảng 6 tuần đến 6 tháng tuổi (2 - 6

tháng) là 23,43%.

Giai đoạn từ dưới 2 tháng tuổi vẫn còn trong thời kỳ bú sữa mẹ hoàn

toàn, chưa tập ăn ngoài, được nhận miễn dịch thụ động tự nhiên từ sữa đầu

của chó mẹ (hình thành kháng thể qua cảm thụ từ tự nhiên hoặc được tiêm

phòng vắc xin phòng bệnh, miễn dịch truyền sang sữa đầu giúp chó con được

phòng bệnh) nên ít bị rối loạn tiêu hóa.

Giai đoạn từ 2 - 6 tháng tuổi là giai đoạn chịu nhiều biến đổi nhất do

lượng kháng thể từ sữa mẹ truyền sang cho chó con từ sữa đầu đã giảm xuống

thấp, chó con bắt đầu cai sữa mẹ và tập quen dần với thức ăn, hệ tiêu hóa bắt

đầu thích nghi dần, chó cũng bắt đầu thay đổi môi trường sống do được tặng,

được bán ở giai đoạn này nên sức khỏe của chúng rất dễ bị xâm nhập mầm

bệnh và phát triển (tỷ lệ mắc 23,43%).

Giai đoạn từ 6 - 12 tháng tuổi tỷ lệ mắc 11,92%; đây là giai đoạn chó

đã trưởng thành, phát triển và thành thục về tính, dần thích nghi với điều kiện

môi trường, điều kiện nuôi dưỡng đã giúp cho chó có sức đề kháng với bệnh.

39

Chỉ có những chó được tiêm phòng đầy đủ thì có đủ khả năng bảo hộ với

bệnh, còn những chó mà chủ nuôi còn chủ quan với việc tiêm phòng thì rất dễ

mắc bệnh (Nguyễn Thị Huyền và cs., 2019).

Nhận xét của chúng tôi, hoàn toàn phù hợp với nhận xét của tác giả

Diệp Thị Diễm Mỹ và cs. (2020), việc không tiêm phòng hoặc tiêm phòng

không đầy đủ, không đúng thời điểm, không đúng cách là nguyên nhân chính

gây ra bệnh.

3.1.4. Tỷ lệ chó mắc bệnh Care theo mùa

Bảng 3.4. Tỷ lệ chó mắc bệnh Care theo mùa

Số chó Số chó Tỷ lệ Số chó Tỷ lệ

Mùa/vụ điều tra mắc bệnh mắc chết chết

(con) (con) (%) (con) (%)

Xuân 316 104 32,91 78 75,00

Hè 121 05 4,13 03 60,00

Thu 100 02 2,00 1 50,00

Đông 308 50 16,23 38 76,00

Tính chung 845 161 19,05 120 74,53

Hình 3.4. Biểu đồ tỷ lệ chó mắc bệnh Care theo mùa

40

Kết quả bảng 3.4 và hình 3.4 cho thấy: chó mắc bệnh Care vào mùa

xuân có tỷ lệ cao nhất chiếm (32,91%). Sở dĩ, có tỷ lệ cao như vậy là do vào

mùa này thời tiết có độ ẩm cao nên virus rất dễ phát tán và sinh trưởng phát

triển mạnh làm tăng khả năng gây bệnh cho chó. Hoàn toàn phù hợp với nhận

xét bệnh Care ở Việt Nam xảy ra nhiều vào mùa xuân của Nguyễn Vĩnh

Phước (1978).

Tiếp đến là mùa đông có tỷ lệ mắc bệnh là 16,23% do mùa này thời

tiết, khí hậu lạnh, mầm bệnh dễ xâm nhập vào cơ thể và gây bệnh do sức đề

kháng của chó giảm vì phải chống chịu với thời tiết nên mầm bệnh dễ dàng

xâm nhập và gây bệnh. Mùa hè có tỷ lệ mắc là 4,13% và thấp nhất là mùa thu,

2,00%. Kết quả của chúng tôi cũng tương tự như kết quả của Nguyễn Thị

Huyền và cs. (2019): mùa đông, tỷ lệ chó mắc Care cao nhất (39,13%), sau đó

đến mùa xuân (35,82%), thấp nhất là mùa thu (11,83%).

3.1.5. Tỷ lệ chó mắc bệnh Care theo nhóm đã được tiêm phòng và chưa

được tiêm phòng vắc xin

Bảng 3.5. Tỷ lệ chó mắc bệnh theo nhóm đã được tiêm và

chưa được tiêm phòng vắc xin

Số chó Số chó Tỷ lệ Số chó Tỷ lệ

Nhóm điều tra mắc bệnh mắc chết chết

(con) (con) (%) (con) (%)

415 37 8,91 7 18,91 Đã được tiêm vắc xin

430 124 28,84 113 91,13 Chưa được tiêm vắc xin

845 161 19,05 120 74,53 Tính chung

Kết quả bảng 3.5. cho thấy trong tổng số 161 chó mắc bệnh có 124 chó

chưa được tiêm phòng chiếm 28,84%.

Kết quả này cho thấy, ngoài các chế độ chăm sóc nuôi dưỡng thì việc

tiêm phòng vắc xin đúng, đủ cho chó sẽ quyết định mức độ cảm nhiễm nguồn

bệnh trên chó. Tuy vậy, có 37 chó đã được tiêm phòng nhưng vẫn mắc bệnh

41

chiếm 8,91%; nguyên nhân có thể do chủ nuôi không tuân theo lịch tiêm

phòng vắc xin, tiêm phòng không đúng quy trình, do khi tiêm vắc xin lại vào

đúng giai đoạn ủ bệnh hoặc cơ thể của chúng không tạo được đáp ứng miễn

dịch đối với vắc xin, do chế độ chăm sóc nuôi dưỡng của từng chủ đối với

chó hoặc do cách sử dụng và bảo quản vắc xin không đúng cách... (Phan Thị

Hồng Phúc và cs., 2019).

Hình 3.5. Biểu đồ tỷ lệ chó mắc bệnh theo nhóm đã được tiêm

và chưa được tiêm phòng vaccine

Nhiều chủ chó, thường chỉ định kỳ tiêm phòng dại mà ít tiêm phòng

các bệnh khác nên khi chó có biểu hiện ốm mới đưa chó đến cơ sở Thú y để

khám và chữa bệnh nên tỷ lệ mắc bệnh là khá cao.

Qua đó cũng cho thấy, ý thức phòng bệnh cho chó của chủ nuôi chó

vẫn còn chưa cao do suy nghĩ chó chỉ nuôi ở quanh nhà, không tiếp xúc với

mầm bệnh từ bên ngoài nên sẽ không mắc bệnh hoặc 1 năm tiêm phòng 1 mũi

vắc xin phòng dại của thú y cơ sở đã đảm bảo miễn dịch với các bệnh khác

nên không phải tiêm phòng nữa.

Kết quả này, phù hợp với nhận xét của Trần Thị Thảo và cs. (2019):

chó được tiêm vắc xin phòng bệnh có tỷ lệ mắc bệnh thấp hơn so với chó

không được tiêm phòng vắc xin hoặc tiêm vaccine chưa đủ liều.

42

3.1.6. Những triệu chứng lâm sàng của chó mắc bệnh Care

Bảng 3.6. Triệu chứng lâm sàng chủ yếu của chó mắc bệnh Care

Số chó Số chó có Tỷ lệ mắc bệnh Biểu hiện lâm sàng biểu hiện (%) (con) (con)

Sốt 161 100

Mệt mỏi, giảm hoặc bỏ ăn 161 100

Chảy nước mắt, nước mũi 155 96,27

Tiêu chảy phân màu cà phê 145 90,06

161 Viêm kết mạc mắt 145 90,06

Nôn mửa 113 70,18

Ho, khó thở 74 45,96

Nốt sài trên da và sừng hóa gan bàn chân 39 24,22

Triệu chứng thần kinh 13 8,07

Từ kết quả bảng 3.6 cho thấy: những dấu hiệu đầu tiên của chó mắc

bệnh là thân nhiệt tăng, dao động từ 40,0 - 41,00C nhưng đây không phải là

triệu chứng điển hình mà nó báo hiệu cơ thể đang đáp ứng lại tác nhân gây

bệnh (chiếm 100%). Đồng thời 100% chó mắc bệnh đều xuất hiện triệu chứng

mệt mỏi, giảm hoặc bỏ ăn (161/161 chó). Các chó bệnh thường chảy nước

mắt, nước mũi chiếm 96,27%; viêm kết mạc mắt và tiêu chảy phân màu cà

phê chiếm 90,06% số chó bệnh.

Ngoài ra, chúng còn thường xuyên nôn mửa, chó thường nôn khan, nôn

ra bọt nhớt màu vàng xanh (70,18%) kèm ho, khó thở chiếm 45,96%. Trên cơ

thể xuất hiện các nốt sài trên da và sừng hóa gan bàn chân chiếm 24,22%.

Một số chó có biểu hiện triệu chứng thần kinh chiếm 8,07%.

Chó bệnh có thể ỉa chảy từ 3 - 6 lần/ngày (tùy từng thể trạng) làm cho

cơ thể mất nước, mất chất điện giải, mũi khô, sừng hóa gan bàn chân, da mất

43

tính đàn hồi. Những triệu chứng này phù hợp với kết quả nghiên cứu của

Nguyễn Thị Lan và cs. (2015), Phan Thị Hồng Phúc và cs. (2020) khi theo dõi

những biểu hiện lâm sàng trên chó mắc bệnh Care.

3.2. Kết quả về số mẫu xét nghiệm và thu nhận gen H của chó mắc bệnh Care

3.2.1. Kết quả tách chiết RNA tổng số từ các mẫu xét nghiệm

Với 161 mẫu bệnh phẩm là hỗn hợp gỉ mắt, gỉ mũi của chó mắc bệnh

được thu bằng tăm bông vô trùng. Hỗn hợp này được thôi ra nước sạch trước

khi tách chiết RNA tổng số.

Sau đó, chúng tôi đã tiến hành tách chiết RNA tổng số mang gen của

các chủng CDV thu thập được theo quy trình của phòng Miễn dịch học - Viện

Công nghệ sinh học như đã trình bày ở mục 2.3.2.4.

Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm tách RNA trên gel agarose 1% được

thể hiện qua hình 3.6.

1 2 M 3 4 5 6 7 8 9

Hình 3.6. Sản phẩm điện di RNA các chủng CDV thu thập được

M: Marker, Fermentas, Mỹ

Giếng số 1: RNA mang gen mã hóa của chủng CDV ký hiệu CDVHN6

Giếng số 2: RNA mang gen mã hóa của chủng CDV ký hiệu CDVHN7

Giếng số 3: RNA mang gen mã hóa của chủng CDV ký hiệu CDVHN9

Giếng số 4: RNA mang gen mã hóa của chủng CDV ký hiệu CDVHN15

Giếng số 5: RNA mang gen mã hóa của chủng CDV ký hiệu CDVHN16

Giếng số 6: RNA mang gen mã hóa của chủng CDV ký hiệu CDVHN28

44

Giếng số 7: RNA mang gen mã hóa của chủng CDV ký hiệu CDVHN36

Giếng số 8: RNA mang gen mã hóa của chủng CDV ký hiệu CDVHN64

Giếng số 9: RNA mang gen mã hóa của chủng CDV ký hiệu CDVHN66

Kết quả điện di cho thấy, 9 chủng CDV sử dụng trong phản ứng tách

RNA tổng số đều thể hiện rõ nét ở tất cả các giếng. Tuy nhiên, tại vị trí giếng

1 và giếng 2 hiển thị độ sáng dàn đều (sáng nhất) chứng tỏ ở hai giếng này có

rất nhiều đoạn RNA có độ dài ngắn khác nhau.

Sản phẩm này được chúng tôi đem tiến hành chuyển đổi từ RNA tổng

số của virus sang sợi cDNA bằng mồi xác suất (hexamer) sử dụng bộ kit và

enzyme Maxima Reverse Transcriptase của hãng Fermentas.

3.2.2. Kết quả lựa chọn sản phẩm và chuyển đổi sang sợi cDNA

Chúng tôi đã lựa chọn được 2 chủng CDV ở vị trí giếng 1 và giếng 2

hiển thị độ sáng sáng nhất (ký hiệu CDVHN6 và CDVHN7) để tiến hành tách

chiết RNA như sau:

Bảng 3.7. Các mẫu virus CDV sử dụng trong nghiên cứu

Giống Địa điểm STT Tên mẫu Tuổi Bệnh phẩm chó thu mẫu

Hà Đông 1 CDVHN6 Becgie 3 tháng Gỉ mắt + gỉ mũi - Hà Nội

Các chủng lựa chọn được đặt tên là CDVHN6 và CDVHN7, đều là chó

Nam Từ Liêm 2 CDVHN7 Pitbull 6 tháng Gỉ mắt + gỉ mũi - Hà Nội

phát hiện nhiễm CDV ở lứa tuổi dưới một năm tuổi.

RNA tổng số sau khi tách chiết được bảo quản ở - 80°C cho tới khi được

dùng làm khuôn cho phản ứng chuyển đồi cDNA. Trước khi thực hiện các thí

nghiệm tiếp theo RNA tổng số được kiểm tra chất lượng bằng cách đo nồng độ

axit nucleic bằng máy Nanodrop (Nhật Bản) với bước sóng 260nm. Hai mẫu

45

trong nghiên cứu này là 2 mẫu có chất lượng RNA tốt (nồng độ khá cao, ít tạp

chất). Chất lượng RNA tổng số sau điện di được thể hiện ở bảng 3.8.

Bảng 3.8. Nồng độ RNA tổng số được đo bằng máy Nanodrop

STT Tên mẫu Nồng độ (ng/µl) A260/A280

1 CDVHN6 165 1.93

2 CDVHN7 202 2.01

3.3. Kết quả phản ứng PCR và giải trình tự nucleotide, amino acid của gen H

Sản phẩm PCR thu được bằng cặp mồi C6863H-F + C9071H-R có kích

thước khoảng 2.2kb. Toàn bộ gen H nằm trọn trong đoạn DNA này. Trước

khi được gửi đi đọc trình tự tại công ty The FirstBase (Singapore) sản phẩm

PCR được tinh sạch bằng cách thôi gel dùng bộ kit GeneJET PCR Gel

purification của hãng Thermo theo đúng hướng dẫn của nhà sản xuất.

Hình 3.7. Kết quả điện di sản phẩm PCR nhân gen H

của 2 mẫu CDV nghiên cứu

Ghi chú: Giếng M: thang DNA chuẩn (DNA của thực khuẩn thể λ được

cắt bằng enzyme HindIII); giếng 1-2: sản phẩm PCR nhân vùng gen H của các

mẫu CDVHN1 và CDVHN6

46

Sản phẩm PCR thu được có kích thước đúng như dự đoán ban đầu.

Chất lượng sản phẩm tốt (nồng độ DNA cao), tuy nhiên có chứa nhiều sản

phẩm phụ không đặc hiệu. Để thu được chỉ phân đoạn DNA có kích thước

như mong đợi (2.2kb) (Hình 3.7). Hai sản phẩm PCR này cần được tinh sạch

bằng phương pháp thôi gel.

Cặp mồi (C6863H-F và C9071H-R) ngoài dùng cho phản ứng PCR còn

được dùng để giải trình tự trực tiếp.

Hai mồi còn lại là C7950H-F và C8250H-R được dùng cho phản ứng

giải trình tự. Bằng cách sử dụng 2 mồi này chúng tôi thu nhận được 2 phân

đoạn DNA chồng lợp lên nhau khoảng 300 nucleotide. Đây là dữ liệu cần

thiết để nối toàn phân đoạn DNA thu được bằng phản ứng PCR.

Bằng 4 mồi trên chúng tôi thu nhận được phân đoạn DNA có kích

thước 2021 nucleotide, chứa hoàn toàn gen H có kích thước 1824bp. Trình tự

nucleotide và amino acid (suy diễn) của gen H thu được từ 2 chủng CDVHN6

và CDVHN7 được trình bày bên dưới đây:

47

* 20 * 40 * 60 * 80 * 100 * 120 CDVHN7: ATGCTCTCCTACCAAGACAAGGTGGGTGCCTTCTATAAGGATAATGCAAGAGCTAATTCATCCAAGCTGTCCTTAGTGACAGAAGAGCAAGGGGGAAGGAGATCACCCTATTTGCTGTTT M L S Y Q D K V G A F Y K D N A R A N S S K L S L V T E E Q G G R R S P Y L L F * 140 * 160 * 180 * 200 * 220 * 240 CDVHN7: GTCCTTCTCATCCTACTGATTGGAATCCTGACCTTGCTTGCCATCACTGGAATTCGATTTCACCAAGTATCAACTAGCAATATGGAATTTAGCAGATTGCTGAAAGAGGATATGGAGAAA V L L I L L I G I L T L L A I T G I R F H Q V S T S N M E F S R L L K E D M E K * 260 * 280 * 300 * 320 * 340 * 360 CDVHN7: TCAGAGGCAGTACATCACCAAGTCATAGATGTCTTGACACCGCTCTTCAAAATTATTGGAGATGAGATTGGGTTGCGGTTGCCACAAAAACTAAACGAGATCAAACAATTTATCCTTCAA S E A V H H Q V I D V L T P L F K I I G D E I G L R L P Q K L N E I K Q F I L Q * 380 * 400 * 420 * 440 * 460 * 480 CDVHN7: AAGACAAACTTCTTCAATCCGAACAGGGAATTCGACTTCCGCGATCTCCACTGGTGCATTAACCCACCTAGCAAGATCAAGGTGAATTTTACTAATTACTGTGATACAGTTGGGGTCAAA K T N F F N P N R E F D F R D L H W C I N P P S K I K V N F T N Y C D T V G V K * 500 * 520 * 540 * 560 * 580 * 600 CDVHN7: AAATCTATTGCATCAGCAGCAAATCCCATCATTTTATCAGCACTCTCTGGAGCCAGAGGCGACATATTCCCGCCGTACAGATGCAGTGGAGCTACTACTTCAGTAGGCAGAGTATTCCCC K S I A S A A N P I I L S A L S G A R G D I F P P Y R C S G A T T S V G R V F P * 620 * 640 * 660 * 680 * 700 * 720 CDVHN7: CTATCCGTATCATTATCCATGTCTTTGATATCAAGAACTTCAGAGATAATCAATATGCTAACCGCTATCTCAGACGGAGTGTATGGTAAAACTTATTTGCTAGTGCCTGATTATATTGAA L S V S L S M S L I S R T S E I I N M L T A I S D G V Y G K T Y L L V P D Y I E * 740 * 760 * 780 * 800 * 820 * 840 CDVHN7: GGGGAGTTCGACTCGCAAAAGATTCGAGTCTTTGAGATAGGGTTTATCAAACGGTGGCTGAATAACATGCCTTTACTCCAGACAACCAACTATATGGTCCTCCCGGAAACTTCCAAAGCC G E F D S Q K I R V F E I G F I K R W L N N M P L L Q T T N Y M V L P E T S K A * 860 * 880 * 900 * 920 * 940 * 960 CDVHN7: AAGGTATGTACTATAGCAGTGGGCGAGCTGACACTAGCTTCCTTGTGTGTAGATGAGAGCACCGTATTGTTATATCATGACAGCAATGGTTCACAAAATGGTATTCTAGTAGTGACATTG K V C T I A V G E L T L A S L C V D E S T V L L Y H D S N G S Q N G I L V V T L * 980 * 1000 * 1020 * 1040 * 1060 * 1080 CDVHN7: GGAATATTTGGGGCAACACCTATGGATCAAGTTGAGGAGGTGATACCTATCGCTCACCCATCAGTGGAGAGAATACATATAACAAATCACCGTGGGTTCATAAAAGATTCAGTAGTAACC G I F G A T P M D Q V E E V I P I A H P S V E R I H I T N H R G F I K D S V V T * 1100 * 1120 * 1140 * 1160 * 1180 * 1200 CDVHN7: TGGATGGTGCCTGTATTGGTCTCTGAGAAACAAGAGGAGCAAAAAAACTGTCTGGAGTCTGCTTGTCAAAGAAAATCCTACCCGATGTGCAACCAAACGTCATGGGAACCCTTTGGAGGG W M V P V L V S E K Q E E Q K N C L E S A C Q R K S Y P M C N Q T S W E P F G G * 1220 * 1240 * 1260 * 1280 * 1300 * 1320 CDVHN7:GGACAGTTGCCTTCTTATGGGCGGTTGACATTACCTCTGGATCCAAGCGTTGACCTTCAACTTAACATATCGTTTACATATGGTCCGGTTATACTGAACGGAGACGGTATGGATTATTAT G Q L P S Y G R L T L P L D P S V D L Q L N I S F T Y G P V I L N G D G M D Y Y * 1340 * 1360 * 1380 * 1400 * 1420 * 1440 CDVHN7:GAAAGCCCACTTTTGGAATTCGGATGGCTTACCATACCCCCTAAGAACGGAACAGTCCTTGGATTGATAAACAAAGCAAGTAGAGGAGACCAGTTCACTGTGACCCCCCATGTGTTGACA E S P L L E F G W L T I P P K N G T V L G L I N K A S R G D Q F T V T P H V L T * 1460 * 1480 * 1500 * 1520 * 1540 * 1560 CDVHN7:TTTGCGCCCAGGGAATCAAGTGGAAATTGTTATTTGCCTATTCAAACATCCCAGATTATGGATAAAGATGTCCTTACTGAGTCCAATTTAGTGGTGTTACCTACACAAAATTTTAGATAT F A P R E S S G N C Y L P I Q T S Q I M D K D V L T E S N L V V L P T Q N F R Y * 1580 * 1600 * 1620 * 1640 * 1660 * 1680 CDVHN7: GTCATAGCAACATATGATATATCCCGGGGCGATCATGCAATTGTTTATTATGTTTATGACCCTATCCGGACGATTTCTTATACATACCCATTTAGACTAACTACCAAGGGTAGACCTGAT V I A T Y D I S R G D H A I V Y Y V Y D P I R T I S Y T Y P F R L T T K G R P D * 1700 * 1720 * 1740 * 1760 * 1780 * 1800 CDVHN7: TTCCTAAGGATTGAATGTTTTGTGTGGGATGACGATTTGTGGTGTCATCAATTTTACCGATTTGAGGCTAACATCACTAACTCTACAACCAGTGTTGAGAATTTAGTCCGTATAAGATTC F L R I E C F V W D D D L W C H Q F Y R F E A N I T N S T T S V E N L V R I R F * 1820 CDVHN7: TCATGTAACCGTTTAAAACCTTGA : 1824 S C N R L K P *

Hình 3.8. Trình tự nucleotide và amico acid (suy diễn) của gen H chủng CDVHN7 Chú thích: Dòng trên là trình tự nucleotide, dòng dưới là trình tự amino acid (suy diễn)

48

* 20 * 40 * 60 * 80 * 100 * 120 CDVHN6: ATGCTCTCCTACCAAGACAAGGTGGGTGCCTTCTATAAGGATAATGCAAGAGCTAATTCATCCAAGCTGTCCTTAGTGACAGAAGAGCAAGGGGGACGGAGACCACCCTATTTGCTGTTT M L S Y Q D K V G A F Y K D N A R A N S S K L S L V T E E Q G G R R P P Y L L F * 140 * 160 * 180 * 200 * 220 * 240 CDVHN6: GTCCTTCTCATCCTACTGATTGGAATCCTGGCCTTGCTTGCCATCACTGGAGTTCGATTTCACCAAGTATCAACTAGCAATATGGAATTTAGCAGATTGCTGAAAGAGGATATGGAGAAA V L L I L L I G I L A L L A I T G V R F H Q V S T S N M E F S R L L K E D M E K * 260 * 280 * 300 * 320 * 340 * 360 CDVHN6: TCAGAGGCCGTACATCACCAAGTCATAGATGTCTTGACACCGCTCTTCAAAATTATTGGAGATGAGATTGGATTACGGTTGCCACAAAAACTAAACGAGATCAAACAATTTATCCTTCAA S E A V H H Q V I D V L T P L F K I I G D E I G L R L P Q K L N E I K Q F I L Q * 380 * 400 * 420 * 440 * 460 * 480 CDVHN6: AAGACAAACTTCTTCAATCCGAACAGGGAATTCGACTTCCGCGATCTCCACTGGTGCATTAACCCACCTAGCAAGATCAAAGTGAATTTTACTAATTACTGTGATACAGTTGGGGTCAAA K T N F F N P N R E F D F R D L H W C I N P P S K I K V N F T N Y C D T V G V K * 500 * 520 * 540 * 560 * 580 * 600 CDVHN6: AAATCTATTGCATCGGCAGCAAATCCCATCATTTTATCAGCACTCTCCGGGGCCAGAGGTGACATATTCCCGCCGTACAGATGCAGTGGAGCTACTACTTCAGTAGGCAGAGTCTTCCCC K S I A S A A N P I I L S A L S G A R G D I F P P Y R C S G A T T S V G R V F P * 620 * 640 * 660 * 680 * 700 * 720 CDVHN6: CTATCCGTATCATTATCCATGTCTTTGATATCAAGAACATCAGAGATAATCAATATGCTAACCGCTATCTCAGACGGAGTGTATGGTAAAACTTATTTGCTAGTGCCTGATTATATTGAA L S V S L S M S L I S R T S E I I N M L T A I S D G V Y G K T Y L L V P D Y I E * 740 * 760 * 780 * 800 * 820 * 840 CDVHN6: GGGGAGTTCGACTCGCAAGAGATTCGAGTCTTTGAGATAGGGTTTATCAAACGGTGGCTGAATGACATGCCTTTACTCCAGACAACCAACTATATGGTCCTCCCGGAAACTTCCAAAGCC G E F D S Q E I R V F E I G F I K R W L N D M P L L Q T T N Y M V L P E T S K A * 860 * 880 * 900 * 920 * 940 * 960 CDVHN6: AAGGTATGTACTATAGCAGTGGGTGAGCTGACACTAGCTTCCTTGTGTGTAGATGAGAGCACCGTATTGTTATATCATGAACGCAACGATTCACAAGATGGTATTCTAGTAGTGACATTA K V C T I A V G E L T L A S L C V D E S T V L L Y H E R N D S Q D G I L V V T L * 980 * 1000 * 1020 * 1040 * 1060 * 1080 CDVHN6: GGAATATTTGGGGCAACACCTATGGATCAAGTTGAAGAGGTGATACCTACCGCTCACCCATCAGTGGAGAGAATACATATAACAAATCACCGTGGGTTCATAAAAGACTCAATAGTAACC G I F G A T P M D Q V E E V I P T A H P S V E R I H I T N H R G F I K D S I V T * 1100 * 1120 * 1140 * 1160 * 1180 * 1200 CDVHN6: TGGATGGTGCCTGTATTGGTCTCTGAGAAACAAGAGGAGCAAAAAAACTGTCTGGAATCTGCTTGTCACAGAAAATCCTACCCTATGTGCAACCAAACGTCATGGGAACCCTTTGGAGGA W M V P V L V S E K Q E E Q K N C L E S A C H R K S Y P M C N Q T S W E P F G G * 1220 * 1240 * 1260 * 1280 * 1300 * 1320 CDVHN6: GGACAGTTGCCTTCTTATGGGCGGTTGACATTACCTCTAGATCCAAGCATTGACCTTCAACTTAACATATCATTTACATATGGTCCAGTTATACTGAACGGAGACGGTATGGATTATTAT G Q L P S Y G R L T L P L D P S I D L Q L N I S F T Y G P V I L N G D G M D Y Y * 1340 * 1360 * 1380 * 1400 * 1420 * 1440 CDVHN6: GAAAGCCCACTTTTGGACTCCGGATGGCTTACCATACCTCCTAAGAACGGGACAGTCCTTGGATTGATAAACAAAGCAAGTAGAGGAGACCAGTTCACTGTGACCCCCCATGTGTTGACA E S P L L D S G W L T I P P K N G T V L G L I N K A S R G D Q F T V T P H V L T * 1460 * 1480 * 1500 * 1520 * 1540 * 1560 CDVHN6: TTTGCGCCCAGGGAATCAAGTGGAAATTGTTATTTGCCTATTCAAACATCCCAGATTATGGATAAAGATGTCCTTACTGAGTCCAATTTAGTGGTGTTACCCACACAGAATTTTAGATAT F A P R E S S G N C Y L P I Q T S Q I M D K D V L T E S N L V V L P T Q N F R Y * 1580 * 1600 * 1620 * 1640 * 1660 * 1680 CDVHN6: GTCATAGCAACATATGACATATCCCGGGGTGATCATGCAATTGTTTATTATGTTTATGACCCAATCCGGACGATTTCTTATACATACCCATTTAGACTAACTACCAAGGGTAGACCTGAT V I A T Y D I S R G D H A I V Y Y V Y D P I R T I S Y T Y P F R L T T K G R P D * 1700 * 1720 * 1740 * 1760 * 1780 * 1800 CDVHN6: TTCTTAAGGATTGAATGTTTTGTGTGGGATGACGATTTGTGGTGTCATCAATTCTACCGATTCGAGGCTAACATCACTAACTCTACAACCAGTGTTGAGAATTTAGTCCGTATAAAATTC F L R I E C F V W D D D L W C H Q F Y R F E A N I T N S T T S V E N L V R I K F * 1820 CDVHN6: TCATGTAACCGTTCAAAACCTTGA : 1824 S C N R S K P *

Hình 3.9. Trình tự nucleotide và amino acid (suy diễn) của gen H chủng CDVHN6 Chú thích: Dòng trên là trình tự nucleotide, dòng dưới là trình tự amino acid (suy diễn)

49

3.4. Kết quả phân tích gen H và so sánh với các chủng của thế giới

Các chuỗi nucleotide thu nhận được truy cập vào Ngân hàng gen sử

dụng chương trình Blast. Kết quả cho thấy 02 chủng virus phân lập được ở Hà

Nội, Việt Nam năm 2019 có hệ số tương đồng cao so với các chủng CDV đã

được công bố trên Ngân hàng gen.

Bảng 3.9. Danh sách các chủng CDV của Việt Nam và thế giới

sử dụng trong nghiên cứu

STT Kí hiệu chủng Genotype

Số đăng kí NHG - - - LC159587 KJ848781 MK431532 JN896331 KJ466106 MH496779 MH496775 AB474397 AB476402 AB490672 AB476401 AB490674 AB475097 AB490672 AB475099 MH496772 MH496773 MH496777 MT149210 MH496774 - - Asia-1 Asia-1 Asia-1 Asia-1 Asia-1 Asia-1 Asia-1 Asia-1 Asia-2 Asia-2 Asia-2 Asia-2 Asia-2 Asia-2 Asia-2 Asia-2 Asia-4 Asia-4 Asia-4 Asia-4 Asia-4 Nước phân lập Việt Nam Việt Nam Việt Nam Việt Nam Trung Quốc Đài Loan Trung Quốc Trung Quốc Thái Lan Thái Lan Nhật Bản Nhật Bản Nhật Bản Nhật Bản Nhật Bản Nhật Bản Nhật Bản Nhật Bản Thái Lan Thái Lan Thái Lan Thái Lan Thái Lan Năm phân lập 2019 2019 2018 2014 2014 2005 2010 2012 2014 2014 - - - - - - - - 2014 2014 2014 2017 2014 1. CDVHN7 2. CDVHN6 3. CDVHN5 4. HCM-33 5. CDV-RD-JL 6. NTU 7. PS 8. SY 9. CDV6 10. CDV4 11. 007Lm 12. 50Con 13. 007Lm-B 14. 011C 15. 011C-H 16. M25CR 17. 009L-H 18. 55L 19. CDV1 20. CDV2 21. CDV8 22. CP8 23. CDV3

50

Genotype STT Kí hiệu chủng

Nước phân lập Trung Quốc Trung Quốc Trung Quốc Nam Phi

Số đăng kí NHG Asia-4 KJ489381 Asia-4 KJ437594 Asia-4 KJ437596 KY971528 Africa MF926601 America-1 Trung Quốc MF926602 America-1 Trung Quốc

Trình tự nucleotide và amio acid vùng gen H của các chủng nghiên cứu

24. NJ(12)5 25. NJ(11)2 26. NJ(12)4 27. WT01SA 28. BJ16C0 29. BJ16C7 30. Onderstepoort AF378705 America-1 31. SnyderHill JN896987 America-1 32. 98-2646 AY542312 America-1 33. 98-2645 AY445077 America-1 34. 98-2654 AY466011 America-1 35. 01-2689 AY649446 America-2 36. A75/17 AF164967 America-2 37. 164071 EU716337 America-2 38. 171391-513 KJ123771 America-2 39. Wa-CDV2013 KC966928 40. Wb-CDV2013 KC966929 41. CDV2784 KF914669 42. BA376-13 KM115535 43. BA201 KM115534 44. BA440 KM115536 45. 25130 KX943324 46. R252 KF640687 47. UY251 KM280689 48. 5804 AY386315 49. 5804P AY386316 Arctic Arctic Arctic Arctic Arctic Arctic Arctic Europe Europe Europe Europe Mỹ Mỹ Mỹ Mỹ Mỹ Mỹ Mỹ Mỹ Mỹ Ý Ý Ý Ý Ý Ý Ý Mỹ Uruguay Đức Đức Năm phân lập 2012 2011 2012 2016 2016 2016 2002 - 1998 1998 1998 2001 2004 2004 2013 2013 2013 2013 2013 2013 2015 - 2012 2003 -

được so sánh với các chủng CDV của thế giời trên ngân hàng gen, bao gồm

đại diện của 8 genotype phổ biến: Asia - 1, Asia - 2, Asia - 4, Europe,

America - 1, America - 2, Arctic, Afirca.

51

Kết quả so sánh cho thấy, giữa 2 chủng nghiên cứu có tỷ lệ đồng nhất

97,30% về nucleotide và tỷ lệ tương đồng 97,20% về amino acid. Tỷ lệ này

thấp nhất khi so sánh với các chủng cùng thuộc genotype Asia - 1.

So sánh với các chủng của thế giới, các chủng CDV của Hà Nội, Việt

Nam có tỷ lệ đồng nhất về nucleotide và tương đồng về amino acid cao hơn

khi so sánh với các chủng CDV thuộc genotype Asia - 1 (từ 97,30% đối với

nucleotide và 97,20% đối với amino acid).

Các nghiên cứu của Việt Nam gần đây cho thấy chủng CDVHN6 có tỷ

lệ đồng nhất cao nhất khi so sánh với chủng CDV-dog-HCM-33-14081 (số

đăng ký ngân hàng gen LC159587) thu được tại thành phố Hồ Chí Minh năm

2014 (99,40%). Tuy nhiên chủng CDVHN7 lại có tỷ lệ đồng nhất nucleotide

so với chủng CDVHN5 cũng thu được tại Hà Nội năm 2018. Điều này giải

thích sự liên hệ về vị trí địa lý và điều kiện khí hậu giữa các chủng CDV.

Khi so sánh với các chủng CDV thuộc các genotype khác, tỷ lệ đồng

nhất về nucleotide và tỷ lệ tương đồng về amino acid thấp hơn đáng kể

(90,10% về nucleotide và 88,60% về amino acid so với chủng Onderstepoort

(số đăng ký AF378705) thuộc genotype America - 1. Đáng chú ý là chủng

Onderstepoort lại là chủng dùng trong sản xuất vắc xin ngày nay. Các chủng

vắc xin hiện nay của Việt Nam có tỷ lệ tương đồng nucleotide cao với chủng

Onderstepoort trong khi có tỷ lệ tương đồng thấp hơn so với chủng

SnyderHill-US (số đăng ký ngân hàng gen: JN896987) cũng là chủng virus

vắc xin thuộc genotype America -1 được phát triển sau này. Kết quả so sánh

về trình tự gen H cũng chỉ ra rằng chủng vaccine này ít hơn 9 nucleotide ở đầu

3’ so với tất cả các CDV ở các genotype khác. Sự khác biệt này được cho là

làm giảm tính thích ứng của chủng CDV vaccine trên chó (RF Budaszewski

và cs., 2016). Các chủng CDV thực địa khác các chủng vaccine ở vị trí liên

kết glycans ở đầu N trên gen H (Sawatsky và Messling V. V., 2010).

52

Cho đến nay các dữ liệu gen của virus gây bệnh Care của Việt Nam

chưa có nhiều. Kết quả giải trình tự gene H và P của 5 chủng virus Care thu

thập từ 5 địa phương: Nam Định, Thái Bình, Hưng yên, Hà Nội và Bắc Giang

cho thấy độ dài lần lượt là 1824 bp và 402 bp. Mức độ tương đồng về

nucleotide ở gene H và P giữa 5 chủng virus nghiên cứu đạt tỷ lệ cao lần lượt

là 90,05 - 99,61% và 94,81 - 99,75%. Mức độ tương đồng về amino acid mã

hóa từ gene H và P giữa 5 chủng virus nghiên cứu đạt tỷ lệ cao lần lượt là

89,38 - 99,5% và 92,47 - 100,0% (Trần Văn Nên và cs., 2017). Chủng của

Việt Nam thu được ở thành phố Hồ Chí Minh năm 2014 (số ngân hàng gen:

LC 159587) có độ tương đồng cao với chủng CDVHN7.

Năm 2018, Nguyễn Văn Dũng và cs. (2018) cho biết tổng cộng có 9 vị

trí glycosyl hóa trên gen H được bảo tồn tương tự như các chủng thuộc

serotype Asia-1. Mức độ tương đồng về acid amin trên gen H giữa các chủng

phát hiện được là 99-100%. Điều này cho thấy các chủng CDV đang lưu hành

tại Việt Nam tương đối phức tạp. Phần lớn các chủng phân lập được gần đây

có tỷ lệ tương đồng cao so với các chủng đã được phân lập trước đây (Đoàn

Thị Thanh Hương và cs., 2018).

53

Bảng 3.10. Tỷ lệ đống nhất về nucleotide và amino acid giữa các chủng CDV nghiên cứu và các chủng của thế giới

Genotype

ASIA-1

AMERICA-1 AMERICA-2

ARCTIC

ASIA-2

ASIA-4

EUROPE AFRICA

STT

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

17

18

1

97.3

99.4

98.2

98.1

90.1

90.8

93.1

95.1

92.8

92.3

92.5

92.4

93.4

93.4

95.2

94.4

93.4

2

97.2

97.4

99.6

98.1

90.1

90.8

93.3

95.1

93.0

92.5

92.3

92.3

93.6

93.5

94.8

94.1

93.3

3

99.2

97.2

97.5

98.3

90.0

90.7

93.1

95.0

92.9

92.3

92.4

92.4

96.7

93.3

95.2

94.4

93.3

4

98.1

99.3

97.5

98.2

90.4

91.1

93.4

95.2

93.1

92.8

92.5

92.4

93.8

93.6

95.0

94.2

93.4

5

98.0

98.2

98.0

98.5

90.2

91.0

93.6

95.6

93.6

93.0

93.1

93.1

94.0

93.9

95.5

94.8

94.1

6

88.6

89.0

88.5

89.5

96.1

90.8

92.4

91.1

90.7

90.9

90.9

91.0

91.0

92.1

91.8

89.1

91.3

7

90.8

91.3

90.8

91.6

91.3

90.7

92.4

91.6

91.2

91.0

91.0

91.2

91.2

92.3

91.9

94.4

91.7

8

92.3

92.6

92.3

93.2

92.9

88.6

96.7

93.6

93.1

92.8

92.8

94.4

94.1

95.7

95.0

89.9

93.6

9

95.1

95.7

95.1

96.0

96.0

91.4

93.1

95.2

94.7

94.6

94.5

96.5

96.2

97.5

96.8

95.2

95.3

10

92.3

92.8

92.3

93.1

92.8

89.2

91.3

92.1

99.4

93.5

93.5

93.8

93.6

95.0

94.4

94.7

94.5

11

91.9

92.4

91.9

92.8

92.4

88.9

91.1

91.9

94.4

93.0

92.9

93.3

93.3

94.4

93.9

99.3

94.1

12

92.9

93.2

92.9

93.6

93.6

89.4

90.6

91.8

94.6

92.6

99.6

92.8

92.8

94.2

93.7

92.3

93.5

13

92.6

92.9

92.6

93.2

93.2

89.1

90.3

91.8

94.2

92.3

91.9

92.9

92.8

94.3

93.6

99.7

93.5

14

93.7

94.4

93.7

94.7

94.7

89.8

91.3

93.6

96.5

93.2

92.9

93.1

99.7

95.8

95.1

93.1

93.6

15

93.4

94.1

93.4

94.4

94.4

89.4

90.9

93.2

96.2

92.9

92.6

92.8

92.8

95.7

95.0

99.7

93.5

16

95.2

95.2

95.2

95.6

95.6

90.7

92.4

94.4

97.5

94.1

93.7

94.1

94.1

96.0

95.7

98.3

95.2

17

94.2

94.2

94.2

94.6

94.6

91.1

92.4

93.7

96.9

93.7

93.4

93.4

93.1

95.1

94.7

98.0

94.6

18

94.6

93.4

93.9

93.4

94.2

94.4

90.1

91.8

92.6

95.9

93.7

93.6

93.7

93.4

94.1

93.7

95.2

1. CDVHN6; 2. CDVHN7; 3.CDVHN5-(VN-2018); 4.CDV-dog-HCM-33-140816(VN-2014)-LC159587; 5.Canine-NTU-2005-1-TW-2005(MK431532); 6.

Onderstepoort (AF378705);7. SnyderHill-US(JN896987); 8. 01-2689-US-2001(AY649446) ; 9. A75-17-US(AF164967); 10. 25130-IT-2015(KX943324) ; 11.

CDV2784-2013-IT-2013(KF914669); 12. 50Con-JP(AB476402) ; 13. 55L-JP(AB475099); 14. CDV1-TH-2014(MH496772); 15. CDV8-TH-2014(MH496777);

16. 5804DE(AY386315); 17. Uy251-UY-2012(KM280689); 18. WT01SA-ZA-2016(KY971528).

54

Toàn bộ gen H của 2 chủng virus nghiên cứu gồm 1824 nucleotide. Độ

dài này giống với đa số độ dài gen H của các chủng CDV ở nhiều genotype

trong đó có cả chủng vắc xin SnyderHill (JN896987) (thuộc genotype

America - 1) nhưng lại dài hơn độ dài của gen H của chủng virus vắc xin là

Onderstepoort (AF378705) 9 nucleotide tương ứng với 3 amino acid. Chín

nucleotide này nằm ở cuối gen H. Bộ 3 kết thúc của chủng nghiên cứu là

TGA trong khi đó ở 2 chủng vắc xin lại là TAA khiến chủng virus vắc xin

Onderstepoort khác hẳn với các chủng virus khác ở vị trí kết thúc 1815 (của

gen H). Chủng virus nghiên cứu CDVHN6 cũng có sự sai khác (T1815C) so

với các chủng khác ở vị trí này (Hình 3.4). Sự sai khác này dẫn đến sai khác

về amino acid (L605S). Đây là sự khác biệt rõ rệt nhất trong gen H của các

chủng virus thực địa so với chủng virus vắc xin.

Hình 3.10. Sai khác nucleotide ở cuối gen H dẫn đến sự khác biệt của chủng virus vaccine so với chủng virus nghiên cứu

55

Kết quả so sánh trình tự nucleotide của gen H so với các chủng CDV

thuộc các genotype khác nhận thấy: các chủng virus CDV thuộc genotype

Asia - 1 có sự khác biệt hoàn toàn với các genotype khác ở các vị trí 30 vị trí

trên gen H dẫn đến 4 vị trí sai khác amino acid (A179G, T267N, V359A)

trong đó tại vị trí 1590 (tương ứng với vị trí amino acid 530) có sự khác biệt

hoàn toàn giữa các genotype.

3.5. Kết quả phân tích phả hệ nguồn gốc của các chủng CDV Việt Nam

Hai chủng CDV trong nghiên cứu này được phân tích xác định phả hệ

nguồn gốc cùng 49 chủng CDV thu thập tại Việt Nam và thế giới dựa trên

trình tự toàn bộ gen H (Hình 3.11).

Trình tự gen H của 2 chủng virus CDNHN6 và CDVHN7 được đưa

vào 2 phần mềm tin - sinh chuyên dụng là GENEDOC 2.7 và MEGA 7 để

xác định tỷ lệ tương đồng nucleotide/amino acid và xây dựng phả hệ nguồn

gốc. Phần mềm MEGA 7 được sử dụng trong nghiên cứu này là phiên bản

mới được cập nhật, sử dụng phương pháp kết nối liền kề (Neighbors -

joining method) với hệ số tin cậy Bootstrap 1000. Các chủng được đưa vào

xây dựng nguồn gốc phả hệ là các chủng thuộc nhiều genotype khác nhau có

thời gian phân lập và vị trí phân bố cũng khác nhau.

Kết quả phân tích phả hệ nguồn gốc của các chủng CDV dựa trên dữ

liệu trình tự nucleotide của gen H Chủng CDVHN6 gần gũi nhất với chủng

CDVHN5 thu được tại Hà Nội, Việt Nam năm 2018 (đã được giải mã toàn bộ

hệ gen). Sự gần gũi có thể là do vị trí và thời điểm thu 2 mẫu này tương đối

giống nhau (cùng ở Hà Nội và cùng năm 2018). Chủng CDVHN7 lại gần gũi

với chủng CDV/dog/HCM/33/140816 thu được tại thành phố Hồ Chí Minh

năm 2014. Cả hai chủng nghiên cứu đều thuộc genotype Asia - 1.

Kết quả được thể hiện ở hình 3.11.

56

Hình 3.11. Cây phả hệ thể hiện mối quan hệ nguồn gốc giữa các chủng CDV nghiên cứu và các chủng của thế giới

Chú thích: Chủng CDVHN6 và CDVHN7 là 2 chủng nghiên cứu được

đánh dấu hình quả trám ( ) trên cây phả hệ nguồn gốc.

57

Cây phả hệ cho thấy chủng CDVHN6 và CDVHN7 thu nhận tại Hà Nội

năm 2019 thuộc genotye Asia-1 cùng với các chủng của châu Á bao gồm

Trung Quốc, Thái Lan, Đài Loan và chủng CDVHN5 của Việt Nam phân lập

năm 2018 tại Hà Nội, CDV/dog/HCM/33/140816 của Việt Nam phân lập năm

2014 tại thành phố Hồ Chí Minh; trong đó chủng CDVHN6 có quan hệ gần

gũi nhất với CDVHN5 của Việt Nam, chủng CDVHN7 gần gũi nhất với

chủng CDV/dog/HCM/33/140816 cũng của Việt Nam (số GenBank:

LC159587). Kết quả nghiên cứu này hoàn toàn thống nhất với kết quả nghiên

cứu năm 2018 khi xác định genotype của các chủng virus CDV thu nhận tại

Hà Nội dựa trên dữ liệu gen H (Đoàn Thị Thanh Hương và cs., 2018).

Các chủng CDV phân lập tại Thái Lan và Trung Quốc năm 2014 tập

trung thành một genotype Asia-4 và có quan hệ gần gũi hơn với nhóm

genotype Asia-1. Các tác giả dự đoán rằng genotype Asia-4 tại Thái Lan gần

đây có nguồn gốc từ các chủng thuộc nhóm Asia-1 tiến hóa thành (Piewbang

và cs., 2019).

Các genotype còn lại nằm ở các nhánh riêng biệt, có độ tập trung cao

theo nhóm genotype. Nhóm genotype Asia-2 gồm các chủng của Nhật Bản.

Nhóm genotype America-1 gồm các chủng của Mỹ, Anh và Trung Quốc.

Nhóm genotype America-2 tập hợp các chủng của Mỹ. Nhóm genotype

Europe gồm tập hợp các chủng của Mỹ, Anh, Gabon, Brazin, Uruguay và

Đức. Các chủng CDV của Ý thuộc genotype Arctic. Genotype Africa chỉ gồm

chủng WT01SA-ZA phân lập được tại Nam Phi năm 2016.

Một số nghiên cứu tại Việt Nam cho thấy: các chủng CDV từ năm 2013

- 2018 chưa có sự biến đổi lớn, đều thuộc genotype Asia-1. Điều này rất thuận

lợi cho công tác phòng bệnh bằng vắc xin tại Việt Nam. Tuy nhiên, đáng chú

ý là nhiều loại vắc xin đang sử dụng hiện nay được nhập khẩu từ Mỹ và các

nước châu Âu, có sự khác biệt khá lớn về trật tự hệ gen, cũng như không gần

gũi về phả hệ nguồn gốc với các chủng thuộc genotype Asia-1. Do đó, chúng

ta nên thận trọng khi sử dụng các chủng vắc xin nhập khẩu tiêm phòng cho

chó tại Việt Nam.

58

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

1. Kết luận

1. Tại 3 Quận (Hà Đông, Nam Từ Liêm, Cầu Giấy - Hà Nội), chó mắc

bệnh Care có đầy đủ các triệu chứng lâm sàng đặc trưng của bệnh: sốt, bỏ ăn

hoặc ăn ít, nôn mửa, ỉa chảy, phân có lẫn máu, trên vùng da mỏng có nốt

chấm đỏ (nốt sài), chảy dịch mắt dịch mũi và có thể có triệu chứng thần

kinh…., tỷ lệ chó mắc bệnh là 19,05% với 74,53% số con chết do bệnh. Trong

đó, giống chó lai có tỷ lệ mắc bệnh cao nhất chiếm 40,90%; giống chó nội có

tỷ lệ mắc bệnh là 29,13% và giống chó ngoại là 11,20%.

Chó từ 2 - 6 tháng tuổi chó có tỷ lệ mắc bệnh cao nhất chiếm 23,28%;

giai đoạn 6 đến trên 12 tháng tỷ lệ từ 11,11 - 11,92%. Chó thường mắc bệnh

với tỷ lệ cao nhất vào mùa xuân (32,91%); mùa thu thấp nhất (2,00%). Nếu

được tiêm phòng đầy đủ tỷ lệ mắc là 8,91%; chưa được tiêm phòng có tỷ lệ

mắc bệnh chiếm 28,84%.

2. Đã xác định và lựa chọn 2 mẫu CDVHN6, CDVHN7 để tách chiết

RNA và thu được RNA tổng số với các nồng độ của mẫu CDVHN6 là 165

ng/µl, CDVHN7 là 202 ng/µl.

3. Sản phẩm PCR thu được có kích thước đúng như dự đoán, chất

lượng sản phẩm tốt. Sản phẩm này tiếp tục được tinh sạch và thu được 2 đoạn

DNA có kích thước 2021 nucleotide, chứa hoàn toàn gen H có kích thước

1824bp.

4. Đã xác định được 2 chủng virus phân lập được có hệ số tương đồng

cao so với các chủng đã được công bố trên Ngân hàng gen với tỷ lệ đồng nhất

97,30% về nucleotide và tỷ lệ tương đồng 97,20% về amino acid.

5. Đã phân tích phả hệ 2 chủng CDVHN6 và CDVHN7 thu nhận tại Hà

Nội năm 2019 cho thấy 2 chủng này thuộc genotye Asia-1 cùng với các chủng

của châu Á bao gồm Trung Quốc, Thái Lan, Đài Loan.

59

2. Đề nghị

- Cần tiếp tục có những nghiên cứu sâu và rộng hơn nữa về gen kháng

nguyên của virus Care trên chó.

- Áp dụng những kết quả nghiên cứu là cơ sở để nhằm phát triển và sản

xuất vaccine tái tổ hợp..

- Người nuôi chó cần chú trọng đến việc phòng, chống bệnh Care một

cách hiệu quả nhằm giảm thiệt hại trong chăn nuôi.

- Cần thận trọng khi sử dụng các chủng vắc xin nhập khẩu từ Mỹ và

các nước châu Âu tiêm phòng cho chó tại Việt Nam do sự khác biệt khá lớn

về trật tự hệ gen, cũng như không gần gũi về phả hệ nguồn gốc với các chủng

thuộc genotype Asia-1.

60

TÀI LIỆU THAM KHẢO

I. Tài liệu tiếng Việt

1. Hồ Đình Chúc (1993), Bệnh Care trên đàn chó ở Việt Nam và kinh nghiệm

điều trị, Công trình nghiên cứu, Hội Thú y Việt Nam.

2. Tô Du, Xuân Giao (2006), Kỹ thuật nuôi chó mèo và phòng trịnh bệnh

thường gặp, Nxb Lao động và Xã hội, Hà Nội

3. Nguyễn Văn Dũng, Vũ Kim Chiến, Phan Xuân Thảo (2018), “Phân lập và

xác định đặc tính di truyền của virus gây bệnh Care trên chó nuôi tại thành

phố Hồ Chí Minh”, Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Thú y, 15(4): 19 - 26.

4. Nguyễn Bá Hiên, Trần Thị Lan Hương (2009), Giáo trình miễn dịch học

thú y, Nxb Nông Nghiệp, 79 - 84.

5. Nguyễn Bá Hiên, Trần Thị Lan Hương (2010), Giáo trình miễn dịch học

ứng dụng, Nxb Nông Nghiệp, 153 -156.

6. Nguyễn Thị Huyền, Nguyễn Vũ Sơn, Phạm Ngọc Thạch, Nguyễn Hữu

Nam (2018), “Một số đặc điểm bệnh lý chủ yếu của chó được gây nhiễm

thực nghiệm bằng chủng virus CDV-HV”, Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Thú

y, 15(4): 27 - 35.

7. Nguyễn Thị Huyền, Nguyễn Vũ Sơn, Phạm Ngọc Thạch, Nguyễn Hữu

Nam (2019), “Một số đực điểm dịch tễ của bệnh Care trên chó tại Hà

Nội”, Tạp chí Khoa học Nông nghiệp Việt Nam, 17(4): 279 - 287.

8. Đoàn Thị Thanh Hương, Nguyễn Thị Khuê, Đỗ Thị Roan, Nguyễn Ngọc

Trâm, Lê Thị Kim Xuyến, Nguyễn Thị Bích Nga, Lê Thanh Hòa (2018),

“Đặc điểm phân tử và phả hệ nguồn gốc virus gây bệnh Care (Cannine

Distemper Virus) phân lập năm 2017 tại Hà Nội”. Hội nghị khoa học Công

nghệ sinh học toàn quốc 2018, Nxb Khoa học Tự nhiên & Công nghệ:

1705 - 1711.

61

9. Nguyễn Thị Lan, Bounheuhang Sihoungvanh, Nguyễn Thị Yến, Nguyễn

Hữu Nam (2015), “Một số đặc điểm bệnh lý của chó được gây bệnh thực

nghiệm bằng chủng virus Care (CDV-768)”, Tạp chí Khoa học và Phát

triển 13(1): 56 - 64.

10. Nguyễn Thị Lan, Trần Trung Kiên (2010), “Nghiên cứu bệnh Care trên

chó vùng Hà Nội bằng phương pháp giải phẫu bệnh lý và mô hóa miễn

dịch”, Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Thú y, 7(2): 14 - 18.

11. Nguyễn Thị Lan, Khao Keonam (2012), “Đặc điểm bệnh lý của chó Phú

Quốc mắc bệnh Care và ứng dụng kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang để

chẩn đoán bệnh”, Tạp chí Khoa học và Phát triển, 10(6): 913 - 918.

12. Diệp Thị Diễm My, Trần Ngọc Bích, Trần Thị Thảo, Nguyễn Khánh

Thuận, Huỳnh Kim Diệu (2020), “Bệnh Care trên chó tại thành phố Sa

Đéc, tỉnh Đồng Tháp”, Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Thú y, 17(4): 25 - 30.

13. Nguyễn Hữu Nam (2010), Nghiên cứu sự lưu hành của virus Care gây bệnh

trên chó ở vùng phụ cận Hà Nội bằng phương pháp miễn dịch và chọn

chủng để chế vaccine phòng bệnh. Báo cáo tóm tắt tổng kết đề tài, 6 - 7.

14. Trần Văn Nên, Nguyễn Thị Lan, Nguyễn Thị Hoa, Nguyễn Hữu Nam

(2016), “Đánh giá khả năng bảo hộ của vacxin vô hoạt Care từ chủng

CDV-VNUA-768 trên chó thí nghiệm”, Tạp chí Khoa học và Phát triển,

14 (1): 21 - 27.

15. Trần Văn Nên, Nguyễn Thị Lan, Nguyễn Văn Thanh, Lương Quốc Hưng

(2017), “Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học phân tử của virus Care

phân lập được tại một số tỉnh phía Bắc Việt Nam”, Tạp chí Khoa học

Nông nghiệp Việt Nam, 15(1): 44 - 57.

16. Nguyễn Như Pho (2003), Bệnh Parvovirus và Care trên chó, Nxb Nông

nghiệp, Hà Nội.

17. Phan Thị Hồng Phúc, Nguyễn Thị Ngân, La Văn Công, Đặng Thị Mai

Lan, Nguyễn Thị Bích Đào, Nguyễn Đình Thắng (2019), “Nghiên cứu

62

một số đặc điểm dịch tễ ở chó mắc bệnh Care tại Bệnh xá Thú y, trường

Đại học Nông Lâm Thái Nguyên”, Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Thú y,

16(4): 43 - 50.

18. Phan Thị Hồng Phúc, Phạm Thị Trang, Phạm Thị Phương Lan (2020),

“Một số đặc điểm bệnh lý ở chó mắc bệnh Care khám và điều trị tại Bệnh

xá thú y, trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên”, Tạp chí Khoa học Kỹ

thuật Thú y, 17(4): 31 - 36.

19. Nguyễn Vĩnh Phước (1978), Giáo trình bệnh truyền nhiễm gia súc, Nxb

Nông nghiệp.

20. Lê Thị Tài (2006), Một số bệnh mới do virus, Nxb Nông Nghiệp

21. Trần Thị Thảo, Trần Ngọc Bích, Nguyễn Phúc Khánh (2019), “Bệnh Care

trên chó tại thành phố Trà Vinh”, Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Thú y, 16(8):

22 - 27.

II. Tài liệu tiếng nước ngoài

22. Alessia Peserico, Maurilia Marcacci, Daniela Malatesta, Marco Di

Domenico, Annamaria Pratelli, Iolanda Mangone, Nicola D’Alterio,

Federica Pizzurro, Francesco Cirone, Guendalina Zaccaria, Cesare

Cammà, Alessio Lorusso (2019), “Diagnosis and characterization of

canine distemper virus through sequencing by MinION nanopore

technology”, Scientific reports, 9:1714

23. An D.J., Yoon S.H., Park J.Y., No I.S., Park B.K. (2008), “Phyogenetic

characterization of canine distemper virus isolates from naturally infected

dogs and marten in Korea”, Veterinary Microbiology, 132: 389 - 395.

24. Angelika K. Loots, Emily Mitchell, Desiré L. Dalton, Antoinette Kotzé,

Estelle H. Venter (2017), “Advances in canine distemper virus

pathogenesis research: a wildlife perspective”, Journal of General

Virology, 98: 311 - 321.

25. Appel M.J.G., Gillespie J.H. (1972), "Canine Distemper Virus", Volume

63

11 of the series Virology Monogiaphs/Die V11US foischung 111

Einzeldarstellungen. Vienna: Springer Vienna, 1 - 96.

26. Assessment M.E. (2005), Ecosystems and human well-being, World

Resources Institute. Springer. New York, 159.

27. Bevan Sawatsky, Veronika von Messling (2010), “Canine Distemper

Viruses Expressing a Hemagglutinin without N-Glycans Lose Virulence but

Retain Immunosuppression”, Jouranl of virology, 2753 – 2761.

28. Blancou J. (2004), “Dog distemper: imported into Europe from South

America?” Hist Med Vet, 29(2): 35 - 41.

29. Carter S.D., May C., Bell S.C. (1992), “Canine distemper virus and

rheuma toid arthritis in dogs”, Veterinary Microbiology, 123 - 145.

30. Carvalho O.V., Botelho C.V., Ferreira C.G., Ferreira H.C., Santos M.R.,

Diaz M.A., Oliveira T.T., Soares-Martins J.A., Almeida M.R., Silva Júnior

A.S. (2013), “In vitro inhibition of canine distemper virus by flavonoids

and phenolic acids: Implications of structural differences for antiviral

design”, Research in Veterinary Science, 95(2): 717 - 724.

31. Cha S.Y. Seo H.S., Kang M., Jang H.K. (2013), “Serologic survey for

antibodies to canine parvovirus and influenza virus in wild raccoon dogs

(Nyctereutes procyonoides) in South Korea”, Journal of Wildlife

Diseases, 49: 200 - 202

32. Cheng Y., Wang J., Zhang M., Zhao J., Shao X., Ma Z., Zhao H., Lin P.,

Wu H. (2015), Isolation and sequence analysis of a canine distemper virus

from a raccoon dog in Jilin Province, China. Virus Gene.

33. Chutchai Piewbang, Araya Radtanakatikanon, Jiratchaya Puenpa, Yong

Poovorawan , Somporn Techangamsuwan (2019), “Genetic and

evolutionary analysis of a new Asia-4 lineage and naturally recombinant

canine distemper virus strains from Thailand”, Sci Rep, 9: 3198.

64

34. David T. Smith, Donald S. Martin (1979), Zinser’s Text book of

Bacteriology, 808 - 810.

35. Diallo A. (1990), “Morbillivirus gruop: genome organisation and

proteins”, Veterinary Microbiology, 23: 155 - 163

36. Demeter Z., Plade E.A., Hormyak A., Rusvai M. (2010), “Controversial

results of the genetic analysis of a canine distemper vaccine strain”, Vet

Microbiol, 142: 420 - 426.

37. Dung N.V., Suzuki J., Minami S., Yonemitsu K., Nagata N., Kuwata R.,

Shimoda H., Vu C.K., Truong T.Q., Maeda K. (2016), “Isolation and

phylogenetic analysis of canine distemper virus among domestic dogs in

Vietnam”, J Vet Med Sci, 79(1):123 - 127.

38. Duque Valencia J., Sarute N., Olarte Castillo X. A., Ruíz Sáenz J. (2019),

“Evolution and Interspecies Transmission of Canine Distemper Virus-An

Outlook of the Diverse Evolutionary Landscapes of a Multi-Host

Virus”. Viruses, 11(7): 582.

39. Gámiz C., Martella V., Ulloa R., Fajardo R., Hernandér I. Q., Martínez S.

(2011), “Indentification of a new genotype of canine distemper virus

circulating in America”, Vet. Res. Commun, 35: 381 - 390.

40. Greene C.E., Appel M.J. (1987), Canine distemper. In Clinical

microbiology and infectious diseases of the dog and cat, 386 - 405. Edited

by Greene C. E. Philadelphia: W B Saunders.

41. Hashimoto M., Une Y., Mochizuki M (2001), “Hemagglutinin genotype

profiles of canine distemper virus from domestic dogs in Japan”. Arch.

Virol, 146: 149 - 155.

42. Hirama K., Goto Y., Uema M., Endo Y., Miura R., Kai C. (2004).

“Phylogenetic analysis of the hemagglutinin (H) gene of canine distemper

viruses isolated from wild masked palm civets (Paguma larvata)”. J Vet

Med Sci, 66(12): 1575 - 1578.

65

43. Ke G.M., Ho C.H., Chiang M.J., Shanno D., Chung C.S., Lin M.Y., Shi

Y.Y., Yang M.H., Tyan Y.C., Liao P.C., Chu P.Y. (2015), “Phylodynamic

analysis of the canine distemper virus hemagglutinin gene”, BMC Vet Res,

11: 164.

44. Kennedy S., Smyth J.A., Cush P.F., Duignan P., Platten M., McCullough

S.J., Allan G.M. (1989), Histopathologic and immune histochemmical

studies of distemper in seal, Veterinary Pathology, 97 - 103

45. Kubo T., Kagawa Y., Taniyama H., Hasegawa A. (2007), “Distribution of

inclusion bodies in tissues from 100 dogs infected with canine distemper

virus”, J Vet Med Sci, 69(5): 527 - 529.

46. Krumm S. A., Yan D., Hovingh E. S., Evers T.J., Enkirch T., Reddy G. P.,

Sun A., Saindane M. T., Arrendale R. F., Painter G., Liotta D. C., Natchus

M. G., Messling V. V., Plemper R. K. (2014), “An Orally Available,

Small-Molecule Polymerase Inhibitor Shows Efficacy Against a Lethal

Morbillivirus Infection in a Large Animal Model”, Science Translational

Medicine ,Vol. 6, Issue 232: 232 - 252.

47. Lamb R.A.; Kolakofsky D. (2001), “Paramyxoviridae: the viruses and

theirreplication”. In: Fields, D.M; Knipe, D.M; Howley, P.M (ed). Fields

virology. 4th ed. Phialdephia: Lippincott-William&Wilkins, 1305 - 1443.

48. Lan N.T., Yamaguchi R., Furuya Y., Inomata A., Ngamkala S., Noganobu

K., Kai K., Mochizuki M., Kobayashi Y., Uchida K. & Tetayama S.

(2005), “Pathogenesis and phylogenetic analyses of canine distemper virus

strain 007Lm, a new isolate in dogs”, Vet Microbiol. 110 (3 - 4): 197 - 207.

49. Lan N.T., Yamaguchi R., Inomata A., Furuya Y., Uchida K., Sugano S. &

Tetayama S. (2006), “Comparative analyses of canine distemper viral

isolates from clinical cases of canine distemper in vaccinated dogs”, Vet

Microbiol. 115(1 - 3): 32 - 42.

66

50. Nguyen Thi Lan, Ryoji Yamaguchi, Tran Trung Kien. Takuya Hirai,

Yuichi Hidaka and Nguyen Huu Nam (2008), “First Isolation and

Chaiactenzation of Canine Distemper Virus in Vietnam with the

Immunohistochemical Examination of the Dog”, J. Vet. Med. Sci, 155-162.

51. Lednicky J.A., Dubach J., Kinsel M.J. (2004). “Genetically distant

American Canine distemper virus lineages have recently caused epizootics

with somewhat different characteristics in raccoons living around a large

suburban zoo in the USA”. Virol J 1, 2.

52. Li W., Cai C., Xue M., Xu G., Wang X., Zhang A., Han L. (2018),

“Phylogenetic analysis of canine distemper viruses isolated from

vaccinated dog in Wuhan”, J Vet Med Sci, 80(11): 1688 - 1690.

53. Ling Guo, Shao-lin Yang, Cheng-dong Wang, Rong Hou, Shi-jie Chen,

Xiao-nong Yang, Jie Liu, Hai-bo Pan, Zhong-xiang Hao, Man-li Zhang,

San-jie Cao, Qi-gui Yan (2013), “Phylogenetic analysis of the

haemagglutinin gene of canine distemper virus strains detected from giant

panda and raccoon dogs in China”, Virology Journal, 10:109

54. Maclachlan N.J., Dubovi E.J. (2011), Paramyxoviridae. Fenner’s veterinary

virology. 4. ed. California, San Diego: Academic Press, 299 - 325.

55. Maria A. Espinal, Francisco J. Díaz, Julian Ruiz-Saenz (2014),

“Phylogenetic evidence of a new canine distemper virus lineage among

domestic dogs in Colombia, South America”, Veterinary Microbiology,

172: 168 - 176.

56. Messling V.V., Zimmer G., Herrler G., Haas L., Cattaneo R. (2001), “The

Hemagglutinin of Canine Distemper Virus Determines Tropism and

Cytopathogenicity”, J Virol. 75(14): 6418 - 6427.

57. Nicholas K.B., Nicholas H.B. (1999), GeneDoc: a tool for editing and

annotating multiple sequence aligntment. Distributed by authors.

67

58. Piewbang C., Radtanakatikanon A., Puenpa J., Poovorawan Y.,

Techangamsuwan S. (2019), “ Genetic and evolutionary analysis of a new

Asia-4 lineage and naturally recombinant canine distemper virus strains

from Thailand, Scientific Reports, 9: 3198

59. Pope J.P., Miller D.L., Riley M.C., Anis E., Wilkes R.P. (2016),

“Characterization of a novel Canine distemper virus causing disease in

wildlife”, J Vet Diagn Invest, 28 (5): 506 - 513.

60. Renata da Fontoura Budaszewski, Veronika von Messling (2016),

“Morbillivirus Experimental Animal Models: Measles Virus Pathogenesis

Insights from Canine Distemper Virus”, Viruses, 8: 274.

61. Sawatsky B., Messling V. V. (2010), “Canine distemper viruses expressing

a hemagglutinin without N-glycans lose virulence but retain

immunosuppression”, J Virol, 84(6): 2753 - 2761.

62. Sidhu M.S., Husar W., Cook S.D., Dowling P.C., Udem S.A. (1993),

“Canine distemper terminal and intergenic non-protein coding nucleotide

sequences: completion of the entire CDV genome sequence”, Virology, 66 - 72

63. Swati, Deka D., Uppal S.K., Verma R. (2015), “Isolation and phylogenetic

characterization of Canine distemper”, Virus Dis, 26(3): 133 - 140.

64. Trejo-Avila L. M., Morales-Martínez M. E., Ricque-Marie D., Cruz-

Suarez L. E., Zapata-Benavides P., Morán-Santibanez K., Rodríguez-

Padilla C. (2014), “In vitro anti-canine distemper virus activity of

fucoidan extracted from the brown alga Cladosiphon okamuranus”, Virus

Disease, 25: 474 - 480.

III. Tài liệu Internet

65. http://www.marvistavet.com/canine-distemper

66. www.veteriankey.com

67. http://www.ncbi.nlm.nih.gov