Luận văn tốt nghiệp: "Nghiên cứu tuyển chọn một số chủng vi khuẩn Bacillus có hoạt tính enzyme proteaza kiềm”

Chia sẻ: Up Upload | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:71

Thêm vào BST

Báo xấu

159
lượt xem 61
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Vi sinh vật trong tự nhiên rất phong phú và đa dạng. Chúng ở xung quanh ta: trong đất, trong nước, không khí thậm chí cả trong cơ thể con người. Chúng có thể gây cho ta cả những bất lợi khôn lường như những bệnh lao, dịch hạch, dịch tả, đại dịch cúm ở người và gia cầm, lở mồm, long móng ở bò lợn... nhưng chúng cũng có thể đem lại cho chúng ta nguồn lợi vô cùng to lớn nếu ta biết, hiểu chúng và biết sử dụng chúng vào mục đích sẽ giúp cho cuộc sống con người tốt đẹp hơn....

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn tốt nghiệp: "Nghiên cứu tuyển chọn một số chủng vi khuẩn Bacillus có hoạt tính enzyme proteaza kiềm”

Đề tài: " Nghiên cứu tuyển chọn một số chủng vi khuẩn Bacillus có hoạt tính enzyme proteaza kiềm"
i LỜI CẢM ƠN Sau gần 3 tháng thực tập tại phòng Vi sinh vật – Viện Sinh học Nông Nghiệp, trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội, dưới sự hướng dẫn của PGS – TS. Lương Đức Phẩm nên tôi đã hoàn thành cuốn luận văn này. Qua đây tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS – TS. Lương Đức Phẩm người đã định hướng nghiên cứu, quan tâm và tận tình chỉ bảo cho tôi trong suốt quá trình thực tập, cùng các anh chị phòng Vi sinh vật, những người đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành tốt nhiệm vụ của mình. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo trường Đại học Nha Trang, cùng toàn thể các thầy cô giáo trong Viện Công nghệ sinh học đã tận tình chỉ bảo và truyền đạt những kiến thức quý báu cho tôi trong những năm học vừa qua. Tôi xin chân thành cảm ơn các anh, chị đang công tác tại Viện Sinh học Nông Nghiệp, trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội và các bạn cùng thực tập đã giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực tập. Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình cùng toàn thể bạn bè thân thiết, những người đã động viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu. Hà Nội, tháng 6 – 2009 Sinh viên Nguyễn Thị Phương Như
ii MỤC LỤC Trang Phần I TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................................3 1.1. Đại cương về Bacillus ............................................................................... 4 1.2. Protease................................................................................................... 10 1.2.1. Tính chất, đặc điểm của protease ...................................................... 10 1.2.2. Ứng dụng của protease .................................................................... 12 1.2.3. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng protease trong sản xuất ở Việt Nam ........................................................................................................... 15 Phần II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................... 16 2.1 Đối tượng – Vật liệu................................................................................. 17 2.1.1. Đối tượng ......................................................................................... 17 2.1.2. Vật liệu ............................................................................................. 17 2.1.2.1.Thiết bị ........................................................................................... 17 2.1.3. Môi trường nuôi cấy vi sinh vật ........................................................ 18 2.1.3.1. Môi trường NA (dùng để phân lập, giữ giống và nuôi cấy) (g/l):........................................................................................................ 18 2.1.3.2. Môi trường thử hoạt tính amylase, protease ................................ 18 2.1.3.3. Cách chuẩn bị môi trường .......................................................... 19 2.2. Các phương pháp nghiên cứu .................................................................. 19 2.2.1. Phương pháp phân lập ...................................................................... 19 2.2.2. Phương pháp giữ giống cấy chuyển .................................................. 19 2.2.3. Một số phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh học của vi khuẩn ..... 20 2.2.3.1. Phương pháp quan sát đặc điểm khuẩn lạc ................................. 20 2.2.3.2. Phương pháp làm tiêu bản tế bào sống ....................................... 20 2.2.3.3. Phương pháp nhuộm Gram......................................................... 21 2.2.3.4. Phương pháp xác định sự hình thành bào tử ............................... 22 2.2.4. Phương pháp xác định hoạt tính Catalase .......................................... 22
iii 2.2.5. Xác định mật độ tế bào bằng phương pháp đo mật độ quang (OD620nm ) ............................................................................................... 22 2.2.6. Nghiên cứu khả năng thủy phân tinh bột, protein .............................. 23 2.2.7. Nghiên cứu ảnh hưởng của các nguồn nguyên liệu khác nhau lên khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp enzyme của các chủng Bs, Bm, BM ............................................................................................................. 24 2.2.8. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ oxy hòa tan lên khả năng sinh trưởng của các chủng Bs, Bm, BM ............................................................. 25 Phần III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ................................ 26 3.1. Phân lập chủng Bacillus .......................................................................... 27 3.2. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc............................................................... 27 3.3. Đặc điểm hình thái tế bào .................................................................... 28 3.4. Nghiên cứu hoạt tính Catalase ............................................................. 30 3.5. Nghiên cứu khả năng sinh enzym thuỷ phân tinh bột, protein của ba chủng Bs, Bm và BM ..................................................................................... 31 3.6. Nghiên cứu quá trình sinh trưởng của các chủng Bs, Bm và BM trên môi trường không có chất cảm ứng ............................................................ 33 3.7 Nghiên cứu quá trình sinh trưởng và sinh enzmy amylaza của 3 chủng vi khuẩn Bs, Bm và BM trên môi trường có chất cảm ứng là tinh bột tan ........................................................................................................ 34 3.7.1. Nghiên cứu quá trình sinh trưởng của 3 chủng vi khuẩn Bs, Bm và BM trên môi trường có chất cảm ứng là tinh bột tan ................................... 34 3.7.2. Nghiên cứu quá trình sinh enzyme của 3 chủng vi khuẩn Bs, Bm và BM trên môi trường có chất cảm ứng là tinh bột tan .............................. 35 3.8 Nghiên cứu quá trình sinh trưởng và sinh enzmy proteaza của 3 chủng vi khuẩn Bs, Bm và BM trên môi trường có chất cảm ứng là cazein............... 37 3.8.1. Nghiên cứu quá trình sinh trưởng của 3 chủng vi khuẩn Bs, Bm và BM trên môi trường có chất cảm ứng là cazein .............................................. 37
iv 3.8.2. Nghiên cứu quá trình sinh enzyme proteaza của 3 chủng vi khuẩn Bs, Bm và BM trên môi trường có chất cảm ứng là cazein ......................... 39 3.9. Nghiên cứu quá trình sinh trưởng và sinh enzyme của các chủng Bs, Bm, BM trên môi trường có bổ sung CaCO3 ................................................. 41 3.9.1. Nghiên cứu nuôi vi khuẩn trong môi trường có CaCO3 thu amylaza ...................................................................................................... 41 3.9.2. Nghiên cứu nuôi vi khuẩn trong môi trường có CaCO3 thu proteaza ...................................................................................................... 44 3.10. Ảnh hưởng của nồng độ oxy hòa tan ................................................. 47 3.11. Nghiên cứu ảnh hưởng của pH tới sự sinh trưởng và phát triển của ba chủng nghiên cứu................................................................................... 50 3.12. Nghiên cứu sử dụng bột đậu tương làm nguồn nguyên liệu thay thế .. 51 3.13. Nghiên cứu đồ thị tổng hợp động học của quá trình lên men .............. 54 Phần IV KẾT LUẬN ....................................................................................... 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 58
v DANH MỤC HÌNH Trang Hình 1: Phân lập khuẩn lạc chủng Bs .........................................................................27 Hình 2: Phân lập khuẩn lạc chủng Bm........................................................................28 Hình 3: Phân lập khuẩn lạc chủng BM .......................................................................28 Hình 4: Hình thái tế bào chủng Bs ..............................................................................29 Hình 5: Hình thái tế bào của chủng BM .....................................................................29 Hình 6: Hình thái tế bào của chủng Bm......................................................................30 Hình 7: Thử hoạt tính phân giải protease và amylase của 3 chủng Bs, Bm và BM ....32 Hình 8: Hoạt tính enzyme amylase của chủng Bs trên môi trường có chất cảm ứng là tinh bột tan ..................................................................................................................36 Hình 9: Hoạt tính enzyme amylase của chủng Bm trên môi trường có chất cảm ứng là tinh bột tan ..................................................................................................................36 Hình 10: Hoạt tính enzyme amylase của chủng BM trên môi trường có chất cảm ứng là tinh bột tan ..............................................................................................................37 Hình 11: Hoạt tính enzyme proteaza của chủng Bs trên môi trường có chất cảm ứng là cazein..........................................................................................................................39 Hình 12: Hoạt tính enzyme proteaza của chủng Bm trên môi trường có chất cảm ứng là cazein ......................................................................................................................40 Hình 13: Hoạt tính enzyme proteaza của chủng BM trên môi trường có chất cảm ứng là cazein ......................................................................................................................40 Hình 14: Ảnh hưởng của CaCO3 đến sinh enzyme trên môi trường có tinh bột tan của chủng Bs .....................................................................................................................42 Hình 15: Ảnh hưởng của CaCO3 đến sinh enzyme trên môi trường có tinh bột tan của chủng Bm ...................................................................................................................42 Hình 16: Ảnh hưởng của CaCO3 đến sinh enzyme trên môi trường có tinh bột tan của chủng BM...................................................................................................................43 Hình 17: Ảnh hưởng của CaCO3 đến sinh enzyme trên môi trường có cazein của chủng Bs .....................................................................................................................44
vi Hình 18: Ảnh hưởng của CaCO3 đến sinh enzyme trên môi trường có cazein của chủng Bm ...................................................................................................................45 Hình 19: Ảnh hưởng của CaCO3 đến sinh enzyme trên môi trường có cazein của chủng BM...................................................................................................................45 Hình 20: Ảnh hưởng của độ hiếu khí lên hoạt tính enzyme amylaza của 3 chủng Bs, Bm và BM trên ở môi trường có bổ sung CaCO3 .......................................................49 Hình 21: Ảnh hưởng của độ hiếu khí lên hoạt tính enzyme proteaza của 3 chủng Bs, Bm và BM trên ở môi trường có bổ sung CaCO3 .......................................................50 Hình 22: Ảnh hưởng của pH đến sự sinh trưởng và phát triển của các chủng Bs, Bm và BM.........................................................................................................................51 Hình 23: Đồ thị biến đổi pH, hoạt độ enzyme proteaza và mật độ tế bào của Bs trong môi trường bột đậu tương có CaCO3 ..........................................................................55
vii DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 3.1: Đường kính phân giải của các enzym và các chủng sinh ra: ............... 31 Bảng 3.2: Sự sinh trưởng của 3 chủng Bs, Bm, và BM trên môi trường không có chất cảm ứng ..................................................................................................... 33 Bảng 3.3. Sự sinh trưởng của chủng Bs trên môi trường có tinh bột tan ............. 34 Bảng 3.4. Sự sinh trưởng của chủng Bm trên môi trường có tinh bột tan ........... 34 Bảng 3.5. Sự sinh trưởng của chủng BM trên môi trường có tinh bột tan ........... 35 Bảng 3.6. Sự sinh trưởng của chủng Bs trên môi trường có cazein..................... 38 Bảng 3.7. Sự sinh trưởng của chủng Bm trên môi trường có cazein ................... 38 Bảng 3.8. Sự sinh trưởng của chủng BM trên môi trường có cazein................... 38 Bảng 3.9: Ảnh hưởng của CaCO3 đến sự sinh trưởng trên môi .......................... 43 trường có tinh bột của 3 chủng Bs, Bm và BM .................................................. 43 Bảng 3.10: Ảnh hưởng của CaCO3 đến sự sinh trưởng trên môi trường có cazein của 3 chủng Bs, Bm và BM ............................................................................... 46 Bảng 3.11: Ảnh hưởng của độ hiếu khí lên khả năng sinh trưởng của 3 chủng Bs, Bm, BM ............................................................................................................ 48 Bảng 3.12: Ảnh hưởng của độ hiếu khí tới khả năng sinh trưởng của 3 chủng Bs, Bm, BM trên môi trường có bổ sung CaCO3 ..................................................... 48 Bảng 3.13: Ảnh hưởng của bột đậu tương lên khả năng sinh proteaza, amylaza của ba chủng Bs, Bm, BM ................................................................................. 52 Bảng 3.14: Ảnh hưởng của nồng độ CaCO3 đến khả năng sinh amylaza, proteaza trên môi trường có bột đậu tương ...................................................................... 53
1 MỞ ĐẦU Vi sinh vật trong tự nhiên rất phong phú và đa dạng. Chúng ở xung quanh ta: trong đất, trong nước, không khí thậm chí cả trong cơ thể con người. Chúng có thể gây cho ta cả những bất lợi khôn lường như những bệnh lao, dịch hạch, dịch tả, đại dịch cúm ở người và gia cầm, lở mồ m, long móng ở bò lợn... nhưng chúng cũng có thể đem lại cho chúng ta nguồ n lợi vô cùng to lớn nếu ta biết, hiểu chúng và biết sử dụng chúng vào mục đích sẽ giúp cho cuộc sống con người tốt đẹp hơn. Từ thời xa xưa, con người đã biết ứng dụng những hoạt tính có lợi của vi sinh vật phục vụ cho đời sống của mình như tạo ra các loại rượu quý nhờ quá trình lên men của vi sinh vật, những bài thuốc chữa bệnh từ vi sinh vật... Ngày nay chúng ta đang sống ở thế kỷ 21, thế kỷ của khoa học k ỹ thuật thì công nghệ sinh học và đặc biệt là công nghệ vi sinh càng chứng tỏ ưu thế của mình. Hiện nay đã có rất nhiều chất có hoạt tính sinh học khác nhau đã được tổng hợp từ vi sinh vật đã được đưa vào sản xuất ở mức độ công nghiệp để phục vụ cho nghiên cứu, công - nông nghiệp, y học và đời sống của con người. Các chủng vi khuẩn như: Bacillus, Lactobacillus… đã và đang được sử dụng trong các chế phẩ m sinh học để phục vụ cho các ngành sản xuất như: rượu, bia, công nghiệp dệt, thuộc da, y học, bổ sung vào thức ăn gia súc, thức ăn trong nuôi trồng thủy sản, phân hủy thức ăn thừa của tôm, phế thải hữu cơ làm sạch môi trường nuôi trồng thủy sản... là nhờ khả năng sinh enzyme thủy phân amylaza, proteaza, xenlulaza của chúng.
2 Xuất phát từ thực tế đó chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: ”Nghiên cứu tuyển chọn một số chủng vi khuẩn Bacillus có hoạt tính enzyme proteaza kiềm”. Với các nội dung sau: 1. Phân lập từ đất vườn qua trung gian là cỏ khô và khoai tây để chọ n các chủng Bacillus. 2. Nghiên cứu các đặc điểm về hình thái tế bào khuẩn lạc, nghiên cứu một số đặc điểm sinh lý, sinh hóa của các chủng đã được tuyển chọn. 3. Nghiên cứu các điều kiện nuôi cấy để thu sinh khối có hoạt tính cao. Đề tài được thực hiện tại phòng Vi sinh vật của Viện Sinh học Nông nghiệp thuộc trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội.
3 Phần I TỔNG QUAN TÀI LIỆU
4 1.1. Đại cương về Bacillus Vi khuẩn Bacillus là những vi khuẩn Gram dương. Thuộc chi Bacillaceae, có nội bào tử hình ovan có khuynh hướng phình ra ở một đầu. Bacillus được phân biệt với các loài vi khuẩn sinh nội bào tử khác bằng hình dạng tế bào hình que, sinh trưởng dưới điều kiện hiếu khí hoặc kỵ khí không bắt buộc. Tế bào Bacillus có thể đơn hoặc chuỗi và chuyển động bằng tiêm mao. Nhờ khả năng sinh bào tử nên vi khuẩn Bacillus có thể tồn tại trong thời gian rất dài dưới các điều kiện khác nhau và rất phổ biế n trong tự nhiên nên có thể phân lập từ rất nhiều nguồn khác nhau như đất, nước, trầm tích biển, thức ăn, sữa,... nhưng chủ yếu là từ đất nơi mà đóng vai trò quan trọng trong chu kỳ C và N [ 10 ] Tất cả các loài thuộc chi Bacillus đều có khả năng dị dưỡng và hoại sinh nhờ sử dụng các hợp chất hữu cơ đa dạng như đường, acid amin, acid hữu cơ,... Một vài loài có thể lên men carbohydrat tạo thành glycerol và butanediol; một vài loài như Bacillus megaterium thì không cần chất hữu cơ để sinh trưởng, một vài loài khác thì cần acid amin, vitamin B. Hầu hết đều là loài ưa nhiệt trung bình với nhiệt độ tối ưu là 30 - 450C, nhưng cũng có nhiều loài ưa nhiệt với nhiệt độ tối ưu là 650C [11]. Đa số Bacillus sinh trưởng ở pH = 7, một số phù hợp với pH = 9 – 10 như Bacillus alcalophillus, hay có loại phù hợp với pH = 2 – 6 như Bacillus acidocaldrius. Bacillus có khả năng sản sinh enzyme ngoại bào (amylase, protease, cellulase…), do đó chúng được ứng dụng rất nhiều trong công nghiệp, trong bảo vệ môi trường, … Sau đây là một số loài Bacillus thường gặp trong tự nhiên:
5 Bacillus subtilis Bacillus subtilis được nhà khoa học cùng thời với Robert Koch tên là Ferdinand Cohn phát hiện và đặt tên năm 1872 [13] . Bacillus subtilis được gọi là trực khuẩn cỏ khô vì nó phân bố nhiề u trong đất và đặc biệt là ở cỏ khô. Chúng phân hủy pectin và polysaccarit ở mô thực vật và góp phần gây nên các nốt trên củ khoai tây bị u. Chúng sinh trưởng trên môi trường nguyên thủy xác định mà không cần bổ sung thêm yếu tố kích thích sinh trưởng. Sự sinh trưởng phát triển của chúng góp phần làm hỏng các nguyên liệu có nguồn gốc động thực vật. Chúng không sinh trưởng trên thực phẩ m có tính axit ở điều kiện tối ưu. Chúng là nguyên nhân gây hư hỏng bánh mì. Phần lớn thông tin chúng ta có về đặc điểm sinh học, hóa sinh, di truyền của các vi khuẩn Gram dương khác đều nhận được từ việc nghiên cứu Bacillus subtilis [13]. Chúng là những vi khuẩn hình que, ngắn, nhỏ, kích thước ( 3 – 5) x 0,6 m. Chúng phát triển riêng rẽ như những sợi đơn bào ít khi kết chuỗi sợi [13]. Khuẩn lạc khô, vô màu hay xám nhạt, có thể màu trắng hơi nhăn hoặc tạo ra lớp màng mịn lan trên bề mặt thạch, mép nhăn hoặc lồi lõm nhiề u hay ít, bám chặt vào môi trường thạch. Bacillus subtilis sinh trưởng tốt nhất ở 360C – 500C, tối đa khoảng 600C. Là loại ưa nhiệt cao. Bào tử của Bacillus subtilis cũng chịu được nhiệt khá cao. Bào tử hình bầu dục, kích thước 0,6m – 0,9m. Phân bố không theo nguyên tắc chặt chẽ nào, lệch tâm, gần tâm nhưng không chính tâm. Chúng phát tán rộng rãi. Chúng là một thể nghỉ sinh ra vào cuối thời kỳ sinh trưởng phát triển của vi khuẩn. Chúng không có khả năng trao đổi chất nên
6 có thể sống được vài năm đến vài chục năm, thậ m chí đến 200 – 300 năm [1]. Vi khuẩn Bacillus subtilis được xem là vi sinh vật điển hình vì có những đặc tính tiêu biểu không gây hại nên đây là một trong những vi khuẩn được sử dụng để sản xuất enzyme và các hóa chất đặc biệt như: amylase, protease, inosine, ribosides, acid amin, subtilisin [14]. Ngoài ra nhờ khả năng bám dính proton lên bề mặt mà B. subtilis có thể loại bỏ được chất thải phóng xạ như Thorium (IV) và Plutonium (IV) [12]. Đặc biệt, B.subtilis được sử dụng trong lên men Natto của Nhật – một thực phẩ m chức năng rất bổ dưỡng cho sức khỏe [15]. Bacillus megaterium Megaterium có nghĩa là “ con thú lớn” [13]. Tế bào của nó khá lớ n khoảng gấp hơn 2 lần tế bào của Bacillus subtilis, chiều ngang (1,2 – 1,5)m có thể đến 2 m, dài từ 3 – 12 m, ở các ống nuôi già thì tế bào ngắn hơn, tròn hơn, đôi khi hình thoi với đầu hẹp lại. Tế bào chứa nhiều hạt nhỏ và chất dinh dưỡng dự trữ (hạt mỡ, glycogen) [2]. Bào tử lớn hình ovan hay bầu dục, kích thước 1,5 x (0,7-1)m, bào tử lớn nhất có đường kính từ 1,2 đến 1,5 m [13]. Chúng nằ m lệch tâm thường theo chiều ngang hoặc xiên của tế bào. Khuẩn lạc tròn đều không thùy, không nếp, mép tròn đều hoặc hơi lượn sóng, trông giống giọt bạch lạp, lồi nhẵn, nhưng thường có vòng viền quanh đồng tâm trên bề mặt, màu trắng sữa hay đục. Sinh trưởng trên môi trường dinh dưỡng đơn giản không cần thêm bất kỳ một yếu tố sinh trưởng nào. Bacillus megaterium cũng sản sinh ra các enzyme tương tự B.subtilis, do đó nó cũng được ứng dụng nhiều trong công nghiệp.
7 Bacillus mensentericus Bacillus mensentericus còn được gọi là trực khuẩn khoai tây do nó có mặt chủ yếu trên khoai tây. Trực khuẩn gần giống Bacillus subtilis, mảnh dài hoặc ngắn ( 3- 10 ) x ( 0,5 – 0,6 ) m, có thể đứng riêng rẽ hoặc chuỗi dài. Bào từ hình bầu dục và kéo dài 0,5 – 0,9 m, nằ m ở vị trí bất kỳ trong tế bào, tế bào Bacillus mensentericus không bị phình to khi mang bào tử. Khuẩn lạc bám chặt vào môi trường thạch, có khi dính vào môi trường, mỏng, nhăn nheo, xám nhạt – trắng, có thể màu Crem, vàng nâu, hồng hoặc đen như Bacillus mensentericus niger ( đen ), Bacillus mensentericus ruber (hồng). Bacillus mensentericus sinh trưởng và phát triển tốt nhất ở nhiệt độ 36 – 450C tối đa 50 – 550C. pH = 4,5 – 5 thì nó ngừng phát triển. Bacillus mensentericus có hoạt tính amylase và protease lớn hơn hẳn Bacillus subtilis, nhưng lên men đường lại kém hơn. Hai loại trực khuẩn này rất phổ biến trong tự nhiên, chúng lây nhiễ m làm hư hỏng thực phẩm, nhất là các thực phẩm có chứa nitơ và các sản phẩ m giàu đường ( bánh kẹo, hoa quả) đây cũng là loại được ứng dụng vào ngành công nghệ sản xuất enzyme protease, amylase… Ngoài ra, nó còn sinh ra một loại hợp chất có hoạt tính kháng với một số vi khuẩn khác ( như Vibrio) gọi là bacterioxin, ở Bacillus subtilis gọi là subtilin hay Irutin A, B Bacillus cereus Đây là loại có mối quan hệ gần gũi với Bacillus anthracis, Bacillus mycoides, Bacillus thuringiensis. Bào tử của chúng phát tán khắp nơi, trong đất, không khí… Chúng thường sinh sôi nảy nở trên thực phẩm như cơm và có thể sinh ra độc tố làm cho thực phẩ m hư hỏng. Chúng được áp dụng để
8 sản xuất kháng sinh, giống Bacillus này có độc tính, gây ngộ độc thực phẩ m [13]. Tế bào Bacillus cereus dày, kích thước (1 – 1,5) x (3 – 5)m, có khi dài hơn, chúng đứng riêng rẽ hay xếp chuỗi. Bào tử hình bầu dục kích thước 0,9 x (1,2 – 1,5)m nằm lệch tâm, tế bào chất của nó chứa các hạt và không bào [2]. Khuẩn lạc của Bacillus cereus phẳng, khá khuyếch tán, hơi lõm, trắng đục, mép lồi lõm [3] . Bacillus pumilus Bào tử phát tán rộng khắp mọi nơi, thường B.pumilus có mặt trong đất nhiều hơn subtilis. Khuẩn lạc nhỏ, xung quanh viền mờ lan không ranh giới. Tế bào của nó gần giống tế bào B.subtilis. Bacillus polymyxa Bacillus polymyxa có khuẩn lạc vô màu, phẳng hoặc lồi , trơn, nhày, lan dần ra xung quanh, mép đôi khi có thùy. Tế bào của Bacillus polymyxa có kích thước (0,6 – 1) x (2 – 7)m, đứng riêng rẽ hay xếp thành đôi, chuỗi ngắn. Khi hình thành bào tử tế bào đó sẽ phồng lên hình quả chanh [3]. Bào tử hình bầu dục kéo dài, trên bề mặt cắt ngang như hình sao. Chúng phát tán rộng, kích thước dài khoảng (1,7 – 2,6)m, nằ m giữa tế bào [13]. Loại vi khuẩn này làm giả m pectin và polysaccarit trong cây. Chúng còn có khả năng cố định đạm. Chúng thường sinh trưởng phát triển trên thực vật đang bị hỏng. Vì vậy người ta thường phân lập chúng từ thực phẩm. Môi trường kem và những môi trường có tính axit yếu phù hợp với loại vi khuẩn này. Chúng là nguồn để sản xuất kháng sinh polymyxin. Đây là một loại vi khuẩn rất phổ biến và có ích, chủ yếu là cho công nghiệp dược.
9 Bacillus brevis Người ta thường tìm thấy và phân lập chúng từ đất và thực phẩ m. Khuẩn lạc của chúng màu trắng, đôi khi có sắc vàng, lồi hoặc phẳng lấp lánh, mép răng cưa giống dạng mỡ đặc. Bacillus brevis là trực khuẩn kích thước (0,7 – 1) x (3 – 5)m. Chúng thường đứng riêng rẽ. Bào tử hình bầu dục, có kích cỡ ( 0,8 – 1) m, nằ m cuối tế bào làm cho đầu tế bào hơi phồng to lên [3]. Về nhu cầu dinh dưỡng, Bacillus brevis yêu cầu một hỗn hợp axit amin cho sinh trưởng và phát triển, không cần bổ sung vitamin [13] . Bacillus simplex Khuẩn lạc giống khuẩn lạc B.cereus, phẳng, khá khuyếch tán, với bề mặt hơi xù xì (dạng bột hoặc hạt nhỏ), hơi lõm, màu đục, mép lồi lõm. Đặc biệt khuẩn lạc của Bacillus simplex có khả năng sinh sắc tố lục nhạt, vàng và tiết vào môi trường [3]. Tế bào của nó nhỏ bé, có kích thước (2 – 5) x 0,6m, thường đứng riêng rẽ không kết thành chuỗi. Bào tử hình bầu dục, có kích thước 0,6 x 0,9 m, nằm lệch tâm. Bacillus lincheniformis Chúng được áp dụng trong việc sản xuất loại vỏ bao poly D – glutamate và phẩm đỏ cùng với nhiều chủng khác. Bào tử của chúng phát tán chủ yếu trong đất. Chúng sinh trưởng phát triển trên các loại thực phẩm. Đặc biệt chúng có khả năng sản xuất ra bacitracin, một kháng sinh có ích trong y học, nên chúng được ứng dụng phổ biến trong công nghiệp dược [13].
10 1.2. Protease 1.2.1. Tính chất, đặc điểm của protease Protease là enzyme xúc tác cho s ự thủy phân liên kết peptid [ - CO- NH-] giữa các loại acid amin trong phân tử protein (hay các nhóm polypeptide). Sản phẩm thủy phân là các acid amin, sản phẩ m trung gian là các peptide có mạch dài ngắn khác nhau và peptone – sản phẩ m thủy phân không hoàn toàn của protein H 2O H2N – CH – CO – NH – CH – CO -…- NH – CH – COOH R1 Rx R2 H2N – CH – COOH + H2N – CH – COOH + … + H2N – CH – COOH R2 Rx R1 Protease là một nhóm enzyme phân giải protein ( gồm proteinase, peptidase, desaminase,…) mà phần lớn được tế bào tiết ra ngoài và hoạt động ở bên ngoài tế bào. Protease có chức năng sinh học rất đa dạng, đóng vai trò quan trọng trong việc điều hòa quá trình trao đổi chất ở sinh vật sống. Ngoài chức năng xúc tác cho phản ứng thủy phân protein thành acid amin và các hợp chất có phân tử lượng thấp mà các tế bào có thể dễ dàng hấp thu, protease còn có vai trò quyết định trong thiết lập, duy trì sự cân bằng giữa tổng hợp và phân giải protein. Bên cạnh đó chúng còn tham gia vào quá trình hình thành và nảy mầm bào tử của vi sinh vật, quá trình đông tụ máu, điều chỉnh huyết áp, biến hình các enzyme và điều hòa biểu hiện gen [4]. So với protease động vật và protease thực vật thì protease vi sinh vật là một hệ thống rất phức tạp bao gồ m nhiều enzyme rất giống nhau về cấu trúc, khối lượng và hình dạng phân tử nên rất khó tách ra dưới dạng tinh thể đồng
11 nhất. Cũng do là phức hệ gồ m nhiều enzyme khác nhau nên protease vi sinh vật thường có tính đặc hiệu rộng rãi cho sản phẩm thủy phân triệt để và đa dạng. Người ta cũng phân loại protease theo vùng pH hoạt động tối thích: protease acid, trung tính và kiềm tính. Tuy nhiên sự phân loại này chỉ có ý nghĩa thực dụng không thật sự chính xác vì pH hoạt động tối thích của mỗ i enzyme còn phụ thuộc vào bản chất cơ chất và nhiều yếu tố khác nữa [7]. Vi khuẩn B.subtilis là một trong những nhóm vi sinh vật gây thối rữa tạo nhiều protease ngoại bào và đây là một enzyme protease kiềm (protease serin). Enzyme này có pH tối ưu trong vùng kiềm (9 – 11) và chứa một nhóm serin quan trọng ở trung tâm hoạt động. *Sự phân giải protein ( quá trình thối rữa ) Khác với lên men, cơ chất của quá trình thối rữa là protein. Protein là thành phần quan trọng của xác động thực vật và vi sinh vật. Protein thường chứa khoảng 15 – 17 % Nitơ (tính theo chất khô). Nếu như tổng lượng cacbon trong cơ thể sinh vật sống trên mặt đất là khoảng 7 tỷ tấn thì tổng lượng nitơ sinh ra cũng tới 10 – 25 tỷ tấn. Trong lớp đất sâu 30cm bao quanh trái đất và người ta còn thấy thường xuyên có khoảng 3 – 7,5 tỷ tấn nitơ mà phần lớn là tồn tại trong các hợp chất hữu cơ chứa nitơ. Sự phân giải các hợp chất chứa nitơ có ý nghĩa rất lớn đối với nông nghiệp và đối với vòng tuần hoàn vật chất trong tự nhiên. Người ta gọi quá trình này là quá trình amon hóa. Muốn phân giải protein cũng như đối với các hợp chất cao phân tử khác, đầu tiên vi sinh vật phải tiết ra các enzyme phân giải protein ngoại bào và làm chuyển hóa protein thành các hợp chất có phân tử lượng nhỏ hơn (các polypeptid và các olygopeptid). Các chất này hoặc tiếp tục được phân hủy thành axitamin nhờ các peptidase ngoại bào, hoặc được xâm nhập
12 ngay vào tế bào vi sinh vật sau đó mới chuyển hóa thành axit amin. M ột phần các axit amin này được các vi sinh vật sử dụng trong quá trình tổng hợp protein của chúng, một phần khác được tiếp tục phân giải theo những con đường khác để sinh ra NH3, CO2 và những sản phẩm trung gian khác. Những vi sinh vật không có khả năng sinh ra những enzyme phân giải protease ngoại bào rõ ràng là không có khả năng đồng hóa được các loại protein thiên nhiên. Chúng chỉ có thể sử dụng các sản phẩ m thủy phân của protease (polypeptide, oligopeptid, axit amin) [5]. Các loài thuộc giống Bacillus (B.subtilis, B.mesentericus, B.megaterium…) có khả năng amon các hợp chất hữu cơ có chứa nitơ. Chúng là những vi sinh vật đầu tiên tham gia vào quá trình phân cắt các protein để tạo thành những chất có phân tử lượng thấp hơn cho các vi sinh vật khác dễ sử dụng. 1.2.2. Ứng dụng của protease Trong khi cả protease từ động vật, từ thực vật được nghiên cứu và ứng dụng từ khá lâu trong các ngành công nghiệp sản xuất phomat, thuộc da, làm bánh mỳ, làm trong bia tươi, thủy phân các protein, làm mề m thịt… thì protease từ vi sinh vật mới được chú ý nghiên cứu từ 1950, mặc dù từ 1918 – 1919 Waksman đã phát hiện được khả năng sinh protease từ xạ khuẩn [6]. Do vậy, ngày nay protease được sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp thực phẩ m, công nghiệp nhẹ, công nghiệp dược, nông nghiệp…  Ứng dụng trong xử lý nước thải và bảo vệ môi trường Protease đã được sử dụng dưới dạng chế phẩ m thô để xử lý các chất protein tồn đọng trong môi trường. Vi sinh vật có khả năng sinh protease cũng được ứng dụng trong lĩnh vực phân hủy sinh học.  Trong công nghiệp thực phẩm