Luận văn tốt nghiệp Dược sĩ: Nghiên cứu sử dụng tinh bột làm chất bảo vệ trong quá trình tạo nguyên liệu Probiotic chứa Lactobacillus acidophilus- Nguyễn Mai Hương

Chia sẻ: Nguyen Thi Bich Lien | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:61

Thêm vào BST

Báo xấu

388
lượt xem 110
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận văn tốt nghiệp Dược sĩ "Nghiên cứu sử dụng tinh bột làm chất bảo vệ trong quá trình tạo nguyên liệu Probiotic chứa Lactobacillus acidophilus" do sinh viên Nguyễn Mai Hương thực hiện nhằm mục đích khảo sát ảnh hưởng của nồng độ tinh bột đến thể chất của nguyên liệu Probiotic dạng vi nang chứa Lactobacillus acidophilus sau đông khô, đánh giá khả năng bảo vệ của tinh bột và độ ổn định của nguyên liệu đông khô dạng vi nang chứa tinh bột trong quá trình bảo quản. Mời các bạn cùng tham khảo để có thêm tài liệu phục vụ nhu cầu học tập và nghiên cứu.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn tốt nghiệp Dược sĩ: Nghiên cứu sử dụng tinh bột làm chất bảo vệ trong quá trình tạo nguyên liệu Probiotic chứa Lactobacillus acidophilus- Nguyễn Mai Hương

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN MAI HƯƠNG NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG TINH BỘT LÀM CHẤT BẢO VỆ TRONG QUÁ TRÌNH TẠO NGUYÊN LIỆU PROBIOTIC CHỨA Lactobacillus acidophilus KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2014
BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN MAI HƯƠNG NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG TINH BỘT LÀM CHẤT BẢO VỆ TRONG QUÁ TRÌNH TẠO NGUYÊN LIỆU PROBIOTIC CHỨA Lactobacillus acidophilus KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: DS. Lê Ngọc Khánh DS. Trần Văn Thái Nơi thực hiện: BM Công nghiệp dược HÀ NỘI – 2014
LỜI CẢM ƠN Trước hết, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới DS. Lê Ngọc Khánh và DS. Trần Văn Thái, những người thầy đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện thuận lợi từ những ngày đầu đến khi em hoàn thành khóa luận tốt nghiệp. Em xin chân thành cảm ơn TS. Đàm Thanh Xuân đã nhiệt tình giúp đỡ và đóng góp nhiều ý kiến quý báu giúp em thực hiện đề tài. Đồng thời, em cũng xin cảm ơn sự quan tâm, giúp đỡ của các thầy cô giáo, các anh chị kỹ thuật viên trong Bộ môn Công nghiệp Dược trong suốt quá trình làm đề tài nghiên cứu và thực nghiệm tại bộ môn. Nhân dịp này, em xin được gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu cùng toàn thể các thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội, những người đã quan tâm, dạy dỗ trong thời gian em học tập tại trường. Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình, người thân và bạn bè đã động viên giúp đỡ em rất nhiều trong quá trình học tập và trong cuộc sống. Em xin trân trọng cảm ơn! Hà Nội, ngày 14 tháng 5 năm 2014 Sinh viên Nguyễn Mai Hương
MỤC LỤC Danh mục các kí hiệu, các chữ viết tắt Danh mục các bảng Danh mục các hình vẽ, đồ thị Trang ĐẶT VẤN ĐỀ 1 Chương 1. TỔNG QUAN 2 1.1. Vi khuẩn lactic 2 1.1.1. Đặc điểm của vi khuẩn lactic 2 1.1.2. Loài Lactobacillus acidophilus 3 1.2. Tổng quan về vi nang hóa probiotic 5 1.2.1. Khái niệm, đặc điểm vi nang hóa probiotic 5 1.2.2. Ưu, nhược điểm của phương pháp vi nang hóa 6 1.2.3. Phương pháp tách pha đông tụ 7 1.2.4. Alginat 9 1.2.5. Các nghiên cứu trong và ngoài nước về vi nang hóa 11 1.3. Các tá dược bảo vệ trong đông khô vi sinh vật 11 1.3.1. Lý thuyết đông khô 11 1.3.2. Các tá dược bảo vệ thường dùng trong đông khô vi sinh vật 12 1.3.3. Tinh bột 13 Chương 2. NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG 15 PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị 15 2.1.1. Chủng vi sinh vật 15 2.1.2. Hóa chất 15 2.1.3. Môi trường 15 2.1.4. Máy móc, dụng cụ 15 2.2. Nội dung nghiên cứu 16
2.2.1. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ tinh bột đến thể chất của 16 nguyên liệu probiotic dạng vi nang chứa Lactobacillus acidophilus sau đông khô 2.2.2. Đánh giá khả năng bảo vệ của tinh bột và độ ổn định của nguyên 17 liệu đông khô dạng vi nang chứa tinh bột trong quá trình bảo quản 2.3. Phương pháp nghiên cứu 17 2.3.1. Phương pháp nhân giống 17 2.3.2. Phương pháp nuôi cấy thu hỗn dịch tế bào 17 2.3.3. Phương pháp vi nang hóa bằng alginat sử dụng kỹ thuật tách pha 17 đông tụ 2.3.4. Phương pháp đông khô 18 2.3.5. Phương pháp xác định hàm ẩm 19 2.3.6. Phương pháp pha loãng liên tục để xác định số lượng VSV 19 Chương 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 21 3.1. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ tinh bột đến thể chất của 21 nguyên liệu probiotic dạng vi nang chứa Lactobacillus acidophilus sau đông khô 3.1.1. Đánh giá thể chất của các dạng nguyên liệu sau đông khô khi 21 thay đổi nồng độ alginat 3.1.2. Đánh giá ảnh hưởng của nồng độ tinh bột đến thể chất hạt vi 25 nang sau đông khô 3.2. Đánh giá khả năng bảo vệ của tinh bột và độ ổn định của 29 nguyên liệu đông khô dạng vi nang chứa tinh bột trong quá trình bảo quản 3.2.1. Đánh giá khả năng bảo vệ của tinh bột trong quá trình tạo nguyên 29 liệu đông khô probiotic 3.2.2. Khảo sát lượng sinh khối thích hợp cho quá trình tạo nguyên liệu 33 đông khô probiotic dạng vi nang 3.2.3. Khảo sát độ ổn định của nguyên liệu đông khô dạng vi nang chứa 36
tinh bột trong quá trình bảo quản KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 40 1. Kết luận 40 2. Kiến nghị 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Am : Amylose Ap : Amylopectin ATCC (American Type Culture Collection) : Trung tâm giữ giống quốc gia Mỹ B. infantis : Bifidobacterium infantis Bifidobacterium spp. : Các loài thuộc chi Bifidobacterium C (Cytosine) : Xitozin Cfu (Colony-Forming Units) : Số đơn vị khuẩn lạc ĐK : Đông khô E. faecium : Enterococcus faecium G (Guanine) : Guanin IDF (Internation Dairy Federation) : Liên đoàn Sữa thế giới Kl/tt : Khối lượng/thể tích LAB (Lactic acid bacteria) : Nhóm vi khuẩn Lactic L. acidophilus : Lactobacillus acidophilus L. amylophilus : Lactobacillus amylophilus L. amylovorus : Lactobacillus amylovorus L. brevis : Lactobacillus brevis L. kefir : Lactobacillus kefir MRS (de Man, Rogosa, Sharpe) : Môi trường nuôi cấy vi khuẩn MRS MT : Môi trường PE (Polyethylene) : Polyetylen TB : Tinh bột VK : Vi khuẩn VSV : Vi sinh vật
DANH MỤC CÁC BẢNG STT Tên bảng Trang 2.1 Các hóa chất dùng trong nghiên cứu 15 2.2 Các máy móc dùng trong nghiên cứu 16 3.1 Thể chất của các mẫu nguyên liệu chứa Lactobacillus acidophilus 22 ngay sau đông khô khi thay đổi nồng độ alginat 3.2 Đường kính, hàm ẩm và thể chất của các mẫu nguyên liệu chứa 26 Lactobacillus acidophilus ngay sau đông khô khi thay đổi nồng độ tinh bột 3.3 Số lượng vi khuẩn sống sót trong 5 mẫu sau đông khô 31 3.4 Số lượng vi khuẩn sống sót và hàm ẩm của các mẫu sau đông khô 34 3.5 Hàm ẩm của nguyên liệu trong thời gian bảo quản 37 3.6 Lượng vi sinh vật sống của nguyên liệu trong thời gian bảo quản 38
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ STT Tên hình Trang 1.1 Trực khuẩn Lactobacillus acidophilus 5 1.2 Cấu trúc của acid alginic 10 1.3 Cấu trúc phân tử Ca-alginat 10 3.1 Vi nang Ca-alginat (2%) sau đông khô 23 3.2 Vi nang Ca-alginat (2%)-TB (10%) sau đông khô 23 3.3 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của hàm ẩm và đường kính vào 27 nồng độ tinh bột của các mẫu sau đông khô 3.4 Đồ thị biểu diễn số lượng vi khuẩn sống sót của 5 mẫu sau đông 31 khô 3.5 Đồ thị biểu diễn số lượng vi khuẩn sống sót của các mẫu sau 35 đông khô 3.6 Đồ thị biểu diễn lượng vi sinh vật sống và hàm ẩm của nguyên 39 liệu trong thời gian bảo quản
1 ĐẶT VẤN ĐỀ Vi khuẩn probiotic được biết đến là một nhóm vi sinh vật mang lại nhiều lợi ích cho con người như: ngăn ngừa nhiễm khuẩn đường ruột, cải thiện khả năng dung nạp lactose, tăng cường miễn dịch… [33] Tuy nhiên, các vi sinh vật này dễ bị ảnh hưởng bởi các điều kiện môi trường như: pH, nhiệt độ, ánh sáng, độ ẩm… [58] Khi sử dụng theo đường uống, pH acid, enzym tiêu hóa, acid mật… là các yếu tố làm giảm số lượng sống sót, ngăn cản việc thiết lập cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột. Ngoài ra, các thông số liên quan trong quá trình sản xuất cũng ảnh hưởng đến khả năng sống sót của vi khuẩn probiotic [46]. Do đó, để đảm bảo số lượng vi sinh vật trong chế phẩm và đem lại tác dụng mong muốn, cần tạo ra những nguyên liệu có khả năng cung cấp lượng vi sinh vật phù hợp và có thể chất thích hợp. Nhiều nghiên cứu được tiến hành nhằm tìm ra những biện pháp làm tăng khả năng chống chịu của vi khuẩn trước điều kiện bất lợi trong sản xuất, bảo quản và sử dụng. Một trong những phương pháp phổ biến để bảo quản chế phẩm sinh học là đông khô. Tuy nhiên, phương pháp này chỉ giúp bảo vệ chế phẩm khỏi độ ẩm chứ không bảo vệ chúng khỏi các yếu tố khác của môi trường [40]. Vì vậy, phương pháp vi nang hóa đã được nghiên cứu, ứng dụng giúp cách ly tế bào vi khuẩn với môi trường bất lợi nhằm giảm lượng vi sinh vật mất đi. Ngoài ra, sử dụng các tá dược bảo vệ cũng là một trong những phương pháp khả thi và đang được áp dụng rộng rãi. Việc sử dụng tinh bột làm tá dược bảo vệ để tăng khả năng chống chịu của vi sinh vật và cải thiện thể chất của nguyên liệu probiotic sau đông khô ở dạng vi nang là một hướng nghiên cứu đáng chú ý. Chính vì vậy, đề tài “Nghiên cứu sử dụng tinh bột làm chất bảo vệ trong quá trình tạo nguyên liệu probiotic chứa Lactobacillus acidophilus” được thực hiện với các mục tiêu cụ thể sau: 1. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ tinh bột đến thể chất của nguyên liệu probiotic dạng vi nang chứa Lactobacillus acidophilus sau đông khô. 2. Đánh giá khả năng bảo vệ của tinh bột và độ ổn định của nguyên liệu đông khô dạng vi nang chứa tinh bột trong quá trình bảo quản.
2 Chương 1. TỔNG QUAN 1.1. Vi khuẩn lactic 1.1.1. Đặc điểm của vi khuẩn lactic Vi khuẩn lactic (lactic acid bacteria – LAB) có thể được định nghĩa là một nhóm vi khuẩn Gram dương, gồm các trực khuẩn và cầu khuẩn không sinh bào tử, không ưa khí (non-aerobic) nhưng chịu oxy (aerotolerant), sinh ra acid lactic là sản phẩm chính khi lên men carbohydrat [26]. Năm 1857, Louis Pasteur đã tìm ra từ sữa bị chua các VSV lên men lactic thuộc họ Lactobacteriaceae (ngày nay gọi là Lactobacterium). Năm 1873, J. Lister lần đầu tiên phân lập được một loài vi khuẩn đặt tên là Bacterium lactis (hay còn gọi là Lactococcus lactis) và ngành công nghiệp lên men nhờ VK lactic đã được hình thành từ năm 1881. Những nghiên cứu quan trọng trong sự phân loại VK lactic đã cho thấy có nét tương tự giữa VK lactic từ sữa chua và VK lactic trong các sản phẩm chứa acid lactic khác như rượu vang, các sản phẩm muối chua và các loại VK lactic có ích trong đường ruột [60]. LAB gồm nhiều chi, trong đó tiêu biểu nhất là các chi Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus và Streptococcus [26]. Có 2 cách chính để phân loại LAB. Cách phân loại thứ nhất dựa trên hình thái, chia LAB làm 2 nhóm chính là trực khuẩn và cầu khuẩn. Cách phân loại thứ 2 dựa trên kiểu lên men lactic, chia LAB làm 2 nhóm chính là nhóm vi khuẩn lactic lên men đồng hình (homofermentative LAB) và nhóm vi khuẩn lactic lên men dị hình (heterofermentative LAB) [26].  Lên men đồng hình Trong lên men đồng hình, sản phẩm cuối cùng của quá trình lên men chủ yếu là acid lactic, chiếm khoảng 90 - 98%, các sản phẩm khác chỉ xuất hiện dưới dạng vết rất nhỏ. Quá trình phân giải glucose, acid lactic được tạo ra theo con đường EMP (con đường Embden - Mayerhoff - Parnas) [5]. Tiêu biểu cho nhóm vi khuẩn lactic lên men đồng hình là các chi Streptococcus và Lactococcus [30].  Lên men dị hình: Trong lên men dị hình, nhiều sản phẩm khác nhau được tạo thành, bên cạnh
3 acid lactic còn có một lượng đáng kể các sản phẩm khác như acid acetic, acid formic, acid succinic, ethanol, CO2 [26] [30] [52]. Tiêu biểu cho nhóm vi khuẩn lactic lên men dị hình là chi Leuconostoc và một số loài thuộc chi Lactobacillus như các loài L. brevis, L. kefir… [5] [30] Vi khuẩn lactic có thể tồn tại ở dạng các tế bào đơn độc hoặc liên kết tạo chuỗi. Hình dạng và kích thước của vi khuẩn lactic khá đa dạng: có thể là hình cầu hoặc hình que, đường kính các loại cầu khuẩn lactic thường từ 0,5 - 1,5µm, trực khuẩn 1 - 8µm. LAB hầu hết không di động, catalase âm tính, tỉ lệ G+C thấp dưới 50% [52]. LAB là các vi khuẩn ưa ấm và chịu nhiệt, nhiệt độ sinh trưởng tối ưu tùy từng loài dao động từ 28 đến 45oC [5]. Nhóm vi khuẩn này có khả năng sinh trưởng trong điều kiện pH thấp từ 4,5 - 6,8; pH tối ưu của chúng là từ 3,5 - 5. LAB có nhu cầu dinh dưỡng phức tạp, khi lên men cần các vitamin, acid amin và peptid ngắn. Nguồn carbon là glucose, fructose, lactose, maltose, sucrose; một số chủng vi khuẩn có thể sử dụng tinh bột như L. amylophilus và L. amylovorus [5]. LAB phân bố rộng rãi trong nhiều hệ sinh thái, thường được tìm thấy trong thực phẩm (các sản phẩm từ sữa, thịt lên men, rau quả…), thực vật, trong đường tiêu hóa, hô hấp và sinh dục của người và động vật [52]. LAB có lịch sử ứng dụng lâu đời trong thực phẩm lên men. Các vi khuẩn lactic sinh trưởng, phát triển và sản sinh ra acid lactic và các loại acid hữu cơ khác làm giảm pH, chống lại hiện tượng thối rữa rau quả, thịt cá, sữa; đồng thời làm tăng hương vị, tăng thời gian bảo quản và thời gian sử dụng sản phẩm được lâu hơn [26]. Trong y dược, nhiều loài LAB đã được sử dụng làm probiotic để cải thiện và nâng cao sức khỏe với rất nhiều tác dụng trị liệu đáng chú ý như: ngăn ngừa nhiễm khuẩn đường ruột, điều trị tiêu chảy, tăng cường đáp ứng miễn dịch, giảm cholesterol máu, giảm nguy cơ mắc ung thư… [52] 1.1.2. Loài Lactobacillus acidophilus Lactobacillus acidophilus lần đầu tiên được phân lập bởi Moro (1900) từ phân của trẻ sơ sinh đã qua phẫu thuật. L. acidophilus nằm trong chi Lactobacillus,
4 là chi lớn nhất của họ vi khuẩn lactic, với rất nhiều chủng đã được nghiên cứu và ứng dụng trong sản xuất [24]. L. acidophilus có dạng hình roi (hình gậy), rộng 0,6 - 0,9µm, dài 1,5 - 6,0µm, tồn tại riêng lẻ hoặc xếp đôi hay chuỗi ngắn, không sinh bào tử, kỵ khí không bắt buộc, có khả năng chuyển hóa đường lactose tạo ra sản phẩm L (+) lactic. Nhiệt độ tối thích cho sinh trưởng là 37ºC, không phát triển trong khoảng 20 - 22ºC hoặc ở nhiệt độ cao hơn 48ºC [2] [12] [51]. L. acidophilus có khả năng sống 2 ngày trong dịch vị, 5 ngày trong dịch mật, 8 ngày trong dịch tràng và có khả năng kháng được 40 loại kháng sinh [8]. L. acidophilus đóng vai trò sinh lý quan trọng như tổng hợp các vitamin. Ngoài ra, chúng có khả năng sản xuất acid lactic và các chất diệt khuẩn như Lactocidin, Bacteriocin [8]. L. acidophilus ngăn cản sự xâm nhập và ức chế tăng sinh các vi khuẩn gây bệnh [8] [12]. Chúng giúp cơ thể đề kháng với nhiễm khuẩn đường ruột, ngăn ngừa tiêu chảy đặc biệt là tiêu chảy do kháng sinh. Hơn nữa, L. acidophilus còn có tác dụng ngăn ngừa ung thư nhất là ung thư ruột kết và có ảnh hưởng nhất định đến sự lão hóa [8] [12]. L. acidophilus tạo ra môi trường acid là môi trường thuận lợi cho hệ vi sinh vật lên men đường ruột và ngược lại ức chế sự phát triển của các vi khuẩn gây bệnh Gram âm. Ngoài ra, L. acidophilus cũng có tác dụng hoạt hóa đại thực bào nhưng mức độ yếu hơn Bifidobacterium bifidum [38]. Tuy nhiên, khả năng sống sót của L. acidophilus phụ thuộc vào nhiều yếu tố: pH, sự acid hóa trong sản phẩm lên men (trong bảo quản), nồng độ oxy hòa tan (oxy khuếch tán từ bao bì, trong môi trường nuôi cấy, bảo quản), nhiệt độ (trong bảo quản), độ ổn định của dạng khô hoặc đông khô... Trong đó, nồng độ oxy hòa tan đóng vai trò quan trọng trong việc hạn chế sự sống sót của L. acidophilus. Do đó, sau thời gian bảo quản, lượng L. acidophilus sống sót sẽ bị giảm đáng kể [32]. Hiện nay, L. acidophilus được sử dụng nhiều trong các chế phẩm men tiêu hóa như Antibio, Lacbio pro, Kidlac… để điều trị các trường hợp rối loạn tiêu hóa
5 do dùng kháng sinh dài ngày, hoặc các trường hợp tiêu chảy, đầy bụng, khó tiêu, trẻ kém ăn, chậm lớn... Hình 1.1: Trực khuẩn Lactobacillus acidophilus 1.2. Tổng quan về vi nang hóa probiotic 1.2.1. Khái niệm, đặc điểm vi nang hóa probiotic a. Khái niệm Vi nang hóa là một trong những phương pháp cố định tế bào được sử dụng rộng rãi hiện nay. Phương pháp sử dụng các chất tạo màng (gel) là các polyme có nguồn gốc tự nhiên như gelatin, alginat, chitosan, cellulose… hoặc có nguồn gốc nhân tạo như polyamid, polystyren, polyacrylat, polyacrylamid, polyester, polyvinyl pyrrolidon (PVP), polyethylen glycol (PEG)… để bẫy, nhốt và bao gói các tế bào, cơ thể vi sinh vật sống trong các nang nhỏ [6]. b. Đặc điểm Vi nang có cấu tạo giống như một màng bán thấm hình cầu, mảnh và có lớp thành bảo vệ vững chắc. Vi khuẩn được bao giải phóng theo các cơ chế: gãy vỡ màng, hòa tan màng và khuếch tán qua màng... [32] Mỗi loại vật liệu bao vi nang và mỗi loại tế bào sống lại hoạt động ở các điều kiện khác nhau nên phải lựa chọn điều kiện để tạo thành vi nang như: pH, nhiệt độ, thời gian… Vi nang hóa không làm tổn hại đến các tế bào sống mà còn bảo vệ tế bào. Vi nang hóa cho phép cố định lượng lớn tế bào sống [59]. Độ bền cơ học của lớp màng bao vi nang là một đặc điểm quan trọng. Màng phải có độ bền tương đối để có thể bảo vệ được các tế bào sống, tuy nhiên nó lại không được quá vững chắc vì như thế sẽ ảnh hưởng đến khả năng phóng thích tế bào khi cần thiết. Kích thước hạt vi nang
6 cũng là đặc điểm cần lưu ý. Giữa kích thước hạt, độ bền vững của hạt và khả năng phóng thích tế bào có mối quan hệ với nhau. Kích thước hạt càng lớn thì độ bền vững của hạt càng cao, khả năng bảo vệ tế bào sống càng cao, nhưng khả năng phóng thích tế bào càng khó. Ngược lại, kích thước hạt càng nhỏ thì độ bền càng thấp, khả năng bảo vệ tế bào sẽ thấp đi nhưng khả năng phóng thích tế bào sẽ dễ dàng hơn. Ngoài ra còn có một số đặc điểm khác cần chú ý như: sự mài mòn của các hạt vi nang do sự va chạm và ma sát vào nhau, khả năng kháng khuẩn của hạt… [6] [32]. 1.2.2. Ưu, nhược điểm của phương pháp vi nang hóa a. Ưu điểm Vi nang hóa có khả năng tạo ra mật độ vi sinh vật lớn do có thể cố định lượng lớn tế bào sống. Hạt vi nang như tấm áo choàng giúp tế bào cách ly với môi trường xung quanh, làm giảm sự tổn thương cũng như sự tổn thất số lượng tế bào, bằng cách này các tế bào sẽ được bảo vệ tốt hơn trong các môi trường khắc nghiệt như pH thấp, muối mật, sốc nhiệt... Ngoài ra, vi nang hóa cũng giúp tăng độ ổn định hoạt tính trao đổi chất của tế bào khi có sự thay đổi pH, nhiệt độ hay sự có mặt các chất ức chế trong môi trường lên men. Do đó, vi nang hóa làm cho tế bào kéo dài khả năng tồn tại và tăng thời gian bảo quản chủng, giống [16] [59]. Màng bao vi nang giống như một rào chắn hạn chế giải phóng tế bào, giảm thiểu sự nhiễm bẩn, bảo vệ tế bào chống lại tác nhân gây hại, từ đó đảm bảo cho quá trình lên men không bị tạp nhiễm, hư hại. Lớp màng bao có thể được thiết kế để bảo vệ và giải phóng vi khuẩn ở những điều kiện môi trường khác nhau cho phép kiểm soát giải phóng vi khuẩn [16] [59]. Vi nang hóa có thể tạo ra các gradien nồng độ cơ chất, nồng độ sản phẩm, nồng độ oxy hòa tan, pH môi trường lên men… từ đó có thể tạo ra các môi trường khác nhau cho tế bào trong các lĩnh vực nghiên cứu và ứng dụng khác nhau. Vi nang hóa cũng cho phép điều chỉnh tốc độ sinh trưởng của vi sinh vật, cho phép sử dụng tế bào ở một pha riêng biệt đối với môi trường lên men, do đó có khả năng dừng phản ứng nhanh [6] [59].
7 Trong các ngành sản xuất, đặc biệt là ngành sản xuất các sản phẩm liên quan đến probiotic, thì việc vi nang hóa tế bào có ý nghĩa rất quan trọng, giúp tăng độ ổn định, thời gian bảo quản, kiểm soát giải phóng và cải thiện về mặt cảm quan cho sản phẩm. Trong các ngành thực phẩm sản xuất các sản phẩm lên men như bia, rượu… thì kỹ thuật vi nang hóa là một trong những lựa chọn để cố định tế bào vi sinh vật sử dụng trong công đoạn lên men, từ đó sử dụng vi sinh vật tiết kiệm, tối ưu và hiệu quả hơn [16] [32]. b. Nhược điểm Mặc dù có nhiều ưu điểm đáng chú ý, song vi nang hóa tế bào vi sinh vật cũng có một số nhược điểm. Trong quá trình trao đổi chất, tế bào vi sinh vật sản sinh ra nhiều enzym trong đó có những enzym có thể cho xúc tác các phản ứng không mong muốn làm tổn hại đến lớp vật liệu vi nang và cả chính tế bào. Để giải quyết vấn đề này phải chọn lựa giống vi sinh vật thích hợp không tạo ra các enzym không mong muốn mà vẫn đảm bảo hoạt tính của các enzym mong muốn [6] [59]. Đa số các vật liệu vi nang như gelatin, thạch… đều là các nguồn dinh dưỡng mà vi sinh vật có thể tiêu hóa được. Điều này khá nghiêm trọng vì như thế vi sinh vật được vi gói bên trong hoặc vi sinh vật tạp nhiễm từ bên ngoài có thể tiêu hóa làm cho lớp vi nang bị rách, thủng và như vậy hiệu quả vi nang hóa sẽ giảm xuống đáng kể. Có bằng chứng cho thấy một số chủng vi khuẩn có khả năng tiêu hóa, sử dụng chính vật liệu vi nang. Vì vậy, mỗi chủng vi sinh vật ta phải nghiên cứu vật liệu vi nang phù hợp nhất cho đối tượng vi sinh vật đó. 1.2.3. Phương pháp tách pha đông tụ a. Nguyên tắc Tách pha nhờ sự thay đổi nhiệt độ, thay đổi pH, sự hóa muối hoặc khi thêm một dung môi thứ hai vào hệ tạo vi nang. Từ dung dịch keo trong một dung môi thích hợp, tiến hành các tác động nhằm thay đổi độ tan của nó, kết quả là một lượng đáng kể keo được tách ra thành pha mới. Như vậy hệ trở thành hai pha, một pha có nồng độ cao chất keo được tách ra dưới dạng giọt nhỏ gọi là các giọt đông tụ
8 (coacervat). Sau đó, các hạt coacervat dần kết dính lại với nhau hoặc hấp thụ trên bề mặt chất cần bao gói tạo thành lớp màng bao [4] [15]. b. Phân loại Nếu chỉ sử dụng một loại dung dịch keo thì gọi là phương pháp tách pha đông tụ đơn giản, nếu sử dụng nhiều loại dung dịch keo thì gọi là phương pháp tách pha đông tụ phức hợp [4] [15]. Tách pha đông tụ đơn giản là quá trình loại nước của các chất keo thân nước dùng trong hệ, do đó làm giảm độ tan của chất keo. Phương pháp này thường chỉ sử dụng một loại polyme (gelatin, polyvinyl alcol, carboxymethyl cellulose). Quá trình làm giảm độ tan của chất keo có thể bằng các cách sau: thêm vào một dung môi có thể trộn lẫn với nước (ethanol, aceton, isopropanol…), thêm vào một muối vô cơ hay thay đổi nhiệt độ [55]. Tách pha đông tụ phức hợp là quá trình tương tác giữa phân tử tích điện âm và tích điện dương của hai hoặc nhiều hợp chất cao phân tử, có thể do sự thay đổi nồng độ các chất tan cao phân tử hoặc thay đổi pH. Các polyme càng có sự khác nhau về điểm đẳng điện càng dễ tạo thành hạt đông tụ [4] [15] [55]. Tách pha còn có thể được thực hiện do thêm vào một polyme khác không tương đồng, do thêm vào một dung môi thứ hai, do sự hóa muối (đông tụ thông thường), hoặc do tương tác giữa các polyme… [4]. Tách pha do sự hóa muối (đông tụ thông thường) Tách pha do sự hóa muối được thực hiện theo nguyên tắc sau: khi thêm dung dịch đậm đặc hoặc muối điện ly mạnh (muối vô cơ) vào hệ chế tạo vi nang sẽ tạo thành hai pha, kết quả là một pha trong đó sẽ trở nên bão hòa các tiểu phân keo. Kỹ thuật đông tụ hóa muối hay còn được biết đến là kỹ thuật ion hóa cố định gel, ion hóa tạo gel (ionic gelation method, ionotropic gelation techniques) để tạo ra các hạt gel không tan (hydrogel). Phương pháp này thường hay sử dụng các polyme có nguồn gốc tự nhiên, có tính tương thích sinh học cao như alginat, chitosan, gôm gellan… Trong phương pháp này, các polyanion như alginat kết hợp với các ion đa hóa trị tạo thành các hạt gel có mạng lưới không gian ba chiều bao gói lấy dược
9 chất hoặc có thể kết hợp tạo phức với các polyanion khác trên bề mặt của hạt gel alginat để tạo lớp màng có độ bền cơ học cao hơn và ngăn thấm tốt hơn. Hydrogel được bào chế bằng hai kỹ thuật cơ bản là kỹ thuật nhỏ giọt và kỹ thuật phun đông tụ [45]. 1.2.4. Alginat a. Cấu tạo, nguồn gốc Alginat là tên gọi chung cho các muối của acid alginic. Acid alginic là một heteropolyme saccharid mạch thẳng, cấu tạo từ hai gốc uronic là acid α-L-guluronic và acid β-D-mannuronic nối với nhau bằng liên kết 1-4-glucosid. Alginat được sản xuất từ tảo nâu Phaeophyta, trong tảo các acid chủ yếu ở dạng muối hỗn hợp (Na, K, Mg, Ca) [42]. b. Tính chất Alginat có tính ưa nước, tương hợp sinh học cao, rẻ tiền và được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực. Alginat có hai tính chất quan trọng là độ nhớt dung dịch và khả năng tạo gel [42]. Độ nhớt của dung dịch alginat phụ thuộc vào số lượng nhánh của phân tử alginat. Ngoài ra, độ nhớt của dung dịch còn thay đổi tùy theo nồng độ, nhiệt độ, pH và sự có mặt của ion kim loại [18] [29]. Dung dịch alginat có khả năng tạo gel khi phản ứng với các ion kim loại hóa trị II, III; sự tạo gel được giải thích qua mô hình vỉ trứng. Bình thường trong dung dịch alginat tồn tại block M là các dải hẹp và block G là các dải gấp khúc. Khi có mặt ion kim loại đa hóa trị (Ca2+, Ba2+, Sr2+...) ở nồng độ thích hợp thì sự tạo gel xảy ra. Các phân tử alginat sắp xếp lại song song nhau, các phần gấp khúc tạo thành khoảng không gian giống như chỗ đặt trứng. Các ion Ca2+ khớp vào các khoảng trống này tạo nên mạng lưới không gian ba chiều. Với cấu trúc gel này, khi sử dụng làm màng bao, chúng có vai trò như một tấm chắn chống lại những yếu tố bất lợi của môi trường và cho phép giải phóng vi sinh vật được bao theo hướng kiểm soát được [42].
10 Hình 1.2: Cấu trúc của acid alginic Hình 1.3: Cấu trúc phân tử Ca-alginat c. Ưu, nhược điểm của vật liệu bao vi nang alginat Sử dụng alginat làm vật liệu bao vi nang có nhiều ưu điểm. Alginat là vật liệu an toàn, không độc với cơ thể, có khả năng tạo chất kết dính với Calci clorid [32]. Alginat dễ dàng tạo gel bao bọc các tế bào vi khuẩn, lớp gel tạo thành có độ ổn định cao. Quá trình vi nang hóa vi khuẩn bằng alginat thực hiện dễ dàng, đơn giản, có thể thực hiện ở nhiệt độ thường nên ít ảnh hưởng đến vi khuẩn sống và gel tạo thành có tính thuận nghịch giúp giải phóng tế bào bên trong. Hạt vi nang tạo thành đẹp và tương đối đồng đều [18] [29]. Tuy nhiên, sử dụng alginat để vi nang hóa tế bào vi sinh vật cũng có một số nhược điểm. Độ bền của gel phụ thuộc vào một số ion hóa trị một và các chất tạo phức với ion Calci. Vì vậy, khi sử dụng lên men lactic, các yếu tố tạo phức như lactat có thể làm giảm độ bền của gel Calci alginat và làm cho tế bào thoát ra ngoài. Ngoài ra, trong quá trình vi nang hóa, cần phải khuấy để phân phối đều tế bào được vi gói nên khá tốn kém [18] [29]. d. Ứng dụng của alginat Alginat được sử dụng trong vi nang hóa tế bào vi sinh vật sống. Muối Natri của alginat tan trong nước được phối hợp với các tế bào vi sinh vật sống, sau đó nhỏ giọt vào dung dịch Calci clorid sẽ tạo thành hạt gel Ca-alginat bao bọc tế bào sống bên trong. Ngoài ra, alginat cũng được sử dụng trong kỹ thuật cố định tế bào và cố định enzym [22] [37].
11 Trong công nghệ bào chế dược phẩm, alginat được sử dụng làm tá dược rã, tá dược dính trong viên nén, tá dược kiểm soát giải phóng trong viên giải phóng kéo dài, tá dược độn trong viên nang. Ngoài ra, Natri alginat còn được sử dụng làm tá dược tăng độ nhớt, ổn định thể chất của nhũ tương, hỗn dịch trong các chế phẩm dạng kem, gel, bột nhão dùng tại chỗ… [42] 1.2.5. Các nghiên cứu trong và ngoài nước về vi nang hóa Vi nang hóa là một trong những phương pháp mới và hiệu quả nhất đang được nghiên cứu và áp dụng để cải thiện khả năng tồn tại của vi sinh vật trong chế phẩm probiotic. Sheu và Marshall (1993) đã nghiên cứu quá trình đông lạnh sữa, vi khuẩn lactobacilli trong sữa được vi gói trong nang Calci alginat cho thấy khả năng sống sót tăng hơn 40% so với khi ở dạng tự do [53]. Kebary và cộng sự (1998) cũng báo cáo rằng vi nang hóa Bifidobacterium bifidum và B. infantis sử dụng alginat hoặc kappa-carrageenan đã cải thiện đáng kể khả năng sống sót của VSV trong sữa đông lạnh trong suốt thời gian lưu trữ (-20ºC trong 10 tuần) [35]. Khalida và cộng sự (2000) đã báo cáo, vi nang hóa L. acidophilus và Bifidobacterium spp. trong nang Calci alginat phối hợp tinh bột cải thiện khả năng sống sót của VSV trong sữa chua sau khi bảo quản trong 8 tuần ở 4ºC [36]. Tại Việt Nam, Đỗ Quốc Cường (2009) đã tiến hành vi gói L. acidophilus trong nang gelatin – alginat và cho thấy khả năng tồn tại của của VK ở dạng vi nang trong môi trường dạ dày nhân tạo tốt hơn dạng tự do [1]. Quách Thu Trang (2010) đã báo cáo, L. acidophilus trong hạt vi nang Calci alginat có sử dụng sữa gầy làm tá dược bảo vệ cho tỉ lệ sống sót sau đông khô và sau 4 tuần bảo quản ở 4ºC cao hơn đáng kể so với không vi nang hóa [9]. Một số chế phẩm probiotic dạng vi nang lưu hành trên thị trường: Probiocap (chứa L. acidophilus) của viện Rosell/Lallemand The Americas, Canada; Cernivet (chứa E. faecium SF 68) của Cerbios-Pharma; Geneflora (chứa Lactobacillus sporogenes) của công ty America’s Bio-Plus… [32] 1.3. Các tá dược bảo vệ trong đông khô vi sinh vật 1.3.1. Lý thuyết đông khô