Một số Enzym sử dụng trong kỹ thuật sinh học phân tử

Chia sẻ: Giang Duong Y Khoa | Ngày: | Loại File: PPT | Số trang:35

Thêm vào BST

Báo xấu

329
lượt xem 106
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

RE tách chiết từ vi khuẩn có thể cắt DNA của tế bào động vật, thực vật, vi khuẩn khác ở cùng vị trí giới hạn hay điểm giới hạn. Số lượng kích thước đoạn cắt dài hay ngắn phụ thuộc vào điểm giới hạn trên phân tử DNA. Enzym giới hạn có khả năng cắt DNA phage ở những vị trí nhất định thành những đoạn ngắn.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Một số Enzym sử dụng trong kỹ thuật sinh học phân tử

1. ENZYM GIỚI HẠN (restriction enzyme, RE) 1.1. Tên gọi các enzym giới hạn 1.2. Các loại enzym giới hạn 1.3. Các RE loại II 2. MỘT SỐ ENZYM KHÁC THƯỜNG SỬ DỤNG TRONG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ
phage (thực Tế bào vi khuẩn bị phage phá hủy  khuẩn thể) phage (thực Một số tế bào vi khuẩn không bị  khuẩn thể) phá hủy Enzym (cắt) do DNA của phagehiện tượng giới hạn) n nhỏ đo ạ (
Enzym giới hạn (Restriction enzyme, RE) : có khả năng cắt DNA phage ở những vị trí nhất định  thành những đoạn ngắn. thuộc nhóm enzym endonuclease, cắt các liên kết  phosphodieste trong phân tử DNA.
Ví dụ: Hae III cắt DNA ở giữa 4 cặp nucleotid  GG CC CC GG Sma I cắt DNA bằng giữa 6 cặp nucleotid  CCC CCC GGG GGG EcoR I cắt DNA lệch giữa 6 cặp nucleotid  G AATTC CTTAA G
Đặc tính của RE: cắt DNA không đặc hiệu loài: RE tách chiết  từ vi khuẩn có thể cắt DNA của tế bào động vật, thực vật và vi khuẩn khác ở cùng vị trí giới hạn hay điểm giới hạn. Số lượng và kích thước đoạn cắt dài hay  ngắn, tùy thuộc vào số lượng điểm giới hạn trên phân tử DNA.
Điều kiện hoạt động :  - nhiệt độ - dung dịch đệm thích hợp Các RE hợp thành hệ thống bảo vệ ở tế  bào prokaryote. Chưa có hệ thống nào tương đương được phát hiện ở eukaryote.
1.1.Tên gọi các enzym giới hạn Giống Chủng Thứ tự dòng Tên Loài Escherichia coli Ry13 EcoR I E co R I EcoR V E co R V Serratia martesens Sma I S ma I Hemophilus aegypticus Hae III H ae III
3 loại (dựa vào khả năng nhận biết và cắt một trình tự xác định trên phân tử DNA): nhận biết được trình tự đặc hiệu, cắt cách vị trí giới hạn khoảng 1000-5000 nucleotid cắt tại đó Loại I và phóng thích độ vài chục nucleotid. Loại II nhận biết trình tự và cắt ngay vị trí đó. nhận biết trình tự và cắt DNA ở vị trí cách đó Loại III khoảng 20 nucleotid về phía trước.
1.3.1. Trình tự nhận biết  Mỗi enzym giới hạn nhận biết và cắt đặc hiệu một đoạn DNA có trình tự từ 4 – 6 cặp nucleotid. Các RE khác nhau có cùng một trình tự nhận biết  được gọi là isoschisomers. Đối với một số RE, trình tự nhận biết không có tính  chuyên biệt tuyệt đối, một số nucleotid của trình tự có thể được thay thế bởi nucleotid khác.
V í d ụ: A NspI GGGCCC T Bgl I GCCNNNNNGGC  Cấu trúc palindromic EcoR I 5’G AATT C 3’ 3’C TTAA G 5’
1.3.2. Các kiểu cắt của các enzym RE loại II Cắt tạo đầu bằng (blunt ends)  Sma I 5’…CCCGGG….3’ 3’…GGGCCC….5’ 5’…CCC GGG…3’ 3’…GGG CCC…5’ không có khả năng tự kết hợp lại. Để nối phải dùng enzym T4 DNA ligase
Cắt tạo đầu so le hay đầu dính (cohesive ends):  Các đầu so le có thể tự nối lại không cần DNA ligase, được sử dụng rất nhiều trong công nghệ tái tổ hợp
1.3.3. Một số điều kiện cần lưu ý khi tạo một phản ứng thủy giải bởi RE ý đến điều kiện nhiệt độ, pH và  Chú dung dịch đệm thích hợp  B ảo quản ở -20oC RE sẽ giữ được hoạt tính  Thể tích RE = 1/10 thể tích phản ứng
1.3.4. Ứng dụng Nghiên cứu bộ gen của eukaryote.  Phương pháp tạo dòng (cloning)  Lập bản đồ giới hạn (restriction map)  Phân tích so sánh bộ gen ở các loài khác nhau  nhờ kỹ thuật RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism, tính đa hình kích thước của các trình tự giới hạn).
2.1. Các enzym polymerase Các DNA polymerase Các RNA polymerase 2.2. Các ligase 2.3. Các nuclease
Polymerase: enzym xúc tác sự tổng hợp DNA và sự tổng hợp RNA. 2.1.1. Các DNA polymerase  Xúc tác sự tổng hợp DNA, theo chiều 5’ – 3’. Cơ chất: phần lớn là DNA để làm khuôn (DNA polymerase I, T4  DNA polymerase, Taq Polymerase). Đặc biệt Transcriptase ngược (Reverse transcriptase) : khuôn  là RNA để tổng hợp DNA. Terminal transferase: không tổng hợp một đoạn DNA mới từ  khuôn mà chỉ thêm các nucleotid vào đầu của một phân tử DNA có sẵn, Các DNA polymerase khi hoạt động cần có mồi (primer) 
DNA polymerase I (DNA pol I) Hoạt tính :  - hoạt tính polymerase: tổng hợp -hoạt tính exonuclease: thủy phân các liên kết phosphodieste giữa các nucleotid từ đầu phân tử DNA, phóng thích từng nucleotid theo cả chiều 5’ → 3’ và 3’ → 5’. Vai trò:  - xúc tác sự tổng hợp một mạch đơn DNA mới - sửa chữa sai sót trong quá trình nhân đôi DNA.
Ứng dụng :  - Xác định trình tự DNA bằng phương pháp dideoxynucleotid - Tổng hợp mẫu dò có độ phóng xạ cao - Thiết kế các vectơ từ DNA mạch đơn - Trong thực tế, sử dụng đoạn Klenow (Klenow fragment) có hoạt tính polymerase và exonuclease 3’ → 5’, không có hoạt tính exonuclease 5’ → 3’