Nghiên cứu cải tiến quy trình tổng hợp thuốc điều trị ung thư Altretamin

T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 5-5017<br /> <br /> NGHIÊN CỨU CẢI TIẾN QUY TRÌNH TỔNG HỢP THUỐC ĐIỀU TRỊ<br /> UNG THƯ ALTRETAMIN<br /> Vũ Bình Dương*; Trần Thái Ngọc**; Phan Đình Châu**<br /> Đào Hồng Nhung***; Hoàng Kim Vương Nam****<br /> <br /> TÓM TẮT<br /> <br /> Mục tiêu: cải tiến các điều kiện trong quy trình tổng hợp altretamin. Phương pháp nghiên<br /> cứu: áp dụng phương pháp tổng hợp hữu cơ cơ bản, sử dụng phần mềm tin học Modde 8.0 để<br /> tối ưu hóa các điều kiện phản ứng, nhận dạng cấu trúc chất tổng hợp được bằng phân tích phổ<br /> IR, MS, NMR. Kết quả: khảo sát được các yếu tố ảnh hưởng để nâng cao hiệu suất cũng như<br /> cách thức thực hiện phản ứng. Trong đó, thay thế dung môi phản ứng là dioxan, chất trung<br /> o<br /> hòa axít là KOH, nhiệt độ phản ứng 78 C; tỷ lệ mol CYC:DMA:KOH = 1:4,0:3,6; lượng dung môi<br /> 1,4-dioxan 36 ml (cho 0,05 mol CYA). Với những cải tiến đó, hiệu suất phản ứng đạt được 92%.<br /> Kết luận: đã cải tiến được quy trình tổng hợp altretamin. Quy trình có nhiều ưu điểm như sử<br /> dụng trang thiết bị phản ứng đơn giản, các điều kiện thực hiện không đòi hỏi áp lực, nhiệt độ<br /> cao nên khả năng ứng dụng sản xuất quy mô lớn rất khả thi.<br /> * Từ khóa: Altretamin; Tổng hợp; Modde 8.0.<br /> <br /> Study on Improvement of Synthesis Process of Altretamine<br /> Summary<br /> Objectives: To improve the altretamine synthesis procedure. Materials and methods: Applying<br /> the basic synthetic method, using Modde 8.0 software to optimize reaction conditions, identifying<br /> the structures of the synthesized compounds by IR, MS, NMR spectra. Results: Investigate the<br /> factors influenced to synthesis procedure and the way to conduct the reaction in which reaction<br /> solvent was dioxane with amount of 36 mL (for 0.05 mol CYA), acid absorbent was KOH, reaction<br /> 0<br /> temperature was 78 C. At this condition, total overall yield archieved 92%. Conclusions: Altretamine<br /> synthesis procedure was improved that had many advantages including using simple equipments,<br /> conventional operation, non-high temperature and potential for scale up of manufacturing.<br /> * Key words: Atretamine; Synthesis; Modde 8.0.<br /> <br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Altretamin là dược chất được sử dụng<br /> khá phổ biến trong điều trị ung thư vú,<br /> ung thư phổi và ung thư buồng trứng [1].<br /> <br /> Dược chất này đang được sử dụng để<br /> điều trị ung thư với các biệt dược như:<br /> hexastat (Pháp), hexinawas (Tây Ban Nha),<br /> altretamin (Mỹ)… Hiện nay, nhu cầu sử<br /> dụng thuốc điều trị ung thư rất lớn và hầu hết<br /> <br /> * Học viện Quân y<br /> ** Đại Học Bách khoa Hà Nội<br /> *** Đại học Đại Nam<br /> *** Đại học Lạc Hồng<br /> Người phản hồi (Corresponding): Vũ Bình Dương (vbduong2978@gmail.com)<br /> Ngày nhận bài: 07/03/2017; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 04/05/2017<br /> Ngày bài báo được đăng: 11/05/2017<br /> <br /> 14<br /> <br /> T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 5-2017<br /> phải nhập ngoại, khiến giá thành và chi phí<br /> điều trị rất cao. Do đó, việc nghiên cứu<br /> tổng hợp các thuốc điều trị ung thư nói<br /> chung và altretamin nói riêng để tiến tới có<br /> thể chủ động sản xuất được trong nước rất<br /> cần thiết. Học viện Quân y đã nghiên cứu<br /> tổng hợp thành công altretamin đạt tiêu<br /> chuẩn USP34 [2]. Tuy nhiên, để có thể tiến<br /> tới ứng dụng trong sản xuất quy mô lớn,<br /> cần tiếp tục có các nghiên cứu cải tiến<br /> quy trình nhằm phù hợp với yêu cầu thực<br /> tế cũng như nâng cao hiệu suất tổng hợp<br /> altretamin.<br /> NGUYÊN VẬT LIỆU THIẾT BỊ VÀ<br /> PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> 1. Nguyên liệu.<br /> Cyanuric clorid 99%, dimethylamin 40%<br /> (Sigma); altretamin chuẩn 96% Pcode<br /> 1001485750 Lot # MKBL 3528V và các<br /> hóa chất dung môi sử dụng trong nghiên<br /> <br /> - Bản mỏng sắc ký silicagel Kieselgel<br /> 60 F254 (Merck), đèn soi sắc ký UV hai bước<br /> sóng 254 và 360 nm.<br /> - Nhiệt độ nóng chảy đo trên máy đo<br /> nhiệt độ nóng chảy Stuart, SMP-10.<br /> - Phổ hồng ngoại (IR): ghi trên máy GXPerkinElmer (Mỹ).<br /> - Phổ khối lượng (MS): ghi trên máy<br /> AutoSpec Primer tại Phòng Phân tích cấu<br /> trúc, Viện Hóa học (Viện Khoa học và<br /> Công nghệ Việt Nam).<br /> - Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H - NMR<br /> và 13C - NMR): ghi trên máy Bruker - AV500<br /> tại Phòng Phân tích cấu trúc, Viện Hóa học<br /> (Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam).<br /> 3. Phương pháp nghiên cứu.<br /> * Phương pháp tổng hợp:<br /> Tổng hợp altretamin từ nguyên liệu<br /> cyanuric clorid (CYA) và dimethylamin (DMA)<br /> trong dung môi và chất trung hòa axít<br /> khác nhau theo sơ đồ phản ứng:<br /> <br /> cứu đạt tinh khiết và tinh khiết phân tích.<br /> 2. Thiết bị nghiên cứu.<br /> - Cân điện tử Electronic Balance WTCF, cân phân tích Metller có độ chính xác<br /> 0,1 mg, tủ sấy Medda, máy khuấy từ gia<br /> nhiệt IKA RH Basic 2 (Đức), máy cất quay<br /> Rotavapor R.200, bơm hút chân không,<br /> phễu lọc hút chân không Buchner.<br /> - Dụng cụ thủy tinh đạt tiêu chuẩn<br /> dùng cho phòng thí nghiệm tổng hợp hữu<br /> cơ (bình ba cổ 500 ml, 1.000 ml, sinh hàn<br /> hồi lưu, nhiệt kế, bình cầu 250 ml, bình<br /> gạn có nút mài 250 ml, bình định mức,<br /> pipet các ống nghiệm…).<br /> <br /> Phản ứng tiến hành trong các điều kiện<br /> nhiệt độ, tỷ lệ mol các chất CYA:DMA:<br /> NaOH khác nhau, trong thời gian phản ứng<br /> (theo dõi bằng sắc ký lớp mỏng [SKLM]).<br /> Hỗn hợp sau phản ứng cho vào nước đá<br /> để thu lấy tủa, lọc rửa tủa và kết tinh lại<br /> trong cồn 96% [3]. Sản phẩm kết tinh<br /> được xác định nhiệt độ nóng chảy, SKLM,<br /> khối lượng và tính hiệu suất phản ứng.<br /> 15<br /> <br /> T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 5-5017<br /> Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến<br /> <br /> dụng là NaOH, KOH, NaH, NaOCH3,<br /> <br /> hành cải tiến so với công bố trước đây [2]<br /> <br /> KHCO3, K2CO3, Na2CO3, NaHCO3, pyridin<br /> <br /> để tiếp tục nâng cao hiệu suất phản ứng,<br /> <br /> và một khảo sát không dùng chất trung<br /> <br /> bao gồm: khảo sát các chất trung hòa<br /> <br /> hòa axít. Kết quả cho thấy: khi sử dụng<br /> <br /> axít; loại dung môi và tỷ lệ dung môi sử<br /> <br /> chất trung hòa axít, phản ứng tổng hợp<br /> <br /> dụng trong phản ứng, tỷ lệ các chất tham<br /> <br /> altretamin đều thực hiện được, nếu không<br /> <br /> gia phản ứng, nhiệt độ. Từ kết quả khảo<br /> <br /> sử dụng, phản ứng xảy ra rất chậm (hiệu<br /> <br /> sát sơ bộ, tiến hành tối ưu hóa điều kiện<br /> <br /> suất phản ứng rất thấp, 11,90%). Với các<br /> <br /> phản ứng bằng phần mềm tối ưu Modde<br /> <br /> chất trung hòa axít khác nhau, hiệu suất<br /> <br /> 8.0 [5].<br /> <br /> phản ứng cũng khác nhau. Trong số các<br /> <br /> * Phương pháp xác định độ tinh khiết<br /> và cấu trúc hóa học:<br /> - Sơ bộ kiểm tra độ tinh khiết của sản<br /> phẩm bằng SKLM và đo nhiệt độ nóng<br /> <br /> chất trung hòa axít đã dùng, KOH cho<br /> hiệu suất phản ứng đạt cao nhất (88,37%)<br /> (cao hơn khi dùng NaOH, 86,37%). Vì vậy,<br /> chúng tôi lựa chọn KOH là chất trung<br /> <br /> chảy.<br /> <br /> hòa axít.<br /> <br /> - Xác định cấu trúc của altretamin tổng<br /> hợp dựa vào phân tích phổ tử ngoại (UV),<br /> phổ hồng ngoại (IR) và phổ khối lượng (MS),<br /> phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR và<br /> 13<br /> C-NMR).<br /> <br /> * Ảnh hưởng của dung môi và nhiệt độ<br /> tham gia phản ứng:<br /> <br /> KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU<br /> 1. Khảo sát ảnh hưởng các yếu tố<br /> tới hiệu suất phản ứng.<br /> * Ảnh hưởng của các loại chất trung<br /> hòa axít:<br /> Trong nghiên cứu trước, chất trung<br /> hòa axít (base) được sử dụng trong phản<br /> ứng tổng hợp altretamin là NaOH. Nhận<br /> thấy chất trung hòa axít đóng vai trò quan<br /> trọng quyết định ảnh hưởng tới hiệu suất<br /> phản ứng. Vì vậy, nghiên cứu này khảo<br /> sát sử dụng các chất trung hòa axít khác<br /> nhau ở cùng tỷ lệ mol tham gia phản ứng<br /> CYA:DMA:base là 1:3,6:3,3. Các base sử<br /> 16<br /> <br /> Trong nghiên cứu trước đây, các tác<br /> giả sử dụng aceton (nhiệt độ sôi 55 - 580C)<br /> là dung môi thực hiện phản ứng [2, 3, 4].<br /> Nhận thấy hiệu suất phản ứng có thể cải<br /> thiện hơn nếu dùng một dung môi khác<br /> có nhiệt độ sôi cao hơn. Vì vậy, tiến hành<br /> khảo sát các loại dung môi khác nhau<br /> gồm acetonitril, 1,4-dioxan, tetrahydrofuran<br /> (THF), aceton. Kết quả cho thấy: khi sử<br /> dụng dioxan (khống chế nhiệt độ 800C),<br /> hiệu suất phản ứng đạt cao nhất 89,52%,<br /> trong khi đó sử dụng aceton hiệu suất đạt<br /> khoảng 86%. Như vậy, có thể sử dụng<br /> dioxan làm dung môi cho phản ứng tổng<br /> hợp altretamin. Khi sử dụng dioxan làm<br /> dung môi phản ứng nhận thấy: ngoài ảnh<br /> hưởng của lượng dung môi sử dụng, khi<br /> tăng nhiệt độ phản ứng, hiệu suất thu<br /> được cũng tăng theo và đạt cao nhất ở<br /> <br /> T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 5-2017<br /> khoảng 800C. Nếu tiếp tục tăng nhiệt độ,<br /> hiệu suất lại giảm. Như vậy, nhiệt độ ảnh<br /> hưởng khá nhiều tới hiệu suất của phản<br /> ứng.<br /> 2. Kết quả tối ưu hóa quy trình tổng<br /> hợp altretamin.<br /> Từ kết quả nghiên cứu cải tiến sơ bộ trên<br /> nhận thấy: hiệu suất phản ứng tổng hợp<br /> <br /> altretamin phụ thuộc nhiều vào các yếu tố<br /> nhiệt độ, lượng dung môi. Ngoài ra, trong<br /> phản ứng hóa học, tỷ lệ mol các chất tham<br /> gia phản ứng cũng ảnh hưởng nhiều tới<br /> hiệu suất. Vì vậy, tiến hành tối ưu hóa<br /> quy trình tổng hợp altretamin bằng phần<br /> mềm Modde 8.0 với các biến đầu vào và<br /> đầu ra như bảng 1.<br /> <br /> Bảng 1: Biến đầu vào và khoảng giá trị khảo sát các biến đầu vào.<br /> Các mức<br /> Biến đầu vào<br /> <br /> Ký hiệu<br /> <br /> o<br /> <br /> Mức dưới<br /> <br /> Mức cơ sở<br /> <br /> Mức trên<br /> <br /> Nhiệt độ phản ứng ( C)<br /> <br /> X1<br /> <br /> 58<br /> <br /> 71<br /> <br /> 84<br /> <br /> Tỷ lệ mol DMA:CYA<br /> <br /> X2<br /> <br /> 1:3,3<br /> <br /> 1:3,7<br /> <br /> 1:4,2<br /> <br /> Tỷ lệ mol KOH:CYA<br /> <br /> X3<br /> <br /> 1:3,0<br /> <br /> 1:3,4<br /> <br /> 1:3,9<br /> <br /> Lượng dung môi dioxan (ml) cho<br /> 0,05 mol CYA<br /> <br /> X4<br /> <br /> 28<br /> <br /> 34<br /> <br /> 40<br /> <br /> Biến đầu ra (hiệu suất phản ứng)<br /> <br /> Y<br /> <br /> Cao nhất<br /> <br /> Các dữ liệu được đưa vào phần mềm thiết kế tối ưu và đưa ra 27 thí nghiệm. Tiến hành<br /> thí nghiệm tổng hợp altretamin, tính hiệu suất phản ứng.<br /> Bảng 2: Kết quả tiến hành thí nghiệm theo thiết kế phần mềm Modde 8.0.<br /> (độ C) X1<br /> <br /> Tỷ lệ mol<br /> DMA:CYC X2<br /> <br /> Tỷ lệ<br /> mol KOH:CYC X3<br /> <br /> Lượng<br /> dung môi X4<br /> <br /> Hiệu suất<br /> phản ứng Y (%)<br /> <br /> 1<br /> <br /> 58<br /> <br /> 4,2<br /> <br /> 3,9<br /> <br /> 28<br /> <br /> 64,69<br /> <br /> 2<br /> <br /> 84<br /> <br /> 4,2<br /> <br /> 3,9<br /> <br /> 28<br /> <br /> 67,21<br /> <br /> 3<br /> <br /> 58<br /> <br /> 3,3<br /> <br /> 3,9<br /> <br /> 28<br /> <br /> 56,25<br /> <br /> 4<br /> <br /> 84<br /> <br /> 3,3<br /> <br /> 3,9<br /> <br /> 28<br /> <br /> 58,34<br /> <br /> 5<br /> <br /> 58<br /> <br /> 4,2<br /> <br /> 3.0<br /> <br /> 28<br /> <br /> 62,37<br /> <br /> 6<br /> <br /> 84<br /> <br /> 4,2<br /> <br /> 3,0<br /> <br /> 28<br /> <br /> 63,86<br /> <br /> 7<br /> <br /> 58<br /> <br /> 3,3<br /> <br /> 3,0<br /> <br /> 28<br /> <br /> 52.18<br /> <br /> 8<br /> <br /> 84<br /> <br /> 3,3<br /> <br /> 3,0<br /> <br /> 28<br /> <br /> 54,01<br /> <br /> 9<br /> <br /> 58<br /> <br /> 4,2<br /> <br /> 3,9<br /> <br /> 40<br /> <br /> 76,89<br /> <br /> 10<br /> <br /> 84<br /> <br /> 4,2<br /> <br /> 3,9<br /> <br /> 40<br /> <br /> 78,56<br /> <br /> STT<br /> <br /> Nhiệt độ<br /> <br /> 17<br /> <br /> T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 5-5017<br /> 11<br /> <br /> 58<br /> <br /> 3,3<br /> <br /> 3,9<br /> <br /> 40<br /> <br /> 68,78<br /> <br /> 12<br /> <br /> 84<br /> <br /> 3,3<br /> <br /> 3,9<br /> <br /> 40<br /> <br /> 70,41<br /> <br /> 13<br /> <br /> 58<br /> <br /> 4,2<br /> <br /> 3,0<br /> <br /> 40<br /> <br /> 73,57<br /> <br /> 14<br /> <br /> 84<br /> <br /> 4,2<br /> <br /> 3,0<br /> <br /> 40<br /> <br /> 75,03<br /> <br /> 15<br /> <br /> 58<br /> <br /> 3,3<br /> <br /> 3,0<br /> <br /> 40<br /> <br /> 65,34<br /> <br /> 16<br /> <br /> 84<br /> <br /> 3,3<br /> <br /> 3,0<br /> <br /> 40<br /> <br /> 66,98<br /> <br /> 17<br /> <br /> 58<br /> <br /> 3,7<br /> <br /> 3,4<br /> <br /> 34<br /> <br /> 86,34<br /> <br /> 18<br /> <br /> 84<br /> <br /> 3,7<br /> <br /> 3,4<br /> <br /> 34<br /> <br /> 88,28<br /> <br /> 19<br /> <br /> 71<br /> <br /> 4,2<br /> <br /> 3,4<br /> <br /> 34<br /> <br /> 86,90<br /> <br /> 20<br /> <br /> 71<br /> <br /> 3,3<br /> <br /> 3,4<br /> <br /> 34<br /> <br /> 72,94<br /> <br /> 21<br /> <br /> 71<br /> <br /> 3,7<br /> <br /> 3,9<br /> <br /> 34<br /> <br /> 80,02<br /> <br /> 22<br /> <br /> 71<br /> <br /> 3,7<br /> <br /> 3,0<br /> <br /> 34<br /> <br /> 75,23<br /> <br /> 23<br /> <br /> 71<br /> <br /> 3,7<br /> <br /> 3,4<br /> <br /> 28<br /> <br /> 83,25<br /> <br /> 24<br /> <br /> 71<br /> <br /> 3,7<br /> <br /> 3,4<br /> <br /> 40<br /> <br /> 85,79<br /> <br /> 25<br /> <br /> 71<br /> <br /> 3,7<br /> <br /> 3,4<br /> <br /> 34<br /> <br /> 87,40<br /> <br /> 26<br /> <br /> 71<br /> <br /> 3,7<br /> <br /> 3,4<br /> <br /> 34<br /> <br /> 88,10<br /> <br /> 27<br /> <br /> 71<br /> <br /> 3,7<br /> <br /> 3,4<br /> <br /> 34<br /> <br /> 87,97<br /> <br /> Với điều kiện khác nhau, hiệu suất của phản ứng tổng hợp altretamin cũng khác<br /> nhau. Trong đó, nếu mol DMA dùng với tỷ lệ thấp, dù phản ứng có thực nghiệm ở<br /> nhiệt độ nào và lượng dung môi bao nhiêu thì hiệu suất đạt được vẫn thấp hơn (phản<br /> ứng: 3, 4, 7, 8, 11, 12, 15, 16, 20) so với những mẻ có tỷ lệ DMA cao hơn. Tương tự,<br /> tỷ lệ KOH sử dụng thấp, hiệu suất phản ứng cũng thấp cho dù nhiệt độ phản ứng bao<br /> nhiêu và lượng dung môi sử dụng bao nhiêu (phản ứng 5, 6, 7, 8, 13, 14, 15, 16, 22).<br /> Lượng dung môi sử dụng phản ứng thấp thì hiệu suất phản ứng cũng giảm (phản ứng<br /> 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 23). Nhiệt độ phản ứng càng cao, hiệu suất phản ứng càng tăng.<br /> Sử dụng phần mềm Modde 8.0 để phân tích các yếu tố ảnh hưởng tới hiệu suất phản<br /> ứng. Kết quả phần mềm đã đưa ra hình ảnh mặt đáp, đồ thị phân tích ảnh hưởng (hình<br /> 1) và phương trình hồi quy bậc 2 về ảnh hưởng của các biến đầu vào với biến đầu ra<br /> (hiệu suất phản ứng) là: Y = 80,16 + 1,81X1 + 9,31X2 + 3,61X3 + 11,02X4 - 1,03(X1)2 17,06(X 2) 2 - 6,61(X 4) 2 - 21,06(X 3) 2 - 0,01X1X 2 + 0,18X1X 3 - 0,19X 1X4 - 0,42X2X 3 0,49X2X4 + 0,07X3X4 với hệ số tương quan tuyến tính R2 = 0,984.<br /> 18<br /> <br />