Nghiên cứu chuyển gen kháng sâu cryiab vào cây cà chua bằng phương pháp sử dụng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 205-211<br /> <br /> NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN KHÁNG SÂU cryIAb VÀO CÂY CÀ CHUA<br /> (Lycopersicon esculentum Mill.) BẰNG PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG VI KHUẨN<br /> Agrobacterium tumefaciens<br /> Lê Tấn Đức1*, Phạm Đức Trí1, Nguyễn Hữu Hổ1, Hà Trần Minh Dũng1, Dương Thị Ngọc Thi2<br /> (1)<br /> <br /> Viện Sinh học nhiệt đới, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, (*)tanduc2007@gmail.com<br /> (2)<br /> Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Nông nghiệp công nghệ cao tp Hồ Chí Minh<br /> <br /> TÓM TẮT: Mục đích của nghiên cứu này là chuyển gen kháng sâu cryIAb vào cây cà chua (Lycopersicon<br /> esculentum Mill.) bằng phương pháp sử dụng vi khuẩn Agrobacterium. Kháng sinh Kanamycin được dùng<br /> như một chất chọn lọc. Chủng Agrobacterium tumefaciens EHA105 mang plasmid CAMBIA2301cryIAb<br /> chứa gen kháng kanamycin (nptII), gen GusA và gen kháng sâu cryIAb. Chúng tôi nghiên cứu một vài yếu<br /> tố ảnh hưởng đến khả năng chuyển gen cà chua như nồng độ của vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens và<br /> nồng độ acetosyringone trong quá trình xâm nhiễm. Để phục vụ cho việc chuyển gen, lá mầm 10 ngày tuổi<br /> được dùng làm nguyên liệu. Sau 2 ngày xử lí chuyển gen lá mầm được rửa và cấy trên môi trường tái sinh<br /> MS có chứa chất sinh trưởng IAA (0,5 mg/l), BA (2 mg/l), chất chọn lọc kanamycin (100 mg/l) và 500<br /> mg/l kháng sinh cefotaxime để diệt vi khuẩn. Sau vài tuần chọn lọc trong môi trường trên, các chồi kháng<br /> chất chọn lọc kanamycin sẽ được chuyển sang môi trường MS để phát triển và tạo rễ. Sự biểu hiện của<br /> gen GusA được kiểm tra bởi chất chỉ thị X-Glu. Sự hiện diện của gen nptII và gen cryIAb trong cây cà<br /> chua giả định chuyển gen đã được khẳng định bằng kỹ thuật PCR. Sự biểu hiện của độc tố tạo bởi gen<br /> kháng sâu cryIAb trong lá cây cà chua giả định chuyển gen đã được kiểm tra bởi Kit Quickstix strip của<br /> công ty Envirologix (Mỹ).<br /> Từ khóa: Agrobacterium tumefaciens, Lycopersicon esculentum, chuyển gen, plasmid, lá mầm, gen cryIA,<br /> PCR.<br /> MỞ ĐẦU<br /> <br /> Cà chua là một loại rau ăn quả được trồng<br /> rất phổ biến ở nhiều nước. Đây là loại rau quả<br /> được ưa thích vì phẩm chất ngon và dễ chế biến.<br /> Tính đa dụng và nhu cầu tiêu thụ cà chua tươi<br /> ngày càng lớn đã thúc đẩy sự phát triển cây cà<br /> chua như một trong những loại cây trồng chính.<br /> Ngoài ra, trồng cà chua đã mang lại hiệu quả<br /> kinh tế khá cao.<br /> Ở Việt Nam, việc phát triển trồng cà chua<br /> còn có ý nghĩa quan trọng về mặt luân canh,<br /> tăng vụ và tăng năng suất trên đơn vị diện tích,<br /> do đó cà chua là loại rau quả được khuyến khích<br /> phát triển. Tuy nhiên, cà chua thường bị hại bởi<br /> sâu ăn lá, đục quả (Heliothis armigera và<br /> Spodoptera litura). Một số loại thuốc hóa học<br /> bảo vệ thực vật được áp dụng vào các giai đoạn<br /> khác nhau của cà chua để bảo vệ cây trồng<br /> chống lại dịch hại. Tuy nhiên, dư lượng chất<br /> hóa học của các loại thuốc này có thể tác hại<br /> đến người tiêu dùng.<br /> Có nhiều báo cáo về nghiên cứu chuyển<br /> gen trên cây cà chua như các tác giả Cortina et<br /> al. (2004) [2], Park et al. (2003) [11], Sarker et<br /> <br /> al. (2009) [12]. Trong những nghiên cứu này, lá<br /> mầm và lá thật được dùng làm nguyên liệu cho<br /> việc chuyển gen cà chua thông qua vi khuẩn<br /> Agrobacterium tumefaciens. Theo hướng nghiên<br /> cứu này, chúng tôi tiến hành chuyển gen kháng<br /> sâu cryIAb vào cây cà chua (Lycopersicon<br /> esculentum Mill.) với hy vọng sự biểu hiện của<br /> gen chuyển cryIA sẽ có tác dụng góp phần làm<br /> giảm tác hại của sâu hại cà chua.<br /> PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> <br /> Vật liệu<br /> Sử dụng giống cà chua vô hạn TN386,<br /> TN148 của Công ty Trang Nông và giống Hồng<br /> Châu của Công ty Sygenta.<br /> Phương pháp<br /> Môi trường nuôi cấy mô và điều kiện nuôi cấy<br /> Môi trường gieo hạt là 1/2MS [10] không<br /> chất điều hòa sinh trưởng.<br /> Môi trường tiền tái sinh là MS với vitamin<br /> B5 [7] có các chất điều hòa sinh trưởng 0,1 mg/l<br /> NAA, 1 mg/l BA.<br /> Môi trường tái sinh chồi từ lá mầm là MS với<br /> 205<br /> <br /> Le Tan Duc, Pham Duc Tri, Nguyen Huu Ho, Ha Tran Minh Dung, Duong Thi Ngoc Thi<br /> <br /> vitamin B5 có bổ sung các chất điều hòa sinh<br /> trưởng 1 mg/l IAA, 2 mg/l BA.<br /> Môi trường chọn lọc như môi trường tái<br /> sinh có 100 mg/L kanamycin và 500 mg/l<br /> cefotaxime.<br /> Môi trường ra rễ là MS.<br /> Điều kiện nuôi cấy trong 9 giờ chiếu<br /> sáng/ngày, nhiệt độ 25-28oC.<br /> Dòng vi khuẩn, môi trường và điều kiện<br /> nuôi cấy<br /> Sử dụng dòng vi khuẩn Agrobacterium<br /> tumefaciens EHA 105 mang plasmid<br /> pCAMBIA2301 chứa gen cryIAb, gen gusA (có<br /> intron, promoter CaMV35S) và gen nptII (kháng<br /> kanamycin) với promoter CaMV35S. Môi trường<br /> giữ giống vi khuẩn là môi trường LB có 50 mg/l<br /> kanamycin. Để nhân giống cho nghiên cứu<br /> chuyển gen, vi khuẩn được nuôi lắc qua đêm<br /> trong môi trường AB [3] cũng có nồng độ<br /> kanamycin như trên và 50 mg/l rifamycin. Nhiệt<br /> độ nuôi cấy ở 28oC.<br /> Nghiên cứu ảnh hưởng của dịch nuôi vi khuẩn<br /> Agrobacterium tumefaciens với các nồng độ<br /> khác nhau đến khả năng chuyển gen<br /> Sử dụng dịch vi khuẩn Agrobacterium<br /> tumefaciens với nồng độ OD ở bước sóng 600<br /> nm là 0,5; 1 và 1,5 trong quá trình chuyển gen<br /> với giống cà chua TN386. Sau 4 ngày xử lí<br /> chuyển gen, các mẫu lá mầm được nhuộm với<br /> dung dịch X-Gluc để kiểm tra khả năng chuyển<br /> gen thông qua biểu hiện của gen gusA.<br /> Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ<br /> acetosyringone trong dịch nuôi vi khuẩn<br /> Agrobacterium tumefaciens đến khả năng<br /> chuyển gen<br /> Để nâng cao tần số chuyển gen<br /> acetosyringone được sử dụng với các nồng độ 50,<br /> 100 và 150 µM trong quá trình chuyển gen với<br /> giống cà chua TN386. Sau 4 ngày xử lí chuyển<br /> gen các mẫu lá mầm được nhuộm với dung dịch<br /> X-Gluc để kiểm tra khả năng chuyển gen.<br /> Quy trình chuyển gen<br /> Các mẫu lá mầm 10 ngày tuổi từ cây in vitro<br /> được sử dụng làm vật liệu chuyển gen.<br /> Các bước chuyển gen: 1. Nuôi cấy lá mầm<br /> trên môi trường MS có 0,1 mg/l NAA và 1 mg/l<br /> 206<br /> <br /> BA trong thời gian 2 ngày; 2. Gây nhiễm các<br /> mẫu lá mầm với vi khuẩn trong thời gian 20<br /> phút; vớt mẫu ra, thấm bớt dịch vi khuẩn thừa<br /> bằng giấy lọc; 3. Nuôi chung mẫu lá mầm với vi<br /> khuẩn trong 2 ngày; sử dụng môi trường như<br /> trên nhưng có 100 µM acetosyringone; 4. Rửa<br /> thật sạch vi khuẩn bằng nước cất và dung dịch<br /> kháng sinh 500 mg/l cefotaxime (kết hợp lắc<br /> nhẹ); 5. Vớt mẫu ra, thấm ráo nước và cấy các<br /> mẫu lá mầm trên môi trường tái sinh có chọn<br /> lọc. Thời gian nuôi 15 ngày/chu kỳ chọn lọc; 6.<br /> Khi xuất hiện chồi tái sinh (cao khoảng 1-2 cm)<br /> cấy truyền sang môi trường MS không chất sinh<br /> trưởng đến khi vươn chồi tạo cây, thời gian nuôi<br /> khoảng 1 tháng.<br /> Kiểm tra cây chuyển gen<br /> Thử GUS [6]: Dùng để kiểm tra sự biểu<br /> hiện của gen chỉ thị gusA mã hóa enzyme βglucoronidase trong mô tế bào thực vật chuyển<br /> gen. Lá mầm sau khi chuyển gen 4 ngày và chồi<br /> con tái sinh được ngâm trong dung dịch X-Gluc<br /> (5-bromo-4-cloro-3-indolyl-β-D-glucuronide) ở<br /> nhiệt độ 37oC trong 20 giờ thì loại bỏ dung dịch<br /> và thay bằng cồn 70% cho đến khi các điểm<br /> xanh xuất hiện rõ ràng.<br /> Phân tích bằng phương pháp sinh học phân<br /> tử PCR: Cây con sau khi tái sinh chọn lọc được<br /> tách chiết DNA nhiễm sắc thể từ lá theo phương<br /> pháp của Dellaporta et al. (1983) [4].<br /> Sự hiện diện của gen nptII và gen cryIAb<br /> được kiểm tra dùng các cặp mồi đặc hiệu. Gen<br /> nptII: Mồi 1 (F): 5’-GCACA ACAGA CAATC 3’, Mồi 2 (R): 5’-CCGCC AAGCT CTTCA - 3’;<br /> chương trình nhiệt: 94C: 5 phút; 35 chu kỳ<br /> (94C: 1 phút, 58C: 1 phút, 72C: 1 phút); 72C:<br /> 5 phút; khuếch đại đoạn DNA 600 bp. Gen<br /> cryIA(b) : Mồi 1 (F): 5’ - TTC CT T GGA CGA<br /> AAT CCC ACC - 3’, Mồi 2 (R): 5’ - GCC AGA<br /> ATT GAA CAC ATG AGC GC - 3’; chương<br /> trình nhiệt: 94C: 4 phút; 35 chu kỳ (94C: 30<br /> giây, 54C: 60 giây, 72C: 1 phút 30 giây); 72C:<br /> 10 phút; khuếch đại đoạn DNA 559 bp.<br /> Kiểm tra biểu hiện của gen cryIAb: Kit của<br /> Công ty Envirologix Quickstix (Hoa Kỳ) được<br /> sử dụng để phát hiện protein độc tố tạo ra bởi<br /> gen cry1Ab trong lá của cây cà chua chuyển<br /> gen. Lá tươi của cây cà chua được nghiền trong<br /> <br /> TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 205-211<br /> <br /> tube<br /> 1,5 ml đến khi lá bị vỡ nát cho thêm dung dịch<br /> tách chiết protein được cung cấp bởi công ty.<br /> Tiếp tục nghiền. Que thử được nhúng vào trong<br /> tube khoảng 5 phút sẽ cho kết quả nếu có mặt<br /> của độc tố tạo bởi gen cryIAb sẽ xuất hiện hai<br /> vạch (dương tính) trên que thử nếu chỉ có môt<br /> vạch là âm tính.<br /> Các thí nghiệm được bố trí theo khối hoàn toàn<br /> ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại. Phần mềm MSTAT-C<br /> được dùng để phân tích kết quả thí nghiệm.<br /> KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN<br /> <br /> Giống cà chua TN 386 được dùng trong thí<br /> nghiệm các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng<br /> chuyển gen. Theo tác giả Abida Yasmeen et al.<br /> (2009) [1] nếu trước khi chuyển gen đặt lá mầm<br /> vào môi trường MS có 0,1 mg/l NAA và 1 mg/l<br /> BA trong thời gian 2 ngày sẽ giúp tăng khả<br /> năng tái sinh và tần số chuyển gen nên trước khi<br /> cho xử lí chuyển gen chúng tôi đặt lá mầm 10<br /> ngày tuổi được dùng làm nguyên liệu và nuôi<br /> cấy trong môi trường này. Lá mầm đã được cắt<br /> ở phần đầu lá và phần cuống lá để tạo vết<br /> thương giúp vi khuẩn Agrobacterium<br /> tumefaciens dễ dàng xâm nhiễm. Khoảng 80%<br /> <br /> lá mầm có phát triển bằng cách phình to ra sau 2<br /> ngày, các lá mầm này được sử dụng làm nguyên<br /> liệu chuyển gen.<br /> Nghiên cứu ảnh hưởng OD600nm của dịch nuôi<br /> vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens đến khả<br /> năng chuyển gen<br /> Sau khi lá mầm giống cà chua TN 386<br /> được tạo vết thương và xâm nhiễm bởi vi khuẩn<br /> Agrobacterium<br /> tumefaciens<br /> mang<br /> plasmidCAMBIA2301cryIAb và plasmid này<br /> có mang gen gusA (gen chỉ thị) nên chúng tôi<br /> sử dụng biểu hiện của gen này để đánh giá kết<br /> quả chuyển gen của thí nghiệm. Kết quả sau khi<br /> chuyển gen 4 ngày chúng tôi nhuộm các lá mần<br /> để xem biểu hiện của gen GusA cho thấy mức<br /> độ chuyển gen thông qua biểu hiện của gen<br /> gusA gia tăng hay giảm tùy thuộc nồng độ của<br /> dịch nuôi vi khuẩn phù hợp với miêu tả trước<br /> đây của tác giả Fillatti et al (1987) [5]. Biểu<br /> hiện tạm thời cao nhất của gen gusA (hình 1)<br /> khi OD600nm là 1,0 với tần suất là 40,55%, khi<br /> OD600nm là 0,5 thì biểu hiện của gen gusA cũng<br /> giảm và khi OD600nm tăng là 1,5 thì biểu hiện<br /> của gen gusA cũng không tăng theo chỉ số OD<br /> (bảng 1).<br /> <br /> Hình 1. Biểu hiện của gen gusA trên lá mầm<br /> Bảng 1. Ảnh hưởng của dịch nuôi vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens đến khả năng biểu hiện tạm<br /> thời của gen gusA<br /> Số lượng lá mầm xử lí<br /> Số lượng lá mầm biểu<br /> % lá mầm biểu hiện<br /> OD600nm<br /> chuyển gen<br /> hiện gen gusA<br /> gen gusA<br /> b*<br /> 0,5<br /> 30<br /> 6<br /> 19,17  6,29<br /> a<br /> 1,0<br /> 30<br /> 12<br /> 40,56  10,05<br /> 1,5<br /> <br /> 30<br /> <br /> 8<br /> <br /> 26,67  2,89<br /> <br /> ab<br /> <br /> 207<br /> <br /> Le Tan Duc, Pham Duc Tri, Nguyen Huu Ho, Ha Tran Minh Dung, Duong Thi Ngoc Thi<br /> * Các số trung bình trong các cột với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt có nghĩa với p = 0,05.<br /> <br /> Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ<br /> acetosyringone trong dịch nuôi vi khuẩn<br /> Agrobacterium tumefaciens đến khả năng<br /> chuyển gen<br /> Sự có mặt của acetosyringone làm tăng khả<br /> năng chuyển gen trên nhiều loại cây trồng trong<br /> đó có cà chua. Vì vậy, acetosyringone đã được<br /> <br /> cho vào trong giai đoạn xử lý ngâm dung dịch<br /> vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens với lá<br /> mầm của giống cà chua TN386 ở các nồng độ<br /> 50, 100 và 150 µM. Kết quả cho thấy khi nồng<br /> độ acetosyringone 100 µM sẽ cho tần số chuyển<br /> gen cao nhất và khi tăng lên 150 µM sẽ làm<br /> giảm tần số chuyển gen (bảng 2).<br /> <br /> Bảng 2. Ảnh hưởng của nồng độ acetosyringone đến khả năng biểu hiện tạm thời của gen gusA<br /> <br /> 50<br /> <br /> Số lượng lá mầm<br /> xử lí chuyển gen<br /> 25<br /> <br /> Số lượng lá mầm biểu<br /> hiện gen gusA<br /> 6<br /> <br /> % lá mầm biểu<br /> hiện gen gusA<br /> b*<br /> 24,07  1,61<br /> <br /> 100<br /> <br /> 25<br /> <br /> 9<br /> <br /> 36,11  2,41<br /> <br /> 150<br /> <br /> 25<br /> <br /> 4<br /> <br /> 15,74  5,61<br /> <br /> Nồng độ Acetosyringone<br /> <br /> a<br /> <br /> b<br /> <br /> * Các số trung bình trong các cột với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt có nghĩa với p = 0,01.<br /> <br /> Hình 2. Biểu hiện của gen gusA<br /> trên chồi cà chua<br /> Nghiên cứu chuyển gen<br /> Lá mầm của các giống cà chua TN 386,<br /> 148 và Hồng Châu sau khi xử lí chuyển gen<br /> được đặt vào môi trường tái sinh chồi có bổ<br /> sung chất chọn lọc 100 mg/l kanamycin, kết quả<br /> sau hai tuần một số lá mầm có mô sẹo phát triển<br /> và tái sinh chồi sau 4-6 tuần trong khi các lá<br /> mầm đối chứng (không xử lí chuyển gen) hoàn<br /> toàn không phát triển mô sẹo và chồi sau 4 tuần<br /> trong môi trường chọn lọc. Các chồi đã tái sinh<br /> trên môi trường chọn lọc được chọn ngẫu nhiên<br /> để kiểm tra biểu hiện của gen gusA đồng thời<br /> quan sát trên chồi không chuyển gen. Kết quả<br /> <br /> 208<br /> <br /> Hình 3. Tái sinh chồi cà chua<br /> trên môi trường chọn lọc<br /> cho thấy, khoảng 60% mẫu chồi giả định<br /> chuyển gen được kiểm tra gen gusA có những<br /> đốm xanh chàm ở những mức độ đậm nhạt khác<br /> nhau cho thấy, việc biểu hiện của gen gusA<br /> (hình 2) không đồng nhất trong các chồi chuyển<br /> gen, trong khi đó, các mẫu không chuyển gen<br /> thì không có vệt xanh nào. Đồng thời, tần số<br /> chuyển gen dựa trên khả năng tái sinh trong môi<br /> trường chọn lọc 100 mg/l kanamycin cho thấy<br /> rất phụ thuộc vào giống, các giống TN 386 và<br /> TN148 khả năng tái sinh chồi tạo dòng kháng<br /> kanamycin (hình 3) là 5,22% và 4,11% theo thứ<br /> tự, riêng với Hồng Châu, tỷ lệ tái sinh khá thấp<br /> 2,45% (bảng 3). Các chồi kháng kanamycin và<br /> <br /> TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 205-211<br /> <br /> có biểu hiện gen gusA được cấy chuyền vào môi trường MS để chồi phát triển thành cây và ra rễ.<br /> Bảng 3. Tần số chuyển gen của lá mầm thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens ở một số<br /> giống cà chua<br /> Giống<br /> cà chua<br /> TN 386<br /> <br /> Số lượng lá mầm<br /> xử lí chuyển gen<br /> 350<br /> <br /> Số lượng chồi tái sinh<br /> trên môi trường chọn lọc<br /> 18<br /> <br /> Phần trăm chồi tái sinh trên<br /> môi trường chọn lọc (%)<br /> a*<br /> 5,22  0,69<br /> <br /> TN148<br /> <br /> 350<br /> <br /> 14<br /> <br /> 4,11  0,84<br /> <br /> ab<br /> <br /> b<br /> Hồng Châu<br /> 250<br /> 6<br /> 2,45  0,43<br /> * Các số trung bình trong các cột với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt có nghĩa với p = 0,01.<br /> <br /> Phân tích PCR các gen nptII và cryIAb<br /> Các dòng chồi tái sinh và phát triển tốt trên<br /> môi trường tái sinh có chất chọn lọc kanamycin<br /> được tách chiết nhiễm sắc thể để kiểm tra sự<br /> hiện diện của gen chuyển bằng phản ứng PCR.<br /> <br /> Hình 4. PCR gen cryIAb dương tính với băng<br /> DNA 559 bp. M. Thang DNA chuẩn 1 kb; PC.<br /> ĐC dương (plasmid); 3. NC âm (cây không<br /> chuyển gen); 1, 2, 3, 4, 5. Cây chuyển gen.<br /> Kiểm tra biểu hiện của gen cryIAb<br /> Chọn một ít dòng cây cà chua giả định<br /> chuyển gen phát triển tốt trên môi trường chọn<br /> lọc 100 mg/l kanamycin để kiểm tra biểu hiện<br /> của gen cryIAb thông qua bộ Kit của Công ty<br /> Envirologix Quickstix (Mỹ) bằng cách phát<br /> hiện protein độc tố tạo ra bởi gen cry1Ab trong<br /> lá của cây cà chua chuyển gen. Lá của cây giả<br /> định chuyển gen và đối chứng được nghiền<br /> trong dung dịch tách chiết protein, que thử được<br /> nhúng vào trong tube khoảng 5 phút cho kết quả<br /> sự có mặt của độc tố Bt (Bacillus thuringiensis)<br /> đã được khẳng định bằng sự xuất hiện hai vạch<br /> (dương tính) trên que thử cây cà chua chuyển<br /> <br /> Kết quả PCR các gen cryIAb và nptII với các<br /> cặp mồi đặc hiệu cho thấy có sự hiện diện của<br /> các băng DNA được khuếch đại tương ứng là<br /> 559 bp (hình 4) và 600 bp (hình 5) trong các<br /> dòng cà chua giả định chuyển gen.<br /> <br /> Hình 5. PCR gen nptII dương tính với băng DNA<br /> 600 bp. M. Thang DNA chuẩn 1 kb; PC. Đối<br /> chứng dương (plasmid); 3. NC âm (cây không<br /> chuyển gen); 1, 2, 3, 4, 5: Cây chuyển gen.<br /> gen<br /> <br /> trong<br /> <br /> khi<br /> <br /> mẫu<br /> <br /> đối<br /> <br /> chứng<br /> <br /> chỉ<br /> <br /> 209<br /> <br />