Nghiên cứu lựa chọn cặp kháng thể sử dụng cho chế tạo bộ xét nghiệm sắc ký miễn dịch phát hiện nhanh nọc rắn hổ mang Naja atra

TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2016<br /> <br /> NGHIÊN CỨU LỰA CHỌN CẶP KHÁNG THỂ SỬ DỤNG CHO<br /> CHẾ TẠO BỘ ÉT NGHIỆM SẮC KÝ MIỄN DỊCH<br /> PHÁT HIỆN NHANH NỌC RẮN HỔ MANG Naja atra<br /> Nguyễn Ngọc uấn*;<br /> nh hanh Hùng**<br /> Nguyễn ung Nguyên***; Nguyễn Đặng Dũng*<br /> TÓM TẮT<br /> Mục tiêu: lựa chọn cặp kháng thể cho chế tạo bộ xét nghiệm sắc ký miễn dịch phát hiện<br /> nhanh nọc rắn Hổ mang Naja atra (N. atra). Đối tượng và phương pháp: từ 3 nguồn kháng thể<br /> đặc hiệu kháng nguyên nọc rắn Hổ mang N. atra, tiến hành đánh giá độ đặc hiệu và khả năng<br /> phát hiện kháng nguyên khi ghép cặp các kháng thể (bằng kỹ thuật ELISA và phương pháp thử<br /> nghiệm trực tiếp trên que nhúng). Kết quả: độ đặc hiệu của từng kháng thể với kháng nguyên<br /> nọc rắn N. atra khác nhau; cặp kháng thể đặc hiệu gồm IgG ngựa và IgG thỏ thể hiện khác biệt<br /> rõ rệt nhất và khi thử nghiệm trên que nhúng cho tín hiệu màu dương tính rõ nhất, không có<br /> hiện tượng dương tính giả. Kết luận: có thể sử dụng cặp kháng thể IgG ngựa và IgG thỏ đặc hiệu<br /> với nọc rắn N. atra cho phát triển xét nghiệm sắc ký miễn dịch phát hiện nhanh nọc rắn N. atra.<br /> * Từ khóa: Rắn Hổ mang; Naja atra; Sắc ký miễn dịch; Kháng thể.<br /> <br /> Study in Selecting a Pair of Antibodies for Development of an<br /> Immuno-Chromatographic Assay for Naja atra Snake Venom Detection<br /> Summary<br /> Objectives: To select a pair of antibodies for development of an immuno-chromatographic<br /> assay for Naja atra snake venom detection. Materials and methods: Each pair of antibodies<br /> (from 3 different antibodies against N. atra venom) was tested (by ELISA, and directly on the<br /> testing stick) for their possible combination in development of a rapid immuno-chromatographic<br /> assay for N. atra venom detection. Results: There was difference in specificity of the 3 antibodies<br /> to N. atra venom antigen. The pair of rabbit and horse IgGs against N .atra venom showed most<br /> obvious difference, giving best color signal on testing stick without false positive result.<br /> Conclusions: The rabbit and horse IgGs against N. atra venom can be utilized for development<br /> of a rapid immuno-chromatographic assay for N. atra venom detection.<br /> * Key words: Snake venom; Naja atra; Immunochromatographic assay; Antibody.<br /> <br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Trong cấp cứu và điều trị nạn nhân rắn<br /> độc cắn, việc xác định nhanh loài rắn gây<br /> tai nạn rắn độc cắn có ý nghĩa quan trọng,<br /> <br /> giúp chỉ định sử dụng huyết thanh kháng<br /> nọc rắn đặc hiệu một cách chính xác và<br /> kịp thời. Phương pháp được áp dụng phổ<br /> biến nhất hiện nay để xác định nọc rắn độc<br /> <br /> * Học viện Quân y<br /> ** Bộ Khoa học và Công nghệ<br /> *** Bệnh viện Bạch Mai<br /> Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn Ngọc uấn (nguyenngoctuanmd@yhaoo.com)<br /> Ngày nhận bài: 29/10/2015; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 17/01/2016<br /> Ngày bài báo được đăng: 22/01/2016<br /> <br /> 35<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2016<br /> <br /> là sử dụng kỹ thuật sắc ký miễn dịch dưới<br /> dạng que thử (hay que nhúng), do tính<br /> đơn giản và nhanh chóng của kỹ thuật<br /> này. Xét nghiệm sắc ký miễn dịch dạng<br /> que nhúng (lateral flow immunoassay LFIA) phát hiện nọc rắn dựa trên nguyên<br /> lý kết hợp đặc hiệu kháng nguyên - kháng<br /> thể. Cụ thể, khi một đầu que thử được<br /> nhúng vào mẫu thử (hoặc mẫu thử được<br /> nhỏ lên một vị trí nhất định tại một đầu<br /> que thử), đánh dấu kháng thể thứ nhất<br /> kháng nọc rắn bằng hạt nano vàng (còn<br /> gọi là kháng thể bắt giữ) sẽ gắn với<br /> kháng nguyên nọc rắn tương ứng trong<br /> mẫu thử (nếu có); phức hợp kháng<br /> <br /> nguyên - kháng thể sẽ dịch chuyển trên<br /> màng đệm của que thử về phía đầu kia<br /> của que thử dưới tác động của lực mao<br /> dẫn; tại vị trí vạch phát hiện (test line) trên<br /> que thử, nơi có kháng thể thứ hai kháng<br /> nọc rắn (còn gọi là kháng thể phát hiện)<br /> được cố định trước đó, phức hợp kháng<br /> nguyên - kháng thể sẽ bị giữ lại do gắn<br /> kết của kháng thể thứ hai với kháng<br /> nguyên nọc rắn (hình 1), dẫn đến các hạt<br /> nano vàng nano tập trung (gắn trên kháng<br /> thể thứ nhất) và tạo nên hình ảnh 1 vạch<br /> có màu đặc trưng tại vị trí vạch phát hiện,<br /> đồng nghĩa với kết quả phản ứng dương<br /> tính.<br /> <br /> Hình 1: Cấu tạo và nguyên lý xét nghiệm sắc ký miễn dịch.<br /> Cặp kháng thể được lựa chọn để chế tạo bộ xét nghiệm cần phải có hoạt tính<br /> kháng thể cao với kháng nguyên nọc rắn cần phát hiện [7]. Ngoài ra, cần lựa chọn cặp<br /> kháng thể sao cho có thể giảm thiểu phản ứng gắn cạnh tranh của 2 kháng thể với<br /> kháng nguyên nọc rắn.<br /> Nghiên cứu này được thực hiện nhằm: Lựa chọn cặp kháng thể tốt nhất trong<br /> 3 kháng thể đặc hiệu nọc rắn N. atra (do chúng tôi chế tạo và tinh sạch thành công<br /> trước đây) để phát triển bộ xét nghiệm sắc ký miễn dịch dạng que nhúng phát hiện<br /> nhanh nọc rắn N. atra.<br /> 36<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2016<br /> <br /> VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP<br /> NGHIÊN CỨU<br /> 1. Vật liệu nghiên cứu.<br /> - Nọc rắn Hổ mang N. atra, Hổ đất, Hổ<br /> chúa, Lục xanh, Chàm quạp.<br /> - Kháng thể IgG kháng nọc rắn Hổ mang<br /> N. atra từ ngựa, kháng thể IgG kháng nọc<br /> rắn Hổ mang N. atra từ thỏ và kháng thể<br /> IgY kháng nọc rắn Hổ mang N. atra từ<br /> trứng gà.<br /> - Các kháng thể kháng IgG thỏ, IgG ngựa,<br /> IgY gà đánh dấu HRP (Hãng Thermo); hạt<br /> nano vàng 30 nm, OD3 (Hãng Tanbead);<br /> một số hóa chất khác: BSA, sucrose,<br /> NaCl...; màng PVDF; cơ chất OPD, ECL<br /> (Hãng Sigma, Merck).<br /> - Một số dụng cụ, thiết bị dùng cho<br /> nghiên cứu: khay phản ứng ELISA loại 96<br /> giếng, pipet và đầu côn các loại, ống<br /> nghiệm, đĩa petri vô trùng; máy đo mật độ<br /> quang, máy ly tâm lạnh; bộ dụng cụ điện<br /> di, máy CCD chụp ảnh màng lai.<br /> 2. Phƣơng pháp nghiên cứu.<br /> * Kiểm tra độ đặc hiệu của kháng thể<br /> với kháng nguyên nọc rắn:<br /> Sử dụng kỹ thuật Western blot: nọc<br /> rắn N. atra (100 µg) được điện di SDSPAGE 15% trong điều kiện biến tính (theo<br /> phương pháp do Laemmli mô tả), sau đó<br /> chuyển qua màng PVDF, ủ với kháng thể<br /> IgG thỏ, IgG ngựa và IgY gà đặc hiệu nọc<br /> rắn. Sau đó, ủ màng PVDF với kháng thể<br /> đánh dấu enzym peroxidase đặc hiệu lần<br /> lượt với IgG thỏ, IgG ngựa và IgY gà,<br /> cuối cùng ủ với cơ chất ECL trong 3 phút.<br /> Ghi nhận kết quả phản ứng bằng máy<br /> CCD với đầu dò huỳnh quang, trong thời<br /> gian từ 30 giây đến 2 phút.<br /> * Phương pháp hấp phụ miễn dịch:<br /> <br /> Tiến hành hấp phụ các kháng thể phản<br /> ứng chéo bằng cách sử dụng cột sắc ký<br /> miễn dịch với kháng nguyên nọc rắn Hổ<br /> đất và Hổ chúa. Sau hấp phụ, kiểm tra<br /> hoạt tính kháng thể bằng kỹ thuật ELISA,<br /> kiểm tra độ đặc hiệu bằng kỹ thuật Western<br /> blot (theo phương pháp được mô tả ở trên).<br /> * Thử nghiệm lựa chọn cặp kháng thể<br /> bằng kỹ thuật ELIS gián tiếp:<br /> Từ 3 kháng thể sau tinh sạch, tiến hành<br /> thử nghiệm từng cặp kháng thể bằng kỹ<br /> thuật ELISA. Kháng thể IgG thỏ, IgG<br /> ngựa và IgY gà được gắn lên bề mặt<br /> giếng ELISA (100 μl, nồng độ 10 μg/ml/24<br /> giờ). Kháng nguyên nọc rắn N. atra (ở các<br /> nồng độ khác nhau, từ 0,3 - 100 ng/ml)<br /> được bổ sung vào các giếng. Tiếp đó, bổ<br /> sung 100 μl kháng thể thứ hai (nồng độ<br /> 5 μg/ml) vào các giếng. Sự có mặt của<br /> kháng nguyên được phát hiện gián tiếp<br /> bằng cách bổ sung vào các giếng dung<br /> dịch cộng hợp kháng thể (kháng IgG thỏ,<br /> IgG ngựa hoặc IgY gà) đánh dấu enzym<br /> peroxidase, tiếp đó là cơ chất OPD<br /> (o-phenylenediamin). Đo mật độ quang<br /> học (OD) của các giếng ở bước sóng 450<br /> nm. Phản ứng được coi là dương tính khi<br /> OD trung bình (<br /> ứng cao hơn<br /> <br /> OD<br /> <br /> OD)<br /> <br /> ở các giếng phản<br /> <br /> của giếng đối chứng âm<br /> <br /> (0 ng/ml) một giá trị  10 lần độ lệch<br /> chuẩn (SD) giá trị OD giếng đối chứng<br /> âm. Cặp kháng thể được lựa chọn là cặp<br /> kháng thể có khả năng phát hiện nhiều<br /> nhất nồng độ nọc rắn N. atra.<br /> <br /> 37<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2016<br /> <br /> * Thử nghiệm lựa chọn cặp kháng thể trực tiếp trên que nhúng:<br /> <br /> Hình 2: Thử nghiệm lựa chọn cặp kháng thể trực tiếp trên que thử.<br /> Các cặp kháng thể sau khi lựa chọn bằng kỹ thuật ELISA, tiếp tục thử nghiệm khảo<br /> sát độ nhạy và độc đặc hiệu phản ứng trực tiếp trên que thử. Lựa chọn một kháng thể<br /> gắn hạt nano vàng, một kháng thể khác được cố định tại vạch phát hiện của que thử<br /> (1 l dung dịch kháng thể nồng độ 1 mg/ml). Kháng thể được gắn vàng theo quy trình<br /> của Beesley J (1989) [5]. Nồng độ kháng nguyên nọc rắn dùng cho thử nghiệm lần<br /> lượt là 50 ng/ml và 100 ng/ml.<br /> KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU<br /> 1. Phản ứng đặc hiệu và phản ứng chéo củ kháng thể với các kháng nguyên<br /> nọc rắn.<br /> kDa<br /> <br /> M<br /> <br /> N. atra<br /> <br /> N. k.<br /> <br /> O. h. (100 g)<br /> <br /> 188<br /> 98<br /> <br /> kDa<br /> <br /> M<br /> <br /> N. atra<br /> <br /> N. k.<br /> <br /> O. h. (100 g)<br /> <br /> 28<br /> <br /> 28<br /> <br /> 17<br /> <br /> O. h. (100 g)<br /> <br /> 38<br /> <br /> 38<br /> <br /> 28<br /> <br /> N. k.<br /> <br /> 49<br /> <br /> 49<br /> <br /> 38<br /> <br /> N. atra<br /> <br /> 62<br /> <br /> 62<br /> <br /> 49<br /> <br /> M<br /> <br /> 188<br /> 98<br /> <br /> 188<br /> 98<br /> <br /> 62<br /> <br /> kDa<br /> <br /> 17<br /> <br /> 17<br /> <br /> 14<br /> <br /> 14<br /> 14<br /> <br /> 6<br /> <br /> 6<br /> 6<br /> <br /> 3<br /> <br /> 1<br /> <br /> 3<br /> <br /> 2<br /> <br /> 3<br /> <br /> 3<br /> <br /> (M: Thang protein chuẩn; 1: Kháng thể IgG thỏ; 2: Kháng thể IgG ngựa; 3: Kháng thể<br /> IgY gà; N.k: Rắn Hổ đất; O.h: Rắn Hổ chúa).<br /> Hình 3: Phản ứng đặc hiệu và phản ứng chéo của kháng thể trên Western blot.<br /> 38<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2016<br /> <br /> Kết quả phản ứng Western blot cho thấy, các kháng thể có độ đặc hiệu khác nhau<br /> với nọc rắn hổ mang N. atra; kháng thể IgG thỏ phản ứng mạnh với kháng nguyên có<br /> trọng lượng phân tử < 6 kDa, kháng thể IgY gà phản ứng mạnh với kháng nguyên có<br /> trọng lượng phân tử > 188 kDa và < 6 kDa, trong khi kháng thể IgG ngựa phản ứng<br /> với hầu hết các kháng nguyên nọc rắn, đặc biệt mạnh với kháng nguyên có trọng<br /> lượng phân tử < 6, 14, 17 kDa và 28 - 49 kDa. Với kháng nguyên nọc rắn Hổ đất (Naja<br /> kaouthia), các kháng thể đều có phản ứng chéo mạnh với kháng nguyên có trọng<br /> lượng phân tử < 6 kDa. Với kháng nguyên nọc rắn Hổ chúa (Ophiophagus hannah),<br /> phản ứng chéo xảy ra mạnh nhất ở kháng thể IgG ngựa và IgY gà với kháng nguyên<br /> có trọng lượng phân tử từ 49 - 62 kDa.<br /> 2. Ho t tính và độ đặc hiệu củ kháng thể với kháng nguyên nọc rắn Hổ m ng N.<br /> atra s u hấp phụ miễn dịch.<br /> <br /> OD 450 nm<br /> <br /> 0,39<br /> <br /> KT ngựa<br /> <br /> 0,34<br /> <br /> KT thỏ<br /> <br /> 0,29<br /> <br /> KT gà<br /> kT ngựa thường<br /> <br /> 0,24<br /> <br /> KT thỏ thường<br /> <br /> 0,19<br /> <br /> KT gà thường<br /> <br /> 0,14<br /> 0,09<br /> 0,04<br /> 2<br /> <br /> 4<br /> <br /> 8<br /> <br /> 16<br /> <br /> 32<br /> <br /> 64<br /> <br /> 128<br /> <br /> Blank<br /> <br /> Độ pha loãng KT x 1000<br /> <br /> 1<br /> <br /> 0,39<br /> <br /> KT ngựa<br /> <br /> 0,34<br /> <br /> KT thỏ<br /> KT gà<br /> <br /> OD 450 nm<br /> <br /> 0,29<br /> <br /> kT ngựa thường<br /> 0,24<br /> <br /> KT thỏ thường<br /> <br /> 0,19<br /> <br /> KT gà thường<br /> <br /> 0,14<br /> 0,09<br /> 0,04<br /> 2<br /> <br /> 4<br /> <br /> 8<br /> <br /> 16<br /> <br /> 32<br /> <br /> 64<br /> <br /> Độ pha loãng KT x 1000<br /> <br /> 128<br /> <br /> 2<br /> <br /> (1: Hấp phụ với kháng nguyên nọc rắn Hổ đất; 2: Hấp phụ với kháng nguyên nọc<br /> rắn Hổ chúa).<br /> Biểu đồ 1: Hoạt tính của kháng thể với nọc rắn N. atra sau hấp phụ miễn dịch.<br /> Sau khi hấp phụ với kháng nguyên nọc rắn Hổ đất, các kháng thể IgG thỏ, IgG ngựa và<br /> IgY gà còn thể hiện hoạt tính rõ khi pha loãng lần lượt là 2.000, 4.000 và 2.000 lần.<br /> Sau khi hấp phụ với kháng nguyên nọc rắn Hổ chúa, các giá trị đó lần lượt là 32.000,<br /> 64.000 và 32.000.<br /> 39<br /> <br />