Nghiên cứu nuôi cấy rễ cây bán tự mốc làm nguồn nguyên liệu thu nhận betuline

TẠP CHÍ SINH HỌC 2014, 36(1se): 145-151<br /> <br /> NGHIÊN CỨU NUÔI CẤY RỄ CÂY BÁN TỰ MỐC (Hemigraphis glaucescens C. B.<br /> Clarke) LÀM NGUỒN NGUYÊN LIỆU THU NHẬN BETULINE<br /> Quách Ngô Diễm Phương*, Vũ Thị Bạch Phượng,<br /> Giống Hối Khoánh, Trần Ngọc Trung, Bùi Văn Lệ<br /> Trường Đại học Khoa học tự nhiên, tp. Hồ Chí Minh, *qndphuong@hcmus.edu.vn<br /> TÓM TẮT: Bán tự mốc (Hemigraphis glaucescens), một loài cây có hình thái tương tự như hoàn ngọc đỏ<br /> (Pseuderanthemum bacteatum), có dược tính do mang chất betuline và đang được sử dụng như một bài<br /> thuốc dân gian khá phổ biến và hữu hiệu trong điều trị cao huyết áp nhưng chưa có công bố khoa học nào<br /> về thành phần hóa học cũng như dược tính. Nghiên cứu này đã chứng minh so với hoàn ngọc đỏ, bán tự<br /> mốc cũng có hoạt tính kháng oxi hóa và mang cùng dược chất betuline. Nghiên cứu của chúng tôi chủ yếu<br /> tập trung sàng lọc và tìm ra nguồn nguyên liệu có hoạt tính kháng oxi hóa từ cây bán tự mốc, từ đó ứng<br /> dụng các kỹ thuật nuôi cấy in vitro nhằm thu nhận nguồn nguyên liệu này một cách chủ động. Bằng cách<br /> sử dụng phương pháp thử năng lực khử Yen & Duh và phương pháp đánh bắt gốc tự do DPPH, phân đoạn<br /> ethanol rễ được xác định có hoạt tính kháng oxi hóa mạnh nhất trong các phân đoạn cao có độ phân cực<br /> khác nhau từ các bộ phân khác nhau của bán tự mốc. Để tạo nguồn rễ in vitro, chúng tôi đã sử dụng<br /> phương pháp tạo rễ bất định bằng auxin và tạo rễ tơ bằng phương pháp chuyển gen tự nhiên nhờ<br /> Agrobacterium rhizogenesATCC 15834. Với 2 phương pháp này, rễ cây bán tự mốc có thể được tạo thành<br /> một cách chủ động chỉ sau 10 ngày nuôi cấy.<br /> Từ khóa: Hemigraphis glaucescens, Pseuderanthemum bacteatum, chống oxi hóa, rễ bất định, rễ tơ.<br /> <br /> MỞ ĐẦU<br /> Theo kinh nghiệm dân gian, phần trên mặt<br /> đất của cây bán tự mốc thường được dùng chữa<br /> viêm đại tràng cấp và mạn tính, rối loạn tiêu<br /> hóa, đau bụng co thắt, đầy chướng bụng, trĩ nội<br /> chảy máu, đại tiện ra máu, chảy máu do chấn<br /> thương; có nơi dùng chữa viêm loét dạ dày,<br /> hoặc chữa bệnh cao huyết áp. Lá cây bán tự<br /> mốc có thể dùng tươi, hoặc phơi khô sắc với<br /> nước, hoặc dùng đắp vết thương giúp vết<br /> thương mau lành [7]. Tuy nhiên, hiệu quả chữa<br /> bệnh của cây này chưa có luận cứ khoa học nào<br /> cụ thể.<br /> Betuline (C30H50O2) là một hợp chất<br /> triterpen có nhiều giá trị dược liệu quý, đang<br /> được quan tâm hiện nay: chống viêm, chống<br /> virus, chống ung thư [4]. Hiện nay, betuline<br /> được phân lập từ vỏ cây bạch dương, cây hoàn<br /> ngọc đỏ và chiếm khoảng 30% trọng lượng khô<br /> [2, 3]. Betuline có thể dễ dàng chuyển đổi thành<br /> acid betulinic (nhóm rượu được thay thế bởi<br /> một nhóm acid carboxylic) [1], có hoạt tính sinh<br /> học hoạt động mạnh hơn so với betuline. Acid<br /> betulinic có khả năng chữa bệnh tương tự như<br /> betuline: có tác dụng chống lại một số khối u ác<br /> tính, một số dạng herpes và thậm chí AIDS [5];<br /> <br /> chống viêm, chống HIV, chống sốt rét cũng như<br /> có khả năng gây độc đối với một số dòng tế bào<br /> ung thư [6].<br /> Vì vậy, nghiên cứu này thực hiện nhằm<br /> chứng minh hoạt tính kháng oxi hóa và sự hiện<br /> diện của betuline trong rễ cây bán tự mốc, đồng<br /> thời nghiên cứu nuôi cấy in vitro rễ nhằm hướng<br /> đến việc thu nhận nguồn vật liệu sản xuất<br /> betuline một cách chủ động trong tương lai.<br /> VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> <br /> Khảo sát hoạt tính kháng oxi hóa của các bộ<br /> phận khác nhau trong các hệ dung môi khác<br /> nhau từ cây bán tự mốc<br /> Điều chế cao: cây tươi được chia làm ba<br /> phần rễ, thân, lá (kg) đem sấy khô ở 50oC đến<br /> khối lượng không đổi, xay nhuyễn tạo bột (g).<br /> Lần lượt ngâm dầm bột cây với các loại dung<br /> môi có độ phân cực tăng dần: diethy eter,<br /> chloroform, etanol, nước ở nhiệt độ phòng; lọc<br /> sau 48 giờ. Phương pháp cô quay chân không<br /> được dùng để tạo cao đối với các dung môi<br /> diethyl eter, chloroform và ethanol. Đối với<br /> dung môi nước, cao được tạo bằng phương pháp<br /> đông khô.<br /> 145<br /> <br /> Quach Ngo Diem Phương et al.<br /> <br /> Khảo sát hoạt tính kháng oxi hóa bằng<br /> phương pháp thử năng lực khử Yen & Duh: hút<br /> 1 ml (nồng độ 0,5 mg/ml) chất thử nghiệm; 2,5<br /> ml dung dịch đệm sodium phosphate 0,2M pH<br /> 6,6; 2,5 ml dung dịch potassium ferricyanide<br /> 1%; ổn định ở 20oC sau 20 phút; thêm 2,5 ml<br /> acid tricloroacetic 10%; ly tâm 2.000 vòng/phút<br /> trong 10 phút; thu dịch nổi; hút 1ml dịch nổi<br /> qua ống nghiệm khác; thêm 2 ml nước cất và<br /> 0,5 ml dung dịch FeCl3 1%; lắc đều rồi để yên<br /> sau 5 phút; đo ở bước sóng 700 nm.<br /> Khảo sát hoạt tính kháng oxi hóa bằng<br /> phương pháp đánh bắt gốc tự do DPPH: bảy<br /> loại cao có kết quả tốt nhất từ phương pháp Yen<br /> & Duh được đem xác định giá trị IC50 bằng<br /> phương pháp đánh bắt gốc tự do DPPH. Pha<br /> dung dịch DPPH có nồng độ 0,6 mM trong<br /> ethanol bằng cách hòa tan 4,728 mg với 20 ml<br /> dung dịch methanol. Mỗi phân đoạn cao được<br /> pha thành các nồng độ: 500; 250; 125; 62,5;<br /> 31,25 µg/ml. Thực hiện phản ứng cho các nồng<br /> độ đã pha như sau: ethanol (3 ml), dịch thử (0,5<br /> ml), dung dịch DPPH (0,5 ml); lắc hỗn hợp<br /> trong 15 giây; sau đó ủ hỗn hợp trong tối ở nhiệt<br /> độ phòng 30 phút và đo mật độ quang ở bước<br /> sóng 516 nm. Hoạt tính kháng oxi hóa (%) được<br /> tính theo công thức sau: (HTCO%) =<br /> [(ODchứng - ODthử)/ODchứng]. Từ đồ thị biễu<br /> diễn sự tương quan giữa HTCO% và nồng độ<br /> các mẫu, giá trị IC50 sẽ được xác định.<br /> Chứng minh sự hiện diện của betuline trong<br /> cây bán tự mốc<br /> Các mẫu cao ethanol của thân, lá, rễ của bán<br /> tự mốc được gửi đi phân tích sự hiện diện và<br /> xác định hàm lượng betuline bằng HPLC-UV<br /> tại phòng thí nghiệm Phân tích trung tâm,<br /> trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học<br /> Quốc gia thành phố Hồ Chí Minh.<br /> Nuôi cấy rễ in vitro cây bán tự mốc nhằm thu<br /> nhận nguồn nguyên liệu in vitro chủ động<br /> trong sản xuất betuline<br /> Nguồn mẫu: cây bán tự mốc được thu hái tại<br /> quận Tân Phú, tp. Hồ Chí Minh; chủng vi khuẩn<br /> A. rhizogenes ATCC 15834, được mua từ tổ<br /> chức RIKEN-PRC thông qua dự án của Mext,<br /> Nhật Bản.<br /> Môi trường sử dụng: Murrashige và Skoog<br /> <br /> 146<br /> <br /> (MS), bổ sung đường (30g/l), pH 5,8 dùng nuôi<br /> cấy thực vật và môi trường Nutrient Broth (NB)<br /> dùng tăng sinh vi khuẩn A. rhizogenes ATCC<br /> 15834.<br /> Điều kiện nuôi cấy: chiếu sáng 16 giờ/ngày;<br /> với cường độ chiếu sáng 3.000 lux; nhiệt độ<br /> phòng nuôi cấy: 22-25oC; ẩm độ trung bình:<br /> 70%.<br /> Khử trùng tạo nguồn mẫu in vitro<br /> Quy trình khử trùng chồi bên cây bán tự<br /> mốc gồm rửa xà phòng, lắc với acid benzoid<br /> 0,3% trong 45 phút, rửa lại bằng nước cất.<br /> Chuyển mẫu vào tủ cấy vô trùng, lắc với cồn<br /> 70% trong 1 phút, rửa bằng nước cất vô trùng;<br /> lắc mẫu trong dung dịch javen: nước (1:2) có bổ<br /> sung tweens 20 trong 15 phút, rửa lại bằng nước<br /> cất vô trùng. Mẫu được cấy vào môi trường MS<br /> để tạo nguồn nguyên liệu in vitro ban đầu.<br /> Khảo sát sự tạo rễ bất định do cảm ứng của<br /> các loại hormon khác nhau<br /> Các mẫu lớp mỏng khác nhau của cây (rễ,<br /> thân, lá) được cấy trên các môi trường có bổ<br /> sung các loại hormone thực vật khác nhau: (1)<br /> MS; (2) MS+0,5 mg/l NAA; (3) MS+0,5 mg/l<br /> BA; (4) MS+0,5 mg/l Kinetin; (5) MS+0,5 mg/l<br /> 2,4D. Sau 5 tuần nuôi cấy, theo dõi tỷ lệ mẫu tạo<br /> rễ (%), và chiều dài rễ (cm) trong từng công<br /> thức.<br /> Khảo sát sự tạo rễ tơ bằng A. rhizogenes<br /> ATCC 15834<br /> Chủng A. rhizogenes ATCC 15834 hoạt hóa<br /> trong 48 giờ trên môi trường NB ở 25-28oC dùng<br /> xâm nhiễm lên mô thực vật. Cắt và tạo vết<br /> thương ở các bộ phận của cây rồi ngâm trong<br /> dịch khuẩn 30 phút. Chuyển mẫu vào môi trường<br /> MS, sau 5-7 ngày, khi khuẩn lạc phát triển, rửa<br /> mẫu với kháng sinh cefotaxime 200 mg/l, chuyển<br /> mẫu vào môi trường MS mới. Sau 5 tuần, theo<br /> dõi tỷ lệ tạo rễ (%), chiều dài rễ (cm).<br /> Khảo sát điều kiện tăng trưởng của rễ<br /> Dựng đường cong tăng trưởng của rễ và so<br /> sánh hiệu quả của bước nuôi chuyển tiếp sang<br /> môi trường lỏng trước khi nuôi cấy rễ độc lập:<br /> 0,5 g rễ cây con in vitro mỗi loại (rễ lỏng, rễ<br /> agar) được nuôi lỏng lắc trong 6 erlen 100 ml<br /> chứa 50 ml môi trường MS trong điều kiện 180<br /> vòng/phút, ở 25-28oC, trọng lượng tươi và trọng<br /> <br /> TẠP CHÍ SINH HỌC 2014, 36(1se): 145-151<br /> <br /> lượng khô của rễ được xác định sau mỗi 6 ngày,<br /> trong vòng 30 ngày.<br /> Khảo sát thành phần môi trường thích hợp:<br /> 0,5 g rễ cây con in vitro được nuôi lỏng lắc (100<br /> vòng/phút, 25-28oC) trong erlen 100 ml chứa 50<br /> ml với các môi trường: MS, B5, SH. Sau 3 tuần,<br /> ghi nhận sự tăng trưởng của rễ qua sự chênh<br /> lệch khối lượng Δ(g).<br /> KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN<br /> <br /> Khảo sát hoạt tính kháng oxi hóa của các bộ<br /> phận của cây trong các hệ dung môi khác<br /> nhau<br /> Sau khi hút ẩm và sấy khô các loại cao đến<br /> khối lượng không đổi, so sánh với khối lượng<br /> khô ban đầu, thu được kết quả cao nước với<br /> <br /> phương pháp đông khô có hiệu suất cao nhất.<br /> Riêng đối với phương pháp cô quay chân<br /> không, ở bộ phận rễ dung môi ethanol có hiệu<br /> suất tạo cao tốt nhất, ở bộ phận thân và lá dung<br /> môi chloroform có hiệu suất tạo cao tốt nhất<br /> (bảng 1).<br /> Khảo sát hoạt tính kháng oxi hóa bằng phương<br /> pháp thử năng lực khử theo Yen & Duh<br /> <br /> Kết quả định tính khả năng kháng oxi<br /> hóa của các loại cao được trình bày trong<br /> bảng 2.<br /> Từ phương pháp của Yen & Duh, chúng<br /> tôi sàng lọc được bảy loại cao có kết quả<br /> kháng oxi hóa tốt nhất, đó là cao R2, R3,<br /> R4, T1, T2, T3 và T4, trong đó, cao ethanol<br /> rễ (R3) có kết quả tốt nhất.<br /> <br /> Bảng 1. Hiệu suất các loại cao từ các bộ phận rễ, thân, lá<br /> Dung môi<br /> Diethyl eter<br /> Chloroform<br /> Etanol<br /> Nước<br /> <br /> Rễ khô<br /> (270g)<br /> 0,7379<br /> 0,9336<br /> 2,3377<br /> 26,9416<br /> <br /> Khối lượng cao (g)<br /> Thân khô<br /> Lá khô<br /> (500g)<br /> (600g)<br /> 2,7832<br /> 1,8855<br /> 3,8900<br /> 11,3502<br /> 2,3741<br /> 1,6181<br /> 55,1300<br /> 39,1506<br /> <br /> Hiệu suất cao (%)<br /> Rễ<br /> <br /> Thân<br /> <br /> Lá<br /> <br /> 0,2733<br /> 0,3458<br /> 0,8658<br /> 9,9784<br /> <br /> 0,5566<br /> 0,7780<br /> 0,4748<br /> 11,0260<br /> <br /> 0,3143<br /> 1,8917<br /> 0,2697<br /> 6,5251<br /> <br /> Bảng 2. Tính khử của các loại cao theo phương pháp Yen & Duh (1993)<br /> Bộ phận của cây<br /> <br /> Rễ<br /> <br /> Thân<br /> <br /> Lá<br /> <br /> Dung dịch đo<br /> Chứng dương<br /> Chứng âm<br /> Cao diethyl eter<br /> Cao chloroform<br /> Cao ethanol<br /> Cao nước<br /> Cao diethyl eter<br /> Cao chloroform<br /> Cao ethanol<br /> Cao nước<br /> Cao diethyl eter<br /> Cao chloroform<br /> Cao ethanol<br /> Cao nước<br /> <br /> Khảo sát hoạt tính kháng oxi hóa bằng<br /> phương pháp đánh bắt gốc tự do DPPH<br /> <br /> Vit E<br /> ĐC<br /> R1<br /> R2<br /> R3<br /> R4<br /> T1<br /> T2<br /> T3<br /> T4<br /> L1<br /> L2<br /> L3<br /> L4<br /> <br /> ABS ± SE<br /> 1,507±0,07353<br /> 0,595±0,05231<br /> 0,679±0,12929<br /> 0,966±0,14757<br /> 1,968±0,22379<br /> 0,919±0,10303<br /> 0,696±0,10930<br /> 0,825±0,15060<br /> 1,324±0,19654<br /> 0,823±0,24229<br /> 0,642±0,15829<br /> 0,631±0,13949<br /> 0,673±0,10468<br /> 0,624±0,04814<br /> <br /> Gía trị IC50 của bảy loại cao có kết quả tốt<br /> nhất ở phương pháp Yen & Duh được xác định<br /> 147<br /> <br /> Quach Ngo Diem Phương et al.<br /> <br /> bằng phương pháp DPPH theo hình 1.<br /> Cao ethanol rễ có hoạt tính kháng oxi hóa<br /> cao nhất với IC50=75 µg/ml, cao ethanol thân<br /> (T3) cũng có hoạt tính kháng oxi hóa ở mức cao<br /> với giá trị IC50=97 µg/ml. Tính kháng oxi hóa<br /> theo phương pháp DPPH của bảy loại cao xếp<br /> theo thứ tự giảm dần như sau: R3>T3>R2>R4><br /> T4>T2>T1. Như vậy, rễ là bộ phận có hoạt tính<br /> kháng oxi hóa tốt nhất trong cây bán tự mốc và<br /> ethanol là dung môi thích hợp để có thể tách<br /> chiết các hoạt chất có hoạt tính cao từ rễ.<br /> <br /> phân tích HPLC cho kết quả định lượng như ở<br /> hình 2. Kết quả ở bảng 3 cho thấy, rõ ràng các<br /> bộ phận của cây bán tự mốc đều có sự hiện diện<br /> của betuline, trong đó, mẫu rễ có chứa hàm<br /> lượng betuline cao nhất.<br /> Bảng 3. Kết quả định lượng betuline bằng<br /> phương pháp HPLC-UV<br /> Tên mẫu<br /> Lá<br /> Thân<br /> Rễ<br /> <br /> Kết quả phân tích (µg/g)<br /> 13,4<br /> 7,0<br /> 59,3<br /> <br /> Nuôi cấy rễ in vitro nhằm thu nhận nguồn<br /> nguyên liệu in vitro chủ động trong sản xuất<br /> betuline<br /> Khảo sát sự tạo rễ bất định do cảm ứng của các<br /> loại hormone khác nhau<br /> Hình 1. Biểu đồ thể hiện giá trị IC50 (µg/ml) của<br /> bảy phân đoạn cao<br /> Chứng minh sự hiện diện của betuline<br /> Các mẫu cao ethanol rễ, thân, lá sau khi<br /> A<br /> <br /> B<br /> <br /> Kết quả cảm ứng tạo rễ bằng hormone thực vật<br /> từ các bộ phận khác nhau (rễ, thân, lá) của cây<br /> bán tự mốc in vitro được trình bày trong hình 3<br /> và 4. Trong đó, rễ bất định chỉ được cảm ứng<br /> tạo thành trên môi trường MS bổ sung NAA 0,5<br /> mg/l.<br /> C<br /> <br /> D<br /> <br /> Hình 2. Sắc kí đồ của A: betuline 20 ppm; B: mẫu lá; C: mẫu thân; D: mẫu rễ<br /> <br /> Hình 3. Đồ thị chiều dài rễ bất định trên môi<br /> trường MS+0,5mg/l NAA sau 5 tuần<br /> 148<br /> <br /> Sau 5 tuần nuôi cấy, rễ bất định từ thân và lá<br /> phát triển dài hơn rễ bất định từ rễ, do đó, để tạo<br /> rễ bất định bằng cảm ứng hormone thực vật,<br /> chúng tôi đề xuất bộ phân thích hợp là thân hay<br /> lá, và hormone thích hợp là NAA.<br /> Khảo sát sự tạo rễ tơ bằng A. rhizogenes ATCC<br /> 15834<br /> Sau 10 ngày nuôi cấy, kết quả cho thấy rõ<br /> hiệu quả tác động tạo rễ của A. rhizogenes ATCC<br /> 15834 lên mẫu cắt ngang (lá, thân, rễ) có tạo vết<br /> thương: xuất hiện rễ trên công thức có bổ sung<br /> A. rhizogenes, trong khi công thức đối chứng<br /> <br /> TẠP CHÍ SINH HỌC 2014, 36(1se): 145-151<br /> <br /> không có (hình 5). Khả năng phát triển của rễ<br /> (chiều dài rễ) được cảm ứng bởi A. rhizogenes<br /> A<br /> <br /> B<br /> <br /> 1cm<br /> <br /> C<br /> <br /> 1cm<br /> <br /> ATCC 15834 sau đó được ghi nhận sau 5 tuần<br /> tiếp theo được trình bày ở hình 6.<br /> D<br /> <br /> 1cm<br /> <br /> E<br /> <br /> 1cm<br /> <br /> F<br /> <br /> 1cm<br /> <br /> 1cm<br /> <br /> Hình 4. Mẫu sau 10 ngày nuôi cấy: A: MS; B:MS+0,5 mg/l NAA; C: MS+0,5mg/l Kinetin;<br /> D:MS+0,5 mg/l 2,4D; E: MS+0,5 mg/l 2,4D; F: Rễ trên môi trường B (5 tuần)<br /> B<br /> <br /> A<br /> <br /> Hình 5. A. Mẫu không nhiễm A. rhizogenes;<br /> B. Mẫu có nhiễm A. Rhizogenes<br /> Để chứng minh sự hiện diện của gen chuyển<br /> trong gennome của rễ được tạo thành nhờ A.<br /> rhizogenes ATCC 15834, phản ứng PCR nhằm<br /> khuếch đại trình tự gen đặc trưng của A.<br /> rhizogenes ATCC 15834 hiện diện trong<br /> gennome của rễ tạo thành đã được tiến hành, kết<br /> quả được trình bày trong hình 7.<br /> A<br /> 400bp<br /> <br /> 600bp<br /> <br /> B<br /> <br /> Hình 6. Đồ thị thể hiện chiều dài của rễ sau 5<br /> tuần nuôi cấy từ các bộ phận được nhiễm<br /> A. rhizogenes<br /> Vẽ đường cong tăng trưởng của rễ và so<br /> sánh hiệu quả của bước nuôi chuyển tiếp sang<br /> môi trường lỏng trước khi nuôi cấy rễ độc lập ở<br /> điều kiện lỏng-lắc (hình 8). Kết quả cho thấy, rễ<br /> tăng trưởng đều đặn và đạt trọng lượng tối đa<br /> sau 18 ngày nuôi cấy, sau đó trọng lượng giảm<br /> dần vì lúc này rễ bắt đầu tổng hợp và sản sinh<br /> hợp chất thứ cấp, làm nồng độ áp suất thẩm thấu<br /> trong môi trường tăng cao, cản trở hấp thu chất<br /> dinh dưỡng, dẫn đến tăng trưởng giảm.<br /> <br /> Hình 7. Sản phẩm PCR<br /> A. cặp mồi rolBF-rolBR; B. cặp mồi rolCF-rolCR;<br /> 1. Thang; 2. Rễ invitro đối chứng;<br /> 3. Rễ invitro chuyển gen.<br /> <br /> Kết quả PCR cho thấy sự hiện diện của<br /> đoạn gen rolB (422bp) và rolC (625bp) của A.<br /> rhizogenes ATCC 15834 trong genome của rễ<br /> tạo thành. Như vậy, A. rhizogenes ATCC 15834<br /> đã cảm ứng tạo được rễ tơ từ mẫu cây bán tự<br /> mốc.<br /> Khảo sát điều kiện tăng trưởng của nguồn rễ<br /> độc lập<br /> <br /> Hình 8. Đường cong tăng trưởng rễ lỏng<br /> <br /> Hình 9. Đường cong tăng trưởng rễ agar<br /> <br /> 149<br /> <br />